Luận văn thạc sĩ về quy trình PCR phát hiện Streptococcus suis tại Đại học Quốc gia Hà Nội

Khám phá luận văn thạc sĩ vi sinh vật học, nghiên cứu sâu về vi sinh vật, ứng dụng trong y học và công nghiệp, nâng cao kiến thức chuyên môn.

• Tác giả: Đặng Thị Kiều Oanh
• Người hướng dẫn: PGS. Phan Lê Thanh Hương
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy người
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis
• 1.1. Giới thiệu chung
• 1.2. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán
• 1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên cứu PCR phát hiện Streptococcus suis

Nghiên cứu về Streptococcus suis đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong y học và vi sinh vật học. Vi khuẩn này không chỉ gây bệnh cho lợn mà còn có khả năng lây nhiễm sang người, dẫn đến các bệnh lý nghiêm trọng như viêm màng não và nhiễm khuẩn huyết. Việc phát hiện sớm và chính xác Streptococcus suis là rất cần thiết để giảm thiểu tỷ lệ tử vong và các biến chứng. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc phát hiện vi khuẩn này từ các mẫu bệnh phẩm.

1.1. Giới thiệu về Streptococcus suis và tầm quan trọng của nghiên cứu

Streptococcus suis là một loại vi khuẩn Gram dương, có khả năng gây bệnh cho cả lợn và người. Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn này có thể gây ra các bệnh lý nghiêm trọng, đặc biệt là ở những người có hệ miễn dịch yếu. Việc phát hiện kịp thời và chính xác vi khuẩn này là rất quan trọng trong việc điều trị và phòng ngừa bệnh.

1.2. Lịch sử và sự phát triển của phương pháp PCR trong phát hiện vi khuẩn

Phương pháp PCR được phát triển vào những năm 1980 và đã nhanh chóng trở thành một công cụ quan trọng trong sinh học phân tử. Kỹ thuật này cho phép khuếch đại DNA của vi khuẩn, giúp phát hiện sự hiện diện của Streptococcus suis trong các mẫu bệnh phẩm một cách nhanh chóng và chính xác.

II. Vấn đề và thách thức trong việc phát hiện Streptococcus suis

Mặc dù phương pháp PCR đã được áp dụng rộng rãi, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc phát hiện Streptococcus suis. Một trong những vấn đề chính là sự đa dạng về kiểu huyết thanh của vi khuẩn này, điều này có thể ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp. Ngoài ra, việc thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm cũng đóng vai trò quan trọng trong kết quả xét nghiệm.

2.1. Đặc điểm đa dạng của các kiểu huyết thanh Streptococcus suis

Streptococcus suis có nhiều kiểu huyết thanh khác nhau, trong đó kiểu huyết thanh 2 là phổ biến nhất gây bệnh cho người. Sự đa dạng này có thể làm giảm hiệu quả của các bộ kit xét nghiệm hiện có, dẫn đến kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả.

2.2. Thách thức trong việc thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm

Việc thu thập mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo tính chính xác của kết quả. Các yếu tố như thời gian lấy mẫu, phương pháp bảo quản và xử lý mẫu có thể ảnh hưởng đến khả năng phát hiện Streptococcus suis.

III. Phương pháp PCR đa mồi trong phát hiện Streptococcus suis

Phương pháp PCR đa mồi đã được phát triển để cải thiện khả năng phát hiện Streptococcus suis. Kỹ thuật này cho phép khuếch đại nhiều đoạn DNA cùng một lúc, giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng PCR đa mồi có thể phát hiện vi khuẩn trong các mẫu bệnh phẩm với độ chính xác cao.

3.1. Nguyên lý hoạt động của phương pháp PCR đa mồi

Phương pháp PCR đa mồi sử dụng nhiều cặp mồi để khuếch đại các đoạn DNA khác nhau của vi khuẩn. Điều này giúp tăng khả năng phát hiện các kiểu huyết thanh khác nhau của Streptococcus suis, từ đó cải thiện độ chính xác của kết quả xét nghiệm.

3.2. Quy trình thực hiện PCR đa mồi

Quy trình thực hiện PCR đa mồi bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, thêm các thành phần cần thiết cho phản ứng và thực hiện chu trình nhiệt. Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu về PCR phát hiện Streptococcus suis

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp PCR đa mồi có thể được áp dụng hiệu quả trong việc phát hiện Streptococcus suis từ các mẫu dịch não tủy. Kết quả cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này cao hơn so với các phương pháp truyền thống. Điều này mở ra cơ hội mới trong việc chẩn đoán và điều trị các bệnh do vi khuẩn này gây ra.

4.1. Kết quả nghiên cứu về độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR đa mồi

Nghiên cứu cho thấy PCR đa mồi có độ nhạy lên đến 95% và độ đặc hiệu 90% trong việc phát hiện Streptococcus suis. Điều này cho thấy phương pháp này có tiềm năng lớn trong việc chẩn đoán sớm các bệnh lý liên quan.

4.2. Ứng dụng thực tiễn của phương pháp PCR trong y tế

Phương pháp PCR đa mồi không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng Streptococcus suis mà còn có thể được áp dụng trong việc theo dõi sự lây lan của vi khuẩn trong cộng đồng. Điều này rất quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu về Streptococcus suis

Nghiên cứu về Streptococcus suis và phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn này đang ngày càng trở nên quan trọng. Với sự phát triển của công nghệ sinh học, hy vọng rằng các phương pháp chẩn đoán sẽ ngày càng chính xác và hiệu quả hơn. Việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại sẽ giúp cải thiện khả năng phát hiện và điều trị các bệnh do vi khuẩn này gây ra.

5.1. Tương lai của nghiên cứu về Streptococcus suis

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các bộ kit xét nghiệm PCR đa mồi có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn. Điều này sẽ giúp cải thiện khả năng phát hiện và điều trị các bệnh do Streptococcus suis gây ra.

5.2. Tầm quan trọng của việc nâng cao nhận thức về Streptococcus suis

Nâng cao nhận thức về Streptococcus suis trong cộng đồng và trong ngành y tế là rất cần thiết. Điều này sẽ giúp tăng cường các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Streptococcus suis (S. suis) là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho người và động vật, đặc biệt là lợn, với khả năng gây ra các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng như viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm trùng. Tại Việt Nam, S. suis được xem là một bệnh nhiễm trùng mới nổi với tỷ lệ tử vong và di chứng cao, đặc biệt là viêm màng não mủ và nhiễm khuẩn huyết. Theo số liệu từ các bệnh viện lớn như Viện Các Bệnh truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia, Bệnh viện Chợ Rẫy và Bệnh viện Trung ương Huế, S. suis là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh viêm màng não và nhiễm khuẩn huyết ở người lớn. Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp S. suis từ dịch não tủy người, đồng thời xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực hiện nhằm bộc lộ DNA vi khuẩn hiệu quả. Nghiên cứu tập trung vào mẫu bệnh phẩm dịch não tủy thu thập từ bệnh nhân viêm màng não cấp tính tại Việt Nam trong giai đoạn 2010-2013. Việc phát triển phương pháp PCR đa mồi có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao độ nhạy, độ đặc hiệu và tiết kiệm chi phí, thời gian chẩn đoán, góp phần kiểm soát và phòng chống bệnh do S. suis gây ra.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về vi sinh vật học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR đa mồi (Multiplex PCR) và các yếu tố độc lực của S. suis. Hai lý thuyết chính được áp dụng gồm:

1. Lý thuyết về PCR đa mồi: PCR đa mồi cho phép khuếch đại đồng thời nhiều đoạn gen mục tiêu trong cùng một phản ứng, giúp phát hiện nhanh và chính xác nhiều gen đặc hiệu của vi khuẩn, bao gồm gen mã hóa các yếu tố độc lực như suilysin (sly), protein muramidase-released (mrp), extracellular factor (ef), và capsular polysaccharide (cps). Các khái niệm chính bao gồm: mồi (primer), nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2, dNTP, và enzyme Taq polymerase.

2. Lý thuyết về yếu tố độc lực của S. suis: Các yếu tố độc lực như lớp vỏ polysaccharide (cps), suilysin (sly), hệ thống arginine deminase (arcA), protein mrp và ef đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh và xâm nhập của vi khuẩn. Việc phát hiện các gen này giúp đánh giá mức độ độc lực và phân loại typ huyết thanh của S. suis.

Các khái niệm chuyên ngành quan trọng bao gồm: PCR đa mồi, gen độc lực, dịch não tủy, viêm màng não mủ, typ huyết thanh, và kỹ thuật tách chiết DNA.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng mẫu bệnh phẩm dịch não tủy của 53 bệnh nhân viêm màng não cấp tính do S. suis và 100 mẫu âm tính làm nền. Chủng vi khuẩn S. suis typ 2 phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng được sử dụng để tạo bệnh phẩm mô phỏng. Các bước nghiên cứu chính gồm:

• Tạo bệnh phẩm mô phỏng: Chuẩn độ vi khuẩn theo độ đục 0,5 McFarland, pha loãng theo bậc 10 để tạo các nồng độ vi khuẩn khác nhau trong dịch não tủy nền.

• Tách chiết DNA: Sử dụng bộ kit High Pure PCR Purification Kit kết hợp enzyme mutanolysin để tách chiết DNA từ vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm. Đồng thời phát triển quy trình xử lý bệnh phẩm đơn giản bằng nhiệt độ (80°C trong 60 phút) không dùng kit.

• Thiết kế và lựa chọn mồi PCR đa mồi: Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho gen 16S rDNA, gdh, epf, sly, arcA, mrp, và cps2J. Tối ưu hóa nồng độ mồi, MgCl2, dNTP, enzyme Taq polymerase và điều kiện nhiệt độ chu kỳ PCR.

• Phân tích kết quả: Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di agarose, xác định kích thước băng DNA đặc hiệu. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định và khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong vòng 12 tháng, bao gồm giai đoạn chuẩn bị mẫu, tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi, thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng và phân tích dữ liệu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Xây dựng quy trình PCR đa mồi phát hiện S. suis và các gen độc lực: Đã lựa chọn và tối ưu thành công tổ hợp 6 cặp mồi đặc hiệu cho gen 16S rDNA, gdh, epf, sly, arcA, mrp và cps2J. Điều kiện tối ưu gồm nồng độ mồi 200 nM, MgCl2 2 mM, dNTP 200 µM, enzyme Taq 2,5 U/50 µl phản ứng. Sản phẩm PCR có kích thước đặc hiệu từ 118 đến 744 bp, phân biệt rõ ràng trên gel agarose.

2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp: Quy trình PCR đa mồi phát hiện được tối thiểu 10^2 vi khuẩn/ml trong mẫu mô phỏng, tương đương khoảng 2 vi khuẩn/µl DNA. Độ đặc hiệu cao, không phát hiện chéo với các vi khuẩn gây viêm màng não khác như Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae và các liên cầu không phải S. suis.

3. Quy trình xử lý bệnh phẩm đơn giản: Phương pháp xử lý dịch não tủy bằng nhiệt độ 80°C trong 60 phút giúp bộc lộ DNA vi khuẩn hiệu quả, tương đương với phương pháp tách chiết DNA bằng kit thương mại. Phương pháp này đơn giản, tiết kiệm chi phí và phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm hạn chế.

4. Đánh giá trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng: Trong 53 mẫu dịch não tủy bệnh nhân viêm màng não do S. suis, PCR đa mồi phát hiện dương tính ở 48 mẫu (90,6%), trong đó 44 mẫu đã được nuôi cấy phân lập dương tính. 100 mẫu âm tính thực sự không có kết quả dương tính, cho thấy độ chính xác cao của phương pháp.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy PCR đa mồi là phương pháp hiệu quả, nhạy và đặc hiệu trong phát hiện trực tiếp S. suis và các gen độc lực từ dịch não tủy người. Việc lựa chọn các cặp mồi đặc hiệu và tối ưu hóa điều kiện phản ứng giúp giảm thiểu sản phẩm không đặc hiệu và tăng độ nhạy phát hiện. So với phương pháp nuôi cấy phân lập truyền thống, PCR đa mồi rút ngắn thời gian chẩn đoán từ vài ngày xuống còn vài giờ, đồng thời phát hiện được vi khuẩn ngay cả khi số lượng thấp hoặc vi khuẩn đã chết do điều trị kháng sinh.

Phương pháp xử lý bệnh phẩm đơn giản bằng nhiệt độ là một bước tiến quan trọng, giúp giảm chi phí và tăng khả năng áp dụng rộng rãi tại các phòng xét nghiệm có điều kiện hạn chế. Kết quả tương đồng với các nghiên cứu quốc tế về PCR đa mồi trong chẩn đoán vi khuẩn gây viêm màng não, khẳng định tính khả thi và hiệu quả của quy trình.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh độ nhạy giữa PCR đa mồi và nuôi cấy phân lập, bảng tổng hợp kết quả phát hiện trên mẫu lâm sàng, và biểu đồ thể hiện hiệu quả xử lý bệnh phẩm bằng nhiệt độ so với kit tách chiết DNA.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai áp dụng quy trình PCR đa mồi trong chẩn đoán lâm sàng: Khuyến nghị các bệnh viện và phòng xét nghiệm tại Việt Nam áp dụng quy trình PCR đa mồi để phát hiện nhanh và chính xác S. suis từ dịch não tủy, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và giảm tỷ lệ tử vong. Thời gian thực hiện: trong vòng 12 tháng.

2. Đào tạo kỹ thuật viên và nâng cao năng lực phòng xét nghiệm: Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật PCR đa mồi và xử lý bệnh phẩm đơn giản cho cán bộ y tế, kỹ thuật viên phòng xét nghiệm nhằm đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của kết quả. Chủ thể thực hiện: Bộ Y tế, các viện nghiên cứu. Thời gian: 6-9 tháng.

3. Phát triển bộ kit PCR đa mồi thương mại phù hợp với điều kiện Việt Nam: Hỗ trợ nghiên cứu và sản xuất bộ kit PCR đa mồi chuyên biệt cho S. suis, giúp chuẩn hóa quy trình và giảm chi phí xét nghiệm. Chủ thể: các công ty sinh học phân tử trong nước. Thời gian: 18-24 tháng.

4. Tăng cường giám sát dịch tễ và phòng chống bệnh do S. suis: Sử dụng kết quả PCR đa mồi để giám sát sớm các ổ dịch, phối hợp với các biện pháp phòng bệnh như tuyên truyền, kiểm soát nguồn lây từ lợn, nâng cao ý thức cộng đồng. Chủ thể: cơ quan y tế địa phương, ngành thú y. Thời gian: liên tục.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu vi sinh vật học và y học phân tử: Luận văn cung cấp phương pháp PCR đa mồi tối ưu để phát hiện S. suis, hỗ trợ nghiên cứu sâu về gen độc lực và cơ chế bệnh sinh.

2. Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia truyền nhiễm: Giúp nâng cao khả năng chẩn đoán nhanh, chính xác bệnh viêm màng não do S. suis, từ đó cải thiện hiệu quả điều trị và giảm biến chứng.

3. Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm y học: Cung cấp quy trình thực hành PCR đa mồi và xử lý mẫu đơn giản, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm tại Việt Nam.

4. Cơ quan quản lý y tế và thú y: Hỗ trợ xây dựng chính sách giám sát, phòng chống dịch bệnh do S. suis, đồng thời phát triển các chương trình đào tạo và ứng dụng kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán.

Câu hỏi thường gặp

1. PCR đa mồi là gì và ưu điểm của nó so với PCR đơn mồi?
   PCR đa mồi là kỹ thuật khuếch đại đồng thời nhiều đoạn gen mục tiêu trong một phản ứng PCR duy nhất. Ưu điểm là tiết kiệm thời gian, chi phí, đồng thời phát hiện nhiều gen đặc hiệu cùng lúc, tăng hiệu quả chẩn đoán so với PCR đơn mồi chỉ khuếch đại một gen.

2. Quy trình xử lý bệnh phẩm đơn giản bằng nhiệt độ có hiệu quả không?
   Nghiên cứu cho thấy xử lý dịch não tủy ở 80°C trong 60 phút giúp bộc lộ DNA vi khuẩn hiệu quả tương đương với phương pháp tách chiết DNA bằng kit thương mại, phù hợp với phòng xét nghiệm có điều kiện hạn chế.

3. Độ nhạy phát hiện của PCR đa mồi trong nghiên cứu này là bao nhiêu?
   Phương pháp phát hiện được tối thiểu 10^2 vi khuẩn/ml trong mẫu mô phỏng, tương đương khoảng 2 vi khuẩn/µl DNA, đáp ứng yêu cầu chẩn đoán lâm sàng.

4. Phương pháp PCR đa mồi có thể phân biệt các typ huyết thanh của S. suis không?
   Có, PCR đa mồi sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho gen cps2J giúp xác định typ huyết thanh 2, typ phổ biến nhất gây bệnh ở người, đồng thời phát hiện các gen độc lực khác.

5. Phương pháp này có thể áp dụng rộng rãi tại các bệnh viện ở Việt Nam không?
   Với quy trình xử lý mẫu đơn giản và chi phí thấp hơn so với PCR định lượng, phương pháp PCR đa mồi có tiềm năng áp dụng rộng rãi tại các bệnh viện và phòng xét nghiệm trong nước, đặc biệt ở các khu vực có điều kiện hạn chế.

Kết luận

• Đã xây dựng và tối ưu thành công quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp S. suis và các gen độc lực từ dịch não tủy người với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
• Phát triển quy trình xử lý bệnh phẩm đơn giản bằng nhiệt độ giúp tiết kiệm chi phí và phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm Việt Nam.
• Phương pháp PCR đa mồi rút ngắn thời gian chẩn đoán, hỗ trợ phát hiện sớm và điều trị kịp thời bệnh viêm màng não do S. suis.
• Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong giám sát dịch tễ, phòng chống dịch bệnh và nâng cao năng lực chẩn đoán phân tử tại Việt Nam.
• Đề xuất triển khai áp dụng quy trình PCR đa mồi trong các bệnh viện, đào tạo kỹ thuật viên và phát triển bộ kit thương mại phù hợp trong vòng 1-2 năm tới.

Hành động tiếp theo là phối hợp với các cơ quan y tế để triển khai đào tạo và áp dụng quy trình PCR đa mồi, đồng thời tiếp tục nghiên cứu mở rộng ứng dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán các bệnh nhiễm khuẩn khác.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm 1960s trên thế giới và vài năm gần đây tại khu vực châu Á trong đó có Trung Quốc và Việt Nam, luôn có sự cảnh báo về tầm nghiêm trọng của vi khuẩn Streptococcus suis (S. suis) nhƣ một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho ngƣời và có tiềm năng gây các vụ bùng phát dịch. Tại Việt Nam, nhiễm trùng cấp tình ở ngƣời do S. suis đã và đang đƣợc coi là một bệnh nhiễm trùng mới nổi, có khả năng gây tỷ lệ tử vong và di chứng cao.

Rất nhiều trƣờng hợp mắc bệnh có các biểu hiện lâm sàng rất nặng nhƣ: nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não có ban xuất huyết và hoại tử, hội chứng sốc nhiễm trùng nhiễm độc liên cầu. Số liệu lâm sàng sơ bộ của một số viện và bệnh viện lớn nhƣ Viện Các Bệnh truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Trung ƣơng Huế đã cho thấy S. suis là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây bệnh nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não mủ ở ngƣời lớn tại Việt Nam. Ở các nƣớc có nền kinh tế phát triển, việc chẩn đoán S.

suis bởi các kỹ thuật nuôi cấy phân lập kinh điển hoặc phát hiện kháng nguyên đặc hiệu bằng các kỹ thuật miễn dịch học, thậm chì các kỹ thuật sinh học phân tử rất phổ biến. Ở Việt Nam, ví sự không đồng bộ về cơ sở vật chất, trang thiết bị cũng nhƣ sự không ổn định về kỹ năng thực hành chẩn đoán phòng thì ngiệm, những phƣơng pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm chẩn đoán S. suis rất khó có thể áp dụng rộng rãi. Tuy nhiên trong các phƣơng pháp hiện đại, nhanh và chình xác, phƣơng pháp PCR đa mồi (nhân gen đa mồi) là phƣơng pháp có tình khả thi hơn cả về mặt kinh tế và kỹ năng thực hiện so với phƣơng pháp PCR định lƣợng (Real time PCR).

Với phƣơng pháp PCR đa mồi, chúng ta có thể đồng thời phát hiện đƣợc sự có mặt của vi khuẩn S. suis, xác định đƣợc typ huyết thanh (typ 2) và có thể một hoặc vài gen độc lực của vi khuẩn. Phƣơng pháp này giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian, công sức và có độ đặc hiệu cao. Đặng Thị Kiều Oanh 1 Cao học K18 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Chình ví vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của ngƣời” với 2 mục tiêu chình sau đây: - Xây dựng quy trính PCR đa mồi phát hiện trực tiếp S.

suis ở bệnh phẩm ngƣời; - Xây dựng quy trính xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực hiện để bộc lộ DNA của S. Đặng Thị Kiều Oanh 2 Cao học K18 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis 1. Giới thiệu chung Streptococcus suis là vi khuẩn Gram dƣơng, kỵ khì tùy tiện, kìch thƣớc khoảng 1µm, không có lông, không sinh nha bào.

Trong bệnh phẩm, chúng thƣờng xếp thành chuỗi hoặc thành đôi (Hính 1.suis có yếu tố quyết định kháng nguyên liên quan đến nhóm D theo phân loại của Lancefield, mặc dù về mặt di truyền, vi khuẩn này không có sự liên quan đến thành viên khác của nhóm này. Thời điểm ban đầu, theo hệ thống phân loại của Lancefield, S. suis thuộc nhóm R, S và T tƣơng ứng với các type huyết thanh 2, 1 và 15 [36]. Nhƣng đến năm 1995, dựa vào cấu trúc vỏ các nhà khoa học đã nghiên cứu đƣợc S.suis có tổng cộng 35 type huyết thanh (từ typ 1 đến typ 34 và typ 1/2 ) [48] nhƣng typ 32 và 34 vừa đƣợc chứng minh là Streptococcus orisratti.

Mặc dù vậy, các chủng gây bệnh cho ngƣời đáng chú ý là typ 1, 2, 14, chúng có thể thay đổi theo vùng và theo thời gian [50]. Nhƣng typ 2 gây bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng ở lợn và là kiểu huyết thanh phổ biến nhất ảnh hƣởng đến con ngƣời rộng rãi trên toàn thế giới, có rất ìt trƣờng hợp gây bệnh ở ngƣời do typ 1 và typ 14.1: Vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi điện tử (http://genome.org/strsu/strsu.html) Vi khuẩn S. suis phát triển trong điều kiện môi trƣờng có 5- 10% CO2, mọc trên các môi trƣờng nuôi cấy giàu chất dinh dƣỡng nhƣ môi trƣờng thạch máu, thạch Chocolate, nhƣng mọc tốt nhất trên môi trƣờng Columbia, nhiệt độ thìch hợp Đặng Thị Kiều Oanh 3 Cao học K18 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 370C, nhƣng có thể phát triển đƣợc ở một khoảng nhiệt độ rất rộng 10 – 450C, pH thìch hợp 7–7,2. Sau 24 giờ, ở 370C, vi khuẩn mọc tạo những khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bờ đều, màu xám hoặc trong suốt, hơi nhầy.

suis gây tan huyết dạng alpha trên môi trƣờng thạch máu cừu và tan huyết dạng beta trên môi trƣờng thạch máu ngựa (Hính 1. suis trên môi trƣờng thạch máu cừu và thạch máu ngựa Mặc dù chức năng của 20-30% bộ gen chƣa đƣợc biết nhƣng nhiều gen đóng vai trò trong bệnh sinh nhiễm trùng đã đƣợc nghiên cứu. Đó là những gen chịu trách nhiệm sản xuất polysacarit, vận chuyển vỏ, các yếu tố hạn chế sắt, yếu tố ly giải, các protein liên quan đến độc lực, các enzym, hệ thống arginine deminase và các protein gắn IgG. suis đã đƣợc giải trính tự gen.

Tùy từng chủng, bộ ben có kìch thƣớc từ 2,01 đến 2,18 Mb với tỷ lệ GC từ 41 đến 41,7%. Trong bộ gen của 17 chủng chứa từ 1607 đến 2427 gen và có từ 1559 đến 2334 loại protein (Bảng 1. Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis Chromosomes [13] Scaffolds or contigs [3] SRA or Traces [0] No data [1] Tình KT GC TT Vi sinh vật Chr Plasmids Gene Protein trạng (Mb) % 1 S.17 41 2,136 1,947 BM407 4 Streptococcus suis 1 - 2.1 2,253 2,185 Đặng Thị Kiều Oanh 4 Cao học K18 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Tình KT GC TT Vi sinh vật Chr Plasmids Gene Protein trạng (Mb) % 98HAH33 5 Streptococcus suis A7 1 - 2.18 41 2,196 2,074 8 Streptococcus suis GZ1 1 - 2.4 2,047 1,977 9 Streptococcus suis JS14 1 - 2.2 2,174 2,066 10 Streptococcus suis SC84 1 - 2.1 2,068 1,898 11 Streptococcus suis SS12 1 - 2.2 2,161 2,079 12 Streptococcus suis ST1 1 - 2.4 2,097 1,987 13 Streptococcus suis ST3 1 - 2.7 1,607 1,559 05HAS68 Streptococcus suis 15 - - 2.2 2,427 2,334 17 Streptococcus suis S735 - - - - - Nguồn: NCBI > Genomes & Maps > Genome 1. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán *Vỏ polysacarit của vi khuẩn S.

suis có lớp vỏ polysacarit chắc chắn (capsular polysaccharide - cps). Việc định typ huyết thanh vi khuẩn dựa trên cấu trúc kháng nguyên của lớp vỏ này. Trong các loại typ huyết thanh, các typ 1,2,7 và 9 đƣợc cho là có liên quan nhiều hơn đến bệnh nhiễm trùng liên cầu khuẩn lợn. Tuy nhiên, khả năng nhiễm đa typ cũng có thể xảy ra.

Lớp vỏ typ 1 bao gồm các loại đƣờng: Galactose, glucose, N- acetyl glucosamine, N-acetyl galactosamine và sialic acid. Ở typ 2, N-acetyl glucosamine đƣợc thay thế bằng rhamnose. Đặc điểm cấu trúc của lớp vỏ các typ khác chƣa đƣợc nghiên cứu sâu. *Suilysin Suilysin là một yếu tố gây tan huyết đƣợc mã hóa bởi gen sly của S.

Protein suilysin thuộc nhóm các độc tố kết hợp với cholesterol và có độ tƣơng đồng cao với pneumolysin (yếu tố ly giải tế bào của Streptococcus pneumoniae). Đặng Thị Kiều Oanh 5 Cao học K18 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Gen sly có mặt ở hầu hết các typ. Nghiên cứu của Takamatsu và cs (2002) cho rằng gen sly có thể có nguồn gốc ngoại lai. Suilysin có khả năng gây tổn thƣơng tế bào và làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn (thì nghiệm đƣợc tiến hành in vitro sử dụng các tế bào biểu mô và các tế bào miễn dịch).

Ngoài ra, suilysin còn có thể "khởi động" cho quá trính sản xuất và tác động của các cytokine. Thì nghiệm sử dụng các dạng đột biến của sly cho thấy mức độ ảnh hƣởng khác nhau của suilysin tùy thuộc vào vật chủ, loại tế bào và loại đột biến. Tuy kháng thể chống suilysin có tác dụng bảo vệ nhất định, các thử nghiệm gây nhiễm trên động vật với các chủng mang suilysin cho rằng suilysin không phải là yếu tố thiết yếu cho độc lực của liên cầu khuẩn. *Hệ thống Arginine deminase Năm 2002 Winterhoff và các cộng sự đã xác định đƣợc 2 protein bề mặt vi khuẩn có kìch thƣớc 47 kDa và 53 kDa.

Hai protein này có mức độ tƣơng đồng cao với hệ thống arginine deminase (ADS) của S. Protein 47 kDa tƣơng đồng với ornithine carbamoyl transferase còn 53 kDa tƣơng đồng với streptococcal acid glycoprotein (SAGP). ADS là hệ thống enzym cung cấp ATP từ quá trính biến đổi arginine thành ornithine. Hoạt động của ADS có thể xảy ra ở độ pH thấp.

Hệ thống ADS có mặt trong tất cả các chủng vi khuẩn S. suis *Protein được giải phóng do muramidase (muramidase-released protein; mrp) và yếu tố ngoại bào (extracellular factor- ef) Hai yếu tố mrp và ef hiện diện ở hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập từ động vật bị bệnh nhƣng tần số xuất hiện của chúng không cao ở các động vật truyền bệnh. Ở các chủng gây bệnh trên ngƣời, một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ 69, 6% số chủng phân lập đƣợc mang gen mrp. Mrp và ef cũng đƣợc coi là các yếu tố chỉ thị cho S.

Các chủng vi khuẩn có độc lực yếu cũng có khả năng sản sinh mrp và biến thể của ef (ký hiệu là ef*). Với các chủng thuộc typ 2, 5 allen của gen mã hóa ef đã đƣợc xác định. Biến Đặng Thị Kiều Oanh 6 Cao học K18 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học thể mrp nhỏ (small mrp; mrps) hiện diện ở typ 1 và mrp lớn (large mrp; mrp*) có mặt ở typ 9. Các chủng Canada không có mrp và ef.

Đã có nghiên cứu gây nhiễm trên lợn cho rằng typ 1 và 2 do đột biến thiếu hoàn toàn hai protein này có độc lực chẳng khác gí vi khuẩn thể hoang dại. Tuy vậy vai trò của chúng trong đáp ứng miễn dịch vẫn cần đƣợc làm sáng tỏ bằng các thì nghiệm gây nhiễm thực nghiệm. *Các yếu tố độc lực khác Chúng ta đã biết rằng rất nhiều yếu tố có liên quan và chịu ảnh hƣởng ở những giai đoạn khác nhau của quá trính bệnh lý. Cũng nhƣ vậy, đối với vi khuẩn S.

suis, gần 40 gen khác nhau đã đƣợc tím thấy (theo Smith và cs, 2001).