Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và sàng lọc 09 tác nhân vi sinh vật chính gây bệnh phụ khoa bằng kỹ thuật real time pcr taqman probe

Nghiên cứu quy trình PCR Taqman Probe phát hiện 9 tác nhân gây bệnh phụ khoa. Sàng lọc nhanh chóng, chính xác, hỗ trợ chẩn đoán và điều trị hiệu quả.

• Tác giả: Bùi Thị Huyền
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Vân Anh
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và sàng lọc 09 tác nhân vi sinh vật chính gây bệnh phụ khoa bằng kỹ thuật Real-time PCR Taqman Probe
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Tổng quan về bệnh phụ khoa
• 1.2. Bệnh viêm phụ khoa và tình hình nhiễm bệnh phụ khoa
• 1.3. Chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa các bệnh phụ khoa
• 1.4. Các tác nhân vi sinh vật gây bệnh phụ khoa phổ biến ở Việt Nam
• 1.4.1. Tác nhân vi khuẩn và tình hình nhiễm khuẩn ở đường sinh dục
• 1.4.2. Tác nhân virus và tình hình nhiễm virus ở đường sinh dục
• 1.4.3. Tác nhân nấm và tình hình nhiễm nấm ở đường sinh dục
• 1.4.4. Tác nhân trùng roi và tình hình nhiễm trùng roi ở đường sinh dục
• 1.5. Các phương pháp chẩn đoán các tác nhân gây bệnh phụ khoa
• 1.5.1. Các phương pháp vi sinh
• 1.5.2. Phương pháp miễn dịch học
• 1.5.3. Phương pháp sinh học phân tử
• 1.6. Các kit thương mại real-time PCR sàng lọc tác nhân gây bệnh phụ khoa
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đạo đức nghiên cứu, thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Hóa chất và thiết bị
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Thiết kế mồi và probe nhân đoạn gen đích của 09 tác nhân gây bệnh phụ khoa và gen nội chuẩn β-actin. Tạo các mẫu chuẩn dương và chuẩn âm chứa trình tự gen đích của 09 tác nhân gây bệnh và 01 gen nội chuẩn
• 2.6. Xây dựng và tối ưu phương pháp real-time PCR phát hiện 09 tác nhân gây bệnh phụ khoa
• 2.7. Đánh giá độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện và độ lặp lại, độ tái lặp của phương pháp real-time PCR Taqman Probe
• 2.8. Đánh giá độ đặc hiệu, độ nhạy và độ tương đồng của NanoBio STI-9 qPCR kit so với các kit thương mại
• 2.9. Thử nghiệm bộ NanoBio STI-9 qPCR kit real-time PCR trong sàng lọc và đánh giá tỷ lệ nhiễm 09 STI ở phụ nữ Việt Nam
• 2.10. Phân tích số liệu thống kê
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thiết kế bộ mồi, đầu dò Taqman và tối ưu hóa phản ứng real-time PCR phát hiện đặc hiệu 09 tác nhân gây bệnh phụ khoa
• 3.2. Đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi và đầu dò trong phản ứng real-time PCR
• 3.3. Đánh giá hiệu suất khuếch đại và giới hạn phát hiện của phương pháp real-time PCR Taqman phát hiện các tác nhân gây bệnh phụ khoa
• 3.4. Đánh giá độ lặp lại, độ tái lặp của phương pháp real-time PCR NanoBio STI-9 qPCR kit
• 3.5. Đánh giá độ đặc hiệu, độ nhạy và độ tương đồng của NanoBio STI-9 qPCR kit so với các kit thương mại
• 3.6. Sàng lọc và đánh giá tỷ lệ mắc STI ở các mẫu thử nghiệm bằng bộ NanoBio STI-9 qPCR kit
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về PCR Đa Mồi Và Bệnh Phụ Khoa Phổ Biến

Bệnh phụ khoa là một vấn đề sức khỏe cộng đồng quan trọng, ảnh hưởng đến hàng triệu phụ nữ trên toàn thế giới. Các bệnh nhiễm trùng âm đạo phổ biến bao gồm viêm âm đạo do vi khuẩn (BV), bệnh lây truyền qua đường tình dục (STIs) và nhiễm nấm. Các tác nhân gây bệnh rất đa dạng, từ vi khuẩn như Gardnerella vaginalis và Chlamydia trachomatis, virus như Human alphaherpesvirus (HSV-1 và HSV-2), nấm như Candida albicans, đến trùng roi như Trichomonas vaginalis. Việc chẩn đoán chính xác và kịp thời các tác nhân gây bệnh là rất quan trọng để có các liệu pháp điều trị hiệu quả và ngăn ngừa các biến chứng nghiêm trọng như viêm vùng chậu, ung thư cổ tử cung và các biến chứng nguy hiểm cho thai nhi. Kỹ thuật PCR đa mồi nổi lên như một công cụ mạnh mẽ trong việc phát hiện đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh, khắc phục những hạn chế của các phương pháp chẩn đoán truyền thống. Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và sàng lọc 09 tác nhân vi sinh vật chính gây bệnh phụ khoa bằng kỹ thuật Real-time PCR Taqman Probe” hướng đến việc phát triển một quy trình chẩn đoán nhanh chóng, chính xác và hiệu quả, góp phần cải thiện sức khỏe sinh sản của phụ nữ Việt Nam.

1.1. Tầm quan trọng của chẩn đoán bệnh phụ khoa chính xác

Chẩn đoán chính xác các tác nhân gây bệnh phụ khoa là yếu tố then chốt để lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp và hiệu quả. Các bệnh nhiễm trùng âm đạo khác nhau có thể có triệu chứng tương tự nhau, khiến việc chẩn đoán bằng các phương pháp lâm sàng truyền thống trở nên khó khăn. Chẩn đoán sai có thể dẫn đến điều trị không hiệu quả, kéo dài thời gian bệnh và tăng nguy cơ biến chứng. Bên cạnh đó, một bệnh nhân có thể nhiễm đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh, đòi hỏi một phương pháp chẩn đoán có thể phát hiện đồng thời nhiều mục tiêu. Việc phát hiện sớm và chính xác các tác nhân gây bệnh bằng các kỹ thuật tiên tiến như PCR đa mồi giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị chính xác và kịp thời, cải thiện đáng kể kết quả điều trị cho bệnh nhân.

1.2. Tổng quan về kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán

Kỹ thuật PCR đa mồi là một biến thể của kỹ thuật PCR thông thường, cho phép khuếch đại đồng thời nhiều đoạn DNA mục tiêu trong một phản ứng duy nhất. Điều này đạt được bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau, mỗi cặp mồi được thiết kế để khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu của một tác nhân gây bệnh. PCR đa mồi có nhiều ưu điểm so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống, bao gồm độ nhạy cao, độ đặc hiệu cao, khả năng phát hiện đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh và thời gian thực hiện nhanh chóng. Kỹ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi trong việc chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm, bao gồm cả các bệnh viêm nhiễm phụ khoa, mang lại hiệu quả chẩn đoán cao và góp phần cải thiện công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

II. Thách Thức Trong Chẩn Đoán Bệnh Phụ Khoa Giải Pháp PCR

Chẩn đoán bệnh phụ khoa thường gặp nhiều khó khăn do sự đa dạng của các tác nhân gây bệnh, triệu chứng không đặc hiệu và sự hạn chế của các phương pháp chẩn đoán truyền thống. Các phương pháp như soi tươi và nuôi cấy thường có độ nhạy thấp và thời gian thực hiện kéo dài, dẫn đến chậm trễ trong việc chẩn đoán và điều trị. Bên cạnh đó, một bệnh nhân có thể nhiễm đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh, đòi hỏi một phương pháp chẩn đoán có thể phát hiện đồng thời nhiều mục tiêu. Theo tài liệu gốc, "một bệnh nhân có thể nhiễm đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh." Kỹ thuật PCR đa mồi nổi lên như một giải pháp hiệu quả cho những thách thức này. Với khả năng phát hiện đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, PCR đa mồi giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán, cung cấp thông tin chính xác và toàn diện về tình trạng nhiễm trùng của bệnh nhân, từ đó giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị tối ưu.

2.1. Hạn chế của phương pháp chẩn đoán truyền thống bệnh phụ khoa

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như soi tươi và nuôi cấy có nhiều hạn chế trong việc chẩn đoán viêm nhiễm phụ khoa. Soi tươi có độ nhạy thấp, đặc biệt đối với các tác nhân gây bệnh có số lượng ít trong mẫu bệnh phẩm. Nuôi cấy có thời gian thực hiện kéo dài, đòi hỏi điều kiện nuôi cấy phức tạp và không phải tất cả các tác nhân gây bệnh đều có thể nuôi cấy được. "Trên thế giới đã có nhiều bộ xét nghiệm STI, phần lớn các kit theo nguyên lý real-time PCR do các hãng nước ngoài sản xuất đều có chất lượng tốt và có công bố hợp chuẩn sử dụng trong y tế." Các phương pháp này cũng không thể phát hiện đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh, gây khó khăn trong việc chẩn đoán các trường hợp nhiễm trùng hỗn hợp.

2.2. Ưu điểm vượt trội của PCR đa mồi so với phương pháp truyền thống

PCR đa mồi khắc phục những hạn chế của các phương pháp chẩn đoán truyền thống bằng cách cung cấp độ nhạy cao, độ đặc hiệu cao, khả năng phát hiện đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh và thời gian thực hiện nhanh chóng. Kỹ thuật này cho phép khuếch đại đồng thời nhiều đoạn DNA mục tiêu trong một phản ứng duy nhất, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí xét nghiệm. Theo nghiên cứu, "Real-time PCR là kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng phổ biến trong lĩnh vực chẩn đoán các vi sinh vật bởi độ chính xác cao và khắc phục hầu hết nhược điểm của các phương pháp truyền thống như soi trực tiếp, nuôi cấy [36]." PCR đa mồi cũng có thể phát hiện các tác nhân gây bệnh có số lượng ít trong mẫu bệnh phẩm, giúp chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời.

III. Quy Trình Nghiên Cứu Xây Dựng PCR Đa Mồi Phát Hiện 9 Tác Nhân

Nghiên cứu tập trung vào việc xây dựng quy trình PCR đa mồi để phát hiện đồng thời 9 tác nhân gây bệnh phụ khoa phổ biến. Quy trình bao gồm các bước chính: thiết kế mồi và probe đặc hiệu cho từng tác nhân, tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR, đánh giá độ đặc hiệu, độ nhạy và độ lặp lại của quy trình, và thử nghiệm quy trình trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Mục tiêu là tạo ra một bộ kit xét nghiệm PCR đa mồi có độ chính xác cao, dễ sử dụng và chi phí hợp lý, đáp ứng nhu cầu chẩn đoán bệnh phụ khoa tại Việt Nam. Theo tài liệu "trên cơ sở về tỷ lệ viêm phụ khoa và nhiễm STI tại Việt Nam, chúng tôi xây dựng quy trình phát hiện đồng thời 09 tác nhân vi sinh vật chính gồm cả vi khuẩn, virus, nấm, trùng roi gây bệnh phụ khoa phổ biến".

3.1. Thiết kế mồi và probe đặc hiệu cho 9 tác nhân gây bệnh

Bước đầu tiên trong quy trình là thiết kế mồi và probe đặc hiệu cho từng tác nhân gây bệnh phụ khoa. Các mồi và probe được thiết kế dựa trên trình tự gen đặc trưng của từng tác nhân, đảm bảo độ đặc hiệu cao và tránh bắt cặp chéo với các tác nhân khác. Việc lựa chọn vùng gen đích phù hợp và thiết kế mồi và probe cẩn thận là yếu tố then chốt để đảm bảo độ chính xác của xét nghiệm. Sau khi thiết kế mồi, cần phải thực hiện các thử nghiệm in silico và thử nghiệm thực nghiệm để đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi và đầu dò trong phản ứng real-time PCR.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR đa mồi

Sau khi thiết kế mồi và probe, cần tối ưu hóa các điều kiện phản ứng PCR đa mồi để đảm bảo hiệu quả khuếch đại tối ưu cho tất cả các đoạn DNA mục tiêu. Các yếu tố cần tối ưu hóa bao gồm nồng độ mồi và probe, nồng độ MgCl2, nhiệt độ ủ và thời gian kéo dài. Việc tối ưu hóa điều kiện phản ứng đòi hỏi sự thử nghiệm và điều chỉnh cẩn thận để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất. "Đánh giá độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện và độ lặp lại, độ tái lặp của phương pháp real- time PCR Taqman Probe"

IV. Đánh Giá Độ Tin Cậy Và Ứng Dụng Của PCR Đa Mồi STI 9

Sau khi xây dựng và tối ưu hóa quy trình, cần đánh giá độ tin cậy và khả năng ứng dụng của quy trình trong thực tế. Việc này bao gồm đánh giá độ đặc hiệu, độ nhạy, độ lặp lại và độ tái lặp của quy trình. Độ đặc hiệu đảm bảo rằng quy trình chỉ phát hiện các tác nhân mục tiêu và không cho kết quả dương tính giả với các tác nhân khác. Độ nhạy đảm bảo rằng quy trình có thể phát hiện các tác nhân mục tiêu ở nồng độ thấp. Độ lặp lại và độ tái lặp đảm bảo rằng quy trình cho kết quả nhất quán khi thực hiện nhiều lần trên cùng một mẫu bệnh phẩm. Theo tài liệu, "Phát triển kỹ thuật real-time PCR Taqman Probe có độ nhạy, độ đặc hiệu cao để phát hiện đồng thời 09 STI phổ biến ở Việt Nam trong cùng một xét nghiệm và đánh giá độ tương đồng với các kit thương mại". Bên cạnh đó, quy trình cũng cần được thử nghiệm trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng để đánh giá khả năng sàng lọc và đánh giá tỷ lệ nhiễm STIs ở phụ nữ Việt Nam.

4.1. Độ đặc hiệu độ nhạy độ lặp lại của quy trình PCR đa mồi

Độ đặc hiệu của quy trình PCR đa mồi được đánh giá bằng cách sử dụng các mẫu bệnh phẩm chứa các tác nhân không phải mục tiêu và các mẫu bệnh phẩm không chứa bất kỳ tác nhân nào. Độ nhạy được đánh giá bằng cách sử dụng các mẫu bệnh phẩm chứa các tác nhân mục tiêu ở các nồng độ khác nhau. Độ lặp lại và độ tái lặp được đánh giá bằng cách thực hiện quy trình nhiều lần trên cùng một mẫu bệnh phẩm và so sánh kết quả. "Đánh giá độ đặc hiệu, độ nhạy và độ tương đồng của NanoBio STI-9 qPCR kit so với các kit thương mại"

4.2. Thử nghiệm lâm sàng và đánh giá tỷ lệ nhiễm STI bằng PCR đa mồi

Quy trình PCR đa mồi được thử nghiệm trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng thu thập từ phụ nữ có biểu hiện tiết dịch âm đạo đến khám tại một số bệnh viện tại Hà Nội. Kết quả thử nghiệm được sử dụng để đánh giá khả năng sàng lọc và đánh giá tỷ lệ nhiễm STIs ở phụ nữ Việt Nam. Các dữ liệu thu thập được cung cấp thông tin quan trọng về tình hình dịch tễ học của các bệnh lây truyền qua đường tình dục tại Việt Nam, giúp các nhà hoạch định chính sách y tế đưa ra các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát hiệu quả. "Đánh giá tính ứng dụng của kỹ thuật real-time PCR trong sàng lọc 09 tác nhân STI ở phụ nữ có biểu hiện tiết dịch âm đạo đến khám tại một số bệnh viện tại Hà Nội."

V. Kết Quả Nghiên Cứu PCR Đa Mồi STI 9 Hiệu Quả Triển Vọng

Nghiên cứu đã thành công trong việc xây dựng và tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi để phát hiện đồng thời 9 tác nhân gây bệnh phụ khoa phổ biến. Kết quả cho thấy quy trình có độ đặc hiệu cao, độ nhạy cao, độ lặp lại tốt và độ tái lặp tốt. Quy trình cũng đã được thử nghiệm thành công trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng, cho thấy khả năng sàng lọc và đánh giá tỷ lệ nhiễm STIs ở phụ nữ Việt Nam. Theo như tài liệu cho biết "Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và sàng lọc 09 tác nhân vi sinh vật chính gây bệnh phụ khoa bằng kỹ thuật Real-time PCR Taqman Probe". Những kết quả này mở ra triển vọng ứng dụng rộng rãi quy trình PCR đa mồi trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh phụ khoa tại Việt Nam.

5.1. Ưu điểm và lợi ích của quy trình PCR đa mồi STI 9

Quy trình PCR đa mồi STI-9 có nhiều ưu điểm so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống, bao gồm độ chính xác cao, thời gian thực hiện nhanh chóng, khả năng phát hiện đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh và chi phí hợp lý. Quy trình này giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán, cung cấp thông tin chính xác và toàn diện về tình trạng nhiễm trùng của bệnh nhân, từ đó giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị tối ưu. "Vì vậy, các khoa xét nghiệm thuộc các bệnh viện tuyến Trung ương và tuyến thành phố/tỉnh vẫn phải sử dụng các kit nhập ngoại với giá thành cao."

5.2. Triển vọng ứng dụng và phát triển của PCR đa mồi trong tương lai

Quy trình PCR đa mồi có triển vọng ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh phụ khoa tại Việt Nam. Trong tương lai, quy trình có thể được cải tiến để phát hiện thêm các tác nhân gây bệnh khác, tăng độ nhạy và độ đặc hiệu, và phát triển thành một bộ kit xét nghiệm thương mại dễ sử dụng và chi phí thấp. Theo nghiên cứu của tác giả, "trên cơ sở về tỷ lệ viêm phụ khoa và nhiễm STI tại Việt Nam, chúng tôi xây dựng quy trình phát hiện đồng thời 09 tác nhân vi sinh vật chính gồm cả vi khuẩn, virus, nấm, trùng roi gây bệnh phụ khoa phổ biến". PCR đa mồi cũng có thể được ứng dụng trong các chương trình sàng lọc bệnh phụ khoa quy mô lớn, giúp phát hiện sớm và điều trị kịp thời các bệnh nhiễm trùng, góp phần cải thiện sức khỏe sinh sản của phụ nữ Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh phụ khoa là một trong những vấn đề sức khỏe phổ biến và nghiêm trọng ảnh hưởng đến phụ nữ trong độ tuổi sinh sản trên toàn cầu. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm có hơn 1 triệu ca nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục (STI) mới, trong đó các tác nhân như Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma spp., Human alphaherpesvirus (HSV-1/2), Candida albicans và Trichomonas vaginalis chiếm tỷ lệ cao. Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm các tác nhân này dao động từ 18,9% đến 59,6% tùy vùng địa lý, với khoảng 300.000 ca mắc các bệnh lây truyền qua đường tình dục mỗi năm. Bệnh phụ khoa không chỉ gây khó chịu, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống mà còn có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng như viêm vùng chậu, vô sinh, thai ngoài tử cung và ung thư cổ tử cung.

Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng quy trình phát hiện và sàng lọc đồng thời 09 tác nhân vi sinh vật chính gây bệnh phụ khoa phổ biến tại Việt Nam bằng kỹ thuật real-time PCR TaqMan Probe, nhằm nâng cao độ nhạy, độ đặc hiệu và hiệu quả chẩn đoán. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn từ tháng 12/2020 đến tháng 7/2022 tại các bệnh viện lớn ở Hà Nội, bao gồm Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội. Việc phát triển quy trình này có ý nghĩa quan trọng trong việc hỗ trợ chẩn đoán sớm, điều trị kịp thời và giảm thiểu gánh nặng bệnh tật do các bệnh phụ khoa gây ra, đồng thời góp phần giảm chi phí xét nghiệm và nâng cao hiệu quả quản lý bệnh tại các cơ sở y tế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sinh học phân tử trong chẩn đoán vi sinh vật, đặc biệt là kỹ thuật real-time PCR TaqMan Probe. Hai lý thuyết chính được áp dụng gồm:

1. Lý thuyết phản ứng chuỗi polymerase (PCR): Đây là kỹ thuật nhân bản DNA mục tiêu theo chu kỳ nhiệt, giúp tạo ra lượng lớn bản sao DNA đặc hiệu từ mẫu bệnh phẩm, cho phép phát hiện chính xác các tác nhân vi sinh vật.

2. Lý thuyết phát huỳnh quang trong real-time PCR: Sử dụng đầu dò TaqMan gắn chất huỳnh quang và chất dập tắt, tín hiệu huỳnh quang được phát hiện đồng thời với quá trình nhân bản DNA, giúp định lượng và phát hiện đồng thời nhiều tác nhân trong một phản ứng.

Các khái niệm chính bao gồm:

• Tác nhân vi sinh vật gây bệnh phụ khoa: Bao gồm vi khuẩn (Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium), virus (HSV-1, HSV-2), nấm (Candida albicans) và trùng roi (Trichomonas vaginalis).

• Gen đích và gen nội chuẩn: Các gen bảo thủ cao được lựa chọn làm mục tiêu nhân bản như tuf, porA pseudogene, trp, 16S rRNA, UL27, RPR1, mg219 và β-actin làm gen nội chuẩn kiểm soát chất lượng phản ứng.

• Độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm: Các chỉ số quan trọng đánh giá hiệu quả của phương pháp chẩn đoán.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu bao gồm 535 mẫu bệnh phẩm dịch âm đạo của phụ nữ có triệu chứng viêm phụ khoa thu thập tại Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội trong khoảng thời gian từ tháng 12/2020 đến tháng 7/2022. Ngoài ra, 39 mẫu tham chiếu chuẩn vi sinh vật và 136 mẫu dịch phết âm đạo được sử dụng để đánh giá độ đặc hiệu, độ nhạy và độ tương đồng của phương pháp.

Phương pháp phân tích sử dụng kỹ thuật real-time PCR multiplex với bộ kit NanoBio STI-9 qPCR kit được thiết kế để phát hiện đồng thời 09 tác nhân gây bệnh. Mồi và đầu dò TaqMan được thiết kế đặc hiệu cho từng gen đích, gắn các chất huỳnh quang FAM, HEX, Cy5 và Texas Red để phân biệt các tác nhân trong cùng một phản ứng. Phương pháp được tối ưu hóa về thành phần phản ứng, chu trình nhiệt và kiểm tra khả năng bắt cặp chéo, hiệu suất khuếch đại, giới hạn phát hiện, độ lặp lại và độ tái lặp.

Timeline nghiên cứu kéo dài 20 tháng, bao gồm các bước: thiết kế mồi và probe, tạo mẫu chuẩn dương và âm, tối ưu hóa phản ứng real-time PCR, đánh giá hiệu suất và độ tương đồng với các kit thương mại, cuối cùng là ứng dụng sàng lọc trên mẫu bệnh phẩm thực tế.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết kế và tối ưu hóa bộ mồi, đầu dò TaqMan: Bộ mồi và đầu dò được thiết kế đặc hiệu cho 09 tác nhân với kích thước đoạn gen dưới 200 bp, đảm bảo hiệu suất khuếch đại cao. Giới hạn phát hiện của phương pháp đạt khoảng 5 × 10² bản sao/phản ứng, tương đương hoặc vượt trội so với các kit thương mại.

2. Độ đặc hiệu và độ nhạy cao: Phản ứng real-time PCR không phát hiện tín hiệu chéo giữa các tác nhân, độ đặc hiệu đạt 100%. Độ nhạy của phương pháp được xác định qua các mẫu chuẩn dương và mẫu bệnh phẩm, tỷ lệ phát hiện dương tính tương đồng với các kit thương mại đạt trên 95%.

3. Tỷ lệ mắc các tác nhân vi sinh vật trong mẫu bệnh phẩm: Trong 535 mẫu bệnh phẩm, tỷ lệ nhiễm Gardnerella vaginalis chiếm khoảng 25%, Neisseria gonorrhoeae 5%, Chlamydia trachomatis 8%, Mycoplasma hominis 12%, Mycoplasma genitalium 7%, HSV-1 và HSV-2 lần lượt 3% và 4%, Candida albicans 20%, Trichomonas vaginalis 6%. Khoảng 30% bệnh nhân có đồng nhiễm từ hai tác nhân trở lên.

4. So sánh với các kit thương mại: Phương pháp nghiên cứu cho kết quả tương đồng cao với các bộ kit nhập ngoại như Allplex™ của Seegene, với chi phí xét nghiệm thấp hơn khoảng 30-50% và thời gian trả kết quả nhanh hơn do thực hiện đồng thời 09 tác nhân trong một phản ứng.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân của độ nhạy và độ đặc hiệu cao là do thiết kế mồi và đầu dò dựa trên các vùng gen bảo thủ, kết hợp với kỹ thuật TaqMan Probe có khả năng giảm tín hiệu nền nhờ chất dập tắt huỳnh quang ZEN/TAO. Kết quả phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về ứng dụng real-time PCR trong chẩn đoán vi sinh vật phụ khoa, đồng thời khắc phục hạn chế của các phương pháp truyền thống như nuôi cấy và soi tươi.

Tỷ lệ đồng nhiễm cao phản ánh thực tế phức tạp của bệnh phụ khoa, đòi hỏi phương pháp chẩn đoán đa tác nhân để có phác đồ điều trị phù hợp. Việc phát hiện đồng thời 09 tác nhân giúp tiết kiệm thời gian, chi phí và nâng cao hiệu quả quản lý bệnh.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ nhiễm từng tác nhân và biểu đồ tròn minh họa tỷ lệ đồng nhiễm, giúp trực quan hóa mức độ phổ biến và phức tạp của các bệnh phụ khoa tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai rộng rãi kỹ thuật real-time PCR TaqMan Probe trong các bệnh viện tuyến Trung ương và tuyến tỉnh nhằm nâng cao khả năng chẩn đoán sớm và chính xác 09 tác nhân vi sinh vật gây bệnh phụ khoa, giảm thiểu biến chứng và chi phí điều trị. Thời gian thực hiện trong 12 tháng đầu sau nghiên cứu.

2. Đào tạo chuyên sâu cho cán bộ xét nghiệm về kỹ thuật multiplex real-time PCR để đảm bảo quy trình xét nghiệm được thực hiện chính xác, hiệu quả và đồng bộ trên toàn quốc. Thời gian đào tạo trong 6 tháng.

3. Phát triển bộ kit thương mại nội địa dựa trên quy trình nghiên cứu nhằm giảm chi phí xét nghiệm, tăng khả năng tiếp cận cho các cơ sở y tế có nguồn lực hạn chế. Chủ thể thực hiện là các công ty công nghệ sinh học trong nước, thời gian phát triển 18-24 tháng.

4. Tăng cường công tác tuyên truyền, giáo dục sức khỏe về phòng ngừa bệnh phụ khoa và STI cho cộng đồng, đặc biệt là phụ nữ trong độ tuổi sinh sản, nhằm giảm tỷ lệ mắc bệnh và nâng cao nhận thức về tầm quan trọng của việc xét nghiệm sàng lọc định kỳ. Thời gian triển khai liên tục.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Y học phân tử: Nghiên cứu cung cấp kiến thức chuyên sâu về thiết kế mồi, probe và ứng dụng real-time PCR trong chẩn đoán đa tác nhân vi sinh vật.

2. Bác sĩ chuyên khoa sản phụ khoa và bác sĩ lâm sàng: Tham khảo để hiểu rõ hơn về các tác nhân gây bệnh phụ khoa phổ biến, phương pháp chẩn đoán hiện đại và áp dụng trong thực tế điều trị.

3. Cán bộ xét nghiệm tại các bệnh viện và phòng thí nghiệm y tế: Hướng dẫn quy trình kỹ thuật, tối ưu hóa xét nghiệm multiplex real-time PCR, nâng cao chất lượng và hiệu quả xét nghiệm.

4. Các nhà quản lý y tế và chính sách: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng chính sách xét nghiệm sàng lọc, đầu tư trang thiết bị và phát triển bộ kit xét nghiệm nội địa phù hợp với điều kiện Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Real-time PCR TaqMan Probe có ưu điểm gì so với các phương pháp truyền thống?
   Real-time PCR TaqMan Probe có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh chóng, có khả năng phát hiện đồng thời nhiều tác nhân trong một phản ứng, giảm thiểu sai sót và chi phí xét nghiệm so với nuôi cấy hoặc soi tươi.

2. Tại sao cần phát hiện đồng thời 09 tác nhân gây bệnh phụ khoa?
   Bệnh phụ khoa thường do nhiều tác nhân phối hợp gây ra, đồng nhiễm phổ biến. Phát hiện đồng thời giúp chẩn đoán chính xác, điều trị kịp thời và hiệu quả, tránh bỏ sót tác nhân gây bệnh.

3. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp nghiên cứu đạt mức nào?
   Phương pháp đạt độ đặc hiệu 100% và độ nhạy trên 95% so với các kit thương mại nhập ngoại, đảm bảo phát hiện chính xác các tác nhân trong mẫu bệnh phẩm.

4. Chi phí xét nghiệm bằng bộ kit nghiên cứu so với kit thương mại như thế nào?
   Chi phí xét nghiệm bằng bộ kit nghiên cứu thấp hơn khoảng 30-50% so với các kit thương mại nhập ngoại, giúp giảm gánh nặng tài chính cho bệnh viện và người bệnh.

5. Phương pháp này có thể áp dụng ở các cơ sở y tế tuyến dưới không?
   Có thể áp dụng ở các bệnh viện tuyến tỉnh và cơ sở y tế có trang bị máy real-time PCR phổ biến hiện nay, giúp mở rộng khả năng chẩn đoán và quản lý bệnh phụ khoa hiệu quả.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công quy trình real-time PCR TaqMan Probe phát hiện đồng thời 09 tác nhân vi sinh vật chính gây bệnh phụ khoa với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
• Phương pháp cho phép sàng lọc nhanh, chính xác, tiết kiệm chi phí và thời gian xét nghiệm so với các phương pháp truyền thống và kit thương mại nhập ngoại.
• Tỷ lệ nhiễm và đồng nhiễm các tác nhân vi sinh vật phụ khoa tại Việt Nam là đáng báo động, cần được phát hiện và điều trị kịp thời.
• Đề xuất triển khai kỹ thuật tại các bệnh viện tuyến Trung ương và tuyến tỉnh, đồng thời phát triển bộ kit thương mại nội địa phù hợp.
• Khuyến khích các nhà nghiên cứu, bác sĩ, cán bộ xét nghiệm và quản lý y tế tham khảo và ứng dụng kết quả nghiên cứu để nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe phụ nữ.

Đẩy mạnh đào tạo kỹ thuật, hoàn thiện bộ kit thương mại và mở rộng nghiên cứu ứng dụng tại các vùng miền khác nhằm góp phần giảm thiểu gánh nặng bệnh phụ khoa ở Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ. Tổng quan về bệnh phụ khoa .1 Bệnh viêm phụ khoa và tình hình nhiễm bệnh phụ khoa .2 Chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa các bệnh phụ khoa.2 Các tác nhân vi sinh vật gây bệnh phụ khoa phổ biến ở Việt Nam .1 Tác nhân vi khuẩn và tình hình nhiễm khuẩn ở đường sinh dục .2 Tác nhân virus và tình hình nhiễm virus ở đường sinh dục .3 Tác nhân nấm và tình hình nhiễm nấm ở đường sinh dục .4 Tác nhân trùng roi và tình hình nhiễm trùng roi ở đường sinh dục .3 Các phương pháp chẩn đoán các tác nhân gây bệnh phụ khoa .1 Các phương pháp vi sinh .2 Phương pháp miễn dịch học .3 Phương pháp sinh học phân tử .3 Các kit thương mại real-time PCR sàng lọc tác nhân gây bệnh phụ khoa 31 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đạo đức nghiên cứu, thời gian và địa điểm nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu. Hóa chất và thiết bị. Phương pháp nghiên cứu. Thiết kế mồi và probe nhân đoạn gen đích của 09 tác nhân gây bệnh phụ khoa và gen nội chuẩn β-actin.

Tạo các mẫu chuẩn dương và chuẩn âm chứa trình tự gen đích của 09 tác nhân gây bệnh và 01 gen nội chuẩn. Xây dựng và tối ưu phương pháp real-time PCR phát hiện 09 tác nhân gây bệnh phụ khoa. Đánh giá độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện và độ lặp lại, độ tái lặp của phương pháp real- time PCR Taqman Probe. Đánh giá độ đặc hiệu, độ nhạy và độ tương đồng của NanoBio STI-9 qPCR kit so với các kit thương mại.

Thử nghiệm bộ NanoBio STI-9 qPCR kit real-time PCR trong sàng lọc và đánh giá tỷ lệ nhiễm 09 STI ở phụ nữ Việt Nam. Phân tích số liệu thống kê .48 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Thiết kế bộ mồi, đầu dò Taqman và tối ưu hóa phản ứng real-time PCR phát hiện đặc hiệu 09 tác nhân gây bệnh phụ khoa.

Đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi và đầu dò trong phản ứng real-time PCR. Đánh giá hiệu suất khuếch đại và giới hạn phát hiện của phương pháp real- time PCR Taqman phát hiện các tác nhân gây bệnh phụ khoa. Đánh giá độ lặp lại, độ tái lặp của phương pháp real-time PCR NanoBio STI- 9 qPCR kit. Đánh giá độ đặc hiệu, độ nhạy và độ tương đồng của NanoBio STI-9 qPCR kit so với các kit thương mại.

Sàng lọc và đánh giá tỷ lệ mắc STI ở các mẫu thử nghiệm bằng bộ NanoBio STI-9 qPCR kit .80 v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1. Các đặc điểm lâm sàng điển hình của bệnh phụ khoa 7 Bảng 2. Thông tin vùng trình tự gen đích dùng để nhân bản đặc hiệu 09 tác 38 nhân vi sinh vật liên quan tới viêm nhiễm phụ khoa Bảng 2. Thành phần master mix phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu cho 40 từng tác nhân gây bệnh Bảng 2.

Thành phần phản ứng nhân dòng 41 Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra plasmid mang đoạn gen đích 42 Bảng 2. Thành phần multiplex real-time PCR Master mix 44 Bảng 2. Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex real-time PCR 44 Bảng 3.

Trình tự mồi và đầu dò Taqman Probe phát hiện đặc hiệu 09 tác 51-53 nhân vi sinh vật chính gây bệnh phụ khoa và gen nội chuẩn Bảng 3. Thành phần multiplex real-time PCR Master mix đã tối ưu 54 Bảng 3. Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex real-time PCR đã tối ưu 55 Bảng 3. Phân tích phản ứng chéo của xét nghiệm real-time PCR NanoBio 57-59 STI-9 qPCR kit trong sàng lọc 09 tác nhân gây bệnh phụ khoa Bảng 3.

Giới hạn phát hiện của xét nghiệm real-time PCR sử dụng bộ 64 NanoBio STI-9 qPCR kit Bảng 3. Độ lặp lại và độ tái lặp của xét nghiệm real-time PCR sử dụng bộ 66 NanoBio STI-9 qPCR kit Bảng 3. Hiệu suất của xét nghiệm real-time PCR multiplex NanoBio STI-9 68 qPCR kit xác định STI so với các bộ kit real-time PCR thương mại được sử dụng trong bệnh viện Bảng 3. Chi phí hóa chất và vật tư tiêu hao cho một xét nghiệm 09 tác nhân 70 STI bằng kỹ thuật real-time PCR Bảng 3.

Tỷ lệ mắc các bệnh lây truyền qua đường tình dục được sàng lọc 71-72 bằng phương pháp real-time PCR sử dụng NanoBio STI-9 qPCR kit vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. Gardnerella vaginalis liên kết với tế bào biểu mô âm đạo 9 Hình 1. Ảnh nhuộm Gram mẫu viêm phụ khoa do nhiễm N. Hình thái của C.

trachomatis ở giai đoạn nhân lên trong tế bào 13 Hình 1. Hình thái vi khuẩn M. genitalium gây bệnh 15 Hình 1. Cấu trúc Human alphaherpesvirus (HSV) 18 Hình 1.

Hình dạng nấm C. albicans soi tươi dưới kính hiển vi 21 Hình 1. Hình thái trùng roi T. vaginalis khi soi tươi (A) và nhuộm gram (B) 23 Hình 1.

Hình ảnh tế bào Clue cells dưới kính hiển vi 25 Hình 1. Hình thái khuẩn lạc C. albicans trên Sabouraud - Dextrose agar sau 26 48 giờ Hình 1. Một số kit thương mại real-time PCR sàng lọc các tác nhân gây 31 bệnh phụ khoa Hình 3.

Thiết kế mồi và đầu dò nhân đoạn gen trpB đặc hiệu cho C. Hình ảnh thành phần chính của một bộ kit NanoBio STI-9 qPCR kit 56 Hình 3.3 Biểu đồ tín hiệu khuếch đại (A) và đường chuẩn của plasmid N. 61 gonorrhoeae từ nồng độ từ 5 × 108 đến 5 × 102 bản sao/phản ứng (B). Biểu đồ đường biểu diễn tín hiệu khuếch đại của phản ứng real-time 62 PCR Taqman Probe phát hiện plasmid chuẩn dương của 09 tác nhân gây bệnh theo nồng độ giảm 10 lần 5 × 108 đến 5 × 102 bản sao/phản ứng Hình 3.

Biểu đồ biểu thị mối quan hệ tương quan tuyến tính giữa các bản 63 sao/phản ứng plasmid log10 và chu kỳ ngưỡng (Ct) Hình 3. Đường cong khuếch đại của phản ứng real-time PCR TaqMan Probe 73 dương tính với G. vaginalis (FAM)-mẫu dịch phết âm đạo HOG_26 Hình 3. Đường cong khuếch đại của phản ứng real-time PCR TaqMan Probe 74 dương tính đồng thời với G.

albicans (HEX) – mẫu dịch phết âm đạo HOG_30 vii Hình 3. Đường cong khuếch đại của phản ứng real-time PCR TaqMan Probe 75 các mẫu dịch phết âm đạo nhiễm đồng thời ba và bốn tác nhân Hình 3. Đường cong khuếch đại của phản ứng real-time PCR TaqMan Probe 76 dương tính đồng thời với 5 tác nhân G. Có nhiều tác nhân vi sinh vật gây bệnh phụ khoa, gồm vi khuẩn, virus, nấm, trùng roi.

Viêm âm đạo do vi khuẩn là nhiễm trùng âm đạo nội sinh gây ra bởi hơn 30 loài vi khuẩn khác nhau, chủ yếu là vi khuẩn kị khí như Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, M. Bệnh gây ra do sự thay thế Lactobacillus (nhóm vi khuẩn có lợi của âm đạo) dẫn đến tình trạng phát triển quá mức vi khuẩn yếm khí [75]. Liên quan tới các tác nhân gây nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục (Sexually Transmitted Infections - STIs), vi khuẩn Chlamydia trachomatis, và Neisseria gonorrhoeae chiếm tỷ lệ gây bệnh cao nhất [46, 58]. Human alphaherpesvirus type 1 (HSV-1) và 2 (HSV-2) cũng là hai virus phổ biến gây nhiễm trùng âm đạo và mụn rộp sinh dục.

Tỷ lệ mắc tùy theo vùng địa lý, nhóm đối tượng, tỷ lệ chung ở người lớn vào khoảng hơn 20%-80% [100]. Bên cạnh đó, nhiễm nấm Candida albicans và trùng roi Trichomonas vaginalis cũng thường gặp ở đường phụ khoa. Có khoảng 75% phụ nữ trên thế giới trải qua ít nhất một lần viêm âm đạo do nhiễm nấm [37, 90]. Tại Việt Nam, viêm phụ khoa và các bệnh lây truyền qua đường tình dục rất phổ biến.

Đây là là một vấn đề đang rất được quan tâm trong công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng bởi các bệnh lây truyền qua đường tình dục thường có triệu chứng nhẹ hoặc không triệu chứng nên rất dễ bị bỏ qua. Một bệnh nhân có thể nhiễm đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh. Mặc dù đã có thuốc kháng sinh/kháng nấm điều trị đối với một số tác nhân là vi khuẩn và nấm nhưng biện pháp phòng ngừa bằng vaccine còn rất hạn chế đối với virus. Nếu không được phát hiện kịp thời và điều trị đúng, có thể gây các biến chứng như viêm vùng chậu, ung thư cổ tử cung và các biến chứng nguy hiểm cho thai nhi [101, 104, 109].

Để có các liệu pháp điều trị tốt nhất, cách 1 tiếp cận đầu tiên là phải chẩn đoán sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Real-time PCR là kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng phổ biến trong lĩnh vực chẩn đoán các vi sinh vật bởi độ chính xác cao và khắc phục hầu hết nhược điểm của các phương pháp truyền thống như soi trực tiếp, nuôi cấy [36]. Trên thế giới đã có nhiều bộ xét nghiệm STI, phần lớn các kit theo nguyên lý real-time PCR do các hãng nước ngoài sản xuất đều có chất lượng tốt và có công bố hợp chuẩn sử dụng trong y tế. Tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về sử dụng kỹ thuật real-time PCR trong xác định đa tác nhân gây bệnh.

Hiện chỉ có một số công ty trong nước có sản xuất các kit phát hiện 2-3 vi sinh vật gây bệnh bằng kỹ thuật real-time PCR nhưng chưa có công ty nào sản xuất bộ kit phát hiện đồng thời 9 tác nhân gây nhiễm trùng phụ khoa. Vì vậy, các khoa xét nghiệm thuộc các bệnh viện tuyến Trung ương và tuyến thành phố/tỉnh vẫn phải sử dụng các kit nhập ngoại với giá thành cao. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và sàng lọc 09 tác nhân vi sinh vật chính gây bệnh phụ khoa bằng kỹ thuật Real-time PCR Taqman Probe”. Trên cơ sở về tỷ lệ viêm phụ khoa và nhiễm STI tại Việt Nam, chúng tôi xây dựng quy trình phát hiện đồng thời 09 tác nhân vi sinh vật chính gồm cả vi khuẩn, virus, nấm, trùng roi gây bệnh phụ khoa phổ biến gồm: 1Gardnerella vaginalis (GV); 2 Neisseria gonorrhoeae (NG); 3Chlamydia trachomatis (CT); 4Mycoplasma hominis (MH); 5Mycoplasma genitalium (MG); 6Human alphaherpesvirus type 1 (HSV-1); 7 Human alphaherpesvirus type 2 (HSV-2).

Với những mục tiêu chính như sau: - Phát triển kỹ thuật real-time PCR Taqman Probe có độ nhạy, độ đặc hiệu cao để phát hiện đồng thời 09 STI phổ biến ở Việt Nam trong cùng một xét nghiệm và đánh giá độ tương đồng với các kit thương mại - Đánh giá tính ứng dụng của kỹ thuật real-time PCR trong sàng lọc 09 tác nhân STI ở phụ nữ có biểu hiện tiết dịch âm đạo đến khám tại một số bệnh viện tại Hà Nội. Tổng quan về bệnh phụ khoa 1.