MỞ ĐẦU Tụ cầu vàng kháng methicillin (Staphylococcus aureus kháng methicillin-MRSA) là một vẩn đề y tể toàn cầu và một thách thức trong điều trị [1]. MRSA có cơ chế kháng với kháng sinh nhóm p-lactam như methicillin và penicillin làm cho các bệnh nhiễm tràng do MRSA rất khó điều trị [2], Năm 2014, cơ quan nghiên cứu y tế và chất lượng Hoa Kỳ (AHRQ) đà công bố gan 375.000 trường hợp nhiềm trùng và 23.000 trường hợp tư vong ở Hoa Kỳ có liên quan đến nhiễm MRSA. Chi phí điều trị cho một vết mổ sâu bị nhiềm MRSA, ước tính khoảng 43.970 USD cho một bệnh nhân từ 65 tuôi trở lên ớ Hoa Kỳ [3] với thời gian điều trị dài, kèm theo những thương tật [3, 4|. Nghiên cứu ở 10 nước châu Á xác định tý lệ tử vong 30 ngày liên quan viêm phối bệnh viện từ 18,7 % đen 40,8 %, trong đó MRSA chiếm 82,1 % trong tống số các chủng 5.
aureus phân lập [5]. Năm 2017, WHO đã công bố danh sách các mầm bệnh, các kiểu hình kháng kháng sinh ưu tiên nghiên cứu và phát triên các phương pháp điều trị mới, được phân chia thành ba mức độ ưu tiên là quan trọng, cao và trung bình. Trong đó, MRSA được xếp vào nhóm quan trọng ưu tiên toàn cầu để nghiên cứu và phát triển các phương pháp điều trị mới [61. MRSA có nhiều yếu tố độc lực, là nguyên nhân gây ra hàng loạt các bệnh về nhiễm trùng da, nhiễm trùng máu, viêm phồi, viêm khớp rất khó điều trị 17].
Một đặc điếm quan trọng khác là khả nàng hình thành màng sinh học (biofilm). Màng sinh học được tạo bởi các vi sinh vật sống bám dính và liên kết với nhau trên bề mặt cư chất [8]. Sự hình thành màng sinh học có vai trò rất quan trọng trong tồn tại, thoát khói hệ thống miền dịch của vật chú [9J. Màng sinh học và các thành phần bao quanh bén ngoài màng có vai trò như một trờ ngại vật lý góp phần ngăn chặn thuốc và sự xâm nhập của tế bào miễn dịch vào bên trong màng sinh học [10], Vancomycin là thuốc ưu tiên hàng đầu cho điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do MRSA [11], Tuy nhiên, các chùng MRSA kháng vancomycin (VRSA) chiếm tỉ lệ 6,1 % đà được báo cáo [12].
Hơn nữa trong khoảng 30 năm trớ lại đây, các nhà khoa học chưa thực sự thành công trong việc tìm ra loại kháng sinh mới, mà chủ yếu là các dạng sửa đối 1 (modify) dựa vào khung nguyên bản cua thuôc kháng sinh thê hệ cũ. Đứng trước các thực trạng nói trên, việc tìm kiếm các nguồn kháng sinh mới hoặc các phương pháp mới de kiểm soát vi khuân kháng kháng sinh, đặc biệt dạng siêu kháng thuốc là hểt sức cấp bách [13]. Một trong nhừng phương pháp có khả năng kháng vi khuân kháng kháng sinh là sự kết hợp các hợp chất thực vật với các kháng sinh [14] hoặc kết hợp các hợp chất thực vật với nhau [15]. Việt Nam có một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng về tài nguyên cây thuốc.
Thực vật dùng làm thuốc trong điều trị các bệnh cấp tính và mãn tính đã và đang được sử dụng từ xa xưa theo các đơn thuốc y học cổ truyền. Trong đỏ, hoạt tính kháng khuấn cùa các loài thực vật được chú ý [ 16]. Bình Dương với 698 loài cây thuốc đã được phát hiện, trong đó có 140 loài cây thuốc quý điều tra từ vốn tri thức bản địa tỉnh đà được báo cáo theo Trần Công Luận và cộng sự VỚI đề tài “Điều tra khảo sát tình hình cây thuốc tỉnh Binh Dương” nhiều loài có tác dụng kháng khuẩn [17], Từ bộ dừ liệu này, đề tài “Sàng lọc kháng sinh thực vật tan trong dung môi nước kháng Staphylococcus aureus ” tiếp tục thực hiện khảo sát hoạt tính kháng khuẩn s. aureus, kết quả ghi nhận một số loài thực vật thu hái tại Bình Dương cho hoạt tinh kháng s.
Xuất phát từ những nguyên nhân nói trên, đề tài: “Đánh giá đặc điểm kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) của một số dược liệu thu hái tại tỉnh Bình Dương” đã được thực hiện. Mục tiêu đề tài Xác định được hoạt tính kháng vi khuấn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) của cao ethanol thực vật/cao phân đoạn/tinh chất. Đối tượng nghiên cứu Cao ethanol toàn phân/cao phân đoạn từ bổn loài thực vật thu hái tại tinh Bình Dương bao gồm: Trâm Tròn (Syzygium glomerulatum), Xăng Mã (Carallia Brachiata), Cò Ke (Grewia asiatica), Ngành Ngạnh Nam (Cratoxylum cochỉnchinensis). Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC® 33591, chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus nhạy methicillin (MSSA) ATCC® 6538 được 2 cung cấp bời Microbiologies của Mỹ.
Phạm vi nghiên cứu Trong nghiên cứu này hoạt tính kháng MRSA cua cao ethanol toàn phần/cao phân đoạn của bốn loài thực vật thu hái tại Binh Dưong. Các thử nghiệm được tiến hành trong phòng thí nghiệm. Nội dung nghiên cứu Sàng lọc hoạt tính kháng MRSA cùa cao ethanol toàn phần/cao phân đoạn từ thực vật thu hái tại tinh Bình Dương. Dánh giá khá năng kháng khuấn MRSA cúa cao ethanol toàn phần/cao phân doạn; Xác định công thức hợp lực giữa cao phân đoạn với kháng sinh, và công thức hợp lực giữa các cao phân đoạn với nhau Xác định hoạt tính ức chế hình thành màng sinh học, hoạt tính ức chế tan huyết, hoạt tính ức chế PBP2a, ức chế khả năng chịu muối trên MRSA cùa cao phàn đoạn Xác định và phân tích hoạt tính cua tinh chất chính từ cao ethanol toàn phần cho hoạt tính kháng MRSA tốt nhất.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thục tiễn Luận án góp phần ghi nhận các loài thực vật mọc tại Bình Dương (Việt Nam) cho hoạt tính kháng MRSA. Đồng thời, luận án tìm kiếm các công thức hợp lực giữa cao phân đoạn/tinh chất với kháng sinh và giữa cao phân đoạn với nhau cho hoạt tinh kháng MRSA, nhằm tìm ra liệu pháp kháng MRSA mà hạn chế xuất hiện cơ chế kháng, và tái sử dụng lại các kháng sinh thế hệ cũ bị kháng bời MRSA. Đề tài cô lập các tinh chất chính từ cao ethanol toàn phần có hoạt tính kháng MRSA cao nhất, và xác định công thức hợp lực giừa tinh chất và kháng sinh trên MRSA. Kct quá cùa luận án sẽ giúp đưa ra một số giải pháp kiếm soát MRSA trong thực tiễn.
TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tỗng quan về MRSA 1.1 Đặc điếm vi the và độc tỉnh chi Staphylococcus s. aureus lần đầu tiên được phân lập từ mù người vào năm 1880 bời Scotland Alexander Ogston [18J. Chi Staphylococcus có hơn 40 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu gây bệnh được chú ý trong y học: s. aureus là nhùmg vi khuân hình câu, không di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 pm, tế bào xếp thành hình chùm nho.
aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí không bat buộc, có thê phát triên trong môi trường không có oxi nhờ enzyme catalase hoặc sử dụng một chất nhận điện tử. Ngoài ra, chúng còn cho phan ứng DNase, phosphatase dương tính, có khá năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose [19]. Ở cơ thể người, s. aureus là vi sinh vật cơ hội tẩn công vào vết thương hở hoặc những người có sức đề kháng kém.
Vi khuẩn thường kí sinh trên mũi, họng và da của con người và động vật. Cư chế kháng thuốc của MRSA Trong chiến tranh thể giới thứ hai, penicillin được đưa vào sừ dụng lâm sàng, s. aureus lúc này còn rất nhạy với kháng sinh. Tuy nhiên, chỉ vài năm sau đó các chúng s.
aureus kháng penicilin đà được phát hiện [20]. aureus kháng penicillin - PRSA (Penicillin Resistant -S’. aureus) chiếm khoảng 90 % , MRSA dao động từ 30-50 % trong tổng số các chung s. aureus được phân lập [21], Methicilin là penicilin bán tống hợp, MRSA kháng methicillin xuất hiện 2 cơ chế kháng phổ biến: một là siêu biếu hiện p-lactamascs, hai là thay đổi dạng binh thường cùa Protein gắn Penicillin (PBPs).
Biểu hiện enzyme P-lactamase được kiểm soát bởi operon bla. Trong Operon bỉa, blaZ là vùng gen mã hóa cho p-lactamase, và hai protein đóng vai trò là các protein điều hòa là: blal (nhân tố ức chế) và blaR I (nhân tố hoạt hóa). Blaĩ ức chế sự biêu hiện của blaZ bang việc gắn với promoter. BlaRl tồn tại như là protein xuyên màng; khi vùng bên ngoài tế bào gắn với P-lactam, thì vùng bên trong tế bào sè được giải phóng và phân giải Blal, việc này cho phép biếu hiện blaZ.
Cơ chế kháng thứ 4 hai là biểu hiện protein PBP2a được mã hóa từ gen mecA, nằm trên vùng Operon mec. Operon mecA có hai nhân tố điều hòa là các protein mecl (là nhân tố ức chế) và mecR 1 (là nhân tố hoạt hóa nằm xuyên màng), mecl và mecRl có chức năng tương đồng với blal và blaRl; việc gan với 0-lactam, vùng mecRl bên trong tế bào được giải phóng để phân giải mecl và cho phép sự phiên mã mecA. Sự hiện diện cúa protein PBP2a-là cơ chế hiện diện sau cùng trong hầu hết các chùng lâm sàng. Khuân lạc màu vàng Cúa Staphylococcus aureus trên môi trường thạch Trypton Soy.
Staphylococcus aureus dưới kính hiện vi điện tử (Centers For Disease Control And Prevention) Hình 1.1 Staphylococcus aureus - Tụ cầu vàng s. aureus có 4 tiền chất PBPs thông thường trên màng tế bào chất tham gia vào quá trình liên kết chéo peptidoglycan của vách tế bào. Những PBPs này có hoạt động tương tự với scrinc cũa protease và có ái lực cao với những chất (3-lactam. Khi xáy ra việc gan, những PBPs không có chức năng hình thành phức hợp vách tế bào, dẫn đến vi khuấn chết.
PBP2a là protein có trọng lượng phân tứ 76kDa, được biểu hiện trong các chung MRSA. PBP2a có ái lực thấp với nhóm kháng sinh P-lactam. Nên dù có sự hiện diện cúa kháng sinh, PBP2a vần có chức năng sinh tông hợp vách như PBPs thông thường, bằng cách này tế bào sẽ tránh được sự ly giải. PBP2a được biểu hiện từ gene mecA không hiện diện trong các chủng s.aureus nhạy kháng sinh [22].
Đặc điếm sinh lý của MRSA Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của s. aureus thay đổi tùy thuộc vào từng dỏng. aureus có khá năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 7 °C - 48 °C, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 30 °C - 34 °C; pH 4,2 - 9,3, pH tối ưu là 7,0 - 7,5; và phát triển tốt 5 trên môi trường chứa NaCl 15 %; nồng độ đường từ 33 % - 60 % [7], Trong môi trường thạch máu, s. aureus có khả năng làm tan huyết.
Ở môi trường TSB lòng, sau 5-6 giờ s. aureus tăng sinh làm đục môi trường, sau 24 giờ s. aureus tăng sinh, môi trường đục có thể quan sát bàng mắt thường. Tế bào dạng cặn, tạo một vòng nhăn ở bề mặt môi trường.