Đặt vấn đề Với mục tiêu phát triển của nghành Lâm nghiệp Việt Nam giai đoạn 2010 - 2020 là nâng cao tỷ lệ che phủ của rừng và chất lượng rừng trồng. Do vậy những loài cây được trồng không chỉ là những cây lấy gỗ lâu năm phù hợp với hoàn cảnh đất trồng rừng mà còn phải đảm bảo có năng suất cao, chu kỳ kinh doanh ngắn có nhiều tác dụng đáp ứng nhu cầu cấp thiết đặt ra hiện nay. Đặc biệt trong những năm gần đây việc trồng cây lâm sản ngoài gỗ dưới tán rừng được xem như là một chiến lược lớn nhằm đáp ứng cả hiệu quả kinh tế trên một đơn vị diện tích trồng rừng và cải thiện môi trường cũng như tính đa dạng sinh học của rừng. Một trong những loài cây dược liệu có giá trị kinh tế cao đang được đưa vào trồng xen dưới tán rừng đó là cây Ba Kích.
Cây Ba kích có 2 loại là Ba kích trắng và Ba kích tím. Cây Ba kích tím được sử dụng nhiều bởi hàm lượng dược liệu có trong củ tốt hơn so với cây Ba kích trắng. Cây Ba kích tím (Morinda officinalis How) thuộc họ cà phê Rubioceae. Cây Ba kích tím được xem là cây bản địa của tỉnh Quảng Ninh đây là loài cây dược liệu quý hiếm có rất nhiều công dụng.
Nước Ba kích sắc có tác dụng hạ huyết áp, tăng sức dẻo dai, tăng cường đề kháng cơ thể, chống viêm, chữa thận hư, tráng dương, phụ nữ khó thụ thai, tay chân đau nhức, chữa gân xương yếu…. có giá trị xuất khẩu cao. Ngoài ra củ Ba kích còn được dùng ngâm rượi là một loại đặc sản của Quảng Ninh. Những năm gần đây Ba kích mọc tự nhiên trong rừng bị khai thác cạn kiệt dẫn đến diện tích bị thu hẹp, nguồn giống cạn dần.
Hiện nay nhiều hộ gia đình tiến hành phát triển trồng cây Ba kích. Song từ trước đến nay chủ yếu dùng cây giống nhân từ hạt và hom. Việc nhân giống bằng hạt không phải bao giờ cũng n -8- thuận lợi và hợp lý, thời gian nảy mầm dài, tỷ lệ nảy mầm thấp mặt khác cây giống đem trồng có nguồn gốc từ hạt không đảm bảo do hiện tượng phân ly trong sinh sản hữu tính nên quần thể cây rừng không còn giữ được phẩm chất ưu việt của nguồn giống đem trồng. Đối với phương pháp giâm hom thì hệ số nhân giống thấp, cây trồng bằng hom có sức sống kém, chất lượng củ kém.
Khó khăn lớn nhất hiện nay là nguồn giống có phẩm chất di truyền tốt phục vụ cho trồng rừng đại trà còn hạn hẹp. Cùng với yêu cầu và sự phát triển của thị trường hiện nay cần một lượng cây giống có chất lượng cao rất lớn. Để giải quyết nhu cầu cây giống hiện nay và tương lai việc nhân giống cây Ba kích bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào là một hướng đi cần thiết bởi có thể nhân số lượng cây lớn trong thời gian ngắn để cung cấp thị trường mặt khác cây nuôi cấy mô mang nhiều ưu điểm, có sức trẻ hóa cao, cây con mang đuợc toàn bộ tiềm năng di truyền quý của bố mẹ, tăng sự đồng đều rừng trồng, cây trồng có sức sinh trưởng và phát triển cao có tuổi thọ lớn. Cây con được tạo ra từ công nghệ nuôi cấy mô tế bào sẽ khắc phục được những nhược điểm của việc tạo cây con từ hạt và giâm hom.
Để góp phần giải quyết các tồn tại trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống vô tính cây Ba kích tím (Morinda officinalis How) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại Quảng Ninh”.2 Mục tiêu của đề tài 1. Mục tiêu chung Nghiên cứu thành công kỹ thuật nhân giống cây Ba kích bằng phương pháp nuôi cấy mô, nhằm góp phần phục vụ công tác duy trì và sản xuất giống cây Ba kích bằng phương pháp nuôi cấy mô trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh.Mục tiêu cụ thể n -9- - Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng tới hiệu quả khử trùng mẫu cây Ba kích - Nghiên cứu ảnh hưởng một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh của chồi Ba kích. - Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA, IBA tới khả năng ra rễ của chồi Ba kích. - Xác định ảnh hưởng của thời gian huấn luyện tới tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao cây con ở giai đoạn vườn ươm.
Ý nghĩa của đề tài * Ý nghĩa khoa học: - Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra được một biện pháp kỹ thuật nhân giống cây Ba kích bằng phương pháp nuôi cấy mô. Đánh giá được tác động của một số chất điều tiết sinh trưởng trong nhân giống cây Ba kích. - Đánh giá được tác động của các thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng cây con ở giai đoạn vườn ươm. - Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu, giảng dạy và sản xuất cây Ba kích.
* Ý nghĩa thực tiễn sản xuất: Sản xuất được cây con sinh trưởng phát triển tốt, đồng đều và sạch bệnh với khối lượng lớn, kịp thời phục vụ cho sản xuất. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tissue culture): Là phương pháp sản xuất hàng loạt cây con (bản sao) từ các bộ phận của cây (các cơ quan, mô, tế bào) bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng có môi trường thích hợp và được kiểm soát (Ngô Xuân Bình, 2000) [1]. Vật liệu để nhân giống có thể là các cơ quan của cây: rễ, thân, lá, hoa, quả, các tế bào được phát sinh từ các bộ phận của cây (mô sẹo - callus) hoặc các tế bào đơn được tách từ các mô, các tế bào đã được loại bỏ phần vách (tế bào trần - protoplast) [1].
Phương pháp nhân giống này sử dụng một bộ phận rất nhỏ của cơ thể sinh vật làm vật liệu để nhân giống nên còn được gọi là vi nhân giống và thường được thực hiện ở điều kiện vô trùng trong ống nghiệm có môi trường thích hợp và được kiểm soát nên được gọi là nuôi cấy in vitro để phân biệt với quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên, ngoài ống nghiệm (in vivo) (Vũ Thị Huệ, 2008) [18]. Phương pháp nhân giống này thường được gọi chung là nhân giống bằng nuôi cấy mô và tế bào, là một trong những ngành kỹ thuật trẻ, mới được hình thành từ những năm đầu của thế kỷ XX và được phát triển mạnh trong vài chục năm gần đây. Ngày nay phương pháp này được coi là một công cụ đắc lực để nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực có đối tượng sinh vật và là một nội dung quan trọng không thể thiếu được của công nghệ sinh học hiện đại [18]. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật 2.1 Tính toàn năng của tế bào n -11- Năm 1902, nhà sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng.
Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ của cơ thể sinh vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen. Đặc tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ. [15] Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham, Unio) đã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào.
Thành công trên đã tạo ra công nghệ mới: công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu.[25] Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hóa và phản phân hóa tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau.
Các mô có được cấu trúc chuyên môn hóa nhất định nhờ sự phân hóa [16]. Phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân n -12- hóa có thể diễn ra như sau: Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hóa chức năng Khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở lại về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện quá trình phân hóa.
Quá trình đó gọi là sự phản phân hóa của tế bào. Phân hóa Tế bào phôi Tế bào giãn Tế bào sinh chuyển hóa Phản phân hóa Hình 1.01: Tóm tắt quá trình sự phản phân hóa của tế bào Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa phân hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào.
Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi thì các gen được hoạt hóa, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn trong DNA của tế bào (Vũ Văn Vụ, 1994) [22]. n -13- Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào.