Phân lập thực khuẩn thể có khả năng kiểm soát sinh học vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ahpnd ở tôm thẻ chân trắng litopenaeus vannamei

Chuyên khảo phân tích Phân lập thực khuẩn thể có khả năng kiểm soát sinh học vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Tác giả: Trần Thị Kiều Hương
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Minh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phân Lập Thực Khuẩn Thể Có Khả Năng Kiểm Soát Sinh Học Vibrio parahaemolyticus Gây Bệnh Hoại Tử Gan Tụy Cấp Tính (AHPND) Ở Tôm Thẻ Chân Trắng
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TÌNH HÌNH NUÔI TÔM TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
• 1.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới
• 1.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
• 1.1.3. Thiệt hại do bệnh hoại tử gan tụy cấp tính gây ra cho ngành nuôi tôm trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.2. BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY EMS/AHPNS TRÊN TÔM
• 1.2.1. Tình hình dịch bệnh
• 1.2.2. Tác nhân gây bệnh
• 1.3. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA Vibrio parahaemolyticus
• 1.3.1. Phân loại học
• 1.4. THỰC KHUẨN THỂ (BACTERIOPHAGE)
• 1.4.1. Giới thiệu bacteriophage
• 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Thu thập mẫu
• 2.2. Chủng vi khuẩn
• 2.3. Môi trường – hóa chất
• 2.4. Thiết bị - dụng cụ
• 2.5. Phân lập thực khuẩn thể có khả năng phân giải vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
• 2.6. Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus của thực khuẩn thể
• 2.7. Xử lý số liệu
• 2.8. Tinh sạch thực khuẩn thể
• 2.9. Kính hiển vi điện tử
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Phụ lục 1 - THAO TÁC PHÂN LẬP MẪU
• Phụ Lục 2 – ĐỊA ĐIỂM VÀ SỐ LƯỢNG THU MẪU

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Kiểm Soát Sinh Học Vibrio parahaemolyticus

Nghiên cứu về Vibrio parahaemolyticus và bệnh AHPND ở tôm thẻ chân trắng đang trở thành một chủ đề nóng trong ngành nuôi trồng thủy sản. Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) do Vibrio parahaemolyticus gây ra đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm toàn cầu. Việc tìm hiểu về các phương pháp kiểm soát sinh học là cần thiết để bảo vệ sức khỏe tôm nuôi và đảm bảo an toàn thực phẩm. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cái nhìn tổng quan về tình hình dịch bệnh và các giải pháp hiện có.

1.1. Tình Hình Nuôi Tôm Trên Thế Giới

Ngành nuôi tôm toàn cầu đang phát triển mạnh mẽ, với sản lượng dự kiến tăng trưởng đáng kể trong những năm tới. Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) là loài chủ lực, chiếm tỷ lệ lớn trong sản lượng nuôi trồng. Tuy nhiên, bệnh AHPND do Vibrio parahaemolyticus đang đe dọa sự phát triển bền vững của ngành này.

1.2. Tình Hình Nuôi Tôm Ở Việt Nam

Việt Nam là một trong những quốc gia có sản lượng tôm nuôi lớn, nhưng cũng phải đối mặt với nhiều thách thức từ dịch bệnh. Bệnh AHPND đã gây thiệt hại nặng nề cho ngành nuôi tôm, ảnh hưởng đến thu nhập của người nuôi và an toàn thực phẩm.

II. Vấn Đề Nghiêm Trọng Từ Bệnh AHPND Ở Tôm

Bệnh AHPND do Vibrio parahaemolyticus gây ra đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong ngành nuôi tôm. Tỷ lệ tử vong cao và thiệt hại kinh tế lớn là những hệ quả không thể phủ nhận. Việc lạm dụng kháng sinh để kiểm soát bệnh đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc, làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn. Cần có những giải pháp hiệu quả để kiểm soát dịch bệnh này.

2.1. Tác Nhân Gây Bệnh AHPND

Tác nhân chính gây ra bệnh AHPND là vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Vi khuẩn này có khả năng phát triển nhanh chóng trong môi trường nuôi tôm, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao trong thời gian ngắn. Việc hiểu rõ về đặc điểm của vi khuẩn này là rất quan trọng để phát triển các biện pháp kiểm soát hiệu quả.

2.2. Thiệt Hại Kinh Tế Do Bệnh AHPND

Thiệt hại kinh tế do bệnh AHPND gây ra là rất lớn, ảnh hưởng đến hàng triệu người nuôi tôm. Các nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ chết có thể lên đến 100% trong những ngày đầu sau khi thả nuôi, dẫn đến tổn thất nặng nề cho ngành nuôi trồng thủy sản.

III. Phương Pháp Kiểm Soát Sinh Học Vibrio parahaemolyticus

Phương pháp kiểm soát sinh học thông qua việc sử dụng thực khuẩn thể (bacteriophage) đang được nghiên cứu và áp dụng để kiểm soát Vibrio parahaemolyticus. Liệu pháp này không chỉ hiệu quả mà còn thân thiện với môi trường, giúp giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản. Nghiên cứu này sẽ trình bày các phương pháp và kết quả đạt được từ việc sử dụng thực khuẩn thể.

3.1. Phân Lập Thực Khuẩn Thể Có Khả Năng Kiểm Soát

Phân lập thực khuẩn thể có khả năng tiêu diệt Vibrio parahaemolyticus là bước đầu tiên trong nghiên cứu này. Các mẫu vi khuẩn được thu thập từ môi trường nuôi tôm và được kiểm tra khả năng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh.

3.2. Đánh Giá Hiệu Quả Của Thực Khuẩn Thể

Đánh giá hiệu quả của thực khuẩn thể trong việc kiểm soát Vibrio parahaemolyticus là rất quan trọng. Các thử nghiệm được thực hiện để xác định khả năng tiêu diệt vi khuẩn và ảnh hưởng đến sức khỏe tôm nuôi.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Kiểm Soát Sinh Học

Nghiên cứu về kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus không chỉ mang lại lợi ích cho ngành nuôi tôm mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Việc áp dụng thực khuẩn thể trong nuôi trồng thủy sản có thể giúp giảm thiểu ô nhiễm do kháng sinh và hóa chất. Kết quả nghiên cứu sẽ được trình bày chi tiết trong phần này.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Về Thực Khuẩn Thể

Kết quả nghiên cứu cho thấy thực khuẩn thể có khả năng tiêu diệt Vibrio parahaemolyticus hiệu quả. Các thử nghiệm cho thấy tỷ lệ tiêu diệt vi khuẩn cao, mở ra triển vọng cho việc ứng dụng trong thực tiễn.

4.2. Lợi Ích Kinh Tế Từ Việc Sử Dụng Thực Khuẩn Thể

Việc sử dụng thực khuẩn thể không chỉ giúp kiểm soát bệnh mà còn mang lại lợi ích kinh tế cho người nuôi tôm. Giảm thiểu chi phí điều trị và tăng năng suất nuôi trồng là những lợi ích rõ ràng từ phương pháp này.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Kiểm Soát Sinh Học

Nghiên cứu về kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở tôm thẻ chân trắng đã chỉ ra rằng thực khuẩn thể là một giải pháp tiềm năng. Việc áp dụng phương pháp này có thể giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh và bảo vệ sức khỏe tôm nuôi. Tương lai của nghiên cứu này sẽ mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành nuôi trồng thủy sản.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Kiểm Soát Sinh Học

Tương lai của nghiên cứu kiểm soát sinh học sẽ tiếp tục được phát triển với nhiều ứng dụng mới. Việc tìm kiếm và phát triển các chủng thực khuẩn thể mới sẽ là một trong những hướng đi chính trong nghiên cứu này.

5.2. Khuyến Nghị Đối Với Ngành Nuôi Tôm

Ngành nuôi tôm cần áp dụng các phương pháp kiểm soát sinh học để giảm thiểu thiệt hại do bệnh. Việc kết hợp giữa công nghệ sinh học và quản lý nuôi trồng sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất và bảo vệ môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TÌNH HÌNH NUÔI TÔM TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới Hiện nay, trên thế giới có khoảng 50 nước nuôi tôm (VASEP, 2016) và các vùng nuôi trọng điểm như Đông Nam Á (ĐNA), Trung Quốc, Ấn Độ, Mỹ và Trung Đông (Global Aquaculture Alliance, 2016). Sản lượng tôm thế giới được dự báo tăng trưởng hơn 90 % cho giai đoạn 2010 - 2030, riêng ĐNA sẽ tăng hơn 100% (FAO, 2015).

Loài tôm được nuôi phổ biến nhất là tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và kế đến là tôm sú (Penaeus monodon), trong đó tôm thẻ chân trắng đóng góp sản lượng lớn nhất, chiếm 72 % sản lượng. Sản lượng tôm nuôi thế giới có thể đạt 4,44 triệu tấn vào năm 2018 (Global Aquaculture Alliance, 2016) và khoảng 4,49 triệu tấn vào năm 2020 (FAO, 2016). Châu Á sẽ đóng góp 3,65 triệu tấn vào năm 2018, trong đó tăng trưởng chủ yếu là từ Thái Lan, Việt Nam, Indonesia và Ấn Độ (Global Aquaculture Alliance, 2016). Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam Ở Việt Nam hiện nay có gần 694.645 ha nuôi tôm, trong đó có khoảng 560000 ha nuôi tôm quảng canh cải tiến với năng suất trung bình chỉ 200-350 kg/ha.

Hình thức nuôi này có thể tăng năng suất cao gấp 3-4 lần nếu áp dụng những giải pháp khoa học công nghệ (KHCN) phù hợp. Đối với nuôi tôm thâm canh, năng suất bình quân vẫn còn thấp, khoảng 4 tấn/ha, có thể nâng cao năng suất từ 1,5 đến 2 lần so với hiện tại. Thêm vào đó, ngành tôm Việt Nam vẫn còn tiềm năng có thể chuyển diện tích đất sản xuất nông nghiệp kém hiệu quả khoảng 300000 ha sang nuôi tôm để đạt con số 1 triệu ha. Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có tổng diện tích nuôi tôm nước lợ đến năm 2020 là 650000 ha, trong đó: nuôi tôm sú khoảng 560000 ha; tôm thẻ chân trắng là 90000 ha.

Tổng sản lượng tôm nuôi nước lợ toàn vùng đạt 700000 - 825000 tấn, trong đó: tôm sú đạt 350000 - 375000 tấn, tôm thẻ chân trắng đạt 350000 - 450000 tấn (Viện kinh tế và quy hoạch thủy sản, 2015). Riêng ở Cà Mau, sản lượng tôm nuôi sẽ đạt trên 280000 tấn vào năm 2020. Trong các tháng đầu năm 2020, việc triển khai sản xuất tôm nước lợ gặp nhiều khó khăn do dịch Covid-19 kèm theo tình hình xâm nhập mặn tại các vùng nuôi chủ lực, dẫn đến sản lượng tôm nước lợ, đặc biệt là đối tượng tôm sú bị sụt giảm. Đến các 5 tháng cuối năm 2020, tình hình sản xuất tôm nước lợ đã có sự phục hồi khi tình hình dịch bệnh được khống chế, việc xuất khẩu mặt hàng tôm nước lợ được khôi phục đã giúp cho sản lượng tôm nước lợ tăng trưởng khá, tổng sản lượng vượt kế hoạch năm 2020 đã đề ra.

Năm 2020, Tổng sản lượng tôm nuôi đạt 950000 tấn. Trong đó tôm sú đạt 267,7 nghìn tấn, tăng 1 %; tôm thẻ chân trắng 632,3 nghìn tấn, tăng 8,5 % so với cùng kỳ, tôm khác đạt 50000 tấn (Tổng cục Thủy Sản, 2020). Thiệt hại do bệnh hoại tử gan tụy cấp tính gây ra cho ngành nuôi tôm trên thế giới và ở Việt Nam Trên thế giới Theo ước tính của các nhà nghiên cứu thuộc Viện Nuôi trồng Thủy sản Nước lợ Trung ương của Ấn Độ (CIBA), ngành tôm nước này sẽ phải đối mặt với khoản lỗ 1,5 tỉ USD trong giai đoạn 2020-2021 do dịch Covid-19 gây ra (H. Mĩ, Ngành tôm Ấn Độ đã vượt qua ảnh hưởng của COVID-19 như thế nào? vietnambiz).

Ở Malaysia bệnh hoại tử gan tụy gây ra tỷ lệ chết trong ao khác nhau, từ 40- 100% trong quần thể nuôi tôm thẻ chân trắng trong giai đoạn từ năm 2011 đến năm 2013. Các đợt bùng phát đã dẫn đến sản lượng tôm thẻ chân trắng giảm 43%, từ 69.853 tấn năm 2010 còn 39,916 tấn vào năm 2011. Ở Mexico, bệnh được báo cáo lần đầu tiên vào năm 2013. Ba bang nơi nuôi tôm được thực hành là Sinaloa, Sonora và Nayarit.401 ha trong tổng số 50.310 ha của các vùng nuôi và 74% số trang trại bị ảnh hưởng bởi AHPND.

Sản lượng ở Sinaloa năm 2012 là 75.841 tấn, giảm hơn 50% xuống 35.652 tấn vào năm 2013 sau đó sự xuất hiện của AHPND (Tang và cs. Việt Nam Theo số liệu báo cáo của Cục Thú y, năm 2020 cả nước có 43.000 ha tôm nuôi bị thiệt hại. Trong đó, thiệt hại ở tôm nước lợ là 42.738,81 ha, chiếm 93,83% trong tổng số diện tích tôm nuôi bị thiệt hại. Thiệt hại do dịch bệnh là 6.684,27 ha, chiếm 15,64%, tăng 6,7% so với năm 2019.

Thiệt hại do không xác định được nguyên nhân là 32.731,8 ha, chiếm 76,59% trong tổng số tôm bị thiệt hại. Thiệt hại do biến đổi môi trường, thời tiết là 3.322,75 ha, chiếm 7,77% trong tổng số tôm nuôi bị thiệt hại. Diện tích nuôi tôm thâm canh, bán 6 thâm canh bị thiệt hại là 9.335,25 ha; quảng canh, quảng canh cải tiến là 32.896,24 ha; còn lại là tôm lúa và các hình thức nuôi khác chiếm 534,32 ha. Các loại mầm bệnh nguy hiểm như bệnh Hoại tử gan tụy cấp (EMS), Đốm trắng (WSSD)… vẫn lưu hành rộng ở nhiều vùng nuôi.

Cụ thể, với bệnh EMS, Cục Thú y thống kê được 151 xã của 53 huyện, thị xã, thuộc 18 tỉnh thành mắc phải. Diện tích tôm mắc bệnh là 2.754,06 ha, chiếm 3,12% diện tích thả nuôi. Sóc Trăng là tỉnh chịu thiệt hại nặng nề nhất do EMS gây ra với 1.179,51 ha mắc bệnh (chiếm 42,83% tổng diện tích bị bệnh). Với bệnh WSSD, năm 2020 bệnh xảy ra tại 202 xã của 68 huyện thuộc 22 tỉnh thành.

Tổng diện tích nuôi bị bệnh là 2.629,39 ha, chiếm 2,18% diện tích thả nuôi tôm của các khu vực có bệnh. Trọng điểm nuôi tôm của cả nước, tỉnh Sóc Trăng là nơi có diện tích bị bệnh lớn nhất, chiếm 686,72 ha (26,12% tổng diện tích bị bệnh) (Phạm Huệ, Tổng quan ngành tôm 2020: Tăng trưởng trong khó khăn, Người nuôi tôm). BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY EMS/AHPNS TRÊN TÔM 1. Tình hình dịch bệnh Hội chứng gan tụy cấp tính (tên tiếng Anh là Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome - AHPNS) hay còn gọi là Hội chứng chết sớm (Early Mortality Syndrome - EMS) xuất hiện lần đầu tiên tại Trung Quốc (2009), Việt Nam (2010), Malaysia (2010) và Thái Lan (2012) đã gây ra những thiệt hại nặng nề cho nghề nuôi tôm.

Bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng đến trang trại nuôi tôm ở Đông Nam Á, ảnh hưởng lên cả tôm sú (Penaeus monodon) và tôm chân trắng (Penaeus vannamei), được đặc trưng bởi việc chết hàng loạt (có thể lên đến 100 % trong một số trường hợp) trong 20-30 ngày đầu tiên thả nuôi (sau thả giống trong ao nuôi thương phẩm). Dấu hiệu lâm sàng có thể quan sát được bao gồm: tăng trưởng chậm, bơi xoắn ốc, vỏ mềm, cũng như màu sắc nhợt nhạt. Tôm bị ảnh hưởng cũng đều cho thấy dấu hiệu bất thường ở gan tụy (teo tóp lại, nhỏ, sưng hoặc đổi màu). Các tác nhân gây bệnh chính (xem xét bệnh có thể lây bệnh) chưa được xác định, trong khi sự hiện diện của một số vi khuẩn bao gồm cả vi khuẩn Vibrio, Microsporidians và giun tròn đã được quan sát thấy trong một số mẫu.

(Lightner và cs., 2012) 7 Tại Trung Quốc, hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính xuất hiện lần đầu năm 2009 nhưng không được chú ý. Đến năm 2011, dịch đã lan rộng ở 4 tỉnh gồm Quảng Đông, Quảng Tây, Phúc Kiến và Hải Nam (Leaño và Mohan, 2012). Tại Malaysia AHPNS/EMS xuất hiện lần đầu vào giữa năm 2010 tại 2 bang Pahang and Joho, sau đó lan ra các bang Sabah và Sarawak (Othman, 2012). Tại Thái Lan các mẫu tôm chân trắng thu tại 2 tỉnh Chantaburi và Rayong vào cuối năm 2011 đầu năm 2012 cho thấy tôm có các dấu hiệu giống Hội chứng AHPNS/EMS (Prachumwat và cs.

Ở Việt Nam năm 2010, bệnh AHPND được ghi nhận ở các tỉnh như Ninh Thuận (16 ha), Sóc Trăng (1,719 ha), Bạc Liêu (346 ha) và Cà Mau (3,493 ha) (Hien NT và cs. Sau đó, bệnh này tiếp tục xảy ra và lan rộng đến 19 tỉnh thành năm 2012, 22 tỉnh thành năm 2015, 25 tỉnh thành năm 2017 với diện tích nuôi tôm bị nhiễm bệnh lần lượt tương ứng là 28005 ha, 9284 ha và 6793 ha làm giảm đáng kể sản lượng tôm nuôi của Việt Nam ( (Dang, 2018). 1 Tôm thẻ chân trắng có dấu hiệu nhiễm bệnh hoại tử gan tụy (A, B). Hình (C, D) là tôm khỏe cho thấy HP có kích thước bình thường.

Hình (B) và (D) là mẫu lấy từ hai con tôm ở hình (A) và (C) tương ứng (Loc Tran và cs. Tác nhân gây bệnh Nhiều nghiên cứu gần đây đã tìm thấy nhiều loại vi khuẩn ở tôm bị hội chứng hoại tử gan tụy cấp ở tất cả các vùng nuôi tôm trong đó vi khuẩn Vibrio chiếm thành phần chủ yếu và phổ biến nhất là các loài V. Cụ thể là, một nghiên cứu của giáo sư Lightner và cs., (2012) đã chỉ ra một chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là tác nhân gây ra hội chứng này. Theo Lighner và cs., (2012), tôm bệnh thường có một số đặc điểm mô bệnh học đặc trưng 8 như: thoái hoá cấp tính của các ống gan tụy với sự rối loạn về chức năng của tế bào E, R và F; nhân tế bào trương to, tế bào bị hoại tử rơi vào trong lòng ống gan tụy.

Ở giai đoạn cuối, phát hiện có hiện tượng tập trung của các tế bào máu và sự phát triển của tác nhân vi khuẩn thứ cấp chủ yếu là nhóm vi khuẩn Vibrio trong vùng gan tụy, đặc biệt là ở những ống gan tụy bị hoại tử và thoái hoá (Khemayan và cs, 2012). Vibrio parahaemolyticus xâm chiếm đường tiêu hóa của tôm và sinh ra độc tố gây phá hủy mô, làm rối loạn chức năng của gan tụy, cơ quan tiêu hóa của tôm (Lightner và cs. Độc tố PirABvp, tương đồng với độc tố tiêu diệt côn trùng (Pir) của Photorhabdus, được chứng minh là yếu tố độc lực chính gây nên hội chứng gan tụy cấp ở tôm. Các gen tương ứng của chúng (được đặt tên là pirAvp và pirBvp) nằm trên một plasmid có kích thước lớn (69–70 kb) ở các chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh gan tụy cấp (Han, 2015); (Yang, 2014) .Trên plasmid, gen pirAvp và pirBvp nằm trên vùng nucleotide với kích thước khoảng 3,5 kb với hai lần lặp đảo ngược của chuỗi mã hóa transposase (1 kb).

Dựa trên phân tích proteomic, gen pirAvp (336 bp) và pirBvp (1.317 bp) mã hoá cho protein có kích thước khoảng 13 và 50 kDa ( (Han, 2015). MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA Vibrio parahaemolyticus 1. Phân loại học Phân loại hoa học Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Vibrionales Họ: Vibrionaceae Chi: Vibrio Loài: V.