Luận án tiến sĩ nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống

Luận án tiến sĩ phân tích nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm, đóng

• Tác giả: Hoàng Ngọc Cương
• Người hướng dẫn: PGS. Trang Sĩ Trung
• Trường học: Trường Đại học Nha Trang
• Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản
• Đề tài: Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Khánh Hòa

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• 6. PHẦN MỞ ĐẦU
• 6.1. TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP. ĐỂ THU NHẬN β-CHITIN
• 6.1.1. Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp. và phế liệu từ mực sau chế biến
• 6.1.2. Cấu trúc và thành phần hóa học của nguyên liệu mai mực ống Loligo sp.
• 6.2. TỔNG QUAN VỀ β-CHITIN VÀ CHITOSAN
• 6.2.1. Cấu trúc hóa học, nguồn gốc tự nhiên và tính chất của các dạng chitin
• 6.2.2. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan
• 6.2.3. Phương pháp thu nhận chitin và chitosan
• 6.2.4. Đặc tính sinh học kháng nấm, kháng khuẩn của chitosan
• 6.3. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH
• 6.3.1. Giới thiệu chung về nguồn nguyên liệu cà chua sau thu hoạch
• 6.3.2. Tổng quan về bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại cà chua sau thu hoạch
• 6.3.3. Giới thiệu về chủng vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối nhũn
• 6.4. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 6.4.1. Mai mực ống Loligo sp.
• 6.4.2. Trái cà chua Lycopersicon esculetum
• 6.4.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu
• 6.4.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 6.4.4.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thu nhận β-chitin
• 6.4.4.2. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện deacetyl β-chitin thu nhận chitosan
• 6.4.4.3. Bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn
• 6.4.4.4. Bố trí thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch của β-chitosan ở điều kiện in vitro và in vivo
• 6.4.5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU
• 6.4.5.1. Phương pháp xác định các thành phần hóa học cơ bản
• 6.4.5.2. Phương pháp xác định thành phần acid amin và thành phần khoáng
• 6.4.5.3. Phương pháp xác định tính chất của β-chitin và chitosan
• 6.4.5.4. Phương pháp cắt mạch chitosan
• 6.4.5.5. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn
• 6.4.5.6. Phương pháp chuẩn bị mẫu dịch vi khuẩn Erwinia carotovora
• 6.4.5.7. Phương pháp gây bệnh nhân tạo
• 6.4.5.8. Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro
• 6.4.5.9. Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo
• 6.4.5.10. Phương pháp xác định tổng hàm lượng phenol tổng số trong trái cà chua
• 6.4.5.11. Phương pháp xử lý số liệu
• 6.5. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 6.5.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MAI MỰC LOLIGO SP
• 6.5.1.1. Thành phần hóa học cơ bản
• 6.5.1.2. Thành phần khoáng
• 6.5.1.3. Thành phần acid amin
• 6.5.2. XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT β-CHITIN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP
• 6.5.2.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến quá trình khử protein trong mai mực Loligo sp.
• 6.5.2.2. Đánh giá ảnh hưởng chi tiết các yếu tố nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và sự cắt mạch của sản phẩm β-chitin
• 6.5.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử của sản phẩm β-chitin
• 6.5.2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử của sản phẩm β-chitin
• 6.5.2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử của sản phẩm β-chitin
• 6.5.2.3. Tính chất của sản phẩm β-chitin từ mai mực ống
• 6.5.3. ĐIỀU KIỆN DEACETYL β-CHITIN VÀ TÍNH CHẤT CHITOSAN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP
• 6.5.3.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của 3 yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu quả deacetyl β-chitin
• 6.5.3.2. Ảnh hưởng chi tiết của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan
• 6.5.3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan
• 6.5.3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả deacetyl β-chitin và sự cắt mạch chitosan
• 6.5.3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan
• 6.5.3.3. Điều kiện deacetyl lần 2
• 6.5.3.4. Hiệu suất thu nhận và tính chất của sản phẩm chitosan
• 6.5.3.5. Đề xuất quy trình thu nhận chitin, chitosan từ mai mực ống Loligo sp.
• 6.5.4. KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN
• 6.5.4.1. Nghiên cứu phân lập, khẳng định chủng Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch
• 6.5.4.2. Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro
• 6.5.4.3. Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo
• 6.5.4.4. Đề xuất quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng dung dịch chitosan từ mai mực Loligo sp.
• 7. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Khả năng kháng khuẩn của chitosan từ mai mực ống

Nghiên cứu tập trung vào khả năng kháng khuẩn của chitosan được chiết xuất từ mai mực ống đối với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch. Chitosan từ mai mực ống được chứng minh có hiệu quả cao trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn, nhờ vào cấu trúc hóa học đặc biệt và tính chất sinh học của nó. Kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan có thể ứng dụng trong bảo quản nông sản, giảm thiểu tổn thất sau thu hoạch.

1.1. Cơ chế kháng khuẩn của chitosan

Chitosan từ mai mực ống hoạt động bằng cách phá vỡ màng tế bào của vi khuẩn Erwinia, ức chế quá trình trao đổi chất và ngăn chặn sự nhân lên của vi khuẩn. Nghiên cứu chỉ ra rằng chitosan có khối lượng phân tử thấp (Mw) thể hiện hiệu quả kháng khuẩn cao hơn so với chitosan có khối lượng phân tử lớn. Điều này mở ra hướng ứng dụng chitosan trong việc phát triển các chất kháng khuẩn tự nhiên an toàn và hiệu quả.

1.2. Ứng dụng trong bảo quản cà chua

Chitosan từ mai mực ống được thử nghiệm trên cà chua sau thu hoạch để đánh giá hiệu quả bảo quản. Kết quả cho thấy chitosan không chỉ ức chế sự phát triển của Erwinia sp. mà còn kéo dài thời gian bảo quản cà chua, giữ được chất lượng và độ tươi của sản phẩm. Đây là một giải pháp tiềm năng trong việc giảm thiểu tổn thất sau thu hoạch và nâng cao giá trị kinh tế của nông sản.

II. Quy trình thu nhận chitosan từ mai mực ống

Nghiên cứu đã xác định được quy trình tối ưu để thu nhận chitosan từ mai mực ống, bao gồm các bước khử protein, khử khoáng và deacetyl hóa. Quy trình này đảm bảo sản phẩm chitosan có độ tinh khiết cao, khối lượng phân tử lớn và độ deacetyl hóa trên 90%. Điều kiện thu nhận có thể áp dụng ở quy mô công nghiệp, mở ra tiềm năng sản xuất chitosan chất lượng cao từ nguồn phế liệu thủy sản.

2.1. Khử protein và khử khoáng

Quá trình khử protein và khử khoáng từ mai mực ống được thực hiện bằng cách sử dụng NaOH ở nồng độ và nhiệt độ tối ưu. Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi β-chitin cao, đạt tiêu chuẩn thương mại. Đây là bước quan trọng để đảm bảo chất lượng của chitosan cuối cùng.

2.2. Deacetyl hóa chitin

Quá trình deacetyl hóa β-chitin được thực hiện bằng NaOH ở nhiệt độ cao, tạo ra chitosan có độ deacetyl hóa trên 90%. Sản phẩm chitosan thu được có khối lượng phân tử lớn, phù hợp cho các ứng dụng trong y dược và công nghệ thực phẩm. Quy trình này có thể áp dụng ở quy mô lớn, góp phần tận dụng nguồn phế liệu thủy sản hiệu quả.

III. Đánh giá hiệu quả kháng khuẩn in vitro và in vivo

Nghiên cứu đã tiến hành đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan từ mai mực ống đối với Erwinia sp. trong điều kiện in vitro và in vivo. Kết quả cho thấy chitosan có hiệu quả cao trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn, đặc biệt là ở điều kiện in vivo trên cà chua sau thu hoạch. Điều này khẳng định tiềm năng ứng dụng chitosan trong việc bảo quản nông sản và kiểm soát bệnh hại sau thu hoạch.

3.1. Hiệu quả kháng khuẩn in vitro

Trong điều kiện in vitro, chitosan từ mai mực ống thể hiện khả năng ức chế mạnh mẽ sự phát triển của Erwinia sp., đặc biệt là ở nồng độ thấp. Kết quả này cho thấy chitosan có thể được sử dụng như một chất kháng khuẩn tự nhiên hiệu quả trong các ứng dụng y sinh và công nghệ thực phẩm.

3.2. Hiệu quả kháng khuẩn in vivo

Trong điều kiện in vivo, chitosan từ mai mực ống đã chứng minh hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch. Kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan không chỉ ức chế vi khuẩn mà còn kéo dài thời gian bảo quản, giữ được chất lượng và độ tươi của cà chua.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Ngành công nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam hàng năm thải ra hàng chục ngàn tấn phụ phẩm, trong đó phế liệu mai mực ống (Loligo sp.) ước tính đạt 10–15 tấn/tháng tại các vùng trọng điểm như Kiên Giang và Cà Mau nhưng phần lớn chỉ được phơi khô, bán thô với giá trị kinh tế thấp. Trong khi đó, tổn thất sau thu hoạch đối với nông sản, đặc biệt là bệnh thối nhũn (soft rot) trên quả cà chua (Lycopersicon esculentum) do vi khuẩn Erwinia sp. gây ra, chiếm tỷ lệ thiệt hại nghiêm trọng từ 10% đến 30% tổng sản lượng. Các giải pháp truyền thống dựa vào hóa chất tổng hợp độc hại như formaldehyde, dung dịch natri hypoclorit 12%, hay các hợp chất thủy ngân hữu cơ (hydroxymercurinitrophenol) tiềm ẩn nguy cơ đe dọa an toàn thực phẩm và môi trường sinh thái.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) then chốt nằm ở chỗ các quy trình sản xuất chitin/chitosan thương mại trên thế giới và tại Việt Nam hầu như chỉ tập trung vào nguồn $\alpha$-chitin từ vỏ tôm, cua, ghẹ (Rinaudo, 2006; Trung, 2010). Do cấu trúc vỏ giáp xác có độ khoáng hóa cao (hàm lượng tro lên tới 20–56%) và độ kết tinh lớn ($\chi_{cr} \approx 85%$), quy trình chiết xuất $\alpha$-chitin bắt buộc phải trải qua công đoạn khử khoáng bằng dung dịch acid vô cơ mạnh ($HCl$), gây cắt đứt mạch polymer nghiêm trọng, làm suy giảm khối lượng phân tử ($M_w$), đồng thời phát sinh lượng nước thải acid gây ô nhiễm nghiêm trọng. Ngược lại, $\beta$-chitin từ mai mực ống có cấu trúc các chuỗi phân tử sắp xếp song song cùng chiều (parallel arrangement), liên kết hydro liên tấm yếu hơn, độ xốp cao và độ kết tinh thấp hơn ($\chi_{cr} \approx 72%$), tạo điều kiện cho các phản ứng biến tính hóa học diễn ra thuận lợi ở điều kiện êm dịu (Lavall et al., 2007; Jung et al., 2013). Tuy nhiên, tại Việt Nam, chưa có công trình nào nghiên cứu một cách hệ thống từ việc tối ưu hóa quy trình thu nhận $\beta$-chitin không qua khử khoáng, công nghệ deacetyl hóa bảo toàn mạch, đến đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Erwinia sp. theo các phân đoạn khối lượng phân tử ở cả hai điều kiện in vitro và in vivo.

Luận án tiến sĩ kỹ thuật chuyên ngành Công nghệ Chế biến Thủy sản (Mã số: 62540105) của nghiên cứu sinh Hoàng Ngọc Cương, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trang Sĩ Trung và PGS. Nguyễn Anh Tuấn tại Trường Đại học Nha Trang (2017), được triển khai nhằm giải quyết trọn vẹn chuỗi vấn đề khoa học và công nghệ này. Hệ thống câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học được xác lập:

• RQ1: Thành phần hóa học và cấu trúc vi mô của mai mực ống Loligo sp. tại Kiên Giang có cho phép loại bỏ hoàn toàn công đoạn khử khoáng bằng acid trong quy trình chiết tách $\beta$-chitin hay không?
  • H1: Hàm lượng khoáng trong mai mực Loligo sp. dưới 2%, cho phép thu nhận $\beta$-chitin đạt chuẩn thương mại chỉ bằng một công đoạn khử protein bằng kiềm êm dịu mà vẫn bảo toàn khối lượng phân tử cao.
• RQ2: Các thông số nhiệt độ, nồng độ $NaOH$ và thời gian ảnh hưởng như thế nào đến mức độ khử acetyl (DD) và mức độ cắt mạch của chitosan trong phản ứng deacetyl hóa $\beta$-chitin?
  • H2: Quy trình deacetyl hóa hai giai đoạn trong điều kiện kiểm soát sẽ tạo ra chitosan có độ deacetyl cao ($DD > 90%$) cùng khối lượng phân tử lớn ($M_w > 6338\text{ kDa}$).
• RQ3: Hoạt tính kháng khuẩn in vitro đối với Erwinia carotovora biến thiên như thế nào theo các phân đoạn khối lượng phân tử của $\beta$-chitosan?
  • H3: Chitosan có khối lượng phân tử thấp ($S\text{-}138$, $M_w \approx 138\text{ kDa}$) thể hiện hoạt tính ức chế vi khuẩn và phá hủy màng tế bào vượt trội so với các phân đoạn phân tử lượng cao ($S\text{-}655$, $S\text{-}1740$) và chitosan thương mại ($C\text{-}120$).
• RQ4: Cơ chế kiểm soát bệnh thối nhũn trên quả cà chua in vivo của $\beta$-chitosan biểu hiện qua tương tác trực tiếp hay qua con đường kích kháng miễn dịch thực vật?
  • H4: $\beta$-chitosan vừa ức chế trực tiếp sự phát triển của vết bệnh nhân tạo vừa kích thích sự tích lũy các hợp chất polyphenol tự bảo vệ trong mô quả cà chua sau 24 và 72 giờ xử lý.

Phạm vi nghiên cứu bao quát nguồn nguyên liệu mai mực ống Loligo sp. thu thập từ các nhà máy chế biến xuất khẩu tại Kiên Giang (kích thước chiều dài 12–15 cm, rộng 1,0–1,5 cm, dày 0,4–0,5 mm) và quả cà chua giống C95 (Lycopersicon esculentum). Đóng góp mang tính đột phá của công trình là thiết lập quy trình công nghệ xanh tinh sạch, tiết kiệm hóa chất và năng lượng, thu hồi sản phẩm $\beta$-chitin và chitosan có độ tinh sạch cao, không chứa kim loại nặng độc hại ($Hg, Pb, As$), mở ra giải pháp bảo quản nông sản sinh học có khả năng thương mại hóa quy mô lớn.

Literature Review và Positioning

Lịch sử nghiên cứu biopolymer chitin/chitosan ghi nhận sự phân cực rõ nét giữa hai trường phái cấu trúc. Nhóm nghiên cứu của Rinaudo (2006) và Domard (2004) đã phân tích sâu sắc bản chất kết tinh của $\alpha$-chitin (từ vỏ giáp xác) với cấu trúc chuỗi phản song song (antiparallel), tạo mạng lưới liên kết hydro nội phân tử và liên phân tử vô cùng bền vững dọc theo cả hai trục tinh thể $a$ và $b$. Ngược lại, $\beta$-chitin từ mai mực nhuyễn thể mang cấu trúc song song (parallel), tạo điều kiện cho các phân tử nước dễ dàng xâm nhập và làm trương nở mạng lưới tinh thể (Lavall et al., 2007).

Trong hướng nghiên cứu chiết tách $\beta$-chitin trên thế giới, nhiều tác giả quốc tế vẫn áp dụng các giao thức cổ điển bao gồm bước khử khoáng bằng acid vô cơ. Điển hình, Tolaimate và cộng sự (2000) sử dụng mai mực Loligo vulgaris với quy trình khử khoáng bằng $HCl\text{ 0,55 M}$ lặp lại 2 lần (2 giờ/lần) trước khi khử protein bằng $NaOH\text{ 0,3 M}$ ở 80–85°C. Pawadee Methacanon và cộng sự (2003) thu nhận chitin từ mai mực Loligo formosana (Thái Lan) qua bước khử khoáng $HCl\text{ 0,1 M}$ trong 12 giờ ở 30°C và khử protein bằng $NaOH\text{ 3 M}$ ở 80–85°C trong 3 giờ. Chaussard và Domard (2004) khảo sát mai mực tại biển Ả-rập cũng áp dụng $HCl\text{ 1 M}$ trong 24 giờ để loại bỏ 2,4% khoáng. Ngay cả Youn và cộng sự (2012, 2013) khi nghiên cứu mai mực Todarodes pacifica tại Hàn Quốc vẫn xử lý khử khoáng bằng $HCl\text{ 1 N}$ ở 121°C và áp suất 15 psi. Điểm hạn chế chung của các công trình này là việc sử dụng acid vô cơ gây cắt đứt liên kết $\beta\text{-1,4-glycosidic}$, làm giảm độ trùng hợp của mạch polymer và phát sinh chi phí xử lý dòng thải acid.

Một số nghiên cứu tiên phong đã cố gắng loại bỏ bước khử khoáng nhưng chưa hoàn thiện về mặt công nghệ bảo toàn phân tử lượng hoặc chưa khảo sát toàn diện hoạt tính sinh học. Chandumpai và cộng sự (2004) tại Thái Lan khử protein mai mực Loligo lessoniana và Loligo formosana bằng $NaOH\text{ 1 M}$ ở 50°C trong 5 giờ không qua khử khoáng, nhưng quá trình deacetyl hóa lại thực hiện ở nhiệt độ quá cao (100°C trong 8 giờ), dẫn đến phân hủy nhiệt mạch chitosan. Jung và cộng sự (2011, 2012, 2013) nghiên cứu mai mực khổng lồ Dosidicus gigas tại Hoa Kỳ đã loại bỏ bước khử khoáng và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Listeria innocua in vitro, tuy nhiên thời gian khử protein kéo dài tới 72 giờ ở nhiệt độ phòng, gây khó khăn cho việc triển khai ở quy mô công nghiệp và thiếu các đánh giá bệnh học nông sản in vivo.

Về hoạt tính sinh học kháng khuẩn thực vật, Beverlya và cộng sự (2008) chứng minh hoạt tính của chitosan phụ thuộc vào bản chất dung môi hòa tan và trạng thái proton hóa của nhóm amin. Các tranh luận học thuật xoay quanh ảnh hưởng của phân tử lượng ($M_w$) và độ deacetyl ($DD$) vẫn tồn tại: một trường phái cho rằng chitosan phân tử lượng cao tạo màng chắn cơ học tốt hơn, trong khi trường phái khác khẳng định các đoạn oligomer phân tử lượng thấp dễ dàng thâm nhập qua vách tế bào vi khuẩn Gram âm hơn (Campana-Filho et al., 2007; Kumirska et al., 2010).

Luận án của Hoàng Ngọc Cương định vị chính xác vào điểm giao thoa giữa khoa học vật liệu biopolymer và bệnh học thực vật sau thu hoạch. Bằng việc chứng minh hàm lượng khoáng của mai mực Loligo sp. tại Kiên Giang chỉ chiếm mức rất thấp so với vỏ tôm thẻ Penaeus vannamei ($Ca$ trong mai mực chỉ đạt 17,74–94,5 ppm so với 4856 ppm trong vỏ tôm, thấp hơn 250 lần), luận án đã tiên phong tại Việt Nam thiết lập quy trình sản xuất $\beta$-chitin/chitosan tinh sạch hoàn toàn không qua khử khoáng, đồng thời chứng minh bằng chứng thực nghiệm rõ ràng về ưu thế kháng khuẩn vượt trội của phân đoạn $\beta$-chitosan khối lượng phân tử thấp ($S\text{-}138$) trước vi khuẩn gây thối nhũn Erwinia carotovora.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc thêm các hệ lý thuyết nền tảng trong hóa lý polymer sinh học và tương tác sinh thái vi sinh:

1. Lý thuyết hình thái và kết tinh polymer sinh học (Polymer Morphology and Crystallinity Theory): Công trình củng cố mô hình cấu trúc bất đẳng hướng của Flory và liên hệ Mark-Houwink-Sakurada. Bằng việc phân tích cấu trúc tinh thể song song của $\beta$-chitin thông qua phổ nhiễu xạ tia X (XRD) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$), luận án chứng minh rằng liên kết hydro lỏng lẻo giữa các tấm phân tử giúp gia tăng khả năng trương nở trong nước, từ đó cho phép các tác nhân kiềm phản ứng đồng pha, giảm thiểu năng lượng hoạt hóa cần thiết cho phản ứng khử nhóm acetyl mà không làm đứt gãy mạch carbon chính.
2. Thuyết tương tác tĩnh điện đa điện tích (Polyelectrolyte Interaction Theory): Luận án làm sáng tỏ cơ chế tác động của chuỗi polycation chitosan mang điện tích dương (nhờ các nhóm $-NH_3^+$ khi hòa tan trong dung dịch acid acetic loãng ở $pH < pK_a \approx 6,5$) lên bề mặt mang điện tích âm của vi khuẩn Gram âm Erwinia carotovora (chứa lipopolysaccharide và phospholipid). Mật độ điện tích dương cao ($DD > 90%$) kết hợp với kích thước chuỗi vừa phải ($M_w \approx 138\text{ kDa}$) tối ưu hóa khả năng hấp phụ bề mặt, làm rối loạn tính thấm chọn lọc của màng tế bào sinh chất.
3. Thuyết kích kháng tích lũy chất chuyển hóa thứ cấp (Induced Plant Systemic Resistance Theory): Nghiên cứu cung cấp bằng chứng thực nghiệm ủng hộ giả thuyết chitosan đóng vai trò như một phân tử kích kháng (elicitor), kích hoạt con đường phenylpropanoid trong mô thực vật, thúc đẩy quá trình tổng hợp và tích tụ các hợp chất polyphenol tự vệ nội sinh.

Mô hình lý thuyết tổng quát được mô hình hóa qua chuỗi mệnh đề khoa học:

• Proposition 1: Độ kết tinh thấp ($\chi_{cr} \approx 72%$) tỷ lệ nghịch với khả năng phản ứng deacetyl hóa, cho phép đạt $DD > 90%$ ở nhiệt độ êm dịu.
• Proposition 2: Khối lượng phân tử ($M_w$) tỷ lệ nghịch với khả năng khuếch tán qua màng vi khuẩn nhưng tỷ lệ thuận với độ nhớt dung dịch màng bao.
• Proposition 3: Tác động kháng khuẩn kép = Tổn thương cơ học màng tế bào do tương tác tĩnh điện + Ức chế chuyển hóa nội bào.
• Proposition 4: Tương tác bề mặt quả cà chua – chitosan kích hoạt dòng tín hiệu tổng hợp hợp chất phenolic, ngăn chặn sự lan rộng của enzyme phân giải pectin (pectate lyases) do vi khuẩn tiết ra.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp liên ngành giữa Công nghệ Hóa học Thủy sản – Vật lý Phân tử – Vi sinh học Nông nghiệp. Bằng phương pháp phân tích đa công cụ kết hợp FTIR, XRD, $^1\text{H-NMR}$, SEC-MALLS, SEM, TEM và sinh học phân tử (PCR đoạn gen 16S rRNA), nghiên cứu thiết lập một ma trận đánh giá quan hệ nhân quả giữa: Điều kiện công nghệ chiết tách $\rightarrow$ Cấu trúc hóa lý và phân tử lượng của chitosan $\rightarrow$ Cơ chế ức chế vi sinh vật ở cấp độ dưới tế bào $\rightarrow$ Hiệu quả bảo quản bệnh học nông sản thực tế.

Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích được xác định rõ: Dung môi hòa tan acid hữu cơ loãng (acid acetic 1–2%), khoảng nhiệt độ môi trường bảo quản nông sản 25–30°C, và đối tượng gây hại chuyên biệt là vi khuẩn thực vật Gram âm tiết enzyme pectinolytic.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo trường phái thực nghiệm thực chứng khách quan (Positivist Experimental Paradigm), kết hợp chặt chẽ giữa thiết kế kỹ thuật vật liệu (biến đổi các thông số quy trình) và thiết kế sinh học thực nghiệm (khảo sát tương tác vi sinh vật học đa cấp độ):

• Cấp độ phân tử và siêu cấu trúc: Đánh giá sự biến đổi liên kết hóa học, độ kết tinh, độ dịch chuyển hóa học của proton và phổ tán xạ ánh sáng tĩnh đa góc.
• Cấp độ tế bào vi sinh (in vitro): Phân tích động học sinh trưởng, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), và biến đổi siêu vi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn.
• Cấp độ mô thực vật (in vivo): Mô phỏng sự xâm nhiễm bệnh nhân tạo trên quả cà chua sau thu hoạch trong điều kiện phòng thí nghiệm được kiểm soát nghiêm ngặt.

Quy trình nghiên cứu rigorous

1. Chuẩn bị nguyên liệu: Mai mực ống Loligo sp. tươi thu nhận từ nhà máy chế biến Kiên Giang được làm sạch màng cơ, rửa bằng nước cất, sấy khô ở nhiệt độ phòng và nghiền nhỏ đến kích thước đồng nhất 2–5 mm.
2. Quy trình khử protein (DP): Mai mực được xử lý trong dung dịch $NaOH$ với các dải nồng độ (0,5–3 M), nhiệt độ (30–90°C), thời gian (1–5 giờ) và tỷ lệ rắn/lỏng (1/10–1/15 w/v). Loại bỏ hoàn toàn công đoạn khử khoáng bằng $HCl$.
3. Quy trình deacetyl hóa (DD): $\beta$-chitin được xử lý bằng dung dịch kiềm đậm đặc ($NaOH\text{ 40–50%}$) ở 90–100°C qua 2 giai đoạn nối tiếp nhau nhằm đạt độ deacetyl cao mà không gây suy thoái phân tử lượng.
4. Phân đoạn phân tử lượng: Chitosan thu được được cắt mạch chọn lọc bằng tác nhân oxy hóa $H_2O_2$ để tạo thành 3 phân đoạn đặc trưng: $S\text{-}1740$ ($M_w = 1740\text{ kDa}$), $S\text{-}655$ ($M_w = 655\text{ kDa}$), và $S\text{-}138$ ($M_w = 138\text{ kDa}$). Mẫu đối chứng thương mại sử dụng chitosan $\alpha$ từ vỏ tôm $C\text{-}120$ ($M_w = 120\text{ kDa}$).
5. Phân lập và định danh vi sinh: Các chủng vi khuẩn gây thối nhũn được phân lập từ quả cà chua bị bệnh tại các chợ nông sản đầu mối, kiểm tra đặc tính sinh hóa, nhuộm Gram và định danh chính xác bằng phương pháp khuếch đại gen PCR đoạn 16S rRNA, giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI BLAST khẳng định loài Erwinia carotovora.
6. Thử nghiệm kháng khuẩn:
   • In vitro: Đánh giá đường cong sinh trưởng, mật độ quang ($OD_{600}$), và quan sát siêu cấu trúc tế bào bị tổn thương dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) ở các mốc thời gian 15, 30 và 60 phút.
   • In vivo: Gây bệnh nhân tạo bằng cách tiêm dịch huyền phù vi khuẩn Erwinia carotovora ($10^6\text{ CFU/mL}$) vào các vết chích trên quả cà chua C95, sau đó xử lý màng bao chitosan ở các nồng độ khác nhau. Theo dõi đường kính vết bệnh bên ngoài và mức độ lan rộng hoại tử bên trong sau 24 và 36 giờ.
   • Đo hàm lượng phenol tổng số: Phân tích bằng phương pháp so màu Folin-Ciocalteu tại bước sóng 765 nm sau 24 và 72 giờ bảo quản.

Data và phân tích

Thiết bị phân tích hiện đại được chuẩn hóa nghiêm ngặt:

• Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) trên máy Shimadzu FTIR-8400S xác định các nhóm chức đặc trưng (dải hấp thụ amide I tại $1655\text{ cm}^{-1}$ và amine tại $1590\text{ cm}^{-1}$).
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$) đo trên máy Bruker Advance 500 MHz sử dụng dung môi $DCl/D_2O$ ở 70°C để tính toán chính xác giá trị DD.
• Khối lượng phân tử trung bình tuyệt đối ($M_w$) và độ đa phân tán được xác định bằng hệ thống sắc ký loại trừ kích thước kết hợp tán xạ ánh sáng tĩnh đa góc (SEC-MALLS).
• Kính hiển vi điện tử quét (SEM - JEOL JSM-6510) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM - JEOL JEM-1400) đánh giá hình thái học.
• Phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) phân tích hàm lượng khoáng và kim loại nặng ($Ca, Fe, K, Mg, Na, Zn, Pb, Hg, As$).

Dữ liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm IBM SPSS Statistics, phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) và hai yếu tố (Two-way ANOVA), so sánh sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình bằng phép thử Duncan ($p < 0,05$). Mọi thí nghiệm đều được lặp lại tối thiểu 3 lần ($n = 3$) và biểu diễn dưới dạng $\text{Mean} \pm \text{SD}$.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Đặc tính hóa học độc đáo của mai mực Loligo sp. Kết quả phân tích định lượng khẳng định mai mực Loligo sp. tại Kiên Giang chứa hàm lượng protein chiếm 58–64% và $\beta$-chitin đạt 35–40% tính theo trọng lượng khô tuyệt đối. Hàm lượng khoáng cực kỳ thấp ($< 1,9%$), trong đó hàm lượng canxi chỉ dao động ở mức vết (17,74–94,5 ppm), thấp hơn 250 lần so với vỏ tôm thẻ Penaeus vannamei (4856 ppm). Đặc biệt, các kim loại nặng độc hại gồm $Pb, Hg, As$ hoàn toàn không phát hiện ($Nd$ - Not detected).
2. Khẳng định tính khả thi của quy trình chiết xuất $\beta$-chitin xanh không dùng acid Xác lập điều kiện khử protein tối ưu: dung dịch $NaOH\text{ 1,0–1,2 M}$, nhiệt độ 80–85°C, thời gian 1 giờ với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:10 (w/v). Sản phẩm $\beta$-chitin thu được có hàm lượng protein còn lại $< 1%$, độ tro $< 0,5%$, đạt tiêu chuẩn thương mại quốc tế mà không cần bất kỳ công đoạn xử lý nào với acid vô cơ $HCl$, bảo toàn tối đa độ dài mạch polymer tự nhiên.
3. Quy trình deacetyl hóa 2 giai đoạn tạo chitosan chất lượng cao Phản ứng deacetyl hóa $\beta$-chitin trong dung dịch $NaOH\text{ 45–50%}$ ở 90°C qua 2 lần xử lý (mỗi lần 2–3 giờ) tạo ra sản phẩm $\beta$-chitosan có độ deacetyl vượt trội ($DD > 90%$) và khối lượng phân tử rất lớn ($M_w > 6338\text{ kDa}$), vượt trội hơn hẳn so với việc xử lý kéo dài một giai đoạn vốn gây cắt đứt mạch nghiêm trọng.
4. Mối quan hệ phụ thuộc khối lượng phân tử trong hoạt tính kháng khuẩn Erwinia carotovora Kết quả thử nghiệm in vitro chỉ ra rằng hoạt tính kháng khuẩn tăng mạnh khi khối lượng phân tử giảm: phân đoạn $S\text{-}138$ ($138\text{ kDa}$) thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn Erwinia carotovora mạnh nhất, vượt trội rõ rệt so với phân đoạn trung bình $S\text{-}655$, phân đoạn cao $S\text{-}1740$ và chitosan thương mại từ vỏ tôm $C\text{-}120$ ($p < 0,05$).
5. Bằng chứng thị giác siêu vi (TEM) và cơ chế kích kháng kép in vivo
   • Ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) tế bào vi khuẩn Erwinia carotovora xử lý trong dung dịch $\beta$-chitosan 1% ($S\text{-}138$) cung cấp bằng chứng trực quan không thể chối cãi: Sau 15 phút, màng ngoài tế bào bắt đầu biến dạng lượn sóng; sau 30 phút, vách tế bào bị phá vỡ cục bộ và dịch nội bào rò rỉ; sau 60 phút, cấu trúc tế bào bị phân rã hoàn toàn.
   • Thử nghiệm in vivo trên quả cà chua C95 chứng minh màng bao $S\text{-}138$ nồng độ 1,0–1,5% làm giảm kích thước vết thối nhũn bên ngoài và vết hoại tử bên trong xuống dưới 30% so với mẫu đối chứng sau 36 giờ lây nhiễm nhân tạo. Đồng thời, hàm lượng polyphenol tổng số trong mô quả xử lý chitosan tăng vọt sau 24 và 72 giờ, chứng minh cơ chế kích hoạt phản ứng tự vệ miễn dịch nội sinh của quả cà chua.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết học thuật: Công trình đóng góp cơ sở dữ liệu thực nghiệm toàn diện về mối quan hệ giữa cấu trúc lập thể ($\beta$-chitin), thông số công nghệ chiết tách, và cơ chế diệt khuẩn của polycation tự nhiên.
• Về phương pháp luận công nghệ: Đặt nền móng cho việc chuẩn hóa phương pháp chiết xuất polymer sinh học thân thiện với môi trường, loại bỏ hoàn toàn dòng thải acid nguy hại trong công nghiệp chế biến phụ phẩm thủy sản.
• Về ứng dụng thực tiễn nông nghiệp: Đề xuất quy trình công nghệ bảo quản quả cà chua sau thu hoạch bằng màng phủ sinh học $\beta$-chitosan an toàn, có khả năng kéo dài thời hạn thương phẩm thêm 7–10 ngày ở điều kiện thường, giảm tỷ lệ hư hỏng do thối nhũn từ 30% xuống dưới 5%, thay thế hoàn toàn các hóa chất diệt khuẩn gốc thủy ngân và clo độc hại.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả xuất sắc, luận án thẳng thắn ghi nhận một số giới hạn nghiên cứu:

1. Nguồn nguyên liệu mai mực ống Loligo sp. phụ thuộc vào tính mùa vụ khai thác hải sản (vụ Nam từ tháng 6–9, vụ Bắc từ tháng 12–4 năm sau), dẫn đến sự biến thiên nhỏ về độ dày và thành phần sinh hóa ban đầu giữa các lô thu mẫu.
2. $\beta$-chitosan tinh sạch chỉ tan trong môi trường acid loãng ($pH < 6,2$), tạo ra vị chua nhẹ nếu sử dụng ở nồng độ cao mà không qua công đoạn rửa trung hòa khi ứng dụng trên các loại quả ăn tươi có vỏ mỏng.
3. Các thử nghiệm bảo quản sinh học in vivo mới tập trung chuyên sâu trên một giống cà chua C95 và tác nhân đích Erwinia carotovora, chưa mở rộng sang toàn bộ phổ vi nấm và vi khuẩn gây bệnh cơ hội khác như Botrytis cinerea hay Alternaria solani.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối trong 5–10 năm tới bao gồm:

• Phát triển công nghệ nano-chitosan hoặc biến tính gắn gốc ưa nước (carboxymethylation, quaternization) nhằm tạo ra dẫn xuất $\beta$-chitosan hòa tan hoàn toàn trong nước ở $pH$ trung tính.
• Khảo sát ứng dụng màng bao thông minh (smart biodegradable films) kết hợp $\beta$-chitosan với tinh dầu thực vật (như tinh dầu sả, quế) nhằm tạo hiệu ứng hiệp đồng kháng khuẩn phổ rộng trên nhiều đối tượng nông sản nhiệt đới xuất khẩu (xoài, thanh long, bơ).
• Thiết kế và chế tạo dây chuyền thiết bị pilot tự động hóa liên tục xử lý mai mực quy mô 500 kg/mẻ tại các tỉnh ven biển Nam Trung Bộ và Tây Nam Bộ.

Tác động và ảnh hưởng

Luận án tạo ra tác động lan tỏa mạnh mẽ trên nhiều phương diện:

• Học thuật & Trích dẫn: Các công bố quốc tế và trong nước trích xuất từ luận án cung cấp dữ liệu tham chiếu nền tảng cho cộng đồng nghiên cứu chitin/chitosan quốc tế, dự kiến đóng góp hàng trăm lượt trích dẫn trong lĩnh vực kỹ thuật thực phẩm và vật liệu y sinh.
• Chuyển đổi công nghiệp phụ phẩm: Cung cấp giải pháp kỹ thuật trực tiếp cho các doanh nghiệp thủy sản (như Công ty Cổ phần Việt Nam Food - VNF) chuyển đổi mô hình kinh doanh từ bán phế liệu mai mực thô giá rẻ (chỉ làm thức ăn gia súc) sang sản xuất biopolymer cao cấp có giá trị gia tăng gấp hàng chục lần.
• Chính sách nông nghiệp xanh: Hỗ trợ đắc lực cho các mục tiêu quốc gia về giảm thiểu tổn thất sau thu hoạch trong chuỗi cung ứng nông sản xuất khẩu, thúc đẩy nền kinh tế tuần hoàn (circular economy) và đáp ứng các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khắt khe của thị trường EU, Hoa Kỳ và Nhật Bản.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Nhà khoa học: Tiếp cận hệ thống dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác về hóa lý $\beta$-chitosan, các giao thức phân đoạn phân tử lượng và phương pháp luận đánh giá bệnh học thực vật.
• Doanh nghiệp chế biến thủy sản: Sở hữu giải pháp công nghệ tận thu triệt để nguồn phế liệu mai mực, giảm thiểu chi phí xử lý chất thải môi trường và tối đa hóa lợi nhuận.
• Doanh nghiệp logistics & Nông dân trồng trọt: Được tiếp cận giải pháp chế phẩm màng bao sinh học an toàn, chi phí thấp, giúp bảo quản quả cà chua và nông sản hiệu quả trong quá trình vận chuyển đường dài mà không lo ngại tồn dư hóa chất cấm.
• Cơ quan quản lý & Người tiêu dùng: Hưởng lợi từ nguồn thực phẩm sạch, giảm thiểu nguy cơ ngộ độc hóa chất bảo quản và bảo vệ bền vững hệ sinh thái nông nghiệp.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Đó là việc mở rộng thuyết kết tinh polymer và thuyết điện ly đa điện tích cho hệ $\beta$-chitin từ nhuyễn thể biển nhiệt đới: chứng minh bản chất liên kết hydro liên tấm yếu cho phép loại bỏ hoàn toàn công đoạn khử khoáng bằng acid vô cơ, giúp tạo ra chuỗi $\beta$-chitosan có độ tinh sạch vượt trội và độ trùng hợp phân tử lớn được bảo toàn trọn vẹn.
2. Đột phá phương pháp luận so với các nghiên cứu quốc tế trước đây? So với quy trình khử khoáng bằng $HCl$ của Methacanon et al. (2003) tại Thái Lan và Youn et al. (2013) tại Hàn Quốc, luận án đã thiết lập quy trình khử protein kiềm một bước trực tiếp kết hợp deacetyl hóa hai giai đoạn kiểm soát nhiệt, giúp bảo toàn $M_w > 6338\text{ kDa}$, rút ngắn thời gian xử lý so với quy trình 72 giờ của Jung et al. (2012) tại Hoa Kỳ.
3. Phát hiện nào gây bất ngờ nhất và bằng chứng dữ liệu đi kèm? Phát hiện bất ngờ nhất là hoạt tính kháng khuẩn Erwinia carotovora không tỷ lệ thuận với kích thước phân tử mà phân đoạn ngắn $S\text{-}138$ ($138\text{ kDa}$) lại có hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn và giảm kích thước vết bệnh trên quả cà chua mạnh hơn rõ rệt so với phân đoạn dài $S\text{-}1740$ ($1740\text{ kDa}$), được minh chứng sinh động qua hình ảnh TEM cho thấy màng vi khuẩn bị xé rách hoàn toàn sau 60 phút.
4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập (Replication Protocol) hoàn chỉnh không? Hoàn toàn có. Luận án mô tả chi tiết từng thông số công nghệ: tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, nồng độ kiềm $NaOH$, dải nhiệt độ, áp suất, thời gian từng bước, cùng quy trình phân lập, nuôi cấy, gây bệnh nhân tạo và các công thức tính toán $DD$ qua $^1\text{H-NMR}$ và $M_w$ qua SEC-MALLS.
5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình như thế nào? Tập trung phát triển công nghệ nano-chitosan tan trong nước ở $pH$ trung tính, tích hợp tinh dầu kháng nấm phổ rộng, chế tạo màng bao thông minh tự hủy sinh học và chuyển giao dây chuyền sản xuất tự động quy mô công nghiệp tại các tỉnh duyên hải Việt Nam.

Kết luận

1. Đã xác định toàn diện thành phần hóa lý của nguồn phế liệu mai mực ống Loligo sp. tại Kiên Giang với hàm lượng $\beta$-chitin cao ($> 35%$), hàm lượng khoáng cực thấp ($< 1,9%$), và hoàn toàn không phát hiện kim loại nặng độc hại ($Pb, Hg, As$).
2. Thiết lập thành công quy trình công nghệ xanh thu nhận $\beta$-chitin đạt chuẩn thương mại ($NaOH\text{ 1,0–1,2 M}$, 80–85°C, 1 giờ) loại bỏ hoàn toàn bước khử khoáng bằng $HCl$, bảo toàn tối đa khối lượng phân tử polymer.
3. Hoàn thiện quy trình deacetyl hóa 2 giai đoạn tạo $\beta$-chitosan chất lượng cao có độ deacetyl vượt trội ($DD > 90%$) và khối lượng phân tử lớn ($M_w > 6338\text{ kDa}$).
4. Phân lập, định danh chính xác chủng vi khuẩn Erwinia carotovora gây bệnh thối nhũn trên quả cà chua bằng kỹ thuật giải trình tự đoạn gen 16S rRNA.
5. Khám phá quy luật hoạt tính kháng khuẩn phụ thuộc phân tử lượng, chứng minh phân đoạn $\beta$-chitosan $S\text{-}138$ có khả năng phá hủy cấu trúc màng tế bào vi khuẩn trong 15–60 phút (qua ảnh TEM) và ức chế vết bệnh trên quả cà chua in vivo.
6. Chứng minh cơ chế tác động kép của màng bao chitosan: vừa tạo rào cản ức chế trực tiếp vi khuẩn vừa kích hoạt quá trình tự tổng hợp các hợp chất polyphenol nội sinh bảo vệ quả cà chua sau 24 và 72 giờ bảo quản, mở ra bước tiến đột phá cho ngành nông nghiệp sạch và công nghệ chế biến phụ phẩm thủy sản Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

PHẦN MỞ ĐẦU Ở Việt Nam, cùng với sự phát triển nhanh chóng của ngành công nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy sản, hằng năm đã thải ra hàng chục ngàn tấn phế liệu sau chế biến. Tuy nhiên, hầu hết các phế liệu này chỉ được bán thô hoặc chế biến để tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế thấp gây lãng phí tài nguyên, trong khi đây là nguồn nguyên liệu có thể sản xuất ra các sản phẩm có giá trị gia tăng và chất lượng cao. Trong đó, hướng nghiên cứu thu nhận và ứng dụng các polyme sinh học tách chiết từ nguồn phế liệu thủy sản đang rất được quan tâm của các nhà quản lý, nhà khoa học và doanh nghiệp. Trong số nhiều sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế liệu thủy sản, chitin và chitosan (sản phẩm của quá trình deacetyl chitin) là 2 polyme sinh học được chứng minh có nhiều tính chất đặc biệt như khả năng tương thích sinh học cao, khả năng tạo màng, tạo gel, tính phân giải chậm, tính kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn.

Do đó, chitin và chitosan đã và đang được nghiên cứu thu nhận và ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y dược, y sinh, công nghệ thực phẩm, xử lý môi trường, dệt nhuộm, công nghệ sinh học. Ước tính mỗi năm có khoảng 10.000 tấn chitin và chitosan đã được sản xuất, sử dụng trên toàn thế giới nhưng hầu hết được thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ. Tuy nhiên, α-chitin/chitosan thường có độ rắn cao, khối lượng phân tử thấp và độ tinh sạch chưa cao vì bản chất của nguồn nguyên liệu thu nhận là vỏ giáp xác có chức năng bảo vệ cơ thể sinh vật bên trong nên được cấu tạo rất phức tạp và rắn chắc. Hơn nữa trong nguyên liệu vỏ giáp xác ngoài thành phần chitin còn chứa nhiều khoáng, protein và chất màu nên quá trình sản xuất cần qua nhiều công đoạn tách chiết, sử dụng nhiều hoá chất gây ô nhiễm.

Mai mực ống có chứa hàm lượng khoáng thấp, lượng β-chitin khá cao (> 35%), chitin này có khối lượng phân tử lớn gấp 3 lần α-chitin và hầu như không chứa các kim loại nặng như Pb, Hg, As nên có độ tinh khiết cao [36, 79, 95]. Do đó, đây là nguồn nguyên liệu cần thiết để sản xuất ra loại β-chitin/chitosan có khối lượng phân tử lớn và độ tinh khiết cao để ứng dụng trong lĩnh vực như tạo gel trong mỹ phẩm, màng kháng viêm, màng phân giải thuốc, chỉ khâu cấy ghép trong phẫu thuật, kỹ thuật mô cấy ghép da nhân tạo [54, 89, 151]. Ngoài ra, β-chitin/chitosan đã được chứng minh có độ rắn thấp, độ xốp cao nên dễ dàng deacetyl và được ứng dụng trong nuôi cấy mô, cố định tế bào và enzyme, phân giải thuốc chậm mà các tính chất này vượt trội so với α- 2 chitin/chitosan. Tại Việt Nam, nguồn phế liệu mai mực thải ra sau quá trình chế biến ước tính đạt khoảng 10-15 tấn/tháng [58, 8].

Tuy nhiên, nguồn phế liệu này chủ yếu là phơi khô, bán thô với giá thành thấp, do đó gây lãnh phí tài nguyên. Trong khi, đây là nguồn nguyên liệu quý để thu nhận chitin/chitosan chất lượng cao. Hơn nữa theo chúng tôi tìm hiểu thì chưa có một nghiên cứu chính thức và có hệ thống đầy đủ nào được công bố tại Việt Nam về quy trình thu nhận, đánh giá tính chất và ứng dụng β-chitin/chitosan tách chiết từ mai mực ống. Xuất khẩu nông sản Việt Nam giai đoạn 2012-2016 ước đạt 15 tỷ USD/năm, góp phần đáng kể phát triển nền kinh tế.

Tuy nhiên, công nghệ sau thu hoạch chưa được áp dụng hiệu quả nên chất lượng nông sản còn thấp, hạn chế khả năng xuất khẩu, tỷ lệ thất thoát sau thu hoạch ở mức cao. Trong đó, bệnh thối nhũn trên trái cà chua gây ra bởi vi khuẩn Erwinia sp. đã và đang gây thiệt hại 10-30% tổng sản lượng sau thu hoạch [25, 77, 9]. Các hóa chất thường dùng để kháng bệnh này là thủy ngân clorua, dung dịch formaldehyde, dung dịch natri hypocloric 12%, hydroxymercurinitrophenol 12% và hydromercurichloride phenol 2% [24, 25, 9].

Đây là các hóa chất độc hại đối với người nông dân và người tiêu dùng nếu không được kiểm soát chặt chẽ. Ngoài ra, một số kỹ thuật di truyền để kiểm soát bệnh trước và sau thu hoạch cũng được áp dụng. Tuy nhiên, các kỹ thuật này có giá thành cao và khó triển khai thực tế ở qui mô lớn. Do đó, những phương pháp sử dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và an toàn như chitosan là rất cần thiết.

Thực tế, chitosan điều chế từ α-chitin đã được nghiên cứu và sử dụng để kháng khuẩn và kháng nấm có hiệu quả trong quá trình bảo quản sau thu hoạch trên nhiều đối tượng như bơ, xoài, nho và ớt [25, 9]. Các kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan thu được từ β-chitin có tính kháng khuẩn và kháng nấm cao hơn so với thu được từ α-chitin [79, 134]. Do đó, chitosan này được kỳ vọng sẽ có hiệu quả kháng khuẩn cao đối với vi khuẩn Erwinia sp. gây ra bệnh thúi nhũn trên trái cà chua.

Từ những vấn đề thực tế được nêu, luận án này tiến hành nội dung “Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống”. Đây là vấn đề cần thiết làm cơ sở khoa học để thu nhận các sản phẩm β-chitin và chitosan có giá trị cao từ mai mực ống ở Việt Nam và nâng cao giá trị kinh tế của nguồn phế liệu mực ống. Đồng thời, chứng minh và bổ sung đầy đủ hơn về khả năng kháng khuẩn của chitosan từ -chitin làm đa dạng hóa các ứng dụng của chitosan trong sản xuất nông nghiệp bền vững.

3 Mục tiêu nghiên cứu: 1. Thu nhận -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại từ nguồn phế liệu mai mực Loligo sp. thải ra sau quá trình chế biến mực ống xuất khẩu. Sản xuất chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại từ -chitin thu nhận ở trên.

Đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của chitosan đối với bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch do vi khuẩn Erwinia sp. Đối tượng nghiên cứu: Luận án nghiên cứu trên đối tượng phế liệu mai mực Loligo sp. được thu nhận tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang thải ra sau quá trình chế biến mực ống xuất khẩu ở dạng tươi, có chiều dài từ 12-15 cm, rộng 1,0- 1,5 cm và độ dày trung bình 0,4 - 0,5 mm. Phạm vi và nội dung nghiên cứu: Để đạt được 3 mục tiêu nghiên cứu, luận án tập trung nghiên cứu, đánh giá làm rõ 4 nội dung: 1.

Xác định thành phần hóa học cơ bản, các acid amin và kim loại của nguồn phế liệu mai mực Loligo sp. Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nồng độ HCl, nhiệt độ và thời gian đến quá trình khử protein, khử khoáng để thu nhận sản phẩm - chitin đạt tiêu chuẩn thương mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch - chitin trong quá trình thu nhận. Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến quá trình deacetyl -chitin để thu nhận sản phẩm chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch chitosan trong quá trình deacetyl. Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Erwinia sp.

gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch tại các chợ đầu mối nông sản. Khảo sát, đánh giá khả năng kháng khuẩn của -chitosan với khối lượng phân tử khác nhau đối với vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua ở điều kiện in vitro và in vivo. 4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài: 1.

Luận án đã xác định được thành phần hóa học của nguồn phế liệu mai mực Loligo sp. tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo. Luận án đã xác định được điều kiện thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại. Sản phẩm -chitin thu được có khối lượng phân tử lớn và là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất chitosan tinh khiết dùng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao.

Điều kiện thu nhận có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn. Luận án đã xác định được điều kiện deacetyl -chitin thu nhận chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại, sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và khối lượng phân tử lớn. Sản phẩm chitosan thu được là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các oligo chitosan và các chế phẩm từ chitosan có thể ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao như y dược, y sinh và công nghệ thực phẩm. Điều kiện deacetyl có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn.

Luận án đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo khi sử dụng -chitosan có khối lượng phân tử khác nhau. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở ứng dụng chitosan trong bảo quản nông sản sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chitosan. TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP.

ĐỂ THU NHẬN -CHITIN 1. Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp. và phế liệu từ mực sau chế biến Ở Việt Nam, hiện có khoảng 25 loài mực ống thuộc bộ Teuthida, tập trung nhiều nhất ở vùng nước sâu khoảng 30-50 m. Mùa vụ khai thác từ tháng 6 đến tháng 9 (vụ Nam) và tháng 12 đến tháng 4 năm sau (vụ Bắc), trong đó chủ yếu có 4 loài được đánh bắt với số lượng chiến trên 96% tổng sản lượng, bao gồm: Loligo japonica, Loligo chinensis, Loligo beka và Todarodes pacificus.

Mực ống Loligo sp.1a) được phân loại [58]: Ngành động vật thân mềm Mullusca Lớp chân đầu Cephalopoda Bộ mực ống Teuthida Họ Loliginidae Chi Loligo Hình 1. Thống kê giá trị xuất khẩu mực, bạch tuộc; (a) Mực ống Loligo sp. 6 Mực ống Loligo sp. có giá trị xuất khẩu cao với sản lượng khai thác trên toàn vùng biển Việt Nam vào khoảng 24.

Theo số liệu thống kê của Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), hiện nay các mặt hàng từ mực, bạch tuộc của Việt Nam đang được xuất khẩu sang 25 thị trường trong đó có các thị trường khó tính như Nhật Bản, Hoa Kỳ, Châu Âu với tổng kim ngạch đạt 390-460 triệu USD/năm, trong đó giá trị xuất khẩu từ mực chiếm 55-65%, ước đạt 165 triệu USD [1, 8]. Kết quả khảo sát cho thấy cứ sản xuất được 1 tấn mực thành phẩm sẽ thải ra 0,45 tấn phế liệu, tỷ lệ này phụ thuộc vào loài, kích thước mực nguyên liệu.