Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Trong nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam, cá rô phi (Oreochromis niloticus) là đối tượng nước ngọt có giá trị kinh tế quan trọng và tiềm năng phát triển lớn. Tuy nhiên, sự phát triển của ngành đang đối mặt với thách thức dịch bệnh nghiêm trọng, đặc biệt là bệnh mắt lồi và xuất huyết. Bệnh này bùng phát phổ biến vào các thời điểm giao mùa, mùa hè - thu ở miền Bắc và mùa khô ở miền Nam, do vi khuẩn Streptococcus agalactiae (liên cầu khuẩn nhóm B - GBS) gây ra với tỷ lệ gây chết cao trên cá ở mọi giai đoạn phát triển.
Biện pháp xử lý truyền thống chủ yếu dựa vào thuốc kháng sinh và hóa chất xử lý môi trường. Việc lạm dụng kháng sinh đã dẫn đến hiện tượng gia tăng tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh, gây ô nhiễm hệ sinh thái thủy vực và để lại dư lượng hóa chất trong sản phẩm thủy sản, ảnh hưởng tiêu cực đến tiêu chuẩn an toàn thực phẩm và xuất khẩu. Do đó, xu hướng nghiên cứu sử dụng các nguồn dược liệu tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn đang được đẩy mạnh nhằm hướng tới giải pháp phòng trị bệnh an toàn và bền vững.
Trái nhàu (Morinda citrifolia L.) là nguồn dược liệu phong phú tại Việt Nam, chứa nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học cao như polyphenol và flavonoid. Mặc dù vậy, các hoạt chất trong trái nhàu thường kém phân cực, có vị đắng, mùi nồng đặc trưng, thời gian bảo quản ngắn và sinh khả dụng thấp khi sử dụng trực tiếp. Để khắc phục nhược điểm này, chitosan – một polysaccharide tự nhiên thu nhận từ quá trình deacetyl hóa chitin mang đặc tính không độc, có khả năng phân hủy sinh học và mang điện tích dương – được ứng dụng làm vật liệu mang ở kích thước nano nhằm tăng cường độ ổn định và cải thiện sinh khả dụng của các hoạt chất.
Nghiên cứu "Điều chế hạt nano chitosan trái nhàu và xác định khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trái nhàu trên vi khuẩn Streptococcus agalactiae" được thực hiện nhằm kết hợp cao chiết trái nhàu và chitosan để tạo hạt nano, từ đó đánh giá hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn S. agalactiae phân lập từ cá bệnh.
Mục tiêu của đề tài là đánh giá khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trái nhàu đối với vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây bệnh trên cá rô phi. Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu triển khai 3 nhiệm vụ cụ thể:
- Khảo sát các điều kiện điều chế cao trái nhàu (tỉ lệ bột nhàu : dung môi Methanol 80% và thời gian ngâm chiết).
- Tạo hạt nano chitosan trái nhàu bằng phương pháp gel ion hóa.
- Xác định khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp dung dịch nano chitosan trái nhàu đối với vi khuẩn Streptococcus agalactiae.
Nghiên cứu sử dụng đối tượng là bột trái nhàu khô thương phẩm, chitosan thương mại (độ deacetyl > 75%, HiMedia), Sodium Tripolyphosphate (STPP) và chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae do Phòng Bệnh học Thủy sản cung cấp. Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2022 đến tháng 12/2022 tại Phòng Độc chất học Môi trường (RIBE 106) thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và Phòng Bệnh thủy sản (PV 309) thuộc Khoa Thủy sản, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khung lý thuyết và mô hình nghiên cứu
- Đặc tính thực vật và hóa học của cây nhàu (Morinda citrifolia L.): Cây thuộc chi Morinda, họ Cà phê/Thiến thảo (Rubiaceae). Quả nhàu chứa khoảng 200 hợp chất sinh học, trong đó quả chín chứa 5,27 g/100 g đường khử, 0,033 g/100 g protein, 8,750 g/100 g lipid và 19,33% cellulose, cùng các axit amin, vitamin (C, A, nhóm B, E), khoáng chất và nhóm hợp chất polyphenol, flavonoid có hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế vi sinh vật.
- Vật liệu Chitosan và hệ mang Nano Chitosan: Chitosan cấu tạo từ các đơn vị D-glucosamine liên kết β-(1-4) với N-acetyl-D-glucosamine. Nhóm amino mang điện tích dương ($-NH_3^+$) trong môi trường acid cho phép chitosan tương tác tĩnh điện với màng vi khuẩn mang điện tích âm, gây rối loạn tính thấm màng hoặc tạo phức chelate với kim loại vi lượng. Khi kết hợp với Sodium Tripolyphosphate (STPP) – chất liên kết ngang mang điện tích âm ($-P_3O_{10}^{5-}$), chitosan tạo thành phức hợp gel ion dạng hạt nano hình cầu bảo vệ hoạt chất bên trong.
- Tác nhân vi khuẩn Streptococcus agalactiae: Vi khuẩn Gram dương, hình cầu (đường kính 0,6–1 µm), không sinh nha bào, thuộc bộ Lactobacillales, họ Streptococcaceae (TCVN 8710-21:2019). Vi khuẩn phát triển tối ưu ở 30–37°C và chịu được độ mặn từ 0‰ đến 35‰, là nguyên nhân gây hoại tử, xuất huyết và lồi mắt ở cá rô phi.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Quy trình chiết xuất và khảo sát yếu tố ảnh hưởng: Cân 5 g bột trái nhàu (độ ẩm 11,5%) ngâm với dung môi Methanol (MeOH) 80% theo mô hình đa yếu tố gồm 4 tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (1:3, 1:5, 1:7, 1:10 w/v) và 4 mốc thời gian ngâm (12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ). Các thí nghiệm lặp lại 3 lần. Hiệu suất chiết xuất được tính theo công thức:
$$H = \frac{m}{M} \times 100%$$
(trong đó $m$ là khối lượng cao chiết thu được, $M$ là khối lượng nguyên liệu ban đầu).
- Định tính và định lượng hoạt chất sinh học:
- Định tính Flavonoid: Thực hiện qua 3 phản ứng màu đặc trưng với dung dịch NaOH 1% (chuyển màu đậm), $\text{AlCl}_3$ 1% (chuyển sang vàng tươi) và $\text{FeCl}_3$ 1% (chuyển sang xanh đen/xanh lục).
- Định lượng Polyphenol tổng số (TPC): Tiến hành theo tiêu chuẩn TCVN 9745:2013 (ISO 1450-1:2005) bằng thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% và $\text{Na}_2\text{CO}_3$ 7,5%. Đo độ hấp thụ quang học tại bước sóng 765 nm trên máy quang phổ UV-Vis. Hàm lượng TPC tính theo đường chuẩn acid gallic (dãy nồng độ 10–50 µg/mL), biểu thị bằng mg GAE/g cao chiết.
- Định lượng Flavonoid tổng số (TFC): Xác định bằng phương pháp nhôm clorua theo quy trình của Meilawati (2021) với $\text{NaNO}_2$ 5%, $\text{AlCl}_3$ 10% và NaOH 1M. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 510 nm. Hàm lượng TFC tính theo đường chuẩn Quercetin (dãy nồng độ 1–12,5 µg/mL), biểu thị bằng mg QE/g cao chiết.
- Chế tạo và phân tích đặc tính hạt nano: Áp dụng phương pháp gel ion hóa theo Calvo và cộng sự (1997). Hòa 25 mL dung dịch cao chiết trái nhàu với 25 mL dung dịch chitosan 0,35%, sau đó nhỏ từ từ 20 mL dung dịch STPP 0,6125% dưới lực khuấy từ 1500 rpm. Mẫu được phân tích hình thái bề mặt bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FESEM - Hitachi SU 8010) và xác định kích thước, phân bố hạt bằng thiết bị tán xạ ánh sáng động (DLS - Horiba LB550).
- Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn in vitro:
- Phương pháp khuếch tán đĩa thạch: Cấy trải dịch khuẩn S. agalactiae đạt chuẩn 0.5 McFarland ($10^8\text{ CFU/mL}$) lên đĩa thạch Tryptone Soya Agar (TSA). Đặt đĩa giấy vô trùng đường kính 6 mm đã ngấm 40 µL các mẫu thử: hỗn hợp dung dịch nano chitosan trái nhàu, nano chitosan trắng, cao chiết trái nhàu lỏng, đối chứng dương (Ampicillin 10 µg) và đối chứng âm (nước cất). Ủ ở 37°C trong 24 giờ. Đánh giá độ nhạy dựa theo đường kính vòng vô khuẩn theo phân loại của Muanza và cộng sự (1994).
- Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Sử dụng phương pháp vi pha loãng trên đĩa 96 giếng chứa môi trường Tryptone Soya Broth (TSB) với dãy nồng độ nano chitosan trái nhàu từ 1,95 đến 1000 mg/L. Ủ 37°C trong 24 giờ, sau đó bổ sung 20 µL thuốc thử chỉ thị màu INT DYE 0,05% để xác định sự chuyển màu hồng của giếng có vi khuẩn sống.
- Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC): Hút dịch từ các giếng MIC không đổi màu cấy ria lên đĩa thạch TSA, ủ 37°C trong 24 giờ để xác định nồng độ thấp nhất không còn khuẩn lạc mọc. Đánh giá cơ chế tác động qua tỉ lệ MBC/MIC theo French và cộng sự (2006).
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1. Mục tiêu đề tài và Nội dung nghiên cứu
Chương 1 thiết lập tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thiệt hại thực tế của bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi, tình trạng kháng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản và tiềm năng của việc kết hợp dịch chiết thực vật với vật liệu mang polymer nano. Đề tài xác định rõ mục tiêu tổng quát và phân chia cụ thể thành 3 nội dung nghiên cứu thực nghiệm từ khâu chiết xuất, tổng hợp nano đến đánh giá hoạt tính vi sinh.
Chương 2. Tổng quan tài liệu
Chương 2 tổng hợp cơ sở dữ liệu học thuật gồm 3 khối kiến thức chính:
- Cây nhàu (Morinda citrifolia L.): Vị trí phân loại (bộ Gentianales, họ Rubiaceae), hình thái thực vật học, phân bố sinh thái tại Nam Á, Đông Nam Á và miền Trung - Nam Việt Nam. Tổng hợp các nghiên cứu thành phần hóa học (đường khử, lipid, protein, cellulose, 200 hợp chất thứ cấp) và dược lý học (kháng khuẩn, chống oxy hóa, kháng viêm).
- Chitosan và Nano Chitosan: Cấu trúc hóa học của chitin/chitosan, cơ chế kháng khuẩn qua điện tích nhóm amino, 5 phương pháp tạo hạt nano (micelles pha đảo, lọc qua rây, liên kết chéo nhũ tương, gel ion, kết hợp giọt nhũ tương) và ưu thế của phương pháp gel ion với STPP. Điểm luận các công trình tiền nhiệm về nano chitosan bọc dịch chiết nhàu (Choiri và ctv., 2016; Aisyah và ctv., 2016; Ningsih và ctv., 2019; Zuprizal và ctv., 2020).
- Vi khuẩn Streptococcus agalactiae và bệnh học thủy sản: Lịch sử phân loại vi khuẩn nhóm B, đặc điểm sinh học vi sinh (Gram dương, hình cầu 0,6–1 µm), dấu hiệu bệnh lý mắt lồi, xuất huyết, bơi xoắn ốc và tổn thất kinh tế trên cá rô phi.
Chương 3. Vật liệu và phương pháp
Chương 3 mô tả chi tiết danh mục trang thiết bị (FESEM, DLS, UV-Vis, tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng, tủ cấy vi sinh), hóa chất tinh khiết và môi trường vi sinh (TSA, TSB, McFarland 0.5, thuốc thử INT DYE 0,05%, Folin-Ciocalteu, Quercetin, Gallic acid). Trình bày chi tiết công thức toán học tính độ ẩm, hiệu suất chiết, TPC, TFC; quy trình gel ion phối trộn Chitosan 0,35% và STPP 0,6125%; quy trình khuếch tán đĩa giấy kháng khuẩn và quy trình vi pha loãng xác định MIC/MBC.
Chương 4. Kết quả và thảo luận
Chương 4 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm và thảo luận so sánh với các tài liệu quốc tế:
- Khảo sát điều kiện chiết xuất: Độ ẩm bột nhàu ban đầu đạt 11,5%. Các phản ứng định tính xác nhận mẫu chứa flavonoid. Hiệu suất chiết cao giữa các nghiệm thức tỉ lệ bột nhàu:dung môi và thời gian ngâm dao động từ 32,36% đến 33,17%, không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê ($p > 0,05$). Tuy nhiên, hàm lượng TPC và TFC biến thiên rõ rệt giữa các nghiệm thức:
- Tỉ lệ 1:10 ở mốc 36 giờ cho giá trị TPC cao nhất ($1,42 \pm 0,06\text{ mg GAE/g}$) và TFC cao nhất ($0,09 \pm 0,01\text{ mg QE/g}$).
- Quá trình điều chế thể tích lớn (500 g bột nhàu trong MeOH 80%, ngâm 36 giờ) thu được 1900 mL cao lỏng có TPC đạt 1,63 mg GAE/g và TFC đạt 0,19 mg QE/g.
- Đặc trưng hạt nano chitosan trái nhàu: Phân tích FESEM cho thấy hạt có dạng hình cầu, phân bố rời rạc. Kết quả DLS chỉ ra dải kích thước hạt từ 87,3 nm đến 1509 nm, mật độ hạt tập trung cao nhất ở khoảng 225,8–258,0 nm (11,281%), kích thước trung bình của hệ hạt là 312,6 nm.
- Hoạt tính kháng khuẩn in vitro:
- Đĩa thạch khuếch tán: Hỗn hợp dung dịch nano chitosan trái nhàu tạo đường kính vòng vô khuẩn $8,667 \pm 0,577\text{ mm}$ (mức độ kháng yếu); dịch cao trái nhàu lỏng tạo vòng vô khuẩn $12,667 \pm 0,764\text{ mm}$ (kháng vừa); dung dịch nano chitosan trắng không tạo vòng vô khuẩn (0 mm).
- Xác định MIC/MBC: Dung dịch nano chitosan trái nhàu có $\text{MIC} = 250\text{ mg/L}$ (giếng số 3) và $\text{MBC} = 500\text{ mg/L}$ (giếng số 2). Tỉ lệ $\text{MBC}/\text{MIC} = 2$ thể hiện hoạt tính diệt khuẩn tiềm năng theo tiêu chuẩn French (2006).
Chương 5. Kết luận và đề nghị
Chương 5 tóm tắt các giá trị tối ưu của quy trình chiết xuất, thông số lý hóa của hạt nano và các chỉ số vi sinh thu được; đồng thời đề xuất các hướng nghiên cứu mở rộng nhằm tối ưu hóa kích thước hạt và hoàn thiện phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học.
Kết quả và đóng góp
Số liệu thực nghiệm tổng hợp
| Chỉ tiêu nghiên cứu |
Điều kiện / Mẫu thử nghiệm |
Giá trị thực nghiệm ghi nhận |
| Độ ẩm nguyên liệu |
Bột trái nhàu sấy 105°C |
$11,5%$ |
| Điều kiện chiết tối ưu |
Tỉ lệ bột nhàu : MeOH 80% / Thời gian ngâm |
Tỉ lệ $1:10\text{ (w/v)}$ / $36\text{ giờ}$ |
| Hàm lượng TPC tối ưu |
Cao chiết nghiệm thức nhỏ (1:10, 36h) |
$1,42 \pm 0,06\text{ mg GAE/g cao}$ |
| Hàm lượng TFC tối ưu |
Cao chiết nghiệm thức nhỏ (1:10, 36h) |
$0,09 \pm 0,01\text{ mg QE/g cao}$ |
| Dung dịch cao lỏng mở rộng |
500 g bột / 1900 mL cao lỏng |
$\text{TPC} = 1,63\text{ mg GAE/g}$; $\text{TFC} = 0,19\text{ mg QE/g}$ |
| Kích thước hạt nano trung bình |
Đo trên thiết bị DLS Horiba LB550 |
$312,6\text{ nm}$ |
| Dải phân bố hạt tập trung |
Mật độ phân bố DLS cao nhất ($11,281%$) |
$225,8 - 258,0\text{ nm}$ |
| Đường kính vòng kháng khuẩn |
Hỗn hợp dung dịch nano chitosan trái nhàu |
$8,667 \pm 0,577\text{ mm}$ (Kháng yếu) |
| Đường kính vòng kháng khuẩn |
Cao chiết trái nhàu lỏng |
$12,667 \pm 0,764\text{ mm}$ (Kháng vừa) |
| Đường kính vòng kháng khuẩn |
Dung dịch nano chitosan trắng (đối chứng) |
$0\text{ mm}$ (Không kháng) |
| Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) |
Khảo sát 10 nồng độ vi pha loãng + INT DYE |
$250\text{ mg/L}$ |
| Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) |
Cấy ria giếng nồng độ lên đĩa thạch TSA |
$500\text{ mg/L}$ |
| Tỉ lệ MBC / MIC |
Đánh giá cơ chế ức chế / diệt khuẩn |
$2\text{ (tác dụng diệt khuẩn khi } < 4\text{)}$ |
Đóng góp học thuật và thực tiễn
- Xác lập thông số chiết xuất trái nhàu: Nghiên cứu chỉ ra rằng sự thay đổi tỉ lệ dung môi và thời gian ngâm không làm thay đổi đáng kể hiệu suất thu hồi tổng khối lượng cao chiết ($p > 0,05$), nhưng tác động trực tiếp đến hàm lượng polyphenol và flavonoid hòa tan. Điều kiện tỉ lệ 1:10 trong 36 giờ ngâm với MeOH 80% là thông số tối ưu để thu nhận hàm lượng hoạt chất chống oxy hóa cao.
- Tổng hợp thành công hệ hạt nano thảo dược - polymer sinh học: Nghiên cứu đã chế tạo thành công hạt nano chitosan bọc cao chiết trái nhàu bằng phương pháp gel ion hóa với STPP, tạo hệ hạt có kích thước trung bình 312,6 nm dạng hình cầu, tương thích với các công bố quốc tế về hạt nano mang hoạt chất tự nhiên.
- Cung cấp dữ liệu thực nghiệm vi sinh: Đề tài cung cấp dữ liệu định lượng cụ thể về khả năng ức chế vi khuẩn Streptococcus agalactiae của chế phẩm nano chitosan trái nhàu với đường kính vòng vô khuẩn 8,667 mm, MIC 250 mg/L và MBC 500 mg/L, khẳng định tiềm năng nghiên cứu ứng dụng thảo dược nano trong kiểm soát bệnh thủy sản.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế được ghi nhận trong văn bản
- Quy trình tạo cao đặc: Do thể tích dịch chiết từ 500 g nguyên liệu tương đối lớn (1900 mL), giới hạn thời gian thực nghiệm chưa cho phép cô đuổi hoàn toàn dung môi và nước để tạo dạng cao đặc chuẩn, do đó tác giả phải sử dụng dung dịch cao lỏng để tạo hạt và thử nghiệm vi sinh.
- Phương pháp đánh giá kháng khuẩn trên đĩa thạch: Nghiên cứu sử dụng trực tiếp toàn bộ hỗn hợp dung dịch phản ứng sau khi tạo hạt nano mà chưa thực hiện bước ly tâm tách riêng hạt nano tinh sạch. Hạt nano chitosan chỉ hòa tan và giải phóng hoạt chất trong môi trường acid; trong khi môi trường thạch TSA có tính trung tính, hạt nano tồn tại dưới dạng hạt trơ không khuếch tán được, dẫn đến đường kính vòng vô khuẩn đo được ($8,667\text{ mm}$) chủ yếu bắt nguồn từ lượng cao nhàu tự do còn dư trong dung dịch. Do đó, thí nghiệm đĩa thạch chưa phản ánh đầy đủ hoạt tính kháng khuẩn thực chất của riêng hạt nano.
- Phạm vi khảo sát thông số gel ion: Đề tài chưa khảo sát sâu sự ảnh hưởng của pH môi trường, tỉ lệ phối trộn Chitosan/STPP và các tốc độ khuấy khác nhau đến việc giảm kích thước hạt nano xuống dưới 100 nm.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước và thế zeta của hạt nano: điều chỉnh pH dung dịch (mức khuyến nghị pH 3,5), thay đổi tỉ lệ Chitosan : STPP (tăng từ 2:1 lên 5:1) và biến thiên tốc độ khuấy để tạo hệ hạt nano đồng nhất có kích thước nhỏ hơn.
- Ly tâm thu hồi hạt nano chitosan trái nhàu tinh khiết, nghiên cứu động học giải phóng hoạt chất (in vitro release) trong các điều kiện pH khác nhau trước khi tiến hành đánh giá lại hoạt tính kháng khuẩn.
- Đánh giá độc tính tế bào và thử nghiệm in vivo hiệu quả phòng trị bệnh nhiễm Streptococcus agalactiae trên mô hình cá rô phi sống trong điều kiện nuôi thực tế.
Giá trị tham khảo
Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành:
- Công nghệ Sinh học và Hóa sinh học: Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về chiết xuất hoạt chất tự nhiên, phương pháp định lượng quang phổ UV-Vis chuẩn hóa theo TCVN đối với polyphenol tổng số (phương pháp Folin-Ciocalteu) và flavonoid tổng số (phương pháp nhôm clorua).
- Công nghệ Vật liệu Sinh học và Dược học: Cung cấp quy trình tổng hợp hạt nano polymer bằng phương pháp gel ion hóa giữa chitosan và STPP, kỹ thuật vận hành và giải thích kết quả phân tích kính hiển vi điện tử FESEM và phân tích tán xạ ánh sáng động DLS.
- Bệnh học Thủy sản và Vi sinh học: Tham khảo phương pháp thử nghiệm vi sinh chuẩn hóa in vitro, kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sử dụng thuốc thử INT DYE 0,05% và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) trên vi khuẩn thủy sản Streptococcus agalactiae.
Câu hỏi thường gặp
1. Tỉ lệ bột nhàu : dung môi và thời gian ngâm chiết nào được xác định là tối ưu trong nghiên cứu?
Nghiên cứu xác định tỉ lệ bột nhàu và dung môi Methanol 80% là 1:10 (w/v) ngâm trong thời gian 36 giờ là điều kiện tối ưu. Tại nghiệm thức này, hàm lượng polyphenol đạt cao nhất là $1,42 \pm 0,06\text{ mg GAE/g cao}$ và flavonoid đạt cao nhất là $0,09 \pm 0,01\text{ mg QE/g cao}$, vượt trội so với các tỉ lệ 1:3, 1:5, 1:7 và các mốc thời gian 12, 24, 48 giờ.
2. Kích thước và đặc điểm hình thái của hạt nano chitosan trái nhàu được ghi nhận như thế nào?
Dưới kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường FESEM (Hitachi SU 8010), các hạt nano chitosan trái nhàu có dạng hình cầu và phân bố rời rạc. Phân tích phân bố kích thước bằng DLS (Horiba LB550) cho thấy dải kích thước hạt từ 87,3 nm đến 1509 nm, tập trung nhiều nhất ở khoảng 225,8–258,0 nm ($11,281%$) và kích thước trung bình của hệ hạt đạt 312,6 nm.
3. Giá trị MIC và MBC của dung dịch nano chitosan trái nhàu đối với Streptococcus agalactiae là bao nhiêu và có ý nghĩa gì?
Dung dịch nano chitosan trái nhàu có nồng độ ức chế tối thiểu $\text{MIC} = 250\text{ mg/L}$ (xác định tại giếng số 3 qua thử nghiệm với thuốc thử INT DYE 0,05%) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu $\text{MBC} = 500\text{ mg/L}$ (xác định tại giếng số 2 khi cấy ria lên môi trường TSA). Tỉ lệ $\text{MBC}/\text{MIC} = 500 / 250 = 2$. Theo phân loại của French và cộng sự (2006), tỉ lệ $\text{MBC}/\text{MIC} \le 4$ chứng minh dung dịch có tác dụng diệt khuẩn thay vì chỉ kìm khuẩn.
4. Tại sao đường kính vòng vô khuẩn của dung dịch cao trái nhàu ($12,667\text{ mm}$) lại lớn hơn dung dịch nano chitosan trái nhàu ($8,667\text{ mm}$)?
Sự chênh lệch này do hai nguyên nhân chính được tác giả phân tích:
- Hàm lượng hoạt chất tự do trong đĩa thử nghiệm cao trái nhàu lỏng lớn hơn (chứa 0,067 mg GAE polyphenol và 0,0079 mg QE flavonoid trên 40 µL) so với mẫu dung dịch nano chitosan trái nhàu (chứa 0,024 mg GAE polyphenol và 0,0028 mg QE flavonoid trên 40 µL).
- Hạt nano chitosan chỉ hòa tan và khuếch tán giải phóng hoạt chất trong môi trường acid. Trên mặt thạch TSA có độ pH trung tính, hạt nano không tan mà tồn tại ở dạng hạt trơ, do đó vòng vô khuẩn của dung dịch nano thực chất chỉ được tạo nên bởi phần dịch chiết cao nhàu tự do chưa tham gia tạo hạt còn sót lại trong dung dịch.
5. Vai trò của Sodium Tripolyphosphate (STPP) trong quá trình tạo hạt nano chitosan là gì?
STPP đóng vai trò là tác nhân liên kết ngang đa điện tích âm ($\text{P}3\text{O}{10}^{5-}$). Khi nhỏ dung dịch STPP vào dung dịch chitosan mang điện tích dương (nhóm $-\text{NH}_3^+$), tương tác tĩnh điện giữa các ion trái dấu dẫn đến hiện tượng gel ion hóa nội phân tử và liên phân tử, làm co cụm mạch polymer và hình thành các hạt nano hình cầu bao bọc hoạt chất sinh học bên trong mà không cần sử dụng hóa chất độc hại.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Đinh Thị Thu Hằng đã tối ưu hóa thành công điều kiện chiết xuất hoạt chất polyphenol và flavonoid từ trái nhàu (Morinda citrifolia L.) bằng dung môi Methanol 80% ở tỉ lệ 1:10 trong 36 giờ. Nghiên cứu đã chế tạo thành công hệ hạt nano chitosan mang cao trái nhàu bằng phương pháp gel ion hóa với STPP, thu nhận hạt hình cầu có kích thước trung bình 312,6 nm. Thử nghiệm vi sinh bước đầu chứng minh hỗn hợp dung dịch nano chitosan trái nhàu có hoạt tính ức chế và diệt khuẩn đối với vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây bệnh trên cá rô phi với giá trị MIC đạt 250 mg/L và MBC đạt 500 mg/L, đặt nền tảng thực nghiệm cho các hướng nghiên cứu sâu hơn về chế phẩm sinh học nano trong nuôi trồng thủy sản.
