CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN 1. Chitin, chitosan, chitooligosaccharide và các dẫn xuất 1. Chitin được cấu tạo từ các đơn phân là N- acetylglucosamine (GlcNAc), và được liên kết với nhau qua liên kết B-1,4-0- glycoside. Chitin được tìm thấy trong vỏ các loài giáp xác, biểu bì côn trùng và thành tế bao nam, v.
Chitin tồn tại dưới 3 dạng hình thái là a, B, y chitin, 3 dạng này khác nhau về tính hydrat hóa và kích thước của đơn vi cấu trúc tạo thành chitin. Cấu trúc của a-chitin là các mạch được sắp xếp song song và ngược chiều, trong khi B- chitin là các mạch được sắp xếp song song và cùng chiều, và dang phức tạp y chitin được sắp xếp cứ hai mạch song song cùng chiều thì có một mạch ngược chiều [8]. Chitin được cô lập lần đầu tiên vào năm 1811, bởi nhà nghiên cứu hóa học và dược học người pháp Henry Braconnot (1787-1855), là một polysaccharide được phan lập từ nam va được đặt tên là fungine. Sau đó vào năm 1823, Odier đã tìm thấy một chất tương tự như fungine trong bộ khung xương của côn trùng và đặt tên cho chất đó là chitin.
Năm 1859, Roughet đã cho thấy chitin có thé hòa tan trong dung môi sau khi được biến đổi bang tác nhân hóa hoc. Chitin là nguyên liệu để tạo chitosan và chitooligosacchride. Chitin đã thu hút nhiều ứng dụng trong điều trị bệnh như chữa lành vết thương và được cho là một vật liệu sinh học đầy hứa hẹn cho kỹ thuật mô và công nghệ tế bào gốc [9]. Bae và cộng sự, (2013) đã cho thấy uống chitin (dạng alpha và beta) có thé mang lại lợi ích là ngăn ngừa bệnh di ứng với thực phẩm.
Nghiên cứu được tóm tắt như sau: chitin với kích thước nhỏ hơn 20 micromet được trộn với thức ăn cho chuột. Kết quả nghiên cứu trên mô hình chuột cho thấy alpha chitin làm giảm lượng đáng kế kháng thé IgE trong huyết thanh (31-47%), trong khi beta chitin không có chức năng này, cả hai dạng chitin làm giảm mức interleukin (IL) như IL4, IL5, IL10 và IL13 [10]. Kha năng ứng dụng của chitosan rộng hon chitin bởi chitosan có khả năng hòa tan tốt trong môi trường acid yếu, trong khi chitin không tan trong môi trường nước và acid [9]. Chitosan Chitosan là polymer sinh học tự nhiên, không độc hại và là một polysaccharide mạch thắng, được cấu tạo từ các đơn phân D-glucosamine liên kết với nhau qua các liên kết beta-1,4-glucoside, vì vậy chitosan còn được gọi là poly-1,4-glucosamine.
Công thức phân tử của chitosan: [CeH1104N]n và M chitosan = (161,07)n. Cấu tạo hóa học của chitosan được thê hiện hình 1. Chitosan không tan trong nước, tan trong dung môi acid hữu cơ. Không giống như chitin, chitosan không là thành phần của các loài động vật và hiếm khi tim thấy trong tự nhiên.
Nguôn tự nhiên cua chitin thường tim thấy trong vỏ cua, tôm, xương mực trong khi chitosan thì không tìm thấy [11]. Trong tế bào nắm thì có cả chitin lẫn chitosan tự nhiên, chúng hiện diện trong thành tế bao nam. Chitosan là thành phan quan trọng trong thành tế bào nắm Zygomycetes [12]. Chitosan tồn tại hai dạng khác nhau trong thành tế bao nắm, một là dạng chitosan tự do, hai là dang chitosan liên kết glucan [11].
Chitosan tự nhiên có thể chiết xuất trực tiếp các nguồn nguyên liệu. Chất lượng và sỐ lượng của chitosan thu nhận từ nguồn nam phụ thuộc vào loài nắm, điều kiện lên men và quy trình chiết xuất. Chitosan thu nhận từ động vật giáp xác có khối lượng phân tử cao, trong khi chitosan thu nhận từ nguồn nắm có khối lượng phân tử thấp hơn [11]. OH OH OH HO HO HO OH NH» NH» NH n Hình 1.1: Cầu trúc hóa học cua chitosan [13] Chitosan thương mại phan lớn được thu nhận từ quá trình deacetyl của chitin tự nhiên và sản lượng hàng năm vải triệu tấn [14].
Sản lượng tiêu thụ chitosan trên thị trường thế giới vượt mức 118.000 tan năm 2018 và giá trị dự kiến đạt 6.8 tỉ USD vào năm 2024 [15]. Phần lớn chitosan được sử dụng tập trung vào các lĩnh vực như mỹ phẩm, y học, phân bón hữu cơ, bé sung ché do an,. Chitosan là sản phẩm deacetyl hóa của chitin bằng dung dich kiềm. Do vậy, chitosan và chitin có thể được phân biệt cơ bản dựa vao sự acetyl hóa của đơn phân D-glucosamine.
Theo quy ước nếu mức độ deacetyl > 50% thì gọi là chitosan còn nhỏ hơn 50% thì gọi là chitin. Trong dung môi acid hữu cơ như acid acetic, acid formic, acid lactic chitosan tôn tại dang muối va hòa tan. Chitosan chứa ba nhóm chức năng phản ứng chính là amino, N-acetamide va hydroxyl. Tinh chất hóa ly của chitosan phụ thuộc chủ yếu vào nhóm amino, N-acetamide [17].
Chitosan được phân loại theo mức độ deacetyl, mức độ polyme hóa và khối lượng phân tử [18]. Chitosan được sử dụng làm nguyên liệu sinh hóa bởi những hoạt tính kháng khuẩn, giảm cholesterol, giảm huyết áp, kháng viêm, kháng oxy hóa, v. Ngoài ra, chitosan là nguyên liệu rẻ tiền, dễ phân hủy sinh học, không độc vì vậy được ứng dụng rất nhiều và đa dạng trong công nghiệp thực pham [19]. Mặc dù, chitosan có nhiều chức năng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, nhưng chúng có khối lượng phân tử lớn và độ nhớt cao nên rất khó dé cơ thé người và động vật hấp thu.
Hơn nữa, chitosan không được ruột non hấp thu vì hệ tiêu hóa của động vật, đặc biệt là hệ tiêu hóa của cơ thé người không có hệ enzym chitinase và chitosanase dé thủy phân chúng thành những chất có khối lượng phân tử thấp dé cơ thé hấp thu. Vi vậy, ảnh hưởng của chitin và chitosan trong cơ thé vẫn chưa rõ ràng. Tuy nhiên, trong những năm gan đây đã có nhiều nghiên cứu chuyên chitosan thành dẫn xuất có khối lượng phân tử thấp hơn, những dẫn xuất phân tử thấp này được dự báo có hoạt tính sinh học và khả năng ứng dụng cho cơ thể tốt hơn chitosan [3]. Chitooligosaccharide và các dẫn xuất Chitooligosaccharide (COS) là dẫn xuất của chitosan có thể được thu nhận bằng hai phương pháp: hóa học va sinh học (sử dụng enzym).
Trường hợp thủy phân chitosan dé thu COS bằng phương pháp hóa học gây độc cho cơ thé cao. Trong khi đó, thủy phân chitosan dé thu COS bằng enzym không độc cho cơ thé và thân thiện môi trường. Ngoài ra, chitooligosacchatide cũng có thé thu nhận bằng phương pháp vật lý [3]. Chitooligosaccharide là dang oligomer của chitosan nên có được hau hết những hoạt tính sinh học của chitosan như kháng oxy hóa, kháng nắm, kháng khuẩn, kháng ung thư, tăng cường miễn dịch, v.
Các tính chất này phụ thuộc rất nhiều vào độ polymer hóa, độ deacetyl hóa, sự phân bồ điện tích và ban chất các biến đồi hóa học trên phân tử của COS. Khác với chitosan, COS có khối lượng phân tử nhỏ hơn nên dễ đi vào máu tạo nên các tác động sinh học một cách có hệ thống lên cơ thể [20]. Các nghiên cứu cũng cho thấy khả năng vượt trội của dẫn xuất COS so với COS về đặc tính và hoạt tính sinh học như khả năng kháng oxy hóa [21], kháng viêm [22], hạ huyết áp [23]. kháng tế bào ung thư [24], bắt gốc tự do [5], phòng ngừa bệnh alzheimer [21, 25], v.
Phương pháp tạo chitooligosaccharide từ chitosan Có nhiều phương pháp được dé xuất tao COS từ chitosan, có thé chia làm ba loại chính như sau: Phân cắt băng tác nhân hóa học: acid vô cơ (HCI, HF, H2SO4, H3POa, HNO¿, v.), acid hữu cơ (CH3COOH, HCOOH, v.), chất oxy hóa (O3, HaO, v. Phân cắt bang tac nhan ly hoc nhu chiéu xa nhu tia gamma v. Phân cắt bằng tác nhân sinh học (enzym): chitosanase, chitinase, cellulase, pectinase, v. Sơ đồ tạo COS từ chitosan bằng phương pháp hóa học và enzym được trình bày ở hình 1.
Chitin Ỷ Deacetyl Ỷ Chitosan M Cắt mạch | Hóa học | Vật lý Enzym | Acid HCl, HNO; Chiéu xa, vi song Dac hiéu: chitosanase Không đặc hiệu: Cellulase, lipase, | hemicellulase, pectinase v.2: Quy trình tao chitooligosacharide từ chitosan 1. Phương pháp hóa hoc Phương pháp hóa học sử dụng acid mạnh đề thủy phân chitosan rất phô biến và là phương pháp nhanh đề sản xuất hàng loạt các COS. Nguyên tắc của phương pháp này là sự thủy phân ngẫu nhiên liên kết O-glycoside giữa các đơn phân của phân tử chitosan dé tao COS [20]. Phương pháp thủy phân bang acid có ưu điểm là chu ki sản xuất ngắn, tác nhân thuỷ phân dé tìm.
Tuy nhiên, hiệu suất thu nhận COS còn thấp, khả năng gây độc cao của sản phẩm là hạn chế khi áp dụng phương pháp hóa học quy mô công nghiệp [28]. Phương pháp vật lý Quá trình thủy phân chitosan bằng chiếu xạ đã thu hút được sự chú ý đáng kể vì đây là một quá trình tương đối đơn giản, không sử dụng xúc tác hóa học, được thực hiện ở nhiệt độ phòng và có thé áp dụng trên quy mô lớn. Tuy nhiên chi phí tạo ra sản pham cao khi sử dụng liều xạ cao là hạn chế của phương pháp này [28]. Chiếu xa gamma thường được ứng dụng dé thuỷ phân chitosan, quá trình này có thê thực hiện ở nhiệt độ phòng và quy mô lớn.
Hiệu quả của quá trình thuỷ phân phụ thuộc vào liều xạ (0,5 — 200 kGy) va dung môi sử dụng (nước, acid acetic, hydrogen peroxyde v. Phương pháp enzym Các enzym phân cắt chitosan là các enzym nhận diện và thủy phân được chitosan. Định nghĩa về chitosanase (mã số EC 3.132) do Ủy ban về enzym đưa ra vào năm 2004 như sau: “chitosanase là enzym có khả năng phân cắt nội phân tử liên kết B-1,4 glycoside giữa các gốc D-glucosamine trong phân tử chitosan có mức acetyl hóa một phần”. Theo định nghĩa đã đề cập ở trên thì các enzym xúc tác thủy phân chitosan đã được nghiên cứu và công nhận như: chitosanase, chitinase, cellulase, pectinase, protease, glucanase, lysozyme, v.
COS được sản xuất tir chitosan bởi enzym đặc hiệu như chitosanase và không đặc hiệu như cellulase, lipase, papain, lysozyme, hemicellulase, pectinase, pepsin, v. Han ché khi str dung enzym đặc hiệu là giá thành cao và su thiếu hụt về số lượng khi sử dụng quy mô lớn. Vì lý do này, các nhà nghiên cứu và sản xuất thường nghiên cứu và lựa chọn loại enzym không đặc hiệu thương mại, những enzym không đặc hiệu này cho hiệu quả tạo COS tương tự như enzym đặc hiệu trong khi giá thành lại thấp [7].1 Enzym dac hiéu Chitosanase có nhiều trong tự nhiên, được thu nhận từ các nguồn như vi khuẩn, nam. Hoạt tính của chitosanase cũng được tìm thấy ở thực vật và động vật.
Enzym đặc hiệu này xúc tác phân cắt liên kết B-1,4-glycoside một cách ngẫu nhiên dé tạo COS. Hiệu quả sử dụng chitosanase dé tao COS cao. Tuy nhiên, chi phí cao cho thu nhận chitosanase như tách chiết, tinh sạch, cô đặc, v.