ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh sốt mò hay sốt bụi rậm (scrub typhus) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, lƣu hành và đe dọa sức khỏe con ngƣời khu vực ở Châu Á - Thái Bình Dƣơng. Theo thống kê, hàng năm trên thế giới có khoảng 1 triệu ca bệnh và trên 1 tỷ ngƣời có nguy cơ mắc bệnh [9, 26]. Bệnh sốt mò thuộc nhóm bệnh lây truyền từ động vật sang ngƣời, tác nhân gây bệnh là Orientia tsutsugamushi (tên gọi trƣớc đây là Rickettsia tsutsugamushi) - một loại vi khuẩn gram âm ký sinh nội bào bắt buộc, truyền bệnh cho ngƣời và vật chủ trung gian qua vết đốt của ấu trùng mò [26]. Các nghiên cứu dịch tễ học của bệnh sốt mò cho thấy khu vực lƣu hành của O.
tsutsugamushi trải rộng từ Pakistan, Afghanistan tới Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, ph a đông của Liên bang Nga tới các quần ở khu vực Đông Nam Thái Bình Dƣơng, ph a bắc của nƣớc c. Bệnh sốt mò nếu đƣợc chẩn đoán và điều trị kịp thời bằng kháng sinh thích hợp, bệnh có thể khỏi sau 3-5 ngày. Tuy nhiên, triệu chứng lâm sàng của sốt mò rất đa dạng và dễ nhầm với các sốt khác nhƣ sốt rét, sốt xuất huyết,. Do vậy, phần lớn bệnh nhân bị chẩn đoán sai dẫn đến tỷ lệ tử vong lên tới 30% [36].
Hiện nay, bên cạnh dựa vào các triệu chứng lâm sàng của bệnh, tại các bệnh viện lớn đã áp dụng nhiều phƣơng pháp chẩn đoán sinh học cho phát hiện nhiễm O. tsutsugamushi bao gồm phân lập vi khuẩn, các xét nghiệm huyết thanh học nhƣ IFA, ELISA, các kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR. Trong đó, phƣơng pháp ELISA dựa trên sự tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng nguyên của vi khuẩn và kháng thể do cơ thể sản xuất ra. Sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ đƣợc phát hiện thông qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang.
Đây là phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm trong chẩn đoán sốt nhƣ nhƣ chẩn đoán nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giá thành xét nghiệm thấp, thích hợp sử dụng ở những vùng lƣu hành bệnh sốt mò. Phân tích bằng Western blot ly giải toàn bộ tế bào O. tsutsugamushi phát hiện thấy ít nhất 4 kháng nguyên protein có trọng lƣợng phân tử lần lƣợt 22 kDa, 47 kDa, 56 kDa và 110 kDa [32]. Trong số các kháng nguyên trên thì kháng nguyên 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 56 kDa biểu hiện có nồng độ cao ngoài màng, chiếm 10-15% protein tổng số tế bào, hầu hết huyết thanh bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng sốt mò đều nhận thấy kháng nguyên 56 kDa với hiệu giá cao.
Kháng nguyên 56 kDa mang t nh đặc hiệu cao và không biểu hiện ở các nhóm Rickettsia gây bệnh sốt núi đá khác [22]. Bởi vậy, đây là kháng nguyên đã đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong ứng dụng phân loại và chẩn đoán bệnh sốt mò. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật di truyền, kháng nguyên 56 kDa đã đƣợc sản xuất bằng công nghệ ADN tái tổ hợp để làm nguyên liệu phục vụ cho các xét nghiệm chẩn đoán miễn dịch O. Hiện nay, tại các bệnh viện tuyến lớn, số lƣợng các ca bệnh sốt không rõ nguyên nhân ngày càng tăng cao, nhu cầu chẩn đoán nhanh và ch nh xác bệnh sốt mò ngày càng lớn.
Vì vậy, nghiên cứu chế tạo bộ kit cho phát hiện nhanh và chính xác bệnh sốt mò đóng vai trò rất quan trọng. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN 56 KDA TÁI TỔ HỢP TỪ Orientia tsutsugamushi TRONG Escherichia coli”, kết quả nghiên cứu của đề tài tạo tiền đề cho nghiên cứu sản xuất bộ kit ELISA dùng trong chẩn đoán sốt mò. Mục tiêu nghiên cứu: - Tách dòng và biểu hiện các đoạn gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên 56 kDa của O. tsutsugamushi trong tế bào E.
- Tinh chế các kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1. Tác nhân gây bệnh Sốt mò là bệnh sốt cấp tính do vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc Orientia tsutsugamushi gây ra (hình 1). Orientia có t nh đa dạng cao (trên 30 chủng), có cấu trúc kháng nguyên rất khác nhau [6].
tsutsugamushi thƣờng sống ký sinh trong các loài mò, có ổ dịch trên các trảng bìa rừng, nơi đất ẩm nhiều cây con bụi rậm, các bãi cỏ ven sông suối, trên nƣơng rẫy trong tự nhiên [26]. Sốt mò là bệnh động vật, chủ yếu trên các thú nhỏ. Ổ bệnh và trung gian truyền bệnh là mò (Leptotrombidium. tsutsugamushi đƣợc truyền qua các giai đoạn phát triển và các thế hệ.
Ấu trùng (Trombiculid) là giai đoạn hút máu và truyền bệnh duy nhất của mò. Khi nở, ấu trùng mò bò lên các ngọn cỏ bám vào các vật chủ ký sinh nhƣ động vật gặm nhấm, mèo, chó… Các loài gặm nhấm là vật chủ kí sinh chính truyền bệnh cho ngƣời. Sinh cảnh tự nhiên của mò là những nơi đất ẩm nhiều cây con bụi rậm, các bãi cỏ ven sông suối, trên nƣơng rẫy, bìa rừng trong tự nhiên [26]. Hình 1: Vi khuẩn O.
tsutsugamushi và ấu trùng mò [7] 1. Đặc điểm lâm sàng bệnh sốt mò Theo nghiên cứu, khoảng 50-70% số bệnh nhân sốt mò xuất hiện vết loét tại vị trí ấu trùng mò đốt (hình 2) [25]. Bệnh thƣờng khởi phát đột ngột, sốt kéo dài từ 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3-4 ngày và trên 3 tuần khi không điều trị đặc hiệu [37]. Đặc điểm lâm sàng bệnh sốt mò gồm đột ngột bị sốt nhẹ kèm theo các triệu chứng nhức đầu, đau cơ, đổ mồ hôi, xuất hiện hạch bạch huyết và rối loạn nhận thức.
Bệnh nặng dẫn đến các tổn thƣơng ở các cơ quan phủ tạng bao gồm gan to, tổn thƣơng phổi, rối loạn chức năng thận, viêm màng não, giảm tiểu cầu. Bệnh nặng có thể gây đông máu hay xuất huyết có thể xảy ra do hệ quả của cơ chế gây bệnh làm phá vỡ tế bào nội mạc mạch máu của O. Bệnh nhân có tỷ lệ tử vong cao nếu không đƣợc chẩn đoán ch nh xác và điều trị bằng kháng sinh phù hợp. Hình 2: Triệu chứng lâm sàng của bệnh sốt mò [37] Mức độ nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc vào chủng O.
tsutsugamushi lây nhiễm. Những ngƣời đã đáp ứng miễn dịch với bệnh sốt mò có khả năng tái phát bệnh thấp. Tuy nhiên, ngƣời nhiễm có thể bị tái phát khi nhiễm phải các chủng O. tsutsugamushi có cấu trúc kháng nguyên khác với chủng đã nhiễm trƣớc đó.
tsutsugamushi có thể tồn tại trong các hạch bạch huyết từ 1-2 năm sau khi nhiễm trùng và không đƣợc điều trị [34]. Đáp ứng miễn dịch của sốt mò Nhiễm O. tsutsugamushi ở ngƣời gây đáp ứng miễn dịch tế bào. Trong giai đoạn phát bệnh, kháng thể IgM xuất hiện sớm và hiệu giá tăng nhanh trong 2-3 tuần, sau đó giảm nhanh trong khoảng 4-5 tuần.
Kháng thể IgG xuất hiện và tăng nhanh trong 2 tuần đầu tiên, đạt đỉnh vào tuần thứ 4 và sau đó giảm chậm đến tháng 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Miễn dịch sau khi nhiễm sốt mò chỉ có tác dụng bảo vệ với chủng O. tsutsugamushi gây bệnh mà không có tác dụng bảo vệ đối với chủng O. Ở ngƣời nhiễm sốt mò, O.
tsutsugamushi phát triển chủ yếu trong các mao mạch, gây tổn thƣơng ở các cơ quan nhƣ phổi, gan, lách và thận. Chẩn đoán bệnh sốt mò Bệnh sốt mò nếu không đƣợc chẩn đoán và điều trị bằng kháng sinh phù hợp dẫn đến tỷ lệ tử vong cao lên đến 30% [36]. Trƣớc đây, chẩn đoán sốt mò thƣờng dựa trên triệu chứng lâm sàng và tiền sử của bệnh nhân. Bệnh sốt mò có triệu chứng giống với các sốt khác nhƣ sốt rét, sốt xuất huyết, sốt do Leptospira, vì vậy, việc chẩn đoán dễ bị nhầm lẫn dẫn đến kết quả chẩn đoán sai, gây ảnh hƣởng đến quá trình điều trị bệnh.
Hiện nay, chẩn đoán sốt mò thƣờng kết hợp dựa trên triệu chứng lâm sàng của bệnh và các kỹ thuật xét nghiệm hiện đại khác. Phản ứng Wei -Felix: O. tsutsugamushi có chung một vài kháng nguyên với vi khuẩn Proteus vulgaris dòng OX-K. Vì vậy, huyết thanh bệnh nhân sốt mò sẽ ngƣng kết vi khuẩn Proteus vulgaris dòng OX-K (phản ứng Weil-Felix).
Kỹ thuật Weil-Felix có giá trị trong chẩn đoán sơ bộ bệnh sốt mò, sốt chuột, sốt núi đá. Hiệu giá ngƣng kết sẽ đạt giá trị cao nhất vào cuối tuần thứ 3, thứ 4, sau đó giảm nhanh, và thƣờng biến mất sau tuần thứ 5 hoặc thứ 6. Phản ứng có độ nhạy, độ đặc hiệu thấp, tỷ lệ dƣơng t nh giả cao khoảng 20% [31]. Phản ứng kết hợp bổ thể với kháng nguyên O.
tsutsugamushi: Nhằm định lƣợng kháng thể kháng O. tsutsugamushi với hiệu giá huyết thanh thấp. Thực hiện phản ứng này đòi hỏi phải có nhiều loại kháng nguyên khác nhau do cấu trúc kháng nguyên O. tsutsugamushi khác nhau tùy theo từng địa phƣơng và không ngƣng kết chéo [24].
Xét nghiệm này có độ nhạy thấp, chỉ đƣợc dùng trong điều tra dịch tễ học về mức độ lƣu hành của bệnh tại một địa phƣơng. tsutsugamushi đƣợc phân lập từ mẫu máu hay vết loét hoại tử, mẫu sau đó đƣợc nghiền và tiêm vào phúc mạc của chuột nhắt 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Chuột bị nhiễm bệnh có thể chết sau 10-18 ngày với các triệu chứng nhƣ viêm màng bụng, gan và lách to. Trên tiêu bản hiển vi áp in tế bào lách hay tế bào phúc mạc, sau khi đã đƣợc cố định bằng cồn methyl và nhuộm theo phƣơng pháp Giemsa, cho thấy có song cầu trong tế bào và ở ngoại bào bắt màu t a [26].
Xét nghiệm này cho kết quả chẩn đoán ch nh xác bệnh sốt mò. Tuy nhiên, thời gian phân lập lâu, không phù hợp trong chẩn đoán bệnh sớm, gây khó khăn cho quá trình điều trị. K thuật inh học ph n t dựa trên khuếch đại ADN: Đây là phƣơng pháp chẩn đoán hiện đại, cho kết quả xét nghiệm nhanh, có khả năng thực hiện tự động với số lƣợng mẫu lớn; có thể sử dụng đa mồi, và trình tự dò. Bằng kĩ thuật sinh học phân tử, số lƣợng vi khuẩn có trong mẫu đƣợc định lƣợng, điều này tạo điều kiện thuận lợi cho theo dõi kết quả điều trị lâm sàng và tiên lƣợng bệnh, cũng nhƣ cho các nghiên cứu thực hành.
Tại Việt Nam, nghiên cứu của tác giả Đoàn Trọng Tuyên và cộng sự (2010) đã xây dựng đƣợc quy trình kỹ thuật chẩn đoán bệnh sốt mò trên máu bệnh nhân mắc bệnh bằng kỹ thuật Nested-PCR và Duplex-PCR. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là độ nhạy, độ đặc hiệu cao, có khả năng phát hiện sớm mầm bệnh.