LỜI MỞ ĐẦU Vốn là một đất nƣớc đƣợc thiên nhiên ƣu đãi, nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao. Từ nhiều thế kỷ nay, thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dƣỡng cho con ngƣời mà còn là những phƣơng thuốc chữa bệnh quý. Trên con đƣờng phát triển các thuốc chữa bệnh mới các hóa chất có nguồn gốc thiên nhiên vẫn đang đóng góp ma ̣nh vào các liñ h vƣ̣c điề u tri ̣bao gồ m chố ng ung thƣ , chố ng nhiễm khuẩ n , chống viêm, điề u chin ̉ h miễn dich ̣ và các bê ̣nh về thầ n kinh. Giƣ̃a nhƣ̃ng năm 2000 - 2005 tiếp tục có hơn 20 thuố c mới là các hợp chất thiên nhiên hoă ̣c các dẫn xuấ t tƣ̀ thiên nhiên đã đƣơ ̣c thƣơng mại hóa.
Viê ̣c áp dụng các phƣơng pháp sàn g lo ̣c hoa ̣t tin ́ h sinh ho ̣c nhanh trong các nghiên cứu hóa dƣợc và y sinh đang đặt ra những thách thƣ́c các nhà hóa ho ̣c hợp chất thiên nhiên trong nghiên cƣ́u các quy triǹ h phân lập nhanh , hiê ̣u quả các hơ ̣p chấ t thiên nhiên tƣ̀ các nguồ n thƣ̣c vâ ̣t , vi nấ m , sinh vâ ̣t biể n… và các chuyể n hóa hóa ho ̣c các cấu trúc gốc, ví dụ nhƣ bằng các con đƣờng biomimetic, để tạo ra các dẫn xuấ t mới chứa các phần cấu trúc quyết định cho các hoạt tính sinh học mới. Một trong những con đƣờng đi nhanh đến các hợp chất có tác dụng sinh học là dựa trên các kiến thức dƣợc lý học dân tộc. Cây Khổ sâm Bắc Bộ có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) là một cây thuốc phổ biến trong y học dân gian Việt Nam, đặc biệt là các bệnh về chống nhiễm trùng, viêm loét hoành tá tràng, đau dạ dày… Cây Khổ sâm Bắc Bộ cũng đã đƣợc nghiên cứu, đánh giá các tác dụng dƣợc lý trên ký sinh trùng sốt rét, vi sinh vật và các mô hình kháng viêm và chống ung thƣ in vitro. Các nghiên cứu sâu của các nhà khoa học Việt Nam đã phát hiện đƣợc nhóm hợp chất ent-kauran ditecpenoit từ lá cây Khổ sâm Bắc Bộ quyết định cho các hoạt tính này.
Các hợp chất thiên nhiên đƣợc biết đến là xuất hiện hạn chế vào các loài và các bộ phận cụ thể của thực vật do nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng. Tiếp theo các nghiên cứu về các thành phần từ Luận văn Thạc sĩ 1 2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Nguyễn Thị Hoài Thanh Cao học Hóa K20 lá cây Khổ sâm Bắc Bộ chúng tôi mở rộng các nghiên cứu phân lập các hợp chất từ cành cây Khổ sâm Bắc Bộ qua đó có thể đánh giá đƣợc chính xác sự phân bố và hàm lƣợng các ent-kauran ditecpenoit trong cây Khổ sâm Bắc Bộ. Luận văn này nghiên cứu các qui trình chiết, phân tách và phân lập sắc ký để đánh giá sự phân bố các hợp chất ent-kauran ditecpenoit và các thành phần khác trong cành cây Khổ sâm Bắc Bộ và xác định cấu trúc của các hợp chất này. Một phƣơng pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cũng đã đƣợc phát triển để định lƣợng hoạt chất ent-kauran ditecpenoit trong cành cây Khổ sâm Bắc Bộ.
Luận văn Thạc sĩ 2 2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Nguyễn Thị Hoài Thanh Cao học Hóa K20 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CROTON (HỌ EUPHORBIACEAE) Chi Croton L. thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có khoảng 700 loài, gặp phổ biến ở các vùng nhiệt đới, ít gặp ở vùng ôn đới và rất hiếm ở vùng hàn đới. Ở châu Á có khoảng 50 loài, riêng ở Đông Dƣơng có hơn 40 loài [7]. Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ chi Croton L.
có 18 loài [3], còn Nguyễn Nghĩa Thìn [16] thống kê đƣợc 41 loài, trong đó có tới 21 loài đặc trƣng trong hệ thực vật nƣớc ta. Một số loài cây thuộc chi Croton ở Việt Nam: Croton argygratus Blume.: Bạc lá Croton cascarilloidis Raeusch.: Cù đèn lá bạc, Khai đen Croton oblongifolius Roxb.: Cù đèn Croton delpyi Gagnep.: Cù đèn Delpy Croton caudatus Geiseler.: Cù đèn đuôi Croton maieuticus Gagnep.: Cù đèn hộ sản Croton crassifolius Geiseler.: Cù đèn lông, Ba vỏ Croton glandulous L.: Cù đèn lông cứng Croton poilanei Gagnep.: Cù đèn răng cƣa Croton roxburghianum Bal.: Cù đèn Roxburgh Croton thorelii Gagnep.: Cù đèn Thorel Croton potabilis Croiz.: Cù đèn tả Croton tiglium L.: Ba đậu hoặc Mần để. Có nhiều loài cây thuộc chi Croton L. đƣợc sử dụng trong y học dân gian nhiều dân tộc, nhất là ở khu vực Trung và Nam Mỹ cũng nhƣ ở Đông Nam Á.
Luận văn Thạc sĩ 3 2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Nguyễn Thị Hoài Thanh Cao học Hóa K20 Croton cajicara Benth mọc nhiều ở vùng Amazon, đƣợc dùng để điều trị bệnh tiểu đƣờng, làm giảm cholesterol trong máu, rối loạn tiêu hóa, rồi loạn gan và giảm cân [52]. Croton celtidifolius Baill đƣợc tìm thấy ở miền nam Brazil, vỏ cây của nó và lá đƣợc dùng để chữa các bệnh viêm, loét [52]. Croton eluteria Bennett đƣợc ngƣời dân Equađo dùng chữa bệnh cao huyết áp, kiết lỵ, sốt rét, đau dạ dày [7]. Croton lechleri mọc ở Equađo và Peru đƣợc dùng để chữa các vết thƣơng, cầm máu [7].
Croton malambo Karst ở phía tây Venezuela và phía bắc Colombia đƣợc dùng trong y học cổ truyền để điều trị bệnh tiểu đƣờng tiêu chảy, bệnh thấp khớp, loét dạ dày, chống viêm [52]. Croton draco có nguồn gốc ở Mexico, đƣợc sử dụng chữa bệnh ho, cảm cúm, tiêu chảy, viêm loét dạ dày, chữa lành vết cắt, lở loét, mụn và chống nhiễm trùng sau khi nhổ răng [52]. Croton oblongifolius Roxb phát triển ở Ấn Độ và Thái Lan, đƣợc dùng nhƣ thuốc bổ, chữa rối loạn tiêu hóa, bệnh lỵ. Ngoài ra, y học cổ truyền Thái còn sử dụng kết hợp với Croton sublyratus để điều trị loét dạ dày và ung thƣ dạ dày [52].
Croton sublyratus đƣợc sử dụng để chữa các bệnh về giun sán và điều trị các bệnh ngoài da [52]. Ở Việt Nam, Croton crassifolim ở Tây Nguyên đƣợc dùng để điều trị bệnh đƣờng ruột [16], Croton tonkinensis trị bệnh sốt rét, bệnh đƣờng ruột [3, 13]. Bên cạnh những cây đƣợc dùng làm thuốc trong y học dân gian, ngƣời ta cũng biết một số cây thuộc chi Croton còn chứa độc tố. Ở Madagasca có Croton hovarum là loại cây độc, đƣợc thổ dân sử dụng trong đánh bắt cá, tẩm tên độc trong săn bắn.
Ở Việt Nam có cây Croton tiglium (cây Ba đậu) là cây độc, dùng làm thuốc trừ sâu thảo mộc [7]. Luận văn Thạc sĩ 4 2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Nguyễn Thị Hoài Thanh Cao học Hóa K20 1.2 CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ (CROTON TONKINENSIS GAGNEP.1 Thực vật học Cây Khổ sâm Bắc Bộ có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep. thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) [1, 3]. Cây mọc hoang dại ở nhiều nơi trên miền Bắc Việt Nam nên còn đƣợc gọi với nhiều tên khác nhau nhƣ Cổ sâm, Sâm nam, ở vùng Tây Thiên, Tam Đảo, Vĩnh Phúc nhân dân gọi là cây Kẻ chỉ.
Hình 1: Cây Khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) Khổ sâm Bắc Bộ là cây nhỏ, cao độ 0,7-1 m. Lá mọc cách hay gần nhƣ mọc đối, có khi mọc thành vòng giả gồm 3-6 lá. Lá hình mũi mác, mép nguyên dài 5-10 cm, rộng 1-3 cm. Cả hai mặt lá đều có lông hình khiên óng ánh (kiểu lông ở lá cây nhót) nhƣng mặt dƣới nhiều hơn ở mặt trên.
Khi phơi khô mặt lá ở dƣới có màu trắng bạc, mặt trên có màu nâu đen. Cụm hoa mọc ở kẽ lá hay đầu cành, lƣỡng tính Luận văn Thạc sĩ 5 2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Nguyễn Thị Hoài Thanh Cao học Hóa K20 hay đơn tính. Hoa đực có 5 lá đài, 12 nhị. Hoa cái có 5 lá đài, 3 vòi nhị.
Quả gồm 3 mảnh vỏ màu hung đỏ. Cây Khổ sâm Bắc Bộ mọc hoang và đƣợc trồng ở các vùng Ninh Bình, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Bắc Giang, Thanh Hóa [13]. Hiện nay, cây còn đƣợc trồng nhiều ở các trạm xá đông y, y tế xã và nhà dân.2 Tác dụng dƣợc lý của cây Khổ sâm Bắc Bộ [1, 4] Lá Khổ sâm Bắc Bộ có vị đắng, hơi ngọt, hơi chát, tính mát hoặc bình, có tác dụng thanh nhiệt tiêu độc, sát trùng. Lá Khổ sâm Bắc Bộ đƣợc dùng nhiều trong các bài thuốc dân gian nhƣ: Chữa ung nhọt, lở loét, viêm mũi, viêm loét dạ dày, tá tràng: 15 - 20 g lá sao vàng, sắc đặc, nếu dùng để rửa thì chữa mụn nhọt, lở ngứa.
Chữa đau bụng không rõ nguyên nhân: hái mấy lá Khổ sâm nhai với mấy hạt muối, nếu có nôn hay sôi bụng thì nhai với một miếng gừng sống. Chữa vẩy nến: Khổ sâm 15 g, kim ngân 15 g, sinh địa 15 g, quả ké 10 g, tán bột làm thành viên, ngày uống 20 - 25 g. Dùng trong đơn thuốc chữa đau dạ dày, có lá khôi: lá khôi 50 g, lá bồ công anh 20 g, lá Khổ sâm 12 g, nƣớc 600 ml, sắc đặc và cô xuống còn khoảng 200 ml, chia làm 2 hoặc 3 lần uống trong ngày. Uống 10 ngày, nghỉ 3 ngày, cứ lặp lại nhƣ vậy đến khi khỏi đau thì uống 1 tuần nữa.
Giúp ăn ngon và giúp tiêu hóa tốt: 24 - 40 g (lá khô sao vàng) thêm vào 600 ml nƣớc (3 bát), sắc còn một bát (200 ml) chia 2 hoặc 3 lần uống trong ngày từ 15 đến 30 phút trƣớc khi ăn cơm. Ở Hƣng Yên, nhân dân dùng cành, lá khô đem sao vàng, sắc lấy nƣớc uống để chữa bệnh tê thấp.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ 1.1 Các ent-kauran ditecpenoit từ chi Croton Luận văn Thạc sĩ 6 2011 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Nguyễn Thị Hoài Thanh Cao học Hóa K20 Các ditecpenoit chiếm tới 104/199 kiểu hợp chất đã đƣợc phân lập và nhận dạng đƣợc từ các loài chi Croton [7]. Cách gọi tên và cấu trúc của chúng rất đa dạng, từ loại khung không vòng đến khung đa vòng giáp nhau. Kiểu không vòng nhƣ phytan, một vòng lớn nhƣ cembran.
Hai vòng giáp nhau nhƣ labdan và clerodan. Ba vòng giáp nhau nhƣ pimaran, kauran và beyeran. Kiểu bốn vòng giáp nhau nhƣ atisan, sarcopetelan và phorbol. Năm vòng nhƣ trachyloban.
Các ent-kauran phổ biến trong tự nhiên, hay gặp nhất trong các loài Isodon (Rabdosia) thuộc họ Lamiaceae, và trong một số họ Annoaceae, Araliaceae, Asteraceae, Celastraceae, Jungermanniaceae, Rubiaceae [20]. Tuy nhiên các ditecpenoit nhóm ent-kauran xuất hiện không nhiều trong chi Croton và chỉ đƣợc tìm thấy ở một số loài Croton. R và các cộng sự đã tìm ra 3 ent-kauran ancol từ hạt cây C.