Phân lập thực khuẩn thể có khả năng kiểm soát sinh học vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ahpnd ở tôm thẻ chân trắng litopenaeus vannamei

Nghiên cứu về Vibrio parahaemolyticus và bệnh AHPND ở tôm thẻ chân trắng đang trở thành một chủ đề… 70 trang · Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh · 2021.

• Tác giả: Trần Thị Kiều Hương
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Minh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phân Lập Thực Khuẩn Thể Có Khả Năng Kiểm Soát Sinh Học Vibrio parahaemolyticus Gây Bệnh Hoại Tử Gan Tụy Cấp Tính (AHPND) Ở Tôm Thẻ Chân Trắng
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TÌNH HÌNH NUÔI TÔM TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
• 1.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới
• 1.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
• 1.1.3. Thiệt hại do bệnh hoại tử gan tụy cấp tính gây ra cho ngành nuôi tôm trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.2. BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY EMS/AHPNS TRÊN TÔM
• 1.2.1. Tình hình dịch bệnh
• 1.2.2. Tác nhân gây bệnh
• 1.3. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA Vibrio parahaemolyticus
• 1.3.1. Phân loại học
• 1.4. THỰC KHUẨN THỂ (BACTERIOPHAGE)
• 1.4.1. Giới thiệu bacteriophage
• 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Thu thập mẫu
• 2.2. Chủng vi khuẩn
• 2.3. Môi trường – hóa chất
• 2.4. Thiết bị - dụng cụ
• 2.5. Phân lập thực khuẩn thể có khả năng phân giải vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
• 2.6. Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus của thực khuẩn thể
• 2.7. Xử lý số liệu
• 2.8. Tinh sạch thực khuẩn thể
• 2.9. Kính hiển vi điện tử
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Phụ lục 1 - THAO TÁC PHÂN LẬP MẪU
• Phụ Lục 2 – ĐỊA ĐIỂM VÀ SỐ LƯỢNG THU MẪU

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Kiểm Soát Sinh Học Vibrio parahaemolyticus

Nghiên cứu về Vibrio parahaemolyticus và bệnh AHPND ở tôm thẻ chân trắng đang trở thành một chủ đề nóng trong ngành nuôi trồng thủy sản. Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) do Vibrio parahaemolyticus gây ra đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm toàn cầu. Việc tìm hiểu về các phương pháp kiểm soát sinh học là cần thiết để bảo vệ sức khỏe tôm nuôi và đảm bảo an toàn thực phẩm. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cái nhìn tổng quan về tình hình dịch bệnh và các giải pháp hiện có.

1.1. Tình Hình Nuôi Tôm Trên Thế Giới

Ngành nuôi tôm toàn cầu đang phát triển mạnh mẽ, với sản lượng dự kiến tăng trưởng đáng kể trong những năm tới. Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) là loài chủ lực, chiếm tỷ lệ lớn trong sản lượng nuôi trồng. Tuy nhiên, bệnh AHPND do Vibrio parahaemolyticus đang đe dọa sự phát triển bền vững của ngành này.

1.2. Tình Hình Nuôi Tôm Ở Việt Nam

Việt Nam là một trong những quốc gia có sản lượng tôm nuôi lớn, nhưng cũng phải đối mặt với nhiều thách thức từ dịch bệnh. Bệnh AHPND đã gây thiệt hại nặng nề cho ngành nuôi tôm, ảnh hưởng đến thu nhập của người nuôi và an toàn thực phẩm.

II. Vấn Đề Nghiêm Trọng Từ Bệnh AHPND Ở Tôm

Bệnh AHPND do Vibrio parahaemolyticus gây ra đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong ngành nuôi tôm. Tỷ lệ tử vong cao và thiệt hại kinh tế lớn là những hệ quả không thể phủ nhận. Việc lạm dụng kháng sinh để kiểm soát bệnh đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc, làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn. Cần có những giải pháp hiệu quả để kiểm soát dịch bệnh này.

2.1. Tác Nhân Gây Bệnh AHPND

Tác nhân chính gây ra bệnh AHPND là vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Vi khuẩn này có khả năng phát triển nhanh chóng trong môi trường nuôi tôm, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao trong thời gian ngắn. Việc hiểu rõ về đặc điểm của vi khuẩn này là rất quan trọng để phát triển các biện pháp kiểm soát hiệu quả.

2.2. Thiệt Hại Kinh Tế Do Bệnh AHPND

Thiệt hại kinh tế do bệnh AHPND gây ra là rất lớn, ảnh hưởng đến hàng triệu người nuôi tôm. Các nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ chết có thể lên đến 100% trong những ngày đầu sau khi thả nuôi, dẫn đến tổn thất nặng nề cho ngành nuôi trồng thủy sản.

III. Phương Pháp Kiểm Soát Sinh Học Vibrio parahaemolyticus

Phương pháp kiểm soát sinh học thông qua việc sử dụng thực khuẩn thể (bacteriophage) đang được nghiên cứu và áp dụng để kiểm soát Vibrio parahaemolyticus. Liệu pháp này không chỉ hiệu quả mà còn thân thiện với môi trường, giúp giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản. Nghiên cứu này sẽ trình bày các phương pháp và kết quả đạt được từ việc sử dụng thực khuẩn thể.

3.1. Phân Lập Thực Khuẩn Thể Có Khả Năng Kiểm Soát

Phân lập thực khuẩn thể có khả năng tiêu diệt Vibrio parahaemolyticus là bước đầu tiên trong nghiên cứu này. Các mẫu vi khuẩn được thu thập từ môi trường nuôi tôm và được kiểm tra khả năng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh.

3.2. Đánh Giá Hiệu Quả Của Thực Khuẩn Thể

Đánh giá hiệu quả của thực khuẩn thể trong việc kiểm soát Vibrio parahaemolyticus là rất quan trọng. Các thử nghiệm được thực hiện để xác định khả năng tiêu diệt vi khuẩn và ảnh hưởng đến sức khỏe tôm nuôi.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Kiểm Soát Sinh Học

Nghiên cứu về kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus không chỉ mang lại lợi ích cho ngành nuôi tôm mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Việc áp dụng thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản có thể giúp giảm thiểu ô nhiễm do kháng sinh và hóa chất. Kết quả nghiên cứu sẽ được trình bày chi tiết trong phần này.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Về Thực Khuẩn Thể

Kết quả nghiên cứu cho thấy thực khuẩn thể có khả năng tiêu diệt Vibrio parahaemolyticus hiệu quả. Các thử nghiệm cho thấy tỷ lệ tiêu diệt vi khuẩn cao, mở ra triển vọng cho việc ứng dụng trong thực tiễn.

4.2. Lợi Ích Kinh Tế Từ Việc Sử Dụng Thực Khuẩn Thể

Việc sử dụng thực khuẩn thể không chỉ giúp kiểm soát bệnh mà còn mang lại lợi ích kinh tế cho người nuôi tôm. Giảm thiểu chi phí điều trị và tăng năng suất nuôi trồng là những lợi ích rõ ràng từ phương pháp này.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Kiểm Soát Sinh Học

Nghiên cứu về kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở tôm thẻ chân trắng đã chỉ ra rằng thực khuẩn thể là một giải pháp tiềm năng. Việc áp dụng phương pháp này có thể giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh và bảo vệ sức khỏe tôm nuôi. Tương lai của nghiên cứu này sẽ mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành nuôi trồng thủy sản.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Kiểm Soát Sinh Học

Tương lai của nghiên cứu kiểm soát sinh học sẽ tiếp tục được phát triển với nhiều ứng dụng mới. Việc tìm kiếm và phát triển các chủng thực khuẩn thể mới sẽ là một trong những hướng đi chính trong nghiên cứu này.

5.2. Khuyến Nghị Đối Với Ngành Nuôi Tôm

Ngành nuôi tôm cần áp dụng các phương pháp kiểm soát sinh học để giảm thiểu thiệt hại do bệnh. Việc kết hợp giữa công nghệ sinh học và quản lý nuôi trồng sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất và bảo vệ môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam ghi nhận sự tăng trưởng ổn định với tổng sản lượng năm 2020 ước đạt 7,7 triệu tấn (trong đó khai thác đạt 3,5 triệu tấn và nuôi trồng đạt 4,2 triệu tấn). Tổng diện tích nuôi tôm nước lợ đạt khoảng 725.000 ha, gồm 616.807 ha tôm sú và 109.000 ha tôm thẻ chân trắng; tổng sản lượng tôm đạt 790.000 tấn (tôm sú đạt 254.382 tấn, tôm thẻ chân trắng đạt 536.182 tấn). Tuy nhiên, phương thức canh tác thâm canh và bán thâm canh mật độ cao đã làm gia tăng tần suất bùng phát dịch bệnh truyền nhiễm, gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng.

Một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với nghề nuôi tôm là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND/EMS - Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease / Early Mortality Syndrome). Bệnh xuất hiện đầu tiên tại Trung Quốc (2009), sau đó lan sang Việt Nam, Malaysia (2010) và Thái Lan (2012). Tại Việt Nam, AHPND xuất hiện năm 2010 tại Ninh Thuận, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau và nhanh chóng lan ra 19 tỉnh (2012), 22 tỉnh (2015), 25 tỉnh (2017) với diện tích nhiễm bệnh hàng chục nghìn hecta. Năm 2020, Cục Thú y ghi nhận dịch bệnh xảy ra trên 151 xã thuộc 18 tỉnh thành, trong đó Sóc Trăng chịu thiệt hại nặng nhất với 1.179,51 ha (chiếm 42,83% tổng diện tích mắc bệnh AHPND cả nước). Bệnh có đặc trưng gây chết hàng loạt từ 40% đến 100% đàn tôm trong vòng 20–30 ngày đầu sau khi thả giống.

Để ứng phó dịch bệnh, người nuôi tôm thường lạm dụng hóa chất diệt khuẩn và kháng sinh. Thực trạng này dẫn đến dư lượng kháng sinh tích tụ trong sản phẩm xuất khẩu, suy giảm giá trị thương phẩm, tiêu diệt hệ vi sinh vật có lợi, phá vỡ cân bằng sinh thái ao nuôi và gia tăng nguy cơ xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng đa thuốc (ARG) đe dọa chuỗi thức ăn. Nhằm tìm kiếm giải pháp kiểm soát sinh học thay thế kháng sinh, khóa luận tập trung nghiên cứu ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể (bacteriophage) để ức chế mầm bệnh vi khuẩn.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể:

1. Mục tiêu chung: Phân lập các chủng thực khuẩn thể (bacteriophage) có khả năng kiểm soát sinh học vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei).
2. Nội dung và nhiệm vụ nghiên cứu:
   • Phân lập các thực khuẩn thể có khả năng làm tan/phân giải vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus từ các mẫu nước ao tôm tự nhiên.
   • Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus của các thực khuẩn thể phân lập được bằng phương pháp tạo vết tan.
   • Thực hiện quy trình tinh sạch thực khuẩn thể phục vụ định danh hình thái qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các thực khuẩn thể chuyên biệt ký sinh và phân giải chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND; mẫu nước đáy ao nuôi tôm.
• Phạm vi không gian: Thu thập mẫu nước ao nuôi tôm tại 4 tỉnh thuộc vùng nuôi tôm trọng điểm: Tiền Giang (huyện Gò Công Đông gồm xã Gia Thuận, Kiểng Phước và Thị xã Gò Công), Kiên Giang (xã Hàm Thuận, huyện An Minh), Bình Thuận (Thị xã La Gi) và Trà Vinh (huyện Duyên Hải).
• Phạm vi thời gian: Thực hiện thực nghiệm từ tháng 03/2021 đến tháng 06/2021 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh – Cơ sở 3 (Bình Dương), Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết về đối tượng vi sinh

• Tác nhân vi khuẩn gây bệnh: Vibrio parahaemolyticus thuộc chi Vibrio, họ Vibrionaceae, bộ Vibrionales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. Đây là vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong (kích thước 0,3–0,5 × 1,4–2,6 µm), di động bằng tiên mao, kỵ khí tùy nghi, ưa mặn (halophile), phản ứng oxidase và catalase dương tính, lên men D-mannitol, maltose, L-arabinose nhưng không lên men saccharose. Vi khuẩn bị tiêu diệt ở 65°C sau 10 phút, không sinh trưởng dưới 15°C và tối ưu ở 37°C. Khi nhiễm vào tôm, vi khuẩn xâm chiếm dạ dày, hình thành màng bao sinh học (biofilm) bằng exopolysaccharide và mang một plasmid lớn (69–70 kb) chứa phức hợp hai gen độc lực pirAvp (336 bp, mã hóa protein 13 kDa) và pirBvp (1.317 bp, mã hóa protein 50 kDa). Độc tố nhị phân PirABvp này gây hoại tử tế bào biểu mô ống gan tụy (tế bào E, R, F), làm thoái hóa và rối loạn chức năng tiêu hóa của tôm.
• Bản chất và cấu trúc của thực khuẩn thể: Bacteriophage là virus chuyên ký sinh trên vi khuẩn. Hầu hết các phage thuộc bộ Caudovirales với 3 họ chính có đuôi: Myoviridae (capsid đối xứng tứ diện, đuôi co xoắn), Siphoviridae (capsid tứ diện, đuôi dài không co rút) và Podoviridae (capsid tứ diện, đuôi rất ngắn). Phage có hai chu trình phát triển: chu trình tiềm tan (lysogenic cycle - tích hợp bộ gen thành prophage, không phù hợp cho trị liệu vì nguy cơ tải nạp gen kháng thuốc) và chu trình sinh tan (lytic cycle - sao chép, tổng hợp vỏ protein, tiết enzym lysozyme/endolysin và holin phá hủy thành tế bào vi khuẩn chủ trong 20–120 phút, giải phóng hàng trăm phage thế hệ mới).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Thu thập và bảo quản mẫu: Mẫu nước được lấy ở tầng đáy ao nuôi tôm (độ sâu tối thiểu 1,2 m) theo tiêu chuẩn TCVN 6663-1:2011 (ISO 5667-1:2006), vận chuyển và bảo quản ở 25°C trước khi xử lý.
• Hoạt hóa vi khuẩn chỉ thị: Chủng Vibrio parahaemolyticus kiểm định được nuôi cấy phục hồi trên môi trường TSB (Tryptone Soya Broth) bổ sung 3% NaCl ở 37°C trong 16 giờ, kiểm tra hình thái khuẩn lạc trên thạch chọn lọc TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar) và kiểm tra đặc tính Gram, catalase.
• Quy trình phân lập thực khuẩn thể: Trộn 2 mL mẫu nước ao vào 10 mL môi trường TSB + 3% NaCl, ủ làm giàu ở 37°C trong 24 giờ. Hút 4 mL dịch ủ vào ống Falcon 15 mL, lắc xoáy (vortex), sau đó ly tâm 6.000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch nổi. Dịch nổi được lọc qua màng lọc vô trùng kích thước lỗ 0,2 µm để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn.
• Kiểm tra hoạt tính tạo vết tan: Trộn 0,1 mL dịch huyền phù vi khuẩn V. parahaemolyticus (mật độ $10^8$ CFU/mL) với 10–12 mL môi trường TSB chứa 0,6% agar rồi đổ đĩa, hoặc gieo trang 200 µL dịch khuẩn lên mặt đĩa thạch TSA + 3% NaCl. Nhỏ 0,1 mL dịch lọc mẫu lên bề mặt thạch, ủ ở 37°C trong 24 giờ và quan sát sự xuất hiện của các vòng vô khuẩn (plaque).
• Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học: Thực hiện bằng kỹ thuật thạch hai lớp (double layer agar method). Lớp thạch đáy gồm TSB + 3% NaCl + 1,7% agar. Lớp thạch mặt gồm 10 mL TSB + 3% NaCl + 0,5% agar trộn đều với 1 mL huyền phù vi khuẩn. Nhỏ 2 µL dịch phage vào các vị trí đã đánh dấu, ủ 37°C và theo dõi, đo đường kính 3 vòng vô khuẩn ngẫu nhiên sau các mốc thời gian 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ.
• Quy trình tinh sạch phage: Chọn các vết tan rõ nét, dùng que cấy vô trùng chuyển vào môi trường nuôi cấy chứa chủng vi khuẩn ký chủ đã tăng sinh 1 giờ; ủ lắc 120 vòng/phút ở 28°C trong 6 giờ; ly tâm và lọc tuần tự qua màng 0,45 µm và 0,22 µm. Quá trình được lặp lại 2 lần để đảm bảo độ đồng nhất, sau đó bảo quản trong glycerol 50% ở 4°C.
• Quan sát hình thái qua TEM: Mẫu phage sau tinh sạch được cố định bằng glutaraldehyde 0,5% trong paraformaldehyde 4% (hoặc chất cố định Karnovsky), nhuộm âm bản bằng uranyl acetate 2% và quan sát cấu trúc dưới kính hiển vi điện tử truyền qua.
• Xử lý số liệu: Nhập và xử lý dữ liệu thô bằng Microsoft Excel 2013; phân tích thống kê bằng phần mềm Statgraphics Plus.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan tài liệu

Chương này cung cấp bức tranh toàn diện về ngành công nghiệp nuôi tôm và thách thức dịch bệnh:

• Trình bày số liệu sản xuất tôm toàn cầu và Việt Nam; phân tích sự chuyển dịch diện tích sang nuôi tôm nước lợ tại Đồng bằng sông Cửu Long (Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc Liêu).
• Thống kê thiệt hại do AHPND/EMS gây ra trên quy mô quốc tế (Malaysia giảm 43% sản lượng tôm thẻ giai đoạn 2010–2011; Sinaloa - Mexico giảm hơn 50% sản lượng từ 75.841 tấn xuống 35.652 tấn năm 2013; Ấn Độ chịu tổn thất lớn).
• Phân tích cơ chế bệnh sinh của V. parahaemolyticus, làm rõ vai trò của phức hợp độc tố PirABvp trong việc phá hủy mô gan tụy tôm.
• Tổng kết sinh học bacteriophage: phân loại cấu trúc hạt virus (đầu tứ diện, đuôi co rút hoặc không co rút), cơ chế chu trình sinh tan (hấp phụ, tiêm DNA, sinh tổng hợp enzym endolysin/holin, lắp ráp virion và ly giải tế bào).
• Điểm luận các nghiên cứu ứng dụng phage trên thế giới (nghiên cứu của Vinod năm 2006 tăng tỷ lệ sống ấu trùng P. monodon từ 25% lên 80%; nghiên cứu của Alagappan năm 2010; Lomelí-Ortega năm 2014 sử dụng phage A3S và Vpms1; Stalin năm 2016 với phage VVP1 ở mật độ $2,3 \times 10^{10}$ PFU/mL; Kalatzis năm 2016 giảm 93% Vibrio trên Artemia; Ding năm 2020 phân lập phage PG07) và tại Việt Nam (nghiên cứu của Võ Văn Nha năm 2014 về tần suất bắt gặp phage trên tôm giống miền Trung).

Chương II: Vật liệu và phương pháp

Chương này thiết lập chi tiết quy trình thực nghiệm phòng thí nghiệm:

• Mô tả nguồn gốc chủng vi sinh vật kiểm định và tiêu chuẩn các hóa chất, môi trường nuôi cấy (TSB, TSA, TCBS, NaCl) và trang thiết bị sử dụng (tủ ấm lắc, máy ly tâm, màng lọc cellulose vô trùng 0,22–0,45 µm, kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử TEM).
• Xây dựng sơ đồ bố trí thí nghiệm tuần tự 5 bước: (1) Thu mẫu nước ao $\rightarrow$ (2) Hoạt hóa chủng kiểm định $\rightarrow$ (3) Phân lập thực khuẩn thể $\rightarrow$ (4) Đánh giá khả năng phân giải $\rightarrow$ (5) Tinh sạch và quan sát hình thái siêu vi.
• Chuẩn hóa các thao tác kỹ thuật thu mẫu tầng đáy theo TCVN 6663-1:2011, kỹ thuật làm giàu mẫu bằng môi trường chọn lọc, ly tâm tách bã tế bào, lọc vô trùng và phương pháp đổ đĩa thạch hai lớp.

Chương III: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu thu được từ thực nghiệm:

• Kết quả hoạt hóa và kiểm tra vi khuẩn chỉ thị: Chủng V. parahaemolyticus sau khi hoạt hóa 16 giờ ở 37°C phát triển tốt trên môi trường TCBS tạo khuẩn lạc tròn, màu xanh đặc trưng. Kết quả nhuộm Gram cho thấy trực khuẩn ngắn, bắt màu Gram âm, đứng riêng lẻ, phản ứng catalase (+), hoàn toàn phù hợp với các mô tả chuẩn vi sinh học.
• Kết quả phân lập thực khuẩn thể tại 4 địa phương: Tổng cộng 65 mẫu nước ao nuôi tôm được kiểm tra sự hiện diện của bacteriophage phân giải V. parahaemolyticus:
  • Tại Tiền Giang (25 mẫu): Phân lập được 4 mẫu dương tính tạo vết tan rõ rệt, ký hiệu gồm TG5 (xã Gia Thuận), TG10, TG15 (xã Kiểng Phước) và TG20 (Thị xã Gò Công). 21 mẫu còn lại cho kết quả âm tính (-).
  • Tại Kiên Giang (10 mẫu): Toàn bộ 10 mẫu thu tại xã Hàm Thuận (huyện An Minh), từ mẫu 26 đến mẫu 35, đều không phát hiện thấy thực khuẩn thể (-).
  • Tại Bình Thuận (10 mẫu): Toàn bộ 10 mẫu thu tại Thị xã La Gi, từ mẫu 36 đến mẫu 45, đều cho kết quả âm tính (-).
  • Tại Trà Vinh (20 mẫu): Phân lập được 6 mẫu dương tính tạo vết tan phân giải vi khuẩn, ký hiệu gồm TV46, TV50, TV55, TV57, TV60 và TV65 thu tại huyện Duyên Hải. 14 mẫu còn lại cho kết quả âm tính (-).
• Thảo luận kết quả phân lập trong mối tương quan với các nghiên cứu của Lomelí-Ortega và cộng sự (2014), khẳng định tiềm năng của các chủng thực khuẩn thể bản địa thu được trong việc ức chế tác nhân gây bệnh AHPND.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả thực nghiệm chính

Khóa luận đã hoàn thành việc khảo sát, thu thập và sàng lọc hoạt tính thực khuẩn thể từ 65 mẫu nước ao nuôi tôm tại 4 tỉnh Nam Bộ và Nam Trung Bộ.

Địa phương thu mẫu	Vị trí thu mẫu chi tiết	Số lượng mẫu (n)	Số mẫu dương tính (+)	Mã số mẫu phân lập thành công	Tỷ lệ phát hiện (%)
Tiền Giang	Xã Gia Thuận, Kiểng Phước, TX. Gò Công	25	4	TG5, TG10, TG15, TG20	16,0%
Kiên Giang	Xã Hàm Thuận, Huyện An Minh	10	0	Không phát hiện	0,0%
Bình Thuận	Thị xã La Gi	10	0	Không phát hiện	0,0%
Trà Vinh	Huyện Duyên Hải	20	6	TV46, TV50, TV55, TV57, TV60, TV65	30,0%
TỔNG CỘNG	4 tỉnh trọng điểm	65	10	10 chủng thực khuẩn thể	15,38%

Đóng góp khoa học và thực tiễn

• Bổ sung nguồn chủng vi sinh vật bản địa: Phân lập thành công 10 thực khuẩn thể có hoạt lực phân giải mạnh vi khuẩn V. parahaemolyticus từ các thủy vực nuôi tôm tự nhiên tại Tiền Giang và Trà Vinh.
• Tiền đề phát triển chế phẩm sinh học: Cung cấp nguồn vật liệu sinh học và cơ sở thực nghiệm ban đầu nhằm phát triển các dòng chế phẩm "phage cocktail" hoặc chế phẩm sinh học thay thế kháng sinh, góp phần kiểm soát hội chứng chết sớm (EMS/AHPND) an toàn sinh học và không để lại dư lượng độc hại trong chuỗi giá trị tôm nuôi.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Nghiên cứu mới dừng lại ở bước phân lập, sàng lọc và đánh giá hoạt tính ly giải in vitro trên môi trường thạch phòng thí nghiệm đối với một chủng vi khuẩn chỉ thị V. parahaemolyticus.
• Số lượng mẫu thu thập tại một số tỉnh (Kiên Giang, Bình Thuận) còn hạn chế (10 mẫu/tỉnh) và chỉ thu ở một thời điểm, chưa đại diện đầy đủ cho sự biến động mật độ thực khuẩn thể theo mùa vụ hoặc theo chu kỳ nuôi.
• Chưa thực hiện giải trình tự hệ gen (whole-genome sequencing) của 10 thực khuẩn thể để kiểm tra sự vắng mặt của các gen prophage độc lực hoặc gen kháng kháng sinh.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng khảo sát phổ phân giải (host range) của 10 thực khuẩn thể phân lập được trên nhiều chủng Vibrio gây bệnh khác nhau trong nuôi trồng thủy sản (V. alginolyticus, V. harveyi, V. vulnificus...).
• Khảo sát các đặc tính sinh hóa - lý học của phage: khả năng chịu nhiệt, độ bền ở các dải pH và độ mặn khác nhau của môi trường nước ao nuôi.
• Tiến hành thử nghiệm cảm nhiễm in vivo trên tôm thẻ chân trắng nuôi thực tế để đánh giá tỷ lệ sống, hiệu quả bảo vệ mô gan tụy và kiểm soát mật độ vi khuẩn trong đường tiêu hóa tôm.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Bệnh học Thủy sản, Vi sinh vật học ứng dụng và Nuôi trồng thủy sản; cán bộ kỹ thuật tại các trung tâm khuyến ngư và trang trại sản xuất tôm giống.
• Nội dung giá trị:
  • Quy trình chuẩn về thu mẫu nước đáy ao, làm giàu mẫu, ly tâm lọc vô trùng màng 0,2 µm và kỹ thuật đổ đĩa thạch hai lớp phân lập bacteriophage.
  • Phương pháp tinh sạch thực khuẩn thể và kỹ thuật chuẩn bị mẫu soi kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
  • Khung tài liệu tổng quan hệ thống về đặc điểm độc lực plasmid mang gen pirAvp / pirBvp của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Cơ chế sinh độc tố gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được mô tả như thế nào?

Vi khuẩn mang một plasmid lớn kích thước 69–70 kb chứa vùng gen mã hóa độc tố nhị phân gồm pirAvp (kích thước 336 bp, mã hóa protein ~13 kDa) và pirBvp (kích thước 1.317 bp, mã hóa protein ~50 kDa). Phức hợp độc tố PirABvp tương đồng với độc tố Pir của Photorhabdus, có khả năng phá hủy cấu trúc biểu mô ống gan tụy tôm, làm tế bào thoái hóa, tróc vảy và rơi vào lòng ống, dẫn đến tôm chết hàng loạt.

2. Tổng số mẫu nước ao tôm được thu thập và kết quả phân lập thực khuẩn thể đạt được là bao nhiêu?

Tổng cộng có 65 mẫu nước ao nuôi tôm được thu thập tại 4 tỉnh: Tiền Giang (25 mẫu), Kiên Giang (10 mẫu), Bình Thuận (10 mẫu) và Trà Vinh (20 mẫu). Kết quả phân lập được 10 mẫu dương tính có thực khuẩn thể ly giải V. parahaemolyticus, bao gồm 4 mẫu từ Tiền Giang (TG5, TG10, TG15, TG20) và 6 mẫu từ Trà Vinh (TV46, TV50, TV55, TV57, TV60, TV65). Hai tỉnh Kiên Giang và Bình Thuận không phát hiện mẫu dương tính.

3. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus sử dụng trong nghiên cứu có những đặc điểm nhận diện sinh học nào?

Chủng vi khuẩn kiểm định có dạng hình que ngắn hoặc hơi cong, bắt màu Gram âm, đứng riêng lẻ, phản ứng catalase (+). Khi nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc TCBS, vi khuẩn phát triển tạo thành các khuẩn lạc tròn màu xanh đặc trưng do không lên men đường sucrose.

4. Quy trình tinh sạch thực khuẩn thể sau phân lập được thực hiện qua các bước nào?

Vết tan trên thạch được thu nhận bằng que cấy vô trùng, đưa vào dịch vi khuẩn ký chủ đã nuôi cấy 1 giờ, ủ lắc 120 vòng/phút ở 28°C trong 6 giờ. Dịch sau ủ được lọc tuần tự qua màng lọc 0,45 µm và 0,22 µm. Toàn bộ chu trình này được lặp lại hai lần để thu được dịch ly giải đồng nhất trước khi bảo quản trong dung dịch glycerol 50% ở 4°C.

---

Kết luận

Khóa luận đã hoàn thành việc phân lập và sàng lọc thực khuẩn thể có khả năng kiểm soát sinh học vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trên tôm thẻ chân trắng. Từ 65 mẫu nước ao tôm thu thập tại 4 tỉnh, nghiên cứu đã phân lập thành công 10 thực khuẩn thể có hoạt tính ly giải mầm bệnh mạnh (4 chủng tại Tiền Giang và 6 chủng tại Trà Vinh). Kết quả thực nghiệm này cung cấp cơ sở khoa học và nguồn vật liệu sinh học quan trọng cho các nghiên cứu ứng dụng liệu pháp phage thay thế kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TÌNH HÌNH NUÔI TÔM TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới Hiện nay, trên thế giới có khoảng 50 nước nuôi tôm (VASEP, 2016) và các vùng nuôi trọng điểm như Đông Nam Á (ĐNA), Trung Quốc, Ấn Độ, Mỹ và Trung Đông (Global Aquaculture Alliance, 2016). Sản lượng tôm thế giới được dự báo tăng trưởng hơn 90 % cho giai đoạn 2010 - 2030, riêng ĐNA sẽ tăng hơn 100% (FAO, 2015).

Loài tôm được nuôi phổ biến nhất là tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và kế đến là tôm sú (Penaeus monodon), trong đó tôm thẻ chân trắng đóng góp sản lượng lớn nhất, chiếm 72 % sản lượng. Sản lượng tôm nuôi thế giới có thể đạt 4,44 triệu tấn vào năm 2018 (Global Aquaculture Alliance, 2016) và khoảng 4,49 triệu tấn vào năm 2020 (FAO, 2016). Châu Á sẽ đóng góp 3,65 triệu tấn vào năm 2018, trong đó tăng trưởng chủ yếu là từ Thái Lan, Việt Nam, Indonesia và Ấn Độ (Global Aquaculture Alliance, 2016). Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam Ở Việt Nam hiện nay có gần 694.645 ha nuôi tôm, trong đó có khoảng 560000 ha nuôi tôm quảng canh cải tiến với năng suất trung bình chỉ 200-350 kg/ha.

Hình thức nuôi này có thể tăng năng suất cao gấp 3-4 lần nếu áp dụng những giải pháp khoa học công nghệ (KHCN) phù hợp. Đối với nuôi tôm thâm canh, năng suất bình quân vẫn còn thấp, khoảng 4 tấn/ha, có thể nâng cao năng suất từ 1,5 đến 2 lần so với hiện tại. Thêm vào đó, ngành tôm Việt Nam vẫn còn tiềm năng có thể chuyển diện tích đất sản xuất nông nghiệp kém hiệu quả khoảng 300000 ha sang nuôi tôm để đạt con số 1 triệu ha. Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có tổng diện tích nuôi tôm nước lợ đến năm 2020 là 650000 ha, trong đó: nuôi tôm sú khoảng 560000 ha; tôm thẻ chân trắng là 90000 ha.

Tổng sản lượng tôm nuôi nước lợ toàn vùng đạt 700000 - 825000 tấn, trong đó: tôm sú đạt 350000 - 375000 tấn, tôm thẻ chân trắng đạt 350000 - 450000 tấn (Viện kinh tế và quy hoạch thủy sản, 2015). Riêng ở Cà Mau, sản lượng tôm nuôi sẽ đạt trên 280000 tấn vào năm 2020. Trong các tháng đầu năm 2020, việc triển khai sản xuất tôm nước lợ gặp nhiều khó khăn do dịch Covid-19 kèm theo tình hình xâm nhập mặn tại các vùng nuôi chủ lực, dẫn đến sản lượng tôm nước lợ, đặc biệt là đối tượng tôm sú bị sụt giảm. Đến các 5 tháng cuối năm 2020, tình hình sản xuất tôm nước lợ đã có sự phục hồi khi tình hình dịch bệnh được khống chế, việc xuất khẩu mặt hàng tôm nước lợ được khôi phục đã giúp cho sản lượng tôm nước lợ tăng trưởng khá, tổng sản lượng vượt kế hoạch năm 2020 đã đề ra.

Năm 2020, Tổng sản lượng tôm nuôi đạt 950000 tấn. Trong đó tôm sú đạt 267,7 nghìn tấn, tăng 1 %; tôm thẻ chân trắng 632,3 nghìn tấn, tăng 8,5 % so với cùng kỳ, tôm khác đạt 50000 tấn (Tổng cục Thủy Sản, 2020). Thiệt hại do bệnh hoại tử gan tụy cấp tính gây ra cho ngành nuôi tôm trên thế giới và ở Việt Nam Trên thế giới Theo ước tính của các nhà nghiên cứu thuộc Viện Nuôi trồng Thủy sản Nước lợ Trung ương của Ấn Độ (CIBA), ngành tôm nước này sẽ phải đối mặt với khoản lỗ 1,5 tỉ USD trong giai đoạn 2020-2021 do dịch Covid-19 gây ra (H. Mĩ, Ngành tôm Ấn Độ đã vượt qua ảnh hưởng của COVID-19 như thế nào? vietnambiz).

Ở Malaysia bệnh hoại tử gan tụy gây ra tỷ lệ chết trong ao khác nhau, từ 40- 100% trong quần thể nuôi tôm thẻ chân trắng trong giai đoạn từ năm 2011 đến năm 2013.