Đặt vấn đề Cây nhãn đã là một trong những giống cây ăn quả đƣợc trồng lâu đời và phổ biến ở nƣớc ta. Theo Tổng cục Thống kê năm 2020, diện tích nhãn của cả nƣớc đạt 70.207 ha với tổng sản lƣợng quả đạt 551. Đi cùng với sản lƣợng dồi dào sau mỗi vụ thu hoạch là lƣợng lớn phế phụ phẩm nhãn đƣợc thải ra. Chính vì lƣợng lớn phế phụ phẩm thải ra chƣa đƣợc xử lý đúng cách gây nên hiện trạng ô nhiễm môi trƣờng lãng phí một nguồn tài nguyên sẵn có mà chƣa đƣợc tận dụng.
Gần đây, nhiều công trình nghiên cứu tập trung vào việc tái sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp để sản xuất phân bón hữu cơ, thức ăn chăn nuôi, hoặc than đốt nhằm nâng cao giá trị nguồn phụ phẩm sẵn có. Thành phần chính từ nguồn cơ chất này là cellulose, hemicellulose và lignin. Trong đó lignin là hợp chất khó phân hủy có tính kết dính chặt các thành phần cellulose và hemicellulose. Chính đặc tính này làm lignin rất khó bị phân hủy để giải phóng cellulose và hemicellulose tạo nguyên liệu cho quá trình tái sử dụng cơ chất.
Cấu trúc phức tạp của lignin cũng khiến lignocellulose khó bị phân hủy và chuyển hóa bởi sinh vật, hạn chế việc sử dụng hiệu quả phế phụ phẩm nông nghiệp. Chìa khóa của việc sử dụng các phƣơng pháp sinh học để phân hủy lignin là thu đƣợc các nguồn vi sinh vật có thể phân hủy và biến đổi lignin một cách hiệu quả và khai thác các enzyme có khả năng phân hủy lignin ở vi sinh vật. Một số vi sinh vật có thể phân hủy lignin một cách tự nhiên và tạo ra các enzyme phân hủy lignin, bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn. Trong tự nhiên, vai trò của laccase là phân hủy lignin để tiếp cận với các carbohydrate khác trong gỗ (cellulose và hemicellulose).
Tính đặc hiệu cơ chất thấp của chúng cho phép laccase phân hủy lignin. Laccase đƣợc tìm thấy rộng rãi trong nấm, vi khuẩn và thực vật. Trong số đó, laccase đƣợc phát hiện thấy lần đầu ở nấm chủ yếu có nguồn gốc từ nấm mục trắng. 1 Trên thế giới cũng có nhiều nghiên cứu về nấm mốc có khả năng phân giải lignin nhƣ nghiên cứu khả năng phân hủy lignin trong ủ cây thuốc lá với việc cấy 2 loại nấm mục trắng Trametes hirusta và Pleurotus ostreatus giúp tăng khả năng phân hủy và tăng chất lƣợng đống ủ (Reddy & Yang, 2005).
Năm 2012, Zeng và cs đã đánh giá đƣợc sự phân hủy lignin rơm rạ lúa mì bản địa do Streptomyces viridosporus T7A (Zeng & cs. Tuy đã có nhiều nghiên cứu đánh giá về khả năng phân giải lignin trên phụ phẩm nhƣng trên phế phụ phẩm nhãn chƣa có nghiên cứu nào về nấm mốc sinh tổng hợp laccase phân giải lignin trên phế phụ phẩm nhãn sau thu hoạch để phục vụ cho mục đích tạo chế phẩm vi sinh. Chính vì vậy, đề tài: “Phân lập các chủng nấm mốc sinh tổng hợp laccase và đánh giá khả năng xử lý lignin phế phụ phẩm nhãn” đƣợc thực hiện nhằm tuyển chọn đƣợc chủng nấm mốc có khả năng phân giải lignin tốt phù hợp để xử lý nguồn phế phụ phẩm sau thu hoạch nhãn, tạo nguyên liệu cho quá trình sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh 1. Nội dung đề tài Phân lập đƣợc các chủng nấm sinh tổng hợp laccase.
Đánh giá khả năng phân hủy lignin từ phế phụ phẩm sau thu hoạch nhãn của các chủng nấm mốc đƣợc tuyển chọn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về enzyme laccase 2. Định nghĩa laccase Laccase (p-benzenediol: oxygen oxidoreductase, E.2) thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ thể là polyphenol oxidase.
Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn các enzyme khác, laccase có phổ cơ chất rất đa dạng bao gồm: diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB, dioxin và cả các hợp chất vô cơ nhƣ iot. Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lƣợng phân tử, tính chất glycosyl hóa và tính chất động học (Kiiskinen, 2005). Năm 1896, hai nhà khoa học Bertrand và Laborde là những ngƣời đầu tiên chứng minh laccase có mặt trong nấm.
Kể từ đó, laccase đã đƣợc tìm thấy ở Ascomycetes, Deuteromycetes và Basidiomycetes, đặc biệt có nhiều ở nhiều loại nấm mục trắng tham gia vào quá trình chuyển hóa lignin. Laccase là một trong những enzyme oxy hóa cung cấp khả năng hóa trị lignin rộng lớn thông qua phản ứng trùng hợp hoặc ghép.2 Cấu trúc của laccase Một loài sinh vật có thể có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng isozyme này khác nhau về trình tự acid amine và một số tính chất về động học xúc tác. Nấm có thể tạo ra nhiều dạng isozyme laccase khác nhau cả về mức độ glycosyl hóa và cả thành phần các gốc carbonhydrate. Loài nấm Trametes versicolor có 5 dạng isozyme chỉ khác nhau về thành phần carbonhydrate, thành phần carbonhydrate của chúng thay đổi từ 10 - 45% so với khối lƣợng của thành phần protein, Galerina sp.
HC1 có thể sản xuất 4 isozyme (Laura, 2011), trong khi Fusarium sp.BOL35 chỉ sản xuất ra 1 laccase duy nhất (Terrazas 2005). Khối lƣợng phân tử của các monomer laccase khoảng 40 - 130kDa với thành phần carbohydrat thay đổi từ 10 - 25% trong nấm và 20 - 45% trong thực 3 vật. Hơn một nửa carbohydrate thƣờng là manose, nacetylglucosamine và galactose, có thể đóng góp vào sự ổn định của các enzyme. Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng (Cu) và 2 cầu liên kết disulfide phân bố trong 3 nhóm khác nhau.
Những nguyên tử đồng này đƣợc chia thành 3 nhóm: T1, T2 và T3 chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp phụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ hấp thụ điện tử, và có thể đƣợc hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh. Hình ảnh không gian ba chiều của laccase từ M. Phân tử laccase thông thƣờng bao gồm 3 tiểu phần chính (vùng) A, B, C có khối lƣợng tƣơng đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác của laccase.
Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và C. Trung tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa 1 nguyên tử 4 đồng T1, liên kết với một đoạn peptide có 2 gốc histidine và 1 gốc cystein. Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nƣớc biển đặc trƣng. Trung tâm đồng 3 nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3.
Nguyên tử đồng T2 liên kết với 2 gốc histidine bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidine bảo thủ T1 là một trung tâm đơn nhân chứa 1 nhân Cu, trong khi một nhân Cu khác ở T2 và hai nhân Cu ở T3. Tóm lại, quá trình oxy hóa cơ chất xảy ra ở vùng T1 thông qua trình tự tripeptide His – Cys - His, sau đó các điện tử đƣợc chuyển đến trung tâm ba hạt nhân T2/T3 và diễn ra sự khử O2 thành nƣớc (Mayolo-Deloisa & cs. 2 Trung tâm đồng trong laccase của nấm (Claus, 2004) Chú thích: Loại 1 ( type 1): Đồng loại 1 tạo ra màu xanh lam cho các protein đa đồng, đó là do sự hấp thụ điện tử mạnh gây ra bởi liên kết đồng-cysteine cộng hóa trị. Đồng loại 1 có một phối trí tam giác, với hai histine và một cysteine là phối tử xích đạo được bảo tồn và một vị trí thường thay đổi, và trong trường hợp của nấm, phối tử trục là leucine hoặc phenylalanin.
Loại 2 (type 2): Vị trí Cu loại 2 hoặc bình thường được đặc trưng bởi thiếu các tính năng hấp thụ mạnh trong vùng khả kiến và để lộ phổ cộng hưởng từ thuận từ điện 5 tử (EPR) thông thường. Đồng loại 2 được điều phối bởi hai gốc histidin và có vị trí chiến lược gần với đồng loại 3. Loại 3 (type 3): là trung tâm hạt nhân được điều chỉnh bởi sáu histidine và được đặc trưng bằng quang phổ bởi sự hấp phụ điện tử ở bước sóng 330 nm (dạng oxy hóa) và không có tín hiệu EPR do sự kết hợp phản sắt từ mạnh mẽ giữa hai nguyên tử đồng Loại 3 có liên quan đến sự hiện diện của một cầu hydroxyl. Cơ chế tác động của laccase Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử.
Khác với phần lớn các loại enzyme khác, laccase có phổ đặc hiệu cơ chất khá rộng. Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính. Thứ nhất là sự phù hợp giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme. Các đại lƣợng này phụ thuộc cấu trúc hóa học của cơ chất.
Thế oxy hóa khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,9 trong vỏ nấm. Cơ chất khử bị mất một điện tử nhờ xúc tác laccase thƣờng tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không cần xúc tác enzyme nhờ hydrate hóa, phân ly hoặc polymer hóa. Quá trình xúc tác của laccase bắt đầu với quá trình oxy hóa đơn điện tử của bốn chất khử thích hợp tƣơng đƣơng, chẳng hạn nhƣ phenol hoặc các amin thơm và béo để tạo thành các gốc hữu cơ với chi phí oxy phân tử và cuối cùng bị khử thành hai phân tử nƣớc. Một cụm bốn đồng ghi nhớ đại diện cho bộ máy xúc tác của các enzym này, cũng là nơi điều phối và khử oxy cũng nhƣ hình thành và giải phóng nƣớc.
Trong vỏ bọc của nấm, ba vị trí khác nhau thƣờng đƣợc xác định trong cụm đồng tùy thuộc vào vai trò của chúng trong chu trình xúc tác: cái gọi là “vị trí màu xanh” hoặc Loại 1 (T1), “vị trí bình thƣờng” hoặc Loại 2 (T2) và "Địa điểm hạt nhân" hoặc Loại 3 (T3) (Sơ đồ 1). cụ thể, đồng T1 tham gia vào quá trình oxy hóa cơ chất, trong khi đồng T2 và T3, xác định một cụm phụ ba hạt nhân, xúc tác quá trình khử oxy phân tử.