Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên 56 kda tái tổ hợp từ orientia tsutsugamushi trong escherichia coli

Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp từ Orientia tsutsugamushi trong Escherichia coli, góp phần vào y học.

• Tác giả: Trịnh Văn Toàn
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Bảo Yên
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp từ Orientia tsutsugamushi trong Escherichia coli
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: Tác nhân gây bệnh
• 1.1. Đặc điểm lâm sàng bệnh sốt mò
• 1.2. Đáp ứng miễn dịch của sốt mò
• 1.3. Chẩn đoán bệnh sốt mò
• 1.4. Điều trị
• 1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh sốt mò trên thế giới và Việt Nam
• 1.5.1. Trên thế giới
• 1.5.2. Tại Việt Nam
• 1.6. Cơ sở nghiên cứu kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp
• 1.6.1. Kháng nguyên màng 56 kDa
• 1.6.2. Nghiên cứu tạo kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp trong chẩn đoán sốt mò
• 1.6.3. Công nghệ protein tái tổ hợp
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 2.1. Các chủng vi sinh vật và plasmid
• 2.2. Máy móc và thiết bị
• 2.3. Vật tƣ tiêu hao
• 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Nhân gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa bằng phƣơng pháp PCR. Điện di ADN trên gel agarose. Tạo dòng tế bào biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa
• 2.4.2. Biểu hiện kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp trong tế bào E. coli Rosseta
• 2.4.3. Điện di SDS – PAGE
• 2.4.4. Thẩm tách miễn dịch Western blot
• 2.4.5. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực
• 2.4.5.1. Thẩm tách loại muối
• 2.4.6. Một số phần mềm sử dụng trong luận văn
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tách dòng và biểu hiện đoạn gen mã hoá kháng nguyên 56 kDa trong E. coli
• 3.2. Khuếch đại các đoạn gen mã hoá kháng nguyên 56 kDa bằng phƣơng pháp PCR
• 3.3. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa
• 3.4. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa trong vi khuẩn E. coli
• 3.5. Kiểm tra mức độ phản ứng của protein tái tổ hợp với mẫu huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật Western blot
• 3.6. Lựa chọn một số điều kiện biểu hiện kháng nguyên 56 kDa
• 3.6.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng
• 3.6.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG đến quá trình tổng hợp kháng nguyên 56 kDa
• 3.6.3. Ảnh hƣởng của thời gian thu mẫu đến sinh tổng hợp kháng nguyên 56 kDa
• 3.7. Tinh sạch kháng nguyên 56 kDa
• 3.7.1. Xử lý tiền tinh chế
• 3.7.2. Kết quả tinh sạch kháng nguyên 56 kDa sắc ký ái lực
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về kháng nguyên 56 kDa từ Orientia tsutsugamushi

Kháng nguyên 56 kDa từ Orientia tsutsugamushi là một trong những yếu tố quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh sốt mò. Vi khuẩn này gây ra nhiều ca bệnh nghiêm trọng tại khu vực Châu Á - Thái Bình Dương. Kháng nguyên này có nồng độ cao trong tế bào và được phát hiện trong hầu hết các mẫu huyết thanh của bệnh nhân. Việc nghiên cứu và sản xuất kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp từ E. coli sẽ giúp cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán bệnh.

1.1. Đặc điểm của kháng nguyên 56 kDa

Kháng nguyên 56 kDa có trọng lượng phân tử lớn và biểu hiện chủ yếu trên màng tế bào của O. tsutsugamushi. Nó đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Nghiên cứu cho thấy kháng nguyên này có thể được sử dụng để phát hiện kháng thể IgM và IgG trong huyết thanh bệnh nhân, giúp chẩn đoán bệnh sốt mò một cách nhanh chóng và chính xác.

1.2. Vai trò của kháng nguyên trong chẩn đoán bệnh

Kháng nguyên 56 kDa được sử dụng rộng rãi trong các xét nghiệm huyết thanh học như ELISA và Western blot. Những phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của kháng thể kháng O. tsutsugamushi trong cơ thể. Điều này rất quan trọng trong việc chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời bệnh sốt mò.

II. Thách thức trong nghiên cứu kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp

Mặc dù kháng nguyên 56 kDa có nhiều tiềm năng trong chẩn đoán bệnh sốt mò, nhưng việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp từ E. coli gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như độ tinh khiết của protein, khả năng biểu hiện và tính ổn định của kháng nguyên là những yếu tố cần được giải quyết.

2.1. Vấn đề về độ tinh khiết của kháng nguyên

Để đảm bảo độ chính xác trong chẩn đoán, kháng nguyên 56 kDa cần được tinh chế một cách hiệu quả. Các phương pháp như sắc ký ái lực và điện di SDS-PAGE thường được sử dụng để đạt được độ tinh khiết cao. Tuy nhiên, việc tối ưu hóa các điều kiện tinh chế vẫn là một thách thức lớn.

2.2. Khả năng biểu hiện trong E. coli

Việc biểu hiện kháng nguyên 56 kDa trong E. coli có thể gặp khó khăn do sự khác biệt trong cấu trúc protein giữa vi khuẩn và tế bào người. Cần phải điều chỉnh các yếu tố như nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ IPTG và thời gian thu mẫu để đạt được mức độ biểu hiện tối ưu.

III. Phương pháp nghiên cứu kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp

Nghiên cứu kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp từ Orientia tsutsugamushi trong E. coli được thực hiện thông qua các phương pháp sinh học phân tử hiện đại. Các bước chính bao gồm tách dòng gen, biểu hiện protein và tinh chế kháng nguyên.

3.1. Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên

Quá trình tách dòng gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa được thực hiện bằng phương pháp PCR. Gen này sau đó được đưa vào plasmid tái tổ hợp để tạo dòng tế bào biểu hiện. Việc lựa chọn mồi PCR và điều kiện phản ứng là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả tách dòng.

3.2. Biểu hiện và tinh chế kháng nguyên

Sau khi tạo dòng tế bào biểu hiện, kháng nguyên 56 kDa được biểu hiện trong E. coli. Các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ và thời gian cần được tối ưu hóa để đạt được sản lượng protein cao. Sau đó, kháng nguyên được tinh chế bằng các phương pháp như sắc ký ái lực và điện di SDS-PAGE để đảm bảo độ tinh khiết cần thiết cho các xét nghiệm chẩn đoán.

IV. Ứng dụng thực tiễn của kháng nguyên 56 kDa trong chẩn đoán

Kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp có nhiều ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sốt mò. Việc sử dụng kháng nguyên này trong các bộ kit xét nghiệm giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác bệnh, từ đó giảm thiểu tỷ lệ tử vong do bệnh sốt mò.

4.1. Bộ kit chẩn đoán nhanh

Bộ kit chẩn đoán nhanh sử dụng kháng nguyên 56 kDa cho phép phát hiện kháng thể IgM và IgG trong huyết thanh bệnh nhân chỉ trong vòng 15-20 phút. Điều này giúp bác sĩ có thể đưa ra quyết định điều trị kịp thời, giảm thiểu nguy cơ biến chứng cho bệnh nhân.

4.2. Đánh giá hiệu quả chẩn đoán

Nghiên cứu cho thấy bộ kit chẩn đoán dựa trên kháng nguyên 56 kDa có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương với các phương pháp truyền thống như ELISA và Western blot. Điều này mở ra cơ hội cho việc sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện tuyến dưới, nơi có nhu cầu chẩn đoán nhanh và chính xác.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu kháng nguyên 56 kDa

Nghiên cứu kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp từ Orientia tsutsugamushi trong E. coli không chỉ giúp cải thiện khả năng chẩn đoán bệnh sốt mò mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu về vaccine và điều trị bệnh. Việc phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh sẽ góp phần quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh.

5.1. Tương lai của nghiên cứu kháng nguyên

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc nghiên cứu và sản xuất kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp sẽ ngày càng trở nên dễ dàng hơn. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và mở rộng ứng dụng của kháng nguyên trong các lĩnh vực khác nhau.

5.2. Tầm quan trọng của kháng nguyên trong y học

Kháng nguyên 56 kDa không chỉ có giá trị trong chẩn đoán mà còn có thể được nghiên cứu để phát triển vaccine phòng ngừa bệnh sốt mò. Điều này sẽ giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh sốt mò (scrub typhus) do vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc Orientia tsutsugamushi gây ra là một trong những bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm hàng đầu tại khu vực châu Á - Thái Bình Dương. Hàng năm, thế giới ghi nhận khoảng 1 triệu ca mắc mới và hơn 1 tỷ người thường xuyên sống trong vùng nguy cơ lây nhiễm. Tại Việt Nam, dịch tễ học bệnh sốt mò diễn biến phức tạp, lưu hành rộng khắp các quân khu và nhiều địa phương như Yên Bái, Hà Giang, Quảng Ninh. Triệu chứng lâm sàng của bệnh rất đa dạng, dễ nhầm lẫn với sốt xuất huyết hoặc sốt rét, khiến tỷ lệ chẩn đoán sai tại tuyến cơ sở lên tới 81% và dẫn đến nguy cơ tử vong lên đến 30% khi không được điều trị kịp thời.

Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là tiến hành tách dòng, tối ưu hóa điều kiện biểu hiện và tinh sạch protein kháng nguyên bề mặt 56 kDa tái tổ hợp từ 4 chủng O. tsutsugamushi lưu hành phổ biến nhất tại Việt Nam gồm HT09 (chủng Karp), YB50 (chủng Kato), HT11 (chủng Gilliam) và HT49 (chủng TA763) trong hệ thống vi khuẩn Escherichia coli. Nghiên cứu được thực hiện tại Hà Nội trong giai đoạn 2018–2019, giải quyết triệt để bài toán thiếu hụt kháng nguyên chuẩn độ tinh sạch cao. Kết quả đạt được tạo tiền đề kỹ thuật vững chắc để tự chủ sản xuất các bộ kit ELISA chẩn đoán nhanh, nâng cao độ nhạy phát hiện bệnh lên trên 95% và hạ giá thành xét nghiệm y tế trong nước.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lý thuyết cấu trúc kháng nguyên vi sinh vật và công nghệ protein tái tổ hợp trong tế bào nhân sơ. Kháng nguyên màng ngoài 56 kDa là protein chiếm từ 10% đến 15% tổng lượng protein tế bào của O. tsutsugamushi, đóng vai trò quyết định trong cơ chế xâm nhập tế bào chủ và kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Cấu trúc gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa gồm 4 vùng bảo tồn và 4 vùng biến đổi (VDI đến VDIV). Trong đó, 3 vùng quyết định kháng nguyên (ADI, ADII, ADIII) nằm ở đầu N phân tử mang tính sinh miễn dịch cao nhất và đặc hiệu loài rõ rệt.

Hệ thống biểu hiện được lựa chọn dựa trên mô hình vector plasmid pLATE51 kết hợp chủng chủ E. coli Rosetta 1 mang đột biến khuyết protease và bổ sung plasmid pRARE chứa các tRNA hiếm. Cơ chế cảm ứng phiên mã được điều hòa chặt chẽ bởi promoter T7 và chất cảm ứng IPTG, đồng thời tích hợp peptide tín hiệu pelB cùng đuôi 6xHistidine nhằm hỗ trợ định hướng phân tử và tối ưu hóa quy trình tinh sạch ái lực kim loại cố định.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm sử dụng mẫu DNA tổng số tách chiết từ huyết thanh của 4 bệnh nhân được khẳng định nhiễm 4 kiểu gen O. tsutsugamushi đại diện tại Việt Nam: HT09 (nhóm Karp, chiếm 62,6% tỷ lệ lưu hành), YB50 (nhóm Kato, 12,1%), HT11 (nhóm Gilliam, 9,1%) và HT49 (nhóm TA763, 9,1%). Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm bao phủ toàn diện các biến chủng dịch tễ học thực tế.

Quy trình khuếch đại gen sử dụng kỹ thuật PCR hai bước với cặp mồi chuyên biệt P51KARPF và P51KARPR để thu nhận đoạn gen kích thước khoảng 1,2 kb. Sản phẩm gen sau đó được gắn định hướng vào vector pLATE51 bằng kỹ thuật LIC và biến nạp vào tế bào E. coli DH5α trước khi chuyển sang chủng biểu hiện E. coli Rosetta 1. Việc kiểm tra kích thước đoạn chèn được đối chiếu qua giải trình tự Sanger với độ tương đồng đạt 99%.

Phương pháp sắc ký ái lực cột Ni2+ HiTrap HP Chelating 5 ml kết hợp biến tính bằng ure 6 M được lựa chọn nhằm thu hồi triệt để protein từ thể vùi (inclusion bodies). Quá trình loại muối và tái gấp cuộn protein được thực hiện qua phương pháp thẩm tích giảm dần nồng độ ure từ 6 M, 4 M, 2 M về 0 M. Khả năng tương tác miễn dịch được kiểm chứng bằng kỹ thuật Western blot sử dụng kháng thể IgM từ huyết thanh bệnh nhân ở độ pha loãng 1:5000.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã nhân bản thành công 4 đoạn gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên 56 kDa với kích thước từ 1113 bp đến 1200 bp. Khối lượng phân tử của các protein tái tổ hợp sau biểu hiện được ghi nhận chính xác trên bản điện di SDS-PAGE 12,6%: HT09 đạt 46 kDa, HT11 đạt 44 kDa, HT49 đạt 46 kDa và YB50 đạt 48 kDa.

Quá trình khảo sát điều kiện sinh tổng hợp đã xác định các thông số tối ưu mang tính đặc thù cho từng chủng. Nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng đạt hiệu suất cao nhất tại 37°C đối với HT09 và YB50, trong khi HT11 và HT49 cho sản lượng tốt nhất tại 30°C. Nồng độ IPTG tối ưu được ghi nhận ở mức 0,1 mM cho HT09 và HT11; 0,25 mM cho HT49 và 0,5 mM cho YB50. Thời gian thu hoạch sinh khối lý tưởng nhất của cả 4 chủng là đúng 3 giờ sau khi bổ sung chất cảm ứng.

Toàn bộ 4 kháng nguyên tái tổ hợp tồn tại ở dạng không tan (thể vùi) và được hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm chứa ure 6 M. Sau khi qua cột sắc ký ái lực Ni2+, protein tinh sạch thu được chủ yếu ở phân đoạn rửa giải 100 mM Imidazole với độ tinh sạch đồng nhất trên 95%. Năng suất biểu hiện protein đạt mức ấn tượng: HT09 đạt 31,3 mg/L (nồng độ 12,57 mg/ml), HT11 đạt 28,6 mg/L (11,6 mg/ml), HT49 đạt 22,15 mg/L (8,98 mg/ml) và YB50 đạt 19,77 mg/L (8,02 mg/ml).

Thảo luận kết quả

Các kết quả thực nghiệm có thể được hệ thống hóa rõ ràng thông qua biểu đồ tăng trưởng mật độ quang OD600 kết hợp bảng phân tích mật độ quang học của các băng điện di. Việc protein 56 kDa tạo thể vùi trong E. coli là hiện tượng phổ biến do tốc độ dịch mã diễn ra quá nhanh dưới sự điều khiển của promoter T7 mạnh, khiến chuỗi polypeptide chưa kịp gấp cuộn chính xác.

Quyết định sử dụng nồng độ ure 6 M thay vì ure 8 M đã chứng minh ưu thế vượt trội khi vừa hòa tan hiệu quả protein đích, vừa giảm thiểu chi phí hóa chất và hạn chế biến tính không hồi phục các epitop nhận diện. Năng suất thu hồi protein trong công trình này (19,77–31,3 mg/L) cao hơn gấp 1,5 đến 3 lần so với các công bố quốc tế trước đây của một số nhóm tác giả nước ngoài (chỉ đạt từ 10 đến 20 mg/L). Phản ứng Western blot cho thấy cả 4 kháng nguyên sau tinh sạch và tái gấp cuộn đều phản ứng đặc hiệu mạnh với kháng thể IgM huyết thanh bệnh nhân tại vị trí vạch băng khoảng 50 kDa, khẳng định cấu trúc không gian của các epitop ADI-ADIII đã được phục hồi hoàn chỉnh.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển giao kết quả nghiên cứu vào thực tiễn y tế dự phòng, bốn nhóm giải pháp chiến lược được đề xuất:

• Tối ưu hóa quy trình lên men quy mô pilot: Nâng cấp hệ thống nuôi cấy từ bình tam giác lên nồi lên men tự động bioreactor dung tích 10–50 lít. Mục tiêu kiểm soát chính xác nồng độ oxy hòa tan và pH để tăng mật độ tế bào, nâng năng suất protein lên trên 50 mg/L trong vòng 6 đến 12 tháng tới do Viện Y sinh nhiệt đới chủ trì.
• Chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán đa giá: Phối trộn 4 kháng nguyên tái tổ hợp HT09, HT11, HT49 và YB50 theo tỷ lệ kháng nguyên chuẩn hóa nhằm phát triển bộ kit multi-epitope ELISA. Mục tiêu đạt độ nhạy trên 98% và độ đặc hiệu trên 96%, thực hiện trong lộ trình 12–18 tháng với sự phối hợp của các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế.
• Mở rộng thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm: Tổ chức đánh giá mù đôi trên tối thiểu 500 mẫu huyết thanh bệnh nhân nghi nhiễm sốt mò tại các bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh ở miền Bắc và miền Trung trong giai đoạn 1–2 năm tới, dưới sự giám sát chuyên môn của Cục Y tế Dự phòng.
• Tự động hóa hệ thống tinh sạch protein: Áp dụng hệ thống sắc ký lỏng FPLC công nghiệp kết hợp cột lọc gel tái gấp cuộn liên tục. Giải pháp này giúp cắt giảm 25–30% chi phí dung môi, rút ngắn thời gian tinh sạch xuống dưới 2 giờ mỗi mẻ sản xuất do các phòng thí nghiệm trọng điểm thực hiện trong 6 tháng tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và dữ liệu thực nghiệm của luận văn mang lại giá trị thiết thực cho 4 nhóm đối tượng:

• Nhà nghiên cứu và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ Sinh học: Nắm vững quy trình thiết kế đoạn mồi, kỹ thuật nhân dòng LIC không phụ thuộc enzyme cắt giới hạn và phương pháp xử lý protein thể vùi bằng sắc ký ái lực trong điều kiện biến tính.
• Đơn vị sản xuất sinh phẩm y tế và thiết bị chẩn đoán in vitro: Khai thác quy trình công nghệ biểu hiện protein kháng nguyên 56 kDa với chi phí thấp, năng suất cao để chủ động nguồn nguyên liệu sản xuất kit ELISA thương mại hóa.
• Bác sĩ truyền nhiễm và cán bộ xét nghiệm lâm sàng: Hiểu sâu về đặc tính kháng nguyên học và sự phân bố kiểu gen của vi khuẩn O. tsutsugamushi tại Việt Nam, từ đó nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán phân biệt các hội chứng sốt cấp tính.
• Cơ quan quản lý y tế và chuyên gia dịch tễ học: Sử dụng dữ liệu phân bố kiểu gen của 4 chủng lưu hành chính để xây dựng hướng dẫn giám sát, chẩn đoán sớm và xây dựng phác đồ can thiệp dịch bệnh sốt mò hiệu quả trong cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

Kháng nguyên 56 kDa có ưu điểm gì vượt trội so với các protein khác của vi khuẩn sốt mò? Kháng nguyên 56 kDa là protein phong phú nhất trên màng ngoài O. tsutsugamushi, chiếm 10–15% tổng lượng protein vi khuẩn. Protein này chứa các vùng quyết định kháng nguyên ADI–ADIII có tính sinh miễn dịch cực mạnh, tạo phản ứng bắt cặp đặc hiệu cao với kháng thể IgM và IgG, hoàn toàn không xuất hiện phản ứng chéo với các loài Rickettsia gây bệnh sốt núi đá khác.

Tại sao protein tái tổ hợp lại biểu hiện dưới dạng thể vùi và được xử lý ra sao? Do mức độ biểu hiện quá cao trong tế bào chất của E. coli, protein 56 kDa kết tụ thành dạng thể vùi không tan. Nghiên cứu đã xử lý thành công bằng cách siêu âm phá màng tế bào, sau đó hòa tan triệt để bằng đệm ure 6 M và tinh sạch qua cột Ni2+ trước khi thẩm tích loại muối từng bước để hồi tính protein.

Việc kết hợp cả 4 chủng kháng nguyên HT09, HT11, HT49 và YB50 mang lại lợi ích gì? Vi khuẩn sốt mò có tính đa dạng kháng nguyên rất lớn với hơn 30 chủng khác nhau. Bằng cách kết hợp 4 chủng đại diện chiếm trên 90% cơ cấu lưu hành tại Việt Nam (Karp, Kato, Gilliam, TA763), kit chẩn đoán sẽ bao phủ toàn bộ các phân type huyết thanh thực tế, hạn chế tối đa nguy cơ âm tính giả.

Việc tối ưu nồng độ IPTG và nhiệt độ nuôi cấy có ý nghĩa kinh tế như thế nào? Chất cảm ứng IPTG có giá thành rất cao trong điều kiện phòng thí nghiệm. Việc hạ nồng độ IPTG xuống mức 0,1–0,25 mM mà vẫn đạt sản lượng tối đa giúp giảm từ 50% đến 75% chi phí hóa chất cảm ứng, đồng thời nhiệt độ 30–37°C giúp duy trì sự ổn định của plasmid biểu hiện.

Protein sau khi tinh sạch trong môi trường ure 6 M có giữ được hoạt tính miễn dịch không? Sau khi tinh sạch, nồng độ ure được loại bỏ dần qua các bước thẩm tích phân đoạn (4 M, 2 M về 0 M). Kết quả Western blot khẳng định protein tái tổ hợp cuộn xoắn chính xác, bắt cặp đặc hiệu 100% với kháng thể IgM từ huyết thanh bệnh nhân ở độ pha loãng cao 1:5000.

Kết luận

• Đã tách dòng và biểu hiện thành công 4 đoạn gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa (kích thước ~1,2 kb) của các chủng HT09, HT11, HT49 và YB50 trong E. coli Rosetta 1.
• Xác lập được bộ thông số công nghệ biểu hiện tối ưu riêng cho từng chủng: nhiệt độ 30–37°C, nồng độ IPTG 0,1–0,5 mM và thời gian thu sinh khối chuẩn xác 3 giờ.
• Xây dựng quy trình xử lý thể vùi và tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni2+ trong đệm ure 6 M, đạt độ sạch đồng nhất trên 95%.
• Đạt năng suất sinh tổng hợp vượt trội từ 19,77 mg/L đến 31,3 mg/L, đồng thời chứng minh khả năng bắt cặp đặc hiệu 100% với kháng thể IgM của bệnh nhân.
• Đóng góp quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh, làm chủ công nghệ sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ chế tạo kit ELISA chẩn đoán sốt mò tại Việt Nam.

Trong giai đoạn 2024–2025, hướng nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung chuẩn hóa quy trình lên men công nghiệp và phối chế kháng nguyên tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán thương mại. Các viện nghiên cứu và doanh nghiệp y tế quan tâm có thể tiếp cận chuyển giao công nghệ để đưa sản phẩm vào ứng dụng thực tiễn lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh sốt mò hay sốt bụi rậm (scrub typhus) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, lƣu hành và đe dọa sức khỏe con ngƣời khu vực ở Châu Á - Thái Bình Dƣơng. Theo thống kê, hàng năm trên thế giới có khoảng 1 triệu ca bệnh và trên 1 tỷ ngƣời có nguy cơ mắc bệnh [9, 26]. Bệnh sốt mò thuộc nhóm bệnh lây truyền từ động vật sang ngƣời, tác nhân gây bệnh là Orientia tsutsugamushi (tên gọi trƣớc đây là Rickettsia tsutsugamushi) - một loại vi khuẩn gram âm ký sinh nội bào bắt buộc, truyền bệnh cho ngƣời và vật chủ trung gian qua vết đốt của ấu trùng mò [26]. Các nghiên cứu dịch tễ học của bệnh sốt mò cho thấy khu vực lƣu hành của O.

tsutsugamushi trải rộng từ Pakistan, Afghanistan tới Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, ph a đông của Liên bang Nga tới các quần ở khu vực Đông Nam Thái Bình Dƣơng, ph a bắc của nƣớc c. Bệnh sốt mò nếu đƣợc chẩn đoán và điều trị kịp thời bằng kháng sinh thích hợp, bệnh có thể khỏi sau 3-5 ngày. Tuy nhiên, triệu chứng lâm sàng của sốt mò rất đa dạng và dễ nhầm với các sốt khác nhƣ sốt rét, sốt xuất huyết,. Do vậy, phần lớn bệnh nhân bị chẩn đoán sai dẫn đến tỷ lệ tử vong lên tới 30% [36].

Hiện nay, bên cạnh dựa vào các triệu chứng lâm sàng của bệnh, tại các bệnh viện lớn đã áp dụng nhiều phƣơng pháp chẩn đoán sinh học cho phát hiện nhiễm O. tsutsugamushi bao gồm phân lập vi khuẩn, các xét nghiệm huyết thanh học nhƣ IFA, ELISA, các kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR. Trong đó, phƣơng pháp ELISA dựa trên sự tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng nguyên của vi khuẩn và kháng thể do cơ thể sản xuất ra. Sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ đƣợc phát hiện thông qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang.

Đây là phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm trong chẩn đoán sốt nhƣ nhƣ chẩn đoán nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giá thành xét nghiệm thấp, thích hợp sử dụng ở những vùng lƣu hành bệnh sốt mò. Phân tích bằng Western blot ly giải toàn bộ tế bào O. tsutsugamushi phát hiện thấy ít nhất 4 kháng nguyên protein có trọng lƣợng phân tử lần lƣợt 22 kDa, 47 kDa, 56 kDa và 110 kDa [32]. Trong số các kháng nguyên trên thì kháng nguyên 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 56 kDa biểu hiện có nồng độ cao ngoài màng, chiếm 10-15% protein tổng số tế bào, hầu hết huyết thanh bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng sốt mò đều nhận thấy kháng nguyên 56 kDa với hiệu giá cao.

Kháng nguyên 56 kDa mang t nh đặc hiệu cao và không biểu hiện ở các nhóm Rickettsia gây bệnh sốt núi đá khác [22]. Bởi vậy, đây là kháng nguyên đã đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong ứng dụng phân loại và chẩn đoán bệnh sốt mò. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật di truyền, kháng nguyên 56 kDa đã đƣợc sản xuất bằng công nghệ ADN tái tổ hợp để làm nguyên liệu phục vụ cho các xét nghiệm chẩn đoán miễn dịch O. Hiện nay, tại các bệnh viện tuyến lớn, số lƣợng các ca bệnh sốt không rõ nguyên nhân ngày càng tăng cao, nhu cầu chẩn đoán nhanh và ch nh xác bệnh sốt mò ngày càng lớn.

Vì vậy, nghiên cứu chế tạo bộ kit cho phát hiện nhanh và chính xác bệnh sốt mò đóng vai trò rất quan trọng. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN 56 KDA TÁI TỔ HỢP TỪ Orientia tsutsugamushi TRONG Escherichia coli”, kết quả nghiên cứu của đề tài tạo tiền đề cho nghiên cứu sản xuất bộ kit ELISA dùng trong chẩn đoán sốt mò. Mục tiêu nghiên cứu: - Tách dòng và biểu hiện các đoạn gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên 56 kDa của O. tsutsugamushi trong tế bào E.

- Tinh chế các kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1. Tác nhân gây bệnh Sốt mò là bệnh sốt cấp tính do vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc Orientia tsutsugamushi gây ra (hình 1). Orientia có t nh đa dạng cao (trên 30 chủng), có cấu trúc kháng nguyên rất khác nhau [6].

tsutsugamushi thƣờng sống ký sinh trong các loài mò, có ổ dịch trên các trảng bìa rừng, nơi đất ẩm nhiều cây con bụi rậm, các bãi cỏ ven sông suối, trên nƣơng rẫy trong tự nhiên [26]. Sốt mò là bệnh động vật, chủ yếu trên các thú nhỏ. Ổ bệnh và trung gian truyền bệnh là mò (Leptotrombidium. tsutsugamushi đƣợc truyền qua các giai đoạn phát triển và các thế hệ.

Ấu trùng (Trombiculid) là giai đoạn hút máu và truyền bệnh duy nhất của mò. Khi nở, ấu trùng mò bò lên các ngọn cỏ bám vào các vật chủ ký sinh nhƣ động vật gặm nhấm, mèo, chó… Các loài gặm nhấm là vật chủ kí sinh chính truyền bệnh cho ngƣời. Sinh cảnh tự nhiên của mò là những nơi đất ẩm nhiều cây con bụi rậm, các bãi cỏ ven sông suối, trên nƣơng rẫy, bìa rừng trong tự nhiên [26]. Hình 1: Vi khuẩn O.

tsutsugamushi và ấu trùng mò [7] 1. Đặc điểm lâm sàng bệnh sốt mò Theo nghiên cứu, khoảng 50-70% số bệnh nhân sốt mò xuất hiện vết loét tại vị trí ấu trùng mò đốt (hình 2) [25]. Bệnh thƣờng khởi phát đột ngột, sốt kéo dài từ 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 3-4 ngày và trên 3 tuần khi không điều trị đặc hiệu [37]. Đặc điểm lâm sàng bệnh sốt mò gồm đột ngột bị sốt nhẹ kèm theo các triệu chứng nhức đầu, đau cơ, đổ mồ hôi, xuất hiện hạch bạch huyết và rối loạn nhận thức.

Bệnh nặng dẫn đến các tổn thƣơng ở các cơ quan phủ tạng bao gồm gan to, tổn thƣơng phổi, rối loạn chức năng thận, viêm màng não, giảm tiểu cầu. Bệnh nặng có thể gây đông máu hay xuất huyết có thể xảy ra do hệ quả của cơ chế gây bệnh làm phá vỡ tế bào nội mạc mạch máu của O. Bệnh nhân có tỷ lệ tử vong cao nếu không đƣợc chẩn đoán ch nh xác và điều trị bằng kháng sinh phù hợp. Hình 2: Triệu chứng lâm sàng của bệnh sốt mò [37] Mức độ nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc vào chủng O.

tsutsugamushi lây nhiễm. Những ngƣời đã đáp ứng miễn dịch với bệnh sốt mò có khả năng tái phát bệnh thấp. Tuy nhiên, ngƣời nhiễm có thể bị tái phát khi nhiễm phải các chủng O. tsutsugamushi có cấu trúc kháng nguyên khác với chủng đã nhiễm trƣớc đó.

tsutsugamushi có thể tồn tại trong các hạch bạch huyết từ 1-2 năm sau khi nhiễm trùng và không đƣợc điều trị [34]. Đáp ứng miễn dịch của sốt mò Nhiễm O. tsutsugamushi ở ngƣời gây đáp ứng miễn dịch tế bào. Trong giai đoạn phát bệnh, kháng thể IgM xuất hiện sớm và hiệu giá tăng nhanh trong 2-3 tuần, sau đó giảm nhanh trong khoảng 4-5 tuần.

Kháng thể IgG xuất hiện và tăng nhanh trong 2 tuần đầu tiên, đạt đỉnh vào tuần thứ 4 và sau đó giảm chậm đến tháng 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Miễn dịch sau khi nhiễm sốt mò chỉ có tác dụng bảo vệ với chủng O. tsutsugamushi gây bệnh mà không có tác dụng bảo vệ đối với chủng O. Ở ngƣời nhiễm sốt mò, O.

tsutsugamushi phát triển chủ yếu trong các mao mạch, gây tổn thƣơng ở các cơ quan nhƣ phổi, gan, lách và thận. Chẩn đoán bệnh sốt mò Bệnh sốt mò nếu không đƣợc chẩn đoán và điều trị bằng kháng sinh phù hợp dẫn đến tỷ lệ tử vong cao lên đến 30% [36]. Trƣớc đây, chẩn đoán sốt mò thƣờng dựa trên triệu chứng lâm sàng và tiền sử của bệnh nhân. Bệnh sốt mò có triệu chứng giống với các sốt khác nhƣ sốt rét, sốt xuất huyết, sốt do Leptospira, vì vậy, việc chẩn đoán dễ bị nhầm lẫn dẫn đến kết quả chẩn đoán sai, gây ảnh hƣởng đến quá trình điều trị bệnh.

Hiện nay, chẩn đoán sốt mò thƣờng kết hợp dựa trên triệu chứng lâm sàng của bệnh và các kỹ thuật xét nghiệm hiện đại khác. Phản ứng Wei -Felix: O. tsutsugamushi có chung một vài kháng nguyên với vi khuẩn Proteus vulgaris dòng OX-K. Vì vậy, huyết thanh bệnh nhân sốt mò sẽ ngƣng kết vi khuẩn Proteus vulgaris dòng OX-K (phản ứng Weil-Felix).

Kỹ thuật Weil-Felix có giá trị trong chẩn đoán sơ bộ bệnh sốt mò, sốt chuột, sốt núi đá. Hiệu giá ngƣng kết sẽ đạt giá trị cao nhất vào cuối tuần thứ 3, thứ 4, sau đó giảm nhanh, và thƣờng biến mất sau tuần thứ 5 hoặc thứ 6. Phản ứng có độ nhạy, độ đặc hiệu thấp, tỷ lệ dƣơng t nh giả cao khoảng 20% [31]. Phản ứng kết hợp bổ thể với kháng nguyên O.

tsutsugamushi: Nhằm định lƣợng kháng thể kháng O. tsutsugamushi với hiệu giá huyết thanh thấp. Thực hiện phản ứng này đòi hỏi phải có nhiều loại kháng nguyên khác nhau do cấu trúc kháng nguyên O. tsutsugamushi khác nhau tùy theo từng địa phƣơng và không ngƣng kết chéo [24].

Xét nghiệm này có độ nhạy thấp, chỉ đƣợc dùng trong điều tra dịch tễ học về mức độ lƣu hành của bệnh tại một địa phƣơng. tsutsugamushi đƣợc phân lập từ mẫu máu hay vết loét hoại tử, mẫu sau đó đƣợc nghiền và tiêm vào phúc mạc của chuột nhắt 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Chuột bị nhiễm bệnh có thể chết sau 10-18 ngày với các triệu chứng nhƣ viêm màng bụng, gan và lách to. Trên tiêu bản hiển vi áp in tế bào lách hay tế bào phúc mạc, sau khi đã đƣợc cố định bằng cồn methyl và nhuộm theo phƣơng pháp Giemsa, cho thấy có song cầu trong tế bào và ở ngoại bào bắt màu t a [26].

Xét nghiệm này cho kết quả chẩn đoán ch nh xác bệnh sốt mò. Tuy nhiên, thời gian phân lập lâu, không phù hợp trong chẩn đoán bệnh sớm, gây khó khăn cho quá trình điều trị. K thuật inh học ph n t dựa trên khuếch đại ADN: Đây là phƣơng pháp chẩn đoán hiện đại, cho kết quả xét nghiệm nhanh, có khả năng thực hiện tự động với số lƣợng mẫu lớn; có thể sử dụng đa mồi, và trình tự dò. Bằng kĩ thuật sinh học phân tử, số lƣợng vi khuẩn có trong mẫu đƣợc định lƣợng, điều này tạo điều kiện thuận lợi cho theo dõi kết quả điều trị lâm sàng và tiên lƣợng bệnh, cũng nhƣ cho các nghiên cứu thực hành.

Tại Việt Nam, nghiên cứu của tác giả Đoàn Trọng Tuyên và cộng sự (2010) đã xây dựng đƣợc quy trình kỹ thuật chẩn đoán bệnh sốt mò trên máu bệnh nhân mắc bệnh bằng kỹ thuật Nested-PCR và Duplex-PCR. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là độ nhạy, độ đặc hiệu cao, có khả năng phát hiện sớm mầm bệnh.