Phân lập gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển cây đậu tương kháng bệnh

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phân lập đoạn gen cp từ soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc rnai, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Tác giả: Lò Thị Mai Thu
• Người hướng dẫn: Chu Hoàng Mậu
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Phân lập gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển cây đậu tương kháng bệnh
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2.1. Mục tiêu chung
• 1.2.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Những đóng góp mới của luận án
• 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 1.5.1. Về khoa học
• 1.5.2. Về thực tiễn
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. BỆNH KHẢM DO VIRUS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG
• 1.1.1. Cây đậu tương và bệnh virus ở cây đậu tương
• 1.1.2. Sơ đồ mô phỏng quá trình xâm nhiễm và nhân lên của SMV và BYMV vào tế bào cây đậu tương
• 1.1.3. Đặc điểm hệ gen của SMV, BYMV và Potyvirus
• 1.1.4. Bản đồ hệ gen của SMV và dự đoán các điểm cắt của protease

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu phân lập gen CP từ Soybean mosaic virus

Nghiên cứu về gen CP từ Soybean mosaic virus (SMV) là một lĩnh vực quan trọng trong nông nghiệp sinh học. Cây đậu tương (Glycine max) là một trong những cây trồng chủ lực, nhưng thường xuyên bị ảnh hưởng bởi các loại virus, đặc biệt là SMV. Việc phân lập gen CP từ SMV không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển giống cây kháng bệnh. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu tạo ra các giống đậu tương có khả năng kháng lại virus, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

1.1. Đậu tương và vai trò của nó trong nông nghiệp

Cây đậu tương có giá trị dinh dưỡng cao, chứa nhiều protein và lipid. Nó không chỉ là nguồn thực phẩm quan trọng mà còn có tác dụng cải tạo đất. Tuy nhiên, năng suất đậu tương ở Việt Nam vẫn còn thấp do ảnh hưởng của các loại virus như SMV.

1.2. Tác động của Soybean mosaic virus đến cây đậu tương

SMV gây ra bệnh khảm, làm giảm năng suất và chất lượng hạt đậu tương. Nghiên cứu cho thấy, năng suất có thể giảm tới 40% khi cây bị nhiễm virus trước khi ra hoa. Việc hiểu rõ tác động của virus này là cần thiết để phát triển các biện pháp kháng bệnh hiệu quả.

II. Thách thức trong việc phát triển cây đậu tương kháng bệnh

Mặc dù có nhiều biện pháp phòng ngừa, nhưng việc phát triển giống đậu tương kháng bệnh vẫn gặp nhiều thách thức. Nguồn giống kháng tự nhiên đối với SMV và BYMV rất hạn chế. Các biện pháp như vệ sinh đồng ruộng và luân canh cây trồng thường không mang lại hiệu quả cao. Do đó, việc nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học để tạo ra cây đậu tương kháng virus là rất cần thiết.

2.1. Hạn chế của các biện pháp phòng bệnh hiện tại

Các biện pháp phòng bệnh như chọn lọc cây giống sạch bệnh và vệ sinh đồng ruộng thường tốn nhiều công sức và không đạt hiệu quả cao. Điều này dẫn đến việc cần thiết phải tìm kiếm các giải pháp mới.

2.2. Nhu cầu về giống đậu tương kháng bệnh

Nhu cầu về giống đậu tương kháng bệnh ngày càng tăng cao do tình trạng nhiễm virus ngày càng nghiêm trọng. Việc phát triển giống mới có khả năng kháng virus sẽ giúp nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

III. Phương pháp nghiên cứu phân lập gen CP từ SMV

Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật RNA interference (RNAi) để phát triển cây đậu tương kháng virus. Phương pháp này cho phép tạo ra các giống cây có khả năng kháng lại virus bằng cách sử dụng gen CP từ SMV. Việc phân lập gen CP và phát triển vector chuyển gen là những bước quan trọng trong nghiên cứu này.

3.1. Quy trình phân lập gen CP từ SMV

Quy trình phân lập gen CP bao gồm thu thập mẫu virus, thiết kế cặp mồi và nhân đoạn gen CP. Sau đó, đoạn gen này được tách dòng và xác định trình tự để phục vụ cho các bước tiếp theo.

3.2. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong nghiên cứu

Kỹ thuật RNAi được áp dụng để tạo ra cây đậu tương kháng virus. Bằng cách chuyển gen CP vào cây, nghiên cứu này hy vọng sẽ tạo ra giống cây có khả năng kháng lại SMV và BYMV hiệu quả hơn.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã thành công trong việc phát triển các dòng cây thuốc lá và đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi. Kết quả cho thấy các dòng cây này có khả năng kháng lại SMV và BYMV cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen. Điều này mở ra triển vọng mới trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất nông nghiệp.

4.1. Đánh giá tính kháng của cây chuyển gen

Các dòng cây chuyển gen đã được đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV. Kết quả cho thấy, cây chuyển gen có khả năng kháng cao hơn, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng hạt đậu tương.

4.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống

Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống đậu tương ở Việt Nam. Việc phát triển giống cây kháng virus sẽ giúp cải thiện năng suất và chất lượng sản phẩm nông nghiệp.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu phân lập gen CP từ SMV và phát triển cây đậu tương kháng bệnh đã mở ra hướng đi mới trong nông nghiệp sinh học. Việc ứng dụng công nghệ RNAi không chỉ giúp tạo ra giống cây kháng virus mà còn góp phần nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành nông nghiệp Việt Nam.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong nông nghiệp

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển giống cây trồng kháng bệnh, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm nông nghiệp. Điều này sẽ giúp đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về thực phẩm.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Hướng nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình chuyển gen và mở rộng ứng dụng công nghệ RNAi trong các giống cây trồng khác. Điều này sẽ giúp nâng cao khả năng kháng bệnh cho nhiều loại cây trồng khác nhau.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Sản xuất đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) tại Việt Nam và trên thế giới đang đối mặt với những tổn thất nghiêm trọng do các tác nhân sinh học gây ra, nổi bật là các loài virus thuộc chi Potyvirus. Trong số hơn 100 loài virus gây hại trên cây họ đậu, Soybean mosaic virus (SMV) và Bean yellow mosaic virus (BYMV) được xác định là hai đối tượng nguy hiểm hàng đầu. Theo các thống kê dịch tễ học, "năng suất đậu tương có thể giảm tới 40% khi các cây bị nhiễm virus trước khi ra hoa và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém", thậm chí khi đồng nhiễm cả hai loài, năng suất mùa vụ có thể suy giảm nghiêm trọng từ 66% đến 80%, cá biệt thiệt hại có thể lên đến 94% tổng sản lượng.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi nằm ở việc nguồn gen kháng tự nhiên đối với SMV và BYMV trong quỹ gen đậu tương bản địa vô cùng hạn chế, trong khi các biện pháp canh tác truyền thống hoặc phòng trừ môi giới rệp truyền bệnh mang lại hiệu quả rất thấp. Trước yêu cầu cấp bách đó, công trình nghiên cứu tiến sĩ thuộc chuyên ngành Di truyền học (mã số: 62 42 01 21) của nghiên cứu sinh Lò Thị Mai Thu, dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TS. Chu Hoàng Mậu và PGS.TS. Chu Hoàng Hà, đã tiên phong ứng dụng công nghệ can thiệp RNA (RNA interference - RNAi) để giải quyết triệt để bài toán kháng virus.

Nghiên cứu tập trung giải quyết 4 câu hỏi nghiên cứu (Research Questions - RQ) và kiểm chứng 4 giả thuyết khoa học (Hypotheses - H) tương ứng:

• RQ1: Trình tự phân tử và mức độ bảo thủ của đoạn gen mã hóa protein vỏ (Coat Protein - CP) ở các chủng SMV lưu hành tại các vùng sinh thái nông nghiệp miền Bắc Việt Nam có đặc điểm như thế nào?
  • H1: Đoạn gen CP của các chủng SMV tại Việt Nam sở hữu các vùng trình tự nucleotide bảo thủ cao (>90%), đủ điều kiện làm khuôn mẫu thiết kế cấu trúc can thiệp RNA.
• RQ2: Liệu có thể phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc RNA kẹp tóc chứa đoạn intron (intron-spliced hairpin RNA - ihpRNA) để ức chế đặc hiệu đơn loài SMV cũng như đồng thời cả hai loài SMV và BYMV?
  • H2: Cấu trúc ihpRNA mang đoạn lai ghép CPi (SMV-BYMV) khi biểu hiện sẽ kích hoạt hệ thống PTGS tạo ra các siRNA nhắm trúng đích mRNA của cả hai loại virus.
• RQ3: Mức độ biểu hiện và hiệu quả kháng bệnh thực nghiệm của cấu trúc RNAi trên hệ thống mô hình thực vật (Nicotiana tabacum) đạt ngưỡng sinh học nào?
  • H3: Cây mô hình chuyển gen mang cấu trúc CPi (SMV-BYMV) có khả năng kháng đồng thời SMV và BYMV với tỷ lệ sống sót và giảm triệu chứng vượt trội so với đối chứng hoang dại (WT).
• RQ4: Khả năng chuyển nạp và tích hợp bền vững cấu trúc RNAi vào các giống đậu tương thuần nông nghiệp của Việt Nam đạt hiệu suất ra sao?
  • H4: Quy trình lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens qua nách lá mầm tổn thương cho phép chuyển thành công cấu trúc CPi vào bộ gen của các giống đậu tương ĐT12 và DT2008.

Khung lý thuyết của luận án được xây dựng dựa trên học thuyết bất hoạt gen sau phiên mã (Post-Transcriptional Gene Silencing - PTGS) qua trung gian phân tử RNA can thiệp ngắn (small interfering RNA - siRNA) được khám phá bởi Fire và Mello (1998, Giải Nobel 2006) và phát triển ứng dụng trên thực vật bởi Baulcombe (2004). Về quy mô, nghiên cứu đã tiến hành thu thập và sàng lọc mẫu bệnh tại 8 tỉnh trọng điểm miền Bắc (Thanh Hóa, Hà Nội, Hưng Yên, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Sơn La, Hà Giang, Bắc Cạn), phân lập và đăng ký thành công 2 trình tự gen CP trên GenBank (HG965102, HG965103), thiết kế thành công 2 vector chuyển gen Gateway, tạo ra 19 dòng thuốc lá chuyển gen C9-1 kháng bệnh, cùng 24 dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T0 (gồm 5 dòng từ giống ĐT12 và 19 dòng từ giống DT2008).

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu kháng virus thực vật đã trải qua nhiều giai đoạn chuyển biến mô hình nhận thức (paradigm shifts). Khởi đầu từ hiện tượng miễn dịch chéo (cross-protection) được ghi nhận trên cây thuốc lá nhiễm Tobacco ringspot virus (Wingard, 1928), tiếp nối bởi công trình kinh điển của Powell-Abel và cộng sự (1986) về biểu hiện protein vỏ để gây kháng. Tuy nhiên, các tranh luận học thuật sâu sắc đã nảy sinh giữa hai trường phái: Trường phái miễn dịch qua trung gian protein (Protein-mediated resistance) cho rằng sự hiện diện dồi dào của protein vỏ ngoại lai ngăn cản quá trình cởi vỏ (uncoating) của virus; trong khi Trường phái câm gen qua trung gian RNA (RNA-mediated resistance) do Lindbo và Dougherty (1992), Baulcombe (2004) dẫn dắt đã chứng minh chính các phân tử RNA bổ sung chứ không phải protein mới là nhân tố kích hoạt cơ chế phòng vệ tế bào chủ.

Tranh luận học thuật thứ hai xoay quanh tính ổn định và phổ kháng của cấu trúc can thiệp RNA. Smith và cộng sự (2000), Wesley và cộng sự (2001) đã chỉ ra rằng các cấu trúc phiên mã dạng sợi đơn (sense hoặc antisense) thường có hiệu quả câm gen thấp (<15%), trong khi cấu trúc dạng kẹp tóc có đoạn intron đệm (ihpRNA) nâng tỷ lệ câm gen lên đến 90-100%. Đối với virus nhóm Potyvirus, Jayaram và cộng sự (1992) khi giải mã hệ gen SMV chủng G2 và G7 (dài 9588 nucleotide, mã hóa polyprotein 3066 amino acid) đã xác nhận gen CP nằm ở đầu 3' là vùng đặc trưng nhất để định danh loài và chủng. Sự đa dạng sinh học của SMV được Cho và Goodman (1982) phân loại thành các nhóm từ G1 đến G7 dựa trên phản ứng gây bệnh mẫn cảm (S), chết hoại (N) hoặc kháng (R) trên các giống đậu tương.

[Mô hình phân loại SMV (Cho & Goodman, 1982)]
Chủng độc lực thấp (G1-G4)   Chủng độc lực cao (G5-G7)
[Hệ gen học Potyvirus: Jayaram et al., 1992; Lim et al., 2003]
[Cơ chế câm gen PTGS/ihpRNA: Baulcombe, 2004; Wesley et al., 2001]
[Nghiên cứu định vị: Vector lai kép CPi (SMV-BYMV) - Lò Thị Mai Thu]

So sánh với các công bố quốc tế:

1. Nghiên cứu của Furutani và cộng sự (2007) tại Nhật Bản đã ứng dụng RNAi tạo đậu tương kháng SMV nhưng chỉ tập trung vào một đoạn đơn gen của chủng nội địa đơn lẻ.
2. Công trình của Bonfim và cộng sự (2007) tại Brazil chuyển cấu trúc RNAi kháng Bean golden mosaic virus (BGMV) trên đậu tương đạt hiệu quả 93%, nhưng áp dụng trên hệ gen virus DNA (Geminivirus) với cơ chế dịch tễ khác biệt so với RNA virus sợi đơn dương (Potyvirus).
3. Nghiên cứu của Shinichiro và cộng sự (2007) biểu hiện ihpRNA mang gen CP trên thuốc lá duy trì tính kháng đến thế hệ T2 cho 12/14 dòng, song chưa giải quyết được bài toán đồng nhiễm đa loài.

Luận án này định vị tại điểm giao thoa giữa hệ gen học virus bản địa và công nghệ tạo vector Gateway đa mục tiêu, lấp đầy khoảng trống nghiên cứu về việc thiết kế cấu trúc can thiệp RNA nhắm đồng thời vào hai tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất trên cây họ đậu tại Đông Nam Á.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Nghiên cứu đóng góp trực tiếp vào việc hoàn thiện Lý thuyết Bất hoạt Gen Sau Phiên mã (Post-Transcriptional Gene Silencing Theory) của Baulcombe (2004) và Cơ chế Cắt chọn lọc siRNA của Hannon (2002). Luận án chứng minh rằng việc biểu hiện một đoạn phiên mã dung hợp nhân tạo chứa các trình tự bảo thủ nguồn gốc từ hai loài virus khác nhau trong cùng chi Potyvirus (SMV và BYMV) không làm suy giảm hoạt tính nhận diện của phức hệ enzyme Dicer-like (DCL) và phức hệ cảm ứng câm gen RISC (RNA-Induced Silencing Complex).

Mô hình lý thuyết mở rộng được đề xuất thông qua 4 mệnh đề khoa học:

• Mệnh đề P1: Đoạn lai ghép nucleotide bảo thủ dài 720 bp của gen CP không tạo ra các cấu trúc bậc hai cản trở không gian, cho phép phức hệ DCL cắt chính xác thành các siRNA 21-25 nt mang nhóm 5'-phosphate và 3'-hydroxyl hoạt động.
• Mệnh đề P2: Sợi dẫn đường (guide strand) bắt nguồn từ siRNA dung hợp có khả năng nạp song song vào protein Argonaute (AGO1), duy trì ái lực liên kết bổ sung hoàn toàn với cả hai phân tử mRNA đích của SMV và BYMV.
• Mệnh đề P3: Cơ chế can thiệp RNA nhân tạo có thể vô hiệu hóa hoạt tính ức chế câm gen (suppressor of silencing) của protein HC-Pro (Helper Component Proteinase) do Potyvirus tiết ra, khôi phục năng lực tự vệ nội sinh của mô chủ.
• Mệnh đề P4: Sự tích hợp bền vững cấu trúc ihpRNA vào hệ gen nhân tế bào thực vật duy trì hoạt tính phiên mã qua chu kỳ phân bào mà không gây ra hiện tượng methyl hóa ức chế ngược (Transcriptional Gene Silencing - TGS) ngoài ý muốn tại promoter tái tổ hợp.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp liên ngành giữa 3 cấu trúc lý thuyết: Hệ gen học so sánh (Comparative Genomics), Động học cấu trúc RNA (RNA Structural Kinetics), và Di truyền tế bào thực vật (Plant Cytogenetics). Khung tiếp cận sử dụng công nghệ Gateway tái tổ hợp định hướng vị trí (site-specific recombination) dựa trên các vị trí nhận diện attL và attR của thực khuẩn thể Lambda, thay thế hoàn toàn kỹ thuật cắt nối bằng enzyme giới hạn truyền thống.

[Mẫu virus SMV/BYMV thực địa (8 tỉnh miền Bắc)] 
[Giải trình tự gen CP & Phân tích Tin sinh học (BioEdit, BLAST)]
[Thiết kế vùng bảo thủ CPi & Tổng hợp nhân tạo CPi (SMV-BYMV)]
[Biến nạp Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2660]
[Mô hình: Nicotiana tabacum C9-1]  [Cây trồng mục tiêu: ĐT12 & DT2008]
[PCR sàng lọc & Thử thách lây nhiễm] [Tái sinh chồi nách lá mầm & PCR T0]
[Đánh giá tính kháng & Xác lập dòng chuyển gen ưu tú]

Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích được xác định rõ: Cơ chế câm gen dựa trên độ tương đồng trình tự nucleotide; do đó, hiệu quả kháng virus đạt tối đa khi độ tương đồng giữa siRNA và hệ gen virus lây nhiễm đạt ≥90%. Nếu virus xuất hiện các đột biến điểm tích lũy tại vùng tương đồng vượt quá ngưỡng 3 nucleotide trên chiều dài siRNA, hiệu lực cắt phân giải của RISC có thể bị suy giảm.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết lập dựa trên lập trường nhận thức thực chứng (positivism) kết hợp với chủ nghĩa thực nghiệm phân tử (molecular experimentalism), sử dụng thiết kế đa tầng (multi-level design) từ cấp độ in silico (tin sinh học), in vitro (dòng hóa và nuôi cấy mô), đến in vivo (lây nhiễm nhân tạo trên cây chuyển gen).

Mẫu nghiên cứu gồm:

1. Quần thể mẫu thực địa: Các mẫu lá đậu tương có triệu chứng khảm lá, biến dạng, xoăn đọt thu thập từ 8 tỉnh miền Bắc Việt Nam.
2. Vật liệu mô hình: Cây thuốc lá Nicotiana tabacum dòng C9-1.
3. Vật liệu cây trồng mục tiêu: Hai giống đậu tương thuần nông nghiệp gồm giống cực ngắn ngày ĐT12 (thời gian sinh trưởng 71-75 ngày, năng suất 14-23 tạ/ha) và giống đậu tương chịu hạn đột biến DT2008 (năng suất 20-40 tạ/ha, hàm lượng protein hạt 40%).

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu thập và xử lý mẫu tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chuẩn sinh học phân tử:

• Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA: 100 mg mẫu lá nghi nhiễm được nghiền trong nitơ lỏng, tách chiết RNA tổng số bằng GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific), loại bỏ hoàn toàn ức chế RNase bằng RiboLock RNase Inhibitor (20 U/µL). Phản ứng phiên mã ngược tổng hợp cDNA mạch đơn sử dụng enzyme RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200 U/µL) với mồi Oligo(dT) tại chu trình nhiệt 42°C trong 60 phút và 70°C trong 5 phút.
• Nhân dòng và giải trình tự gen CP: Đoạn gen CP của SMV được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu trên máy GeneAmp PCR System 9700. Tinh sạch sản phẩm bằng AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer), gắn vào vector tách dòng pBT qua phản ứng ligase ở 22°C trong 90 phút, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt (42°C trong 45 giây). Sàng lọc khuẩn lạc xanh-trắng với IPTG/X-gal và kiểm tra bằng colony-PCR. Trình tự nucleotide được giải mã trên máy ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer.
• Kỹ thuật Gateway xây dựng vector ihpRNA: Đoạn gen bảo thủ CPi của SMV (720 bp) và đoạn dung hợp CPi (SMV-BYMV) được thiết kế và đưa vào vector nhập cuộc pENTR/D-TOPO (Invitrogen). Tiếp đó, phản ứng trao đổi đoạn định hướng (LR reaction) được thực hiện với vector đích pK7GWIWG2(II) nhờ enzyme Gateway LR Clonase. Cấu trúc tái tổ hợp chứa hai đoạn CPi lắp ráp ngược chiều nhau qua một đoạn intron thực vật, được điều khiển bởi promoter kép CaMV 35S và kết thúc bởi terminator 35S.

Bước thí nghiệm	Vector / Kit sử dụng	Chủng vi sinh vật / Tế bào chủ	Mục tiêu kỹ thuật
Phân lập & Dòng hóa	pBT Vector, AccuPrep Kit	E. coli DH5α	Tách dòng gen CP phân lập từ đồng ruộng
Nhập cuộc Gateway	pENTR/D-TOPO	E. coli One Shot TOP10	Định hướng đoạn gen CPi có đầu chèn attL
Tạo vector RNAi	pK7GWIWG2(II)	A. tumefaciens CV58 pGV2660	Tạo cấu trúc ihpRNA mang promoter CaMV 35S
Chuyển gen mô hình	pK7GWIWG2(II)-CPi	N. tabacum C9-1	Đánh giá tính kháng virus in vivo
Chuyển gen cây đậu tương	pK7GWIWG2(II)-CPi	G. max (ĐT12, DT2008)	Tái sinh đa chồi từ nách lá mầm tổn thương

Data và phân tích

Dữ liệu trình tự phân tử được xử lý toàn diện bằng các thuật toán tin sinh học chuẩn mực: BLASTn, BLASTp trên hệ thống cơ sở dữ liệu NCBI; căn chỉnh đa trình tự (multiple sequence alignment) bằng ClustalW trên phần mềm BioEdit v7.2; dựng cây phát sinh loài (phylogenetic tree) và phân tích đa dạng di truyền bằng MEGA và DNAstar.

Quá trình chuyển gen vào mô đậu tương được thực hiện gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens chủng CV58 pGV2660 lây nhiễm vào vùng tế bào mô phân sinh nách lá mầm bị gây tổn thương cơ học. Khử trùng mô và chọn lọc mô chuyển gen trên môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô bổ sung kháng sinh chọn lọc spectinomycin/cefotaxime. Sự tích hợp của gen chuyển CPi trong các dòng cây tái sinh T0 được kiểm tra xác thực bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại phân đoạn chỉ thị cấu trúc RNAi, đảm bảo loại trừ 100% các dòng thoát chết giả tạo (escapes).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Công trình đã đạt được 5 phát hiện mang tính đột phá khoa học:

1. Đặc tính phân tử gen CP của SMV Việt Nam: Phân lập thành công đoạn gen CP từ 2 mẫu đại diện SMV dòng SL1 và dòng SL2 thu thập tại miền Bắc có kích thước chính xác 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn thể hiện độ tương đồng cao (96-99%) với các chủng SMV chuẩn quốc tế thuộc nhóm Poty-coat core, được ngân hàng gen quốc tế cấp mã số định danh HG965102 và HG965103.
2. Xây dựng thành công hệ vector Gateway ihpRNA đa kháng: Thiết lập hoàn chỉnh 2 vector chuyển gen tái tổ hợp: vector kháng đơn loài pK7GWIWG2(II)-CPi(SMV) và vector kháng đồng thời hai loài pK7GWIWG2(II)-CPi(SMV-BYMV). Cấu trúc biểu hiện đoạn phiên mã tự bổ sung tạo kẹp tóc đôi dsRNA, kích hoạt tối ưu bộ máy PTGS của thực vật.
3. Hiệu năng kháng virus vượt trội trên mô hình thuốc lá C9-1: Tạo được 19 dòng thuốc lá chuyển gen độc lập mang cấu trúc CPi (SMV-BYMV). Đánh giá tính kháng sau 3 lần lây nhiễm nhân tạo liên tiếp với nguồn virus SMV và BYMV chuẩn cho thấy: 100% các dòng chuyển gen dương tính với PCR duy trì tỷ lệ sống sót cao, làm chậm sự nhân lên của virus và biểu hiện giảm thiểu triệu chứng khảm xoăn lá tới 75-90% so với đối chứng không chuyển gen bị lụi tàn hoàn toàn.
4. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen trên giống đậu tương ĐT12 và DT2008: Ứng dụng thành công kỹ thuật lây nhiễm A. tumefaciens CV58 pGV2660 qua nách lá mầm tổn thương, kết hợp hệ thống tái sinh đa chồi in vitro. Nghiên cứu đã tạo được 24 dòng cây đậu tương T0 tái sinh hoàn chỉnh, bao gồm 5 dòng từ giống ĐT12 và 19 dòng từ giống DT2008.
5. Khẳng định tính di truyền và tương thích của cấu trúc RNAi: Toàn bộ 24 dòng đậu tương T0 được xác nhận mang đoạn gen chuyển CPi thông qua phân tích PCR với băng điện di đặc hiệu có kích thước chuẩn xác, chứng minh cấu trúc ngoại lai đã thâm nhập ổn định vào mô thực vật mục tiêu.

[Mô phân sinh nách lá mầm đậu tương ĐT12 / DT2008]
[Lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2660]
[Đồng nuôi cấy & Cảm ứng phát sinh đa chồi trên môi trường chọn lọc]
[Tái sinh 24 dòng cây đậu tương T0 hoàn chỉnh]
5 dòng giống ĐT12   19 dòng giống DT2008   100% dương tính PCR  Hình thái sinh trưởng
(Kháng rụng lá sớm) (Chịu hạn, giàu đạm)   với mồi đặc hiệu CPi  bình thường in vitro

Implications đa chiều

• Về lý thuyết sinh học phân tử: Nghiên cứu khẳng định tính khả thi của việc thiết kế cấu trúc can thiệp RNA ghép nối đa đoạn (chimeric RNAi constructs). Kết quả này bác bỏ giả thiết cho rằng việc ghép nối đoạn gen từ hai loài virus khác nhau sẽ gây ức chế cơ chế xử lý của phức hệ Dicer thực vật.
• Về phương pháp luận công nghệ sinh học: Thiết lập quy trình chuẩn từ giải trình tự, thiết kế vector Gateway đến lây nhiễm nách lá mầm, có thể chuyển giao áp dụng trực tiếp cho các đối tượng cây trồng cạn khó tái sinh khác như lạc, đậu xanh, đậu đen.
• Về ứng dụng thực tiễn: Tạo ra nguồn vật liệu di truyền khởi đầu vô cùng quý giá cho nông nghiệp Việt Nam: dòng đậu tương ĐT12 chuyển gen kháng virus kết hợp thời gian sinh trưởng ngắn, và dòng DT2008 chuyển gen tích hợp tính chịu hạn và kháng virus khảm vàng.
• Về chính sách và an toàn sinh học: Cung cấp cơ sở khoa học thực chứng phục vụ xây dựng các quy chế đánh giá rủi ro cây trồng biến đổi gen kháng virus tại Việt Nam theo Nghị định về An toàn sinh học sinh vật biến đổi gen.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những thành tựu mang tính mở đường, nghiên cứu thẳng thắn chỉ ra các giới hạn khoa học cần được tiếp tục hoàn thiện:

1. Giới hạn thế hệ phân tích: Do chu kỳ sinh trưởng của cây đậu tương và thời gian của đề tài, các dòng đậu tương chuyển gen mới dừng lại ở việc đánh giá ở thế hệ T0. Cần tiếp tục theo dõi sự phân ly di truyền, biểu hiện tính kháng và độ ổn định của gen chuyển ở các thế hệ T1, T2 và T3.
2. Kỹ thuật phân tích mức độ biểu hiện phân tử: Nghiên cứu đã xác định sự có mặt của gen chuyển bằng PCR; tuy nhiên, cần bổ sung phân tích Southern blot để xác định chính xác số bản sao (copy number) tích hợp vào bộ gen cây chủ, cũng như thực hiện Northern blot hoặc Small RNA Sequencing để định lượng trực tiếp nồng độ các phân tử siRNA chức năng.
3. Quy mô khảo nghiệm thực địa: Các thử nghiệm lây nhiễm virus nhân tạo mới được tiến hành trên cây mô hình thuốc lá trong điều kiện phòng thí nghiệm tiêu chuẩn. Cần tiến hành khảo nghiệm nhà lưới cách ly đối với các dòng đậu tương chuyển gen để đánh giá khả năng chống chịu trước áp lực truyền bệnh của rệp môi giới tự nhiên.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối định hướng 4 trọng tâm:

• Khảo nghiệm tính kháng virus của các dòng đậu tương ĐT12 và DT2008 mang cấu trúc RNAi ở thế hệ T1 và T2 dưới điều kiện lây nhiễm nhân tạo và bán tự nhiên.
• Ứng dụng kỹ thuật Real-time RT-PCR định lượng tải lượng virus (viral load) SMV và BYMV trong mô lá đậu tương chuyển gen sau lây nhiễm.
• Nghiên cứu cơ chế tương tác ở cấp độ phiên mã giữa các siRNA sinh ra từ cấu trúc CPi với protein ức chế câm gen HC-Pro của các chủng virus bản địa.
• Mở rộng thiết kế vector RNAi đa gen tích hợp các vùng bảo thủ của gen CI (protein thể vùi) và NIb (RNA-dependent RNA polymerase) để tạo tính kháng đa tầng, ngăn chặn nguy cơ virus vượt ngưỡng đề kháng do đột biến thoát (escape mutations).

Tác động và ảnh hưởng

Luận án tạo ra tác động sâu rộng trên nhiều phương diện khoa học và thực tiễn nông nghiệp:

• Tác động học thuật (Academic Impact): Mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ RNAi thế hệ mới trong cải tạo giống cây trồng tại Việt Nam. Hai trình tự gen CP đăng ký trên GenBank (HG965102, HG965103) cung cấp dữ liệu tham chiếu dịch tễ phân tử quan trọng cho cộng đồng nghiên cứu Potyvirus quốc tế.
• Chuyển đổi ngành chọn tạo giống (Breeding Transformation): Khắc phục triệt để điểm nghẽn của phương pháp lai tạo truyền thống vốn bất lực trước tình trạng khan hiếm nguồn gen kháng tự nhiên. Việc tích hợp cấu trúc RNAi vào giống DT2008 mở ra cơ hội tạo ra giống đậu tương vừa kháng hạn vừa kháng virus, thích ứng biến đổi khí hậu.
• Tác động kinh tế - xã hội (Socio-economic Benefits): Đậu tương là nguồn protein và lipid thiết yếu cho chế biến thực phẩm và công nghiệp chăn nuôi. Việc chủ động phòng ngừa dịch bệnh khảm lá có tiềm năng bảo vệ 40-80% năng suất mùa vụ, giảm thiểu hàng trăm tỷ đồng thiệt hại do mất mùa tại 7 vùng sinh thái nông nghiệp, đồng thời giảm thiểu việc phun thuốc trừ sâu hóa học diệt rệp, bảo vệ hệ sinh thái đồng ruộng.
• Ý nghĩa quốc tế (Global Relevance): Đóng góp mô hình thực nghiệm về can thiệp RNA đa mục tiêu cho các nước đang phát triển trong khu vực nhiệt đới - nơi có áp lực dịch hại virus quanh năm và hệ sinh thái côn trùng môi giới phức tạp.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học thuật: Tiếp cận quy trình kỹ thuật chuẩn hóa về dòng hóa Gateway, thiết kế cấu trúc ihpRNA, và hệ thống chỉ thị phân tử đánh giá cây chuyển gen; kế thừa các dòng vector pK7GWIWG2(II)-CPi phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo.
• Các Viện nghiên cứu và Trung tâm chọn tạo giống: Sở hữu 24 dòng đậu tương chuyển gen ưu tú (ĐT12, DT2008) mang cấu trúc RNAi làm vật liệu bố mẹ để phát triển các giống thương phẩm kháng bệnh cao sản.
• Doanh nghiệp nông nghiệp và Nông dân: Hưởng lợi trực tiếp từ các giống đậu tương có tính kháng bệnh bền vững, giảm thiểu chi phí bảo vệ thực vật, ổn định năng suất từ 20-40 tạ/ha, nâng cao chất lượng hạt thương phẩm không bị lốm đốm.
• Cơ quan Quản lý Nhà nước: Có thêm cơ sở dữ liệu khoa học thực chứng để hoàn thiện khung pháp lý về an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen thế hệ mới không sinh tổng hợp protein ngoại lai độc hại.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng học thuyết nào?

Luận án đã mở rộng Học thuyết Bất hoạt Gen Sau Phiên mã (PTGS Theory - Baulcombe, 2004) bằng việc chứng minh rằng một đoạn dung hợp nhân tạo chimeric CPi kết hợp từ hai loài Potyvirus riêng biệt (SMV và BYMV) hoàn toàn có thể được tế bào thực vật nhận diện và xử lý đồng thời thành các siRNA chức năng mà không gây ra hiện tượng cạnh tranh cơ chất làm suy giảm hoạt tính của enzyme Dicer.

2. Đổi mới phương pháp luận của luận án có gì ưu việt so với các công bố quốc tế trước đây?

So với nghiên cứu của Furutani và cộng sự (2007) chỉ kháng đơn loài hoặc Bonfim và cộng sự (2007) sử dụng kỹ thuật cắt nối enzyme giới hạn truyền thống dễ gây đột biến cấu trúc kẹp tóc, luận án đã ứng dụng công nghệ tái tổ hợp Gateway định hướng (Karimi et al., 2002) trên vector pK7GWIWG2(II), cho phép lắp ráp chính xác 100% cấu trúc ihpRNA chứa intron đệm, tối đa hóa hiệu suất câm gen trên cả cây mô hình và cây trồng nông nghiệp.

3. Phát hiện bất ngờ nhất trong quá trình thực nghiệm có sự hỗ trợ của dữ liệu là gì?

Mặc dù SMV và BYMV có sự sai khác đáng kể về mặt sinh học và phổ ký chủ, nhưng vùng gen CP phân lập tại miền Bắc Việt Nam (720 bp, mã hóa 240 amino acid) lại sở hữu mức độ bảo thủ nucleotide lên tới >96% so với các chủng Poty-coat core quốc tế. Điều này giải thích tại sao cấu trúc CPi thiết kế nhân tạo có thể tạo ra tính kháng chéo cực kỳ mạnh mẽ trên 19 dòng thuốc lá mô hình C9-1.

4. Luận án có cung cấp quy trình nhân bản thực nghiệm (replication protocol) chi tiết không?

Luận án cung cấp quy trình phân tử chi tiết từ nồng độ hóa chất, chu trình nhiệt PCR (biến tính 94°C/3 phút; 35 chu kỳ: 94°C/1 phút, gắn mồi 57°C/45 giây, kéo dài 72°C; hoàn tất 72°C/5 phút), thành phần đệm ghép nối T4 ligase, đến quy trình tạo tổn thương nách lá mầm bằng vi kim và nuôi cấy chồi trên môi trường chuyên biệt. Mọi phòng thí nghiệm sinh học phân tử đều có thể tái lập chính xác các kết quả này.

5. Chương trình nghị sự nghiên cứu 10 năm tới được phác thảo ra sao?

Lộ trình 10 năm tập trung vào: (i) Đánh giá tính kháng ổn định đến thế hệ T4-T5 của các dòng ĐT12 và DT2008; (ii) Giải mã toàn bộ siRNA profile bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (NGS); (iii) Khảo nghiệm diện hẹp và diện rộng theo quy chuẩn khảo nghiệm sinh vật biến đổi gen quốc gia; (iv) Đăng ký công nhận giống đậu tương chuyển gen kháng virus thương phẩm đầu tiên tại Việt Nam.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS. Lò Thị Mai Thu là công trình khoa học toàn diện, tiên phong và mẫu mực trong lĩnh vực di truyền học và công nghệ sinh học thực vật tại Việt Nam, được đúc kết qua 6 đóng góp cốt lõi:

1. Xác định trình tự phân tử đoạn gen CP dài 720 bp của hai dòng virus SMV (SL1, SL2) bản địa Việt Nam, đăng ký thành công trên GenBank quốc tế với mã số HG965102 và HG965103.
2. Thiết kế và phát triển thành công 2 vector Gateway mang cấu trúc RNAi dạng ihpRNA kháng đơn loài SMV và kháng đồng thời hai loài SMV - BYMV.
3. Tạo ra 19 dòng cây mô hình thuốc lá C9-1 chuyển gen biểu hiện tính kháng đồng thời đối với SMV và BYMV vượt trội so với đối chứng hoang dại.
4. Tối ưu hóa thành công quy trình chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2660 trên mô phân sinh nách lá mầm tổn thương của đậu tương.
5. Tạo được 24 dòng đậu tương chuyển gen T0 ưu tú mang cấu trúc RNAi (5 dòng thuộc giống ĐT12 và 19 dòng thuộc giống chịu hạn DT2008), 100% dương tính với phân tích PCR đặc hiệu.
6. Xác lập cơ sở khoa học và thực tiễn vững chắc cho chiến lược ứng dụng công nghệ RNAi trong chọn tạo giống cây trồng kháng bệnh virus tại Việt Nam, mở ra triển vọng to lớn hướng tới nền nông nghiệp công nghệ cao, bền vững và an toàn sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. BỆNH KHẢM DO VIRUS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 1. Cây đậu tương và bệnh virus ở cây đậu tương Cây đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L. Đậu tương là loại cây trồng quan trọng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị cải tạo đất.

Hạt đậu tương chứa khoảng 40% protein, 20% lipid và chứa nhiều chất quan trọng cho hoạt động sinh lý của cơ thể người và động vật, như: isoflavone, lecithin, tocopherol và saponin. Thêm nữa hạt đậu tương còn chứa nhiều protein chức năng và là nguồn thực phẩm rẻ tiền, có vai trò trong chăm sóc và bảo vệ sức khỏe con người [149], [158]. Các sản phẩm từ đậu tương đã tăng lên đáng kể so với các loại cây trồng khác do nhu cầu về protein và dầu [82]. Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, lấy hạt và thuộc nhóm cây hàng năm.

Rễ của cây đậu tương là loại rễ cọc, gồm rễ chính và các rễ bên. Rễ tập trung ở tầng đất mặt 30 – 40 cm, ăn lan khoảng 20 – 40 cm. Trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm [1]. Thân cây đậu tương ít phân cành, cây thảo, dạng bụi, có hình trụ, nhiều lông, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có khi dạng bò hay nửa bò.

Cành đậu tương mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt mang một lá kép. Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa lưỡng tính, hoa được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa thuộc hoa cánh bướm, mọc thành chùm, có màu tím hay trắng, thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ [1], [2]. Quả đậu tương là loại quả ráp, bên ngoài vỏ quả thường có lớp lông bao phủ, màu sắc vỏ khi chín có màu vàng hoặc xám đen.

Quả thẳng 6 hoặc hơi cong. Mỗi quả thường có từ 1 - 4 hạt nhưng phổ biến là 2 hạt. Hạt đậu tương có nhiều hình dạng như bầu dục, tròn dài, tròn dẹt. Vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen… nhưng đa số là hạt màu vàng.

Khối lượng hạt dao động từ 200 – 400 mg/hạt và khối lượng 1000 hạt dao động trung bình 100-200g. Hình dạng và màu sắc rốn hạt là dấu hiệu đặc trưng cho mỗi giống đậu tương [1], [2]. Với những giá trị kinh tế và giá trị sử dụng, đậu tương được xem là loại cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới, với vị trí đứng thứ tư chỉ sau lúa, ngô và lúa mỳ. Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng từ rất lâu và nhu cầu tiêu thụ đậu tương cũng rất lớn, nên sản xuất đậu tương trong nước đang được chú trọng, diện tích gieo trồng vì thế đã tăng lên đáng kể.

Đậu tương được trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp, ở 28 tỉnh thành trên khắp cả nước, trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam. Cây đậu tương ở nước ta được trồng chủ yếu ở vùng cao, những nơi đất không cần màu mỡ (khoảng 65%) và 35% được trồng ở những vùng đất thấp, ở khu vực đồng bằng sông Hồng. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, từ năm 2008 đến nay, diện tích trồng, năng suất và sản lượng đậu tương không có sự tăng đáng kể so với những năm trước. Nguồn giống đậu tương kháng bệnh và chống chịu cao là một trong các nguyên nhân chính có thể giải thích cho sự phát triển chậm của ngành sản xuất đậu tương ở nước ta.

Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải thiện tính kháng bệnh của cây đậu tương là cách tiếp cận mới, có hiệu quả đối với ngành chọn giống đậu tương hiện nay. Cây đậu tương có thể mắc một số bệnh do vi khuẩn, nấm hoặc virus, như bệnh khảm do SMV hoặc BYMV, bệnh gỉ sắt hại đậu tương do nấm Phakopsora pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) do nấm Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani hoặc Fusarium solani fsp. Phaseoly, bệnh đốm lá vi khuẩn hại đậu tương và một số bệnh hại khác. Thống kê trên thế giới cho thấy có hơn 100 loại virus gây hại 7 trên cây đậu tương.

Bệnh virus đậu tương phân bố rộng khắp và gây thiệt hại lớn đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Tại những nơi bị nhiễm bệnh nặng, năng suất có thể bị giảm đến 50% ở ngoài đồng, mức giảm có thể lên đến 93% - 95% trong điều kiện lây nhiễm trong thí nghiệm [17]. Một số nước có tỷ lệ thiệt hại lớn do bệnh virus ở đậu tương, như vùng Georgia ở Mỹ (37%), Australia và Thái lan (60%), New Zealand và khu vực Bắc Mỹ (40- 50%) [28], [80], [158]. Bệnh khảm đậu tương do virus nhóm khảm (Potyvirus) gây ra.

Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1900 và đến nay virus khảm đậu tương đã có mặt hầu hết ở các vùng trồng đậu tương trên thế giới [80]. Việt Nam cũng đã công bố phát hiện loại virus này từ năm 1994, chủ yếu tập trung ở những vùng trồng đậu tương lớn, như khu vực trung du, miền núi Bắc bộ, khu vực Đồng Bằng Sông Hồng và Tây Nguyên [1], [12]. Các nhà khoa học đã xác định có một số loài virus đặc biệt nguy hiểm, gây hại trên cây đậu tương, trong đó có SMV và BYMV [17], [73]. SMV là loài virus gây bệnh khảm ở cây đậu tương, thuộc nhóm Potyvirus, họ Potyviridae, và là một trong những virus chủ yếu nhất gây bệnh ở đậu tương, bệnh xảy ra trên toàn thế giới [44].

SMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất, thậm chí ở một số trường hợp tổn thất có thể lên đến 94% tổng sản lượng đậu tương. Những cây đậu tương bị nhiễm SMV thường sinh trưởng phát triển chậm, hình thái thân, lá, quả bị biến dạng, và khi bị nhiễm ở giai đoạn muộn sẽ làm giảm sản lượng và chất lượng hạt [85] [86]. Họ Potyviridae được biết đến là có số lượng loài lớn nhất trong các loài virus gây bệnh ở thực vật. Nếu nhiễm Potyvirus và các loài virus khác thì thiệt hại về năng suất và chất lượng hạt đậu tương tăng lên gấp bội [32], [145].

Những cây bị nhiễm Potyvirus cũng dễ bị nhiễm nấm gây bệnh hơn [145]. SMV có thể lây nhiễm qua hạt với tỷ lệ trung bình là 10% và thay đổi theo chủng virus, kiểu gen thực vật và thời gian bị nhiễm [104]. 8 Phản ứng khác biệt của giống về sức đề kháng với SMV được biểu hiện ở hiện tượng cây đậu tương mẫn cảm với bệnh khảm hoặc khảm hệ thống (S), chết hoại (N), và không có triệu chứng hoặc kháng (R). Quan sát này đã được Cho và Goodman (1982) sử dụng để phân loại SMV thành các nhóm, chủng SMV từ G1 đến G7 [49].

BYMV là loài virus cũng thuộc nhóm Potyvirus, có thể tìm thấy ở các cây thuộc họ đậu đỗ (đậu tương, lạc, đậu xanh, đậu đen, …) và một số loài thực vật khác [28], [80]. Khi cây đậu tương nhiễm BYMV sẽ xuất hiện những vết khảm và đường biến vàng ngoằn ngoèo trên bề mặt lá, làm cây không phát triển được và dẫn tới bị chết. Bệnh khảm vàng do BYMV cũng gây thiệt hại đáng kể về năng suất và chất lượng hạt, đặc biệt đối với các cây đậu đỗ, trong đó có đậu tương [137]. Khi cây bị nhiễm BYMV, năng suất hạt đậu tương bị giảm, một số trường hợp có thể giảm tới 74% - 80% [96].

Đối với cây đậu tương, SMV và BYMV có thể nhiễm đồng thời trên cùng một cây và triệu chứng rất khó phân biệt. Ảnh hưởng của việc nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau dẫn tới năng suất đậu tương có thể bị giảm từ 66% - 80% [80], [91]. Bằng các quan sát thực địa nhóm tác giả ở Ukraine đã xác định được triệu chứng nhiễm hai loại SMV và BYMV ở đậu tương vùng Cherkassy, Vinnitsa, Kiev và kết quả đã được xác nhận bằng kính hiển vi điện tử và kỹ thuật ELISA [103]. Trên cơ sở phân tích gen và thiết lập cây phát sinh loài một số tác giả cho rằng BYMV phân lập từ các vùng thuộc Cộng hòa Séc được phân bố ở ba nhóm trên sơ đồ hình cây và không phụ thuộc vào cây chủ [142].

Phản ứng của cây đậu tương đối với SMV và BYMV phụ thuộc vào kiểu gen của giống, chủng virus, tuổi cây, thời gian lây nhiễm, nhiệt độ không khí và các điều kiện môi trường khác [41]. Sự xâm nhập của SMV và BYMV vào tế bào đậu tương SMV và BYMV có thể xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào đậu tương hoặc có thể xâm nhiễm qua môi giới trung gian là rệp. Virus và cơ thể côn trùng có 9 mối quan hệ sinh học với nhau, virus có thể tiềm ẩn một thời gian dài trong cơ thể côn trùng, qua tuyến nước bọt để đi vào hệ thống tiêu hoá thấm qua thành ruột vào máu rồi trở lại tuyến nước bọt. Sau giai đoạn tiềm ẩn, virus được nhân lên trong cơ thể côn trùng và ở thời điểm này côn trùng có khả năng truyền bệnh một cách nhanh chóng.

Tuy nhiên khả năng truyền bệnh của côn trùng cũng có những hạn chế do tuổi của côn trùng thường rất ngắn [12], [13]. SMV có khả năng xâm nhập vào tế bào qua các vết thương nhẹ do cọ xát giữa các cây với nhau, hoặc còn có thể truyền bệnh trong trường hợp hạt phấn bị nhiễm virus rơi vào noãn của cây. SMV di chuyển trong tế bào chất và có thể di chuyển sang tế bào khác thông qua các sợi liên bào. Sau 3 ngày virus mới nhiễm hết một lá đơn, sau 4 ngày thì mới nhiễm hết đoạn gân của lá kép và một phần đoạn thân sát gốc [80], [145].

Sau 5 ngày virus nhiễm hết dọc thân chính và các lá ngọn, khoảng sau 25 ngày virus có thể nhiễm trên toàn bộ cây. Virus có thể nhiễm qua nhân giống vô tính, qua hạt giống, qua phấn hoa, hoặc qua côn trùng [108]. Cách thức truyền virus gây bệnh qua trung gian làm cho cây đậu tương có khả năng nhiễm bệnh rất cao, khi cây trưởng thành có thể bị nhiễm virus từ 90 - 100% ở các mức độ biểu hiện bệnh khác nhau [80], [161]. SMV và BYMV có cấu tạo đơn giản, gồm hai thành phần chính là protein (60 - 95%) và nucleic acid (5 - 40%) [80], [91].

Hệ gen của SMV và BYMV là RNA sợi đơn dương (RNA (+)).