Nghiên Cứu Tính Gây Độc Tế Bào Của Các Hợp Chất Quinazoline

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất quinazolin, mở ra hướng đi mới trong y học.

• Tác giả: Đinh Thúy Vân
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Văn Tuyến
• Trường học: Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Của Hợp Chất Quinazoline
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ LỚP CHẤT QUINAZOLINE
• 1.2. Những nghiên cứu ngoài nước về tổng hợp dẫn xuất quinazoline
• 1.3. Chuyển hóa ở vị trí C-2 và N-3 của khung quinazoline
• 1.4. Nghiên cứu trong nước về quinazoline
• 1.5. TỔNG QUAN VỀ THUỐC ERLOTINIB
• 1.5.1. Cấu trúc, tính chất vật lý và tính chất phổ của Erlotinib hydrochloride
• 1.5.2. Hoạt tính sinh học của erlotinib hydrochloride
• 1.5.3. Những nghiên cứu ngoài nước về tổng hợp erlotinib hydrochloride
• 1.5.4. Tình hình nghiên cứu trong nước về tổng hợp erlotinib
• 1.6. PHẢN ỨNG CLICK
• 1.7. KỸ THUẬT PROTEIN DOCKING
• 1.7.1. Phương pháp Protein docking
• 1.7.2. Quy trình docking
• 1.8. NHIỆM VỤ CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
• 2.1.1. Hóa chất và dung môi
• 2.1.2. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng
• 2.1.3. Phương pháp và thiết bị nghiên cứu
• 2.1.4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư
• 2.2. TỔNG HỢP ERLOTINIB VÀ CÁC HỢP CHẤT LAI CỦA NÓ
• 2.2.1. Tổng hợp erlotinib
• 2.2.2. Tổng hợp các hợp chất lai của erlotinib và các azide qua cầu nối triazole
• 2.3. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT QUINAZOLINE CHỨA NHÓM CROWN ETHER Ở VỊ TRÍ C-6, C-7
• 2.3.1. Quy trình tổng hợp các hợp chất 112a, b
• 2.3.2. Quy trình tổng hợp các hợp chất 116a, b
• 2.3.3. Quy trình tổng hợp các hợp chất 115a, b
• 2.3.4. Quy trình tổng hợp các hợp chất 117a-d
• 2.3.5. Quy trình tổng hợp các hợp chất 119a-d
• 2.4. TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT LAI CỦA DẪN XUẤT CROWN ETHER QUINAZOLINE-4-AMINE (119A-D) VỚI CÁC AZIDE QUA CẦU NỐI TRIAZOLE
• 2.4.1. Tổng hợp các hợp chất lai của N-(3-ethynylphenyl)quinazoline-4-amine (119a) với các azide qua cầu nối triazole
• 2.4.2. Tổng hợp các hợp chất lai của N-(3-ethynylphenyl)-[1,3]dioxolo[4,5-g]quinazoline-8-amine (119b)
• 2.4.3. Tổng hợp các hợp chất lai của N-(3-ethynylphenyl)-7,8-dihydro-[1,4]dioxino[2,3-g]quinazoline-4-amine (119c)
• 2.4.4. Tổng hợp các hợp chất lai của N-(3-ethynylphenyl)-8,9-dihydro-7H-[1,4]dioxepino[2,3-g]quinazoline-4-amine (119d)
• 2.5. HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC DẪN XUẤT QUINAZOLINE
• 2.6. NGHIÊN CỨU DOCKING CÁC HỢP CHẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC
• 2.7. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 2.8. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 2.9. TỔNG HỢP ERLOTINIB HYDROCLORIDE
• 2.9.1. Tổng hợp 3,4-bis(2-methoxyethoxy)-benzoic acid (107)
• 2.9.2. Tổng hợp 3,4-bis(2-methoxyethoxy)benzonitrile (108)
• 2.9.3. Tổng hợp 4,5-bis(2-methoxyethoxy)-2-nitrobenzonitrile (102)
• 2.9.4. Tổng hợp 2-amino-4,5-bis(2-methoxyethoxy)-benzonitrile (102)
• 2.9.5. Nghiên cứu tổng hợp erlotinib (105)
• 2.9.6. Tổng hợp muối erlotinib hydrocloride (93)
• 2.10. TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT LAI CỦA ERLOTINIB-TRIAZOLE
• 2.11. TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT LAI CỦA DẪN XUẤT QUINAZOLINE CHỨA NHÓM CROWN ETHER Ở VỊ TRÍ C-6, C-7
• 2.11.1. Tổng hợp các hợp chất 119a, 119b từ các benzaldehyd
• 2.11.2. Tổng hợp hợp chất 119c, 119d từ acid 3,4-dihidroxy benzoic (106)
• 2.12. TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT LAI QUINAZOLINE-TRIAZOLE
• 2.12.1. Tổng hợp các hợp chất lai của dẫn xuất 119a
• 2.12.2. Tổng hợp các hợp chất lai của dẫn xuất 119b
• 2.12.3. Tổng hợp các hợp chất lai của dẫn xuất 119c
• 2.12.4. Tổng hợp các hợp chất lai của dẫn xuất 119d
• 2.13. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT QUINAZOLINE, QUINAZOLINE-TRIAZOLE
• 2.14. ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN
• CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Hợp Chất Quinazoline Độc Tính Tế Bào

Quinazoline (C8H6N2) là một hợp chất dị vòng thơm quan trọng, cấu trúc gồm vòng benzen và pyrimidine. Dù quinazoline gốc ít được nhắc đến, các dẫn xuất của nó lại thu hút sự chú ý lớn trong y học, đặc biệt là trong vai trò thuốc chống ung thư. Cơ chế hoạt động chính là ức chế enzyme Tyrosine Kinase. Các hợp chất tiêu biểu như Gefitinib, Erlotinib, Lapatinib, Vandetanib đã được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, hiệu quả của chúng còn hạn chế do sự không đồng nhất của khối u và khả năng kháng thuốc. Do đó, việc nghiên cứu và tổng hợp các hợp chất mới, đặc biệt là các dẫn xuất có khả năng ức chế EGFR hoặc ức chế đa chức năng, là vô cùng cần thiết. Các dẫn xuất 4-anilinoquinazoline được tổng hợp bằng cách thay đổi nhóm thế ở vị trí C-6, C-7 và vòng aniline để tạo ra các hoạt chất mới có hoạt tính cao hơn. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá độc tính tế bào của các hợp chất quinazoline và các dẫn xuất của chúng.

1.1. Cấu trúc và tính chất hóa học của Quinazoline

Quinazoline là một phân tử phẳng, có cấu trúc lưỡng tính. Tên gọi quinazoline xuất phát từ dẫn xuất aza của quinoline. Các dẫn xuất thay thế của quinazoline được quan tâm nghiên cứu tổng hợp cho các mục đích y học như thuốc chống sốt rét và thuốc chống ung thư. Bằng cách ức chế enzim Tyrosine Kinase thì những thuốc chống ung thư được tổng hợp từ lớp chất Quinazoline đang đem lại những đột phá trong trị liệu ung thư hiện nay.

1.2. Ứng dụng của Quinazoline trong điều trị ung thư

Một số những hợp chất quinazoline tiêu biểu như Gefitinib (Iressa), erlotinib (Tarceva), lapatinib (Tykerb) và vandetanib (Caprelsa) đã được đưa vào sản xuất thuốc điều trị ung thư. Trong đó Gefitinib và erlotinib là hai thuốc hoá trị liệu thụ thể yếu tố tăng sinh biểu bì (EGFR) thuộc thế hệ đầu tiên được sử dụng để điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ. Lapatinib được dùng làm thuốc điều trị bệnh ung thư vú và các khối u rắn khác bằng cách ức chế tyrosine kinase kép HER2/neu và EGFR.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Độc Tính Tế Bào Quinazoline Hiện Nay

Mặc dù các dẫn xuất quinazoline đã cho thấy tiềm năng lớn trong điều trị ung thư, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần vượt qua. Hiệu quả của các thuốc này bị giới hạn trong một nhóm nhỏ các bệnh nhân do sự không đồng nhất các phân tử bên trong khối u và giữa các khối u với nhau, khả năng đáp ứng thuốc kém và kháng thuốc do đột biến thụ thể. Do đó, nghiên cứu thiết kế và tổng hợp các hợp chất mới với mục tiêu ức chế EGFR hoặc ức chế đa chức năng là cần thiết. Hiện nay, các dẫn xuất của 4- anilinoquinazoline chủ yếu được tổng hợp bằng cách đưa các nhóm thế khác nhau vào vị trí C-6, C-7 của khung quinazoline và vòng aniline nhằm tổng hợp các hoạt chất mới để tìm kiếm các dẫn chất có hoạt tính cao hơn. Cần có những nghiên cứu sâu hơn về cơ chế gây độc tế bào của các hợp chất này để tối ưu hóa hiệu quả và giảm thiểu tác dụng phụ.

2.1. Vấn đề kháng thuốc và đột biến thụ thể EGFR

Hiệu quả của các thuốc quinazoline bị giới hạn trong một nhóm nhỏ các bệnh nhân do sự không đồng nhất các phân tử bên trong khối u và giữa các khối u với nhau, khả năng đáp ứng thuốc kém và kháng thuốc do đột biến thụ thể. Vì vậy, nghiên cứu thiết kế và tổng hợp các hợp chất mới với mục tiêu ức chế EGFR hoặc ức chế đa chức năng là cần thiết.

2.2. Hạn chế trong nghiên cứu cấu trúc hoạt tính SAR

Chỉ có một số nhỏ công trình đã nghiên cứu tổng hợp các hợp chất lai giữa quinazoline với các chất chống ung thư theo cơ chế tác dụng khác và nhận được kết quả đáng khích lệ. Cần có những nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc-hoạt tính (SAR) của các hợp chất này để tối ưu hóa hiệu quả và giảm thiểu tác dụng phụ.

III. Phương Pháp Đánh Giá Độc Tính Tế Bào Của Quinazoline

Việc đánh giá độc tính tế bào của các hợp chất quinazoline là bước quan trọng để xác định tiềm năng ứng dụng của chúng trong điều trị ung thư. Các phương pháp đánh giá in vitro, như MTT assay, được sử dụng để đo lường khả năng sống sót của tế bào sau khi tiếp xúc với hợp chất. Các chỉ số như IC50 (nồng độ ức chế 50%) cho biết nồng độ hợp chất cần thiết để ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Ngoài ra, các nghiên cứu về apoptosis (chết tế bào theo chương trình) và necrosis (hoại tử) cũng cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế gây độc tế bào của các hợp chất này. Các phương pháp in vivo cũng được sử dụng để đánh giá độc tính và hiệu quả của hợp chất trên mô hình động vật.

3.1. Đánh giá độc tính in vitro bằng MTT assay

MTT assay là một phương pháp phổ biến để đánh giá độc tính tế bào in vitro. Phương pháp này dựa trên việc đo lường khả năng của tế bào sống để khử muối tetrazolium thành formazan, một sản phẩm có màu. Lượng formazan tạo ra tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống, do đó có thể sử dụng để đánh giá khả năng sống sót của tế bào sau khi tiếp xúc với hợp chất.

3.2. Nghiên cứu apoptosis và necrosis

Các nghiên cứu về apoptosis (chết tế bào theo chương trình) và necrosis (hoại tử) cũng cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế gây độc tế bào của các hợp chất này. Apoptosis là một quá trình chết tế bào có kiểm soát, trong khi necrosis là một quá trình chết tế bào không kiểm soát, thường gây ra viêm nhiễm. Việc xác định loại chết tế bào mà hợp chất gây ra có thể giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tác dụng của nó.

IV. Tổng Hợp Dẫn Xuất Quinazoline và Đánh Giá Độc Tính Tế Bào

Nghiên cứu này tập trung vào việc tổng hợp các dẫn xuất quinazoline mới và đánh giá độc tính tế bào của chúng trên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Quá trình tổng hợp bao gồm việc cải tiến quy trình tổng hợp Erlotinib hydrochloride và tổng hợp các hợp chất lai giữa dẫn xuất quinazoline với các azide qua cầu nối triazole. Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm như NMR và MS. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất được đánh giá trên các dòng tế bào ung thư như KB (ung thư biểu mô), Hep-G2 (ung thư gan) và Lu (ung thư phổi không tế bào nhỏ). Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất quinazoline.

4.1. Cải tiến quy trình tổng hợp Erlotinib hydrochloride

Nghiên cứu này tập trung vào việc cải tiến quy trình tổng hợp Erlotinib hydrochloride, một thuốc điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ đã được chứng minh hiệu quả. Việc cải tiến quy trình tổng hợp có thể giúp giảm chi phí sản xuất và tăng khả năng tiếp cận thuốc cho bệnh nhân.

4.2. Tổng hợp các hợp chất lai Quinazoline Triazole

Nghiên cứu này cũng tập trung vào việc tổng hợp các hợp chất lai giữa dẫn xuất quinazoline với các azide qua cầu nối triazole. Các hợp chất triazole đã được chứng minh có hoạt tính sinh học đa dạng, bao gồm hoạt tính chống ung thư, kháng khuẩn và kháng nấm. Việc kết hợp quinazoline với triazole có thể tạo ra các hợp chất mới có hoạt tính mạnh hơn và cơ chế tác dụng đa dạng hơn.

V. Kết Quả Nghiên Cứu và Tiềm Năng Ứng Dụng Thực Tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số dẫn xuất quinazoline mới tổng hợp được có hoạt tính gây độc tế bào đáng kể trên các dòng tế bào ung thư. Các hợp chất này có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế, bao gồm apoptosis, necrosis và ức chế chu trình tế bào. Nghiên cứu cũng xác định được mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất quinazoline, giúp định hướng cho việc thiết kế và tổng hợp các hợp chất có hoạt tính mạnh hơn trong tương lai. Các kết quả này có tiềm năng ứng dụng trong việc phát triển các thuốc điều trị ung thư mới hiệu quả hơn.

5.1. Hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số dẫn xuất quinazoline mới tổng hợp được có hoạt tính gây độc tế bào đáng kể trên các dòng tế bào ung thư như KB (ung thư biểu mô), Hep-G2 (ung thư gan) và Lu (ung thư phổi không tế bào nhỏ). Các hợp chất này có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế, bao gồm apoptosis, necrosis và ức chế chu trình tế bào.

5.2. Mối quan hệ cấu trúc hoạt tính SAR của Quinazoline

Nghiên cứu cũng xác định được mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất quinazoline, giúp định hướng cho việc thiết kế và tổng hợp các hợp chất có hoạt tính mạnh hơn trong tương lai. Ví dụ, việc thay đổi nhóm thế ở vị trí C-6 và C-7 của khung quinazoline có thể ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất.

VI. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về Độc Tính Tế Bào Quinazoline

Nghiên cứu về độc tính tế bào của hợp chất quinazoline vẫn còn nhiều tiềm năng phát triển. Các hướng nghiên cứu tương lai có thể tập trung vào việc khám phá các cơ chế tác dụng mới của các hợp chất này, đánh giá độc tính và hiệu quả của chúng trên các mô hình ung thư phức tạp hơn, và phát triển các phương pháp phân phối thuốc hiệu quả hơn. Ngoài ra, việc kết hợp quinazoline với các liệu pháp điều trị ung thư khác, như hóa trị và xạ trị, cũng có thể mang lại kết quả hứa hẹn. Nghiên cứu sâu hơn về dược động học và dược lực học của các hợp chất quinazoline cũng là cần thiết để tối ưu hóa hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ.

6.1. Nghiên cứu cơ chế tác dụng và dược động học

Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng và dược động học của các hợp chất quinazoline là cần thiết để tối ưu hóa hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ. Việc hiểu rõ cách các hợp chất này tương tác với các mục tiêu phân tử trong tế bào ung thư và cách chúng được hấp thụ, phân phối, chuyển hóa và thải trừ khỏi cơ thể có thể giúp thiết kế các thuốc hiệu quả hơn và an toàn hơn.

6.2. Kết hợp Quinazoline với các liệu pháp điều trị khác

Việc kết hợp quinazoline với các liệu pháp điều trị ung thư khác, như hóa trị và xạ trị, cũng có thể mang lại kết quả hứa hẹn. Sự kết hợp này có thể giúp tăng cường hiệu quả điều trị và giảm thiểu sự phát triển kháng thuốc của tế bào ung thư.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Căn bệnh ung thư phổi, đặc biệt là ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (Non-Small Cell Lung Cancer - NSCLC), chiếm tới 80% tổng số ca mắc mới và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong các bệnh lý ác tính trên toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Trị liệu nhắm trúng đích thông qua việc ức chế thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor Receptor - EGFR) và enzyme liên kết Tyrosine Kinase nội bào (EGFR-TK) đã mở ra bước ngoặt mang tính cách mạng so với hóa - xạ trị truyền thống vốn gây độc tủy xương nặng nề. Trong số các hoạt chất thuộc nhóm 4-anilinoquinazoline thế hệ một, Erlotinib hydrochloride (Tarceva) thể hiện hiệu quả lâm sàng vượt trội đối với các khối u mang đột biến hoạt hóa EGFR. Tuy nhiên, rào cản kinh tế nghiêm trọng (chi phí điều trị lên tới 2.000 USD/tháng, tương đương 42 triệu đồng/lọ 30 viên 150 mg tại thị trường Việt Nam) cùng với hiện tượng kháng thuốc thứ phát do đột biến thụ thể (như T790M/L858R) đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tối ưu hóa quy trình tổng hợp hóa dược trong nước và thiết kế các khung phân tử lai mới.

Khoảng trống nghiên cứu then chốt (research gap) nằm ở chỗ: các quy trình tổng hợp Erlotinib hiện hành thường đòi hỏi xúc tác kim loại quý dễ cháy nổ ($PtO_2, H_2$ áp suất cao) hoặc đi qua các dẫn xuất trung gian 4-chloroquinazoline kém bền với hiệu suất tổng chưa tối ưu; đồng thời, chưa có công trình nào tích hợp đồng thời hệ vòng crown ether tại vị trí C-6, C-7 với cấu tử 1,2,3-triazole ở mạch nhánh C-4 nhằm tạo hiệu ứng ức chế đa cơ chế và tăng cường độ hòa tan sinh học. Luận án tiến sĩ Hóa học của nghiên cứu sinh Đinh Thúy Vân, thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS. Nguyễn Văn Tuyến và TS. Đặng Thị Tuyết Anh tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã giải quyết trọn vẹn thách thức này.

Nghiên cứu tập trung vào 4 câu hỏi khoa học và hệ giả thuyết định lượng:

1. Câu hỏi 1 (Q1): Làm thế nào để rút ngắn và nâng cao hiệu suất tổng hợp Erlotinib hydrochloride từ acid 3,4-dihydroxybenzoic mà không qua trung gian halogen hóa kém bền? Giả thuyết 1 (H1): Phản ứng chuyển vị Dimroth qua trung gian amidine và quy trình one-pot cyano hóa bằng $Urea/P_2O_5$ sẽ nâng hiệu suất tổng giai đoạn lên trên 60%.
2. Câu hỏi 2 (Q2): Khả năng dung hợp hệ vòng kín crown ether (dioxolo, dioxino, dioxepino) vào vị trí C-6, C-7 của khung quinazoline ảnh hưởng thế nào đến ái lực liên kết enzyme? Giả thuyết 2 (H2): Khung crown ether tạo ra sự tương hợp thể tích và phân bố điện tử tối ưu tại rãnh kỵ nước của EGFR kinase.
3. Câu hỏi 3 (Q3): Cầu nối dị vòng 1,2,3-triazole tạo bởi phản ứng Click CuAAC có làm tăng độc tính chọn lọc trên tế bào ung thư? Giả thuyết 3 (H3): Moment lưỡng cực cao của vòng 1,2,3-triazole kết hợp các nhóm thế hút/đẩy điện tử ($-NO_2, -CF_3$, halogen) sẽ tăng cường liên kết hydro và tương tác tĩnh điện với thụ thể mục tiêu.
4. Câu hỏi 4 (Q4): Các phân tử lai mới có thể hiện năng lượng liên kết tự do thấp hơn các chất đối chứng lâm sàng trong mô hình protein docking? Giả thuyết 4 (H4): Năng lượng gắn kết $\Delta G_L$ của các dẫn xuất quinazoline-triazole trên miền kinase EGFR tương quan thuận với giá trị $IC_{50}$ in vitro.

Phạm vi nghiên cứu bao gồm thiết kế, tổng hợp toàn phần hơn 30 hợp chất dị vòng quinazoline và quinazoline-triazole lai hóa, xác định cấu trúc bằng phổ đa chiều hiện đại và đánh giá độc tính tế bào sàng lọc trên 3 dòng ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư gan Hep-G2 và ung thư phổi không tế bào nhỏ Lu.

Literature Review và Positioning

Khung dị vòng quinazoline (1,3-diazanaphthalene) cấu thành từ một vòng benzene ngưng tụ với vòng pyrimidine phẳng đóng vai trò là "khung dược lực học ưu tiên" (privileged scaffold) trong hóa dược chống ung thư. Các nghiên cứu cơ bản khẳng định rằng "khung 4-anilinoquinazoline quyết định khả năng ức chế EGFR, còn các nhóm thế ở vị trí C-6 và C-7 quyết định tính chất hóa lý của hợp chất này". Trải qua ba thế hệ thuốc ức chế EGFR-TK, các cấu trúc thương mại như Gefitinib (AstraZeneca), Erlotinib (Roche), Lapatinib (GSK), Vandetanib (AstraZeneca), Afatinib (Boehringer Ingelheim) và Icotinib (Betta Pharma) đã chứng minh tiềm năng trị liệu to lớn.

Tổng hợp y văn quốc tế cho thấy hai trường phái thiết kế cấu trúc chính đang định hình hướng phát triển của nhóm quinazoline:

1. Trường phái biến đổi ngoại vi vòng A (C-6, C-7): Yinxiang Wang và cộng sự (2012) tiên phong đưa hệ crown ether vào khung quinazoline tạo nên Icotinib (7a) với hiệu quả điều trị NSCLC tương đương Gefitinib nhưng dung nạp tốt hơn ở bệnh nhân kháng hóa trị. Hu Liming và cộng sự (2014, 2015) khai thác phản ứng đóng vòng nội phân tử tạo các dẫn xuất $[1,4]dioxino[2,3-f]quinazoline$ (27) và morpholin-3-one $(25, 26)$, cho thấy các dị vòng ngưng tụ giàu oxy cải thiện rõ rệt độ tan và ức chế chọn lọc đột biến kép $EGFR^{T790M/L858R}$ với $IC_{50} < 50$ nM.
2. Trường phái lai hóa phân tử (Pharmacophore Hybridization): Nhằm khắc phục tình trạng kháng thuốc đơn đích, Xiong Cai và cộng sự (2010) thiết kế hoạt chất đa đích CUDC-101 (68) ức chế đồng thời HDAC/EGFR/HER2 với $IC_{50}$ lần lượt là 4,4 nM, 2,4 nM và 15,7 nM. Peng E.W. (2016) và Mahboobi S. (2010) mở rộng liên kết acid hydroxamic với khung 4-anilinoquinazoline tạo các chất ức chế kép VEGFR-2/HDAC (82a, $IC_{50} = 74$ nM trên VEGFR-2). Cùng lúc, Malose Jack Mphahlele (2018) và Adel S. El-Azab (2017) chứng minh việc gắn kết isatine hoặc halogenophenyl tại vị trí C-2 và C-4 làm tăng mạnh khả năng kích hoạt apoptosis trên dòng tế bào HeLa và MDA-MB-231.

Về mặt công nghệ tổng hợp Erlotinib, các lộ trình kinh điển tồn tại nhiều nhược điểm. Quy trình của Petr Knesl và cộng sự (2006) đi từ ethyl 3,4-dihydroxybenzoate qua 6 bước đạt hiệu suất 56% nhưng sử dụng $PtO_2/H_2$ nguy hiểm. Phương pháp của Venkateshappa Chandregowda (2007, 2009) sử dụng $P_2S_5$ tạo trung gian thioamide 101 đạt hiệu suất 73% nhưng kéo dài quy trình; còn quy trình cải tiến năm 2009 từ 4,5-bis(2-methoxyethoxy)-2-nitrobenzonitrile 102 dùng $Na_2S_2O_4$ đạt hiệu suất tổng 63%. Davoud Asgari và cộng sự (2011) đã tạo đột phá khi áp dụng phản ứng one-pot cyano hóa với $Urea/P_2O_5$ và chuyển vị Dimroth từ intermediate formamidine 104, đạt hiệu suất 60% qua 9 bước. Leila Barghi và cộng sự (2012) tối ưu hóa phản ứng khử in situ bằng $Pd/C$ và ammonium formate trong 2-propanol đạt hiệu suất tổng 44%.

Luận án của Đinh Thúy Vân định vị chính xác điểm nghẽn của y văn: kế thừa phản ứng one-pot cyano hóa và chuyển vị Dimroth của Asgari, đồng thời giải quyết bài toán dung hợp đa cấu tử chưa từng có bằng cách kết hợp khung crown ether quinazoline của Yinxiang Wang với cấu tử 1,2,3-triazole thông qua phản ứng Click Cu(I). Đây là bước tiến độc đáo chuyển từ đơn trị liệu sang nền tảng phân tử lai hóa kép có khả năng tương tác đa điểm.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án đóng góp quan trọng vào lý thuyết Mối quan hệ Định tính và Định lượng giữa Cấu trúc và Hoạt tính sinh học (SAR/QSAR) trong hóa dược dị vòng, làm sáng tỏ 3 nguyên lý lý thuyết cơ bản:

1. Mở rộng lý thuyết tương tác túi gắn ATP của EGFR Kinase: Củng cố mô hình gắn kết ligand-thụ thể của Wood et al. và Fry et al. Khung 4-anilinoquinazoline đóng vai trò mỏ neo (anchor) tạo liên kết hydro then chốt giữa nguyên tử N-1 của nhân quinazoline với amino acid bản lề $Met793$ (Hinged region). Việc thay thế chuỗi béo mở 6,7-bis(2-methoxyethoxy) bằng hệ vòng crown ether khép kín giúp hạn chế sự mất mát entropy tự do khi gắn kết, tối ưu hóa sự khít khao thể tích (steric fitting) vào khoang kỵ nước liền kề.
2. Lý thuyết hóa học Click và tương tác lưỡng cực của dị vòng 1,2,3-triazole: Khẳng định quan điểm "1,2,3-triazole vừa là tác nhân vừa là cầu nối lý tưởng để lai hoá với các lớp chất có dược tính khác ví dụ như 4-aminoquinazoline". Với moment lưỡng cực lớn (~5 Debye) và độ bền tuyệt đối trước tác nhân oxy hóa - khử nội bào, vòng 1,2,3-triazole không chỉ đóng vai trò liên kết cấu trúc (spacer) mà còn trực tiếp tham gia tạo liên kết hydro yếu ($C-H\cdots O/N$) và tương tác xếp chồng $\pi-\pi$ (pi-stacking) với các gốc thơm $Phe723, Tyr777$.
3. Cơ chế chuyển hóa định hướng qua chuyển vị Dimroth: Thực nghiệm luận án chứng minh tính quy luật của chuyển vị Dimroth lưỡng phân tử giữa hợp chất $N,N-dimethylformamidine$ trung gian 104 với 3-ethynylaniline, tạo dẫn xuất quinazoline bền vững mà hoàn toàn không cần sự hiện diện của tác nhân halogen hóa độc hại $POCl_3$ hay $SOCl_2$.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp liên ngành giữa Hóa tổng hợp hữu cơ, Hóa phân tích phổ nghiệm và Sinh học phân tử tính toán:

• Mô hình đa tầng (Tri-level Analytical Framework):
  • Tầng 1 (Molecular Synthesis): Thiết kế lộ trình tổng hợp hội tụ (convergent synthesis), chuyển hóa linh hoạt từ tiền chất acid 3,4-dihydroxybenzoic (106) sang các phân nhóm dẫn xuất crown ether ($119a-d$) và dị vòng triazole liên hợp ($120a-d, 121a-d, 122a-d, 123a-c$).
  • Tầng 2 (Spectroscopic Structural Elucidation): Giải đoán cấu trúc không gian thông qua sự tương quan cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR), kết hợp kỹ thuật lọc gradient qua phổ $HMBC$ (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) và $HSQC$ (Heteronuclear Single-Quantum Correlation) nhằm ấn định chính xác vị trí ngưng tụ vòng và tính chọn lọc lập thể thế 1,4-triazole.
  • Tầng 3 (Computational Target Prediction & In Vitro Validation): Mô phỏng docking phân tử trên nền cấu trúc 3D thực nghiệm của thụ thể EGFR kinase để giải thích cơ chế năng lượng liên kết, đối chiếu trực tiếp với kết quả thử nghiệm độc tính tế bào in vitro.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu vận hành theo hệ hình thực chứng nghiêm ngặt (Positivism Paradigm) với phương pháp tiếp cận thực nghiệm định lượng kết hợp mô phỏng cấu trúc phân tử in silico:

• Triết lý nghiên cứu: Xác định mối quan hệ nhân quả trực tiếp giữa biến đổi nhóm thế hóa học (electron donating/withdrawing groups, kích thước vòng crown ether) và hoạt tính ức chế sinh học tế bào ung thư.
• Thiết kế tổng hợp đa nhánh: Phân tách thành hai phân hệ thực nghiệm song song: (1) Cải tiến và tối ưu hóa quy trình tổng hợp hoạt chất chuẩn Erlotinib hydrochloride; (2) Tổng hợp thư viện phân tử lai quinazoline-crown ether-triazole mới qua phản ứng cộng đóng vòng 1,3-lưỡng cực xúc tác $Cu(I)$ (CuAAC).

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thực nghiệm được tiêu chuẩn hóa cao độ với các thông số vận hành chi tiết:

• Giai đoạn 1 - Điều chế tiền chất Erlotinib:
  • Alkyl hóa acid 3,4-dihydroxybenzoic 106 (10 g; 65 mmol) với 1-bromo-2-methoxyethane (24 ml; 260 mmol) trong DMF với xúc tác chuyển pha tetrabutylammonium hydrosulfate ($2,2$ g; 6,5 mmol) và $K_2CO_3$ ($35,9$ g; 260 mmol) ở 110°C trong 20 giờ. Thủy phân este trung gian 110 trong $KOH/MeOH/H_2O$ ở nhiệt độ phòng (4 giờ), acid hóa bằng HCl 10% về pH ~ 3 ở 0°C thu được 15,8 g acid 3,4-bis(2-methoxyethoxy)benzoic 107 (hiệu suất 72,5%, điểm nóng chảy 107-109°C).
  • Cyano hóa one-pot: Đun 107 (12,3 g; 0,08 mol) với urea (48 g; 0,8 mol) ở 220°C trong 1 giờ, làm nguội, thêm xylene (150 ml) và $P_2O_5$ (45,4 g; 0,32 mol), đun hồi lưu ở 142°C trong 15 giờ. Tinh chế qua cột silica gel (100-200 mesh, n-hexane/ethyl acetate) thu 16,1 g 3,4-bis(2-methoxyethoxy)benzonitrile 108 (hiệu suất 80%).
  • Nitro hóa và khử hóa: Nitro hóa 108 (15 g; 0,06 mol) bằng $HNO_3$ 65% trong acid acetic băng ở 0°C đến 50°C (3 giờ) cho sản phẩm 102. Khử hóa chọn lọc nhóm nitro thành amino tạo tiền chất 2-amino-4,5-bis(2-methoxyethoxy)benzonitrile 103.
  • Đóng vòng chuyển vị Dimroth: Cho 103 phản ứng với $DMF-DMA$ tạo formamidine trung gian 104, sau đó xử lý với 3-ethynylaniline trong acid acetic ở 110-130°C tạo Erlotinib bazơ tự do 105, sục khí HCl trong methanol tạo muối Erlotinib hydrochloride 93.
• Giai đoạn 2 - Tổng hợp dãy hợp chất lai Crown Ether - Quinazoline - Triazole:
  • Đóng vòng crown ether C-6, C-7: Tạo các dẫn xuất dị vòng $[1,3]dioxolo[4,5-g]quinazoline$ ($119b$), $7,8-dihydro-[1,4]dioxino[2,3-g]quinazoline$ ($119c$) và $8,9-dihydro-7H-[1,4]dioxepino[2,3-g]quinazoline$ ($119d$) từ acid 3,4-dihydroxybenzoic với các dihaloalkane tương ứng.
  • Phản ứng Click CuAAC: Ghép nối nhóm ethynyl tận cùng của các dẫn xuất 4-(3-ethynylphenylamino)quinazoline ($119a-d$) với các dẫn xuất aryl azide thế ($R-N_3$) dưới xúc tác đồng (I) tạo chọn lọc cấu hình 1,4-disubstituted 1,2,3-triazole ($120a-d, 121a-d, 122a-d, 123a-c$).

Data và phân tích

• Hệ thống thiết bị phân tích cấu trúc:
  • Điểm nóng chảy: Thiết bị Gallenkamp (Anh).
  • Phổ hồng ngoại (FT-IR): Máy Spectrum Two (PerkinElmer), ép viên KBr. Erlotinib HCl thể hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng tại 3276, 3056, 3020, 2921, 2896, 2819, 2746, 2711, 1667, 1564, 1512, 1446, 1284, 1122, 892 $cm^{-1}$.
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Máy Bruker XL-500 ($^1H-NMR$ ở 500 MHz, $^{13}C-NMR$ ở 125 MHz), chuẩn nội TMS, dung môi $CDCl_3, CD_3OD, DMSO-d_6$. Dữ liệu $^{13}C-NMR$ của Erlotinib HCl xác nhận đầy đủ 19 tín hiệu carbon: $\delta$ 170.22, 159.11, 155.07, 151.20, 147.28, 142.31, 130.89, 125.76, 124.35, 122.34, 117.65, 114.15, 108.83, 100.97, 86.76, 80.63, 75.78, 73.52, 51.25 ppm.
  • Phổ khối phân giải cao: Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS sử dụng nguồn ion hóa ESI.
• Mô phỏng Protein Docking:
  • Cấu trúc 3D protein thụ thể EGFR kinase tải từ Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB). Sử dụng thuật toán di truyền di động (Lamarckian Genetic Algorithm - LGA) tích hợp trong AutoDock/AutoDock Vina.
  • Chuẩn bị cấu tử và thụ thể qua phần mềm ChemDraw, Discovery Studio, PyMOL và MOE: khử nước, thêm nguyên tử hydro phân cực, gán trường lực và điện tích Gasteiger, khoanh vùng grid box bao trọn tâm hoạt động của túi liên kết ATP. Hàm tính điểm đánh giá năng lượng tự do liên kết Gibbs ($\Delta G_L$) và hằng số ức chế ($K_i$).
• Thử nghiệm sinh học gây độc tế bào: Phương pháp đo độ hấp thụ quang học MTT/SRB chuẩn hóa thực hiện tại Phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học trên 3 dòng tế bào người: KB, Hep-G2 và Lu. Giá trị $IC_{50}$ được tính toán xử lý thống kê bằng phần mềm chuyên dụng qua 3 lần lặp độc lập.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Tối ưu hóa thành công quy trình tổng hợp Erlotinib hydrochloride: Quy trình cải tiến đạt hiệu suất tổng thể vượt trội, loại bỏ hoàn toàn các bước tạo trung gian 4-chloroquinazoline không bền, nâng cao tính an toàn công nghiệp và giảm đáng kể giá thành hóa chất.
2. Tổng hợp thành công 4 dãy phân tử lai mới: Chế tạo thư viện hơn 20 dẫn xuất lai quinazoline-triazole chứa các cấu tử crown ether kích thước khác nhau (vòng 5 cạnh dioxolo, vòng 6 cạnh dioxino, vòng 7 cạnh dioxepino) liên kết với vòng triazole mang các nhóm thế phenyl, benzyl, nitro, trifluoromethyl.
3. Xác lập hoạt tính độc tế bào mạnh mẽ in vitro: Các hợp chất lai tiêu biểu $120d, 122a, 122b, 123c$ thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào ung thư vượt trội trên cả 3 dòng KB, Hep-G2 và Lu với giá trị $IC_{50}$ đạt mức micromol thấp, vượt trội hoặc tương đương Erlotinib chuẩn đối chứng.
4. Khám phá cơ chế liên kết docking phân tử ưu việt: Kết quả mô phỏng docking trên 3 vị trí hoạt động của miền kinase EGFR chỉ ra rằng các hợp chất $120d, 122a, 122b, 123c$ gắn kết sâu vào túi liên kết ATP với năng lượng gắn kết $\Delta G_L$ âm vượt trội, hình thành mạng lưới liên kết hydro đa điểm bền vững cùng tương tác kỵ nước mạnh mẽ với chuỗi amino acid trọng yếu.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết hóa dược: Khẳng định tính đúng đắn của chiến lược thiết kế "phân tử lai đa chức năng" (hybrid multi-target pharmacophore). Sự kết hợp giữa dị vòng cứng nhắc quinazoline, vòng crown ether linh hoạt và cầu nối 1,2,3-triazole tạo ra một cấu trúc không gian tối ưu cho việc ức chế kinase.
• Về mặt công nghệ tổng hợp: Mở ra phương pháp luận tổng hợp xanh, tiết kiệm năng lượng và giảm thiểu chất thải độc hại cho ngành công nghiệp hóa dược trong nước thông qua việc làm chủ phản ứng one-pot cyano hóa và chuyển vị Dimroth.
• Về mặt y dược lâm sàng và chính sách y tế: Cung cấp cơ sở khoa học vững chắc để phát triển các ứng viên thuốc chống ung thư phổi thế hệ mới "Make in Vietnam", mở ra cơ hội tự chủ nguồn nguyên liệu dược chất (API) cho hoạt chất Erlotinib, trực tiếp hạ giá thành điều trị cho bệnh nhân nghèo.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả đột phá, luận án thẳng thắn ghi nhận 4 hạn chế nghiên cứu mang tính khách quan:

1. Giới hạn mô hình thử nghiệm in vitro: Hoạt tính sinh học mới dừng lại ở mức độ đánh giá độc tính tế bào trên các dòng tế bào nuôi cấy 2D (KB, Hep-G2, Lu), chưa tiến hành thử nghiệm enzyme assay trực tiếp trên các kinase tinh khiết ($EGFR^{wt}, EGFR^{T790M}, HER2, VEGFR-2$).
2. Thiếu dữ liệu tiền lâm sàng in vivo: Chưa tiến hành khảo sát dược động học (PK/PD), độ ổn định trao đổi chất tại gan (cytochrome P450), khả năng thấm qua màng sinh học và độc tính cấp tính trên động vật thực nghiệm (chuột mang khối u dị ghép xenograft).
3. Độ mở rộng của thư viện nhóm thế: Nhóm thế gắn trên vòng triazole chủ yếu tập trung vào một số gốc phenyl/benzyl mang nhóm thế đơn giản, chưa mở rộng sang các hệ dị vòng phức tạp khác như coumarin, isatin hay peptide ngắn.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối (Future Research Agenda) vạch rõ 4 định hướng cụ thể:

1. Thử nghiệm hoạt tính ức chế trực tiếp trên enzyme EGFR kinase đột biến ($T790M/L858R$) và enzyme histon deacetylase (HDAC) nhằm đánh giá chính xác cơ chế tác dụng kép.
2. Tối ưu hóa cấu trúc dẫn xuất $122a$ và $123c$ để cải thiện độ tan trong nước và nâng cao sinh khả dụng đường uống.
3. Đánh giá dược động học, phân bố mô và thử nghiệm hoạt tính kháng u in vivo trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch mang khối u phổi người.
4. Triển khai nâng cấp quy mô tổng hợp (scale-up) quy trình điều chế Erlotinib hydrochloride ở quy mô pilot 1-5 kg/mẻ.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Luận án công bố nhiều công trình trên các tạp chí khoa học chuyên ngành uy tín trong nước và quốc tế, đóng góp dữ liệu phổ nghiệm chuẩn ($^1H, ^{13}C, HMBC, HSQC, HR-MS$) của hàng loạt hợp chất dị vòng mới vào cơ sở dữ liệu hóa học thế giới.
• Chuyển giao công nghệ và sản xuất dược phẩm: Tạo tiền đề kỹ thuật vững chắc để chuyển giao quy trình tổng hợp Erlotinib hydrochloride độ tinh khiết cao (>99%) cho các nhà máy dược phẩm đạt chuẩn GMP trong nước, giúp thay thế thuốc ngoại nhập đắt tiền.
• Lợi ích kinh tế - xã hội: Đóng góp trực tiếp vào mục tiêu giảm gánh nặng chi phí bảo hiểm y tế và gia đình bệnh nhân ung thư, kéo dài thời gian sống và nâng cao chất lượng sống cho người bệnh tại các nước đang phát triển.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và học giả chuyên ngành Hóa Dược/Hóa Hữu cơ: Tiếp cận quy trình tổng hợp mẫu mực về phản ứng chuyển vị Dimroth, phản ứng Click CuAAC và phương pháp biện luận phổ 2D-NMR phức tạp.
• Bộ phận Nghiên cứu & Phát triển (R&D) của các doanh nghiệp dược phẩm: Nhận chuyển giao quy trình tổng hợp Erlotinib hydrochloride hiệu suất cao, nguyên liệu sẵn có, dễ triển khai quy mô công nghiệp.
• Các nhà ung thư học lâm sàng và nhà hoạch định chính sách y tế: Có thêm dữ liệu khoa học tin cậy về các phân tử đích tiềm năng nhằm đa dạng hóa phác đồ điều trị trúng đích bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Đó là việc tích hợp thành công thuyết tương tác khoang kỵ nước của khung quinazoline với thuyết liên kết lưỡng cực 1,2,3-triazole, chứng minh rằng việc cố định cấu hình không gian bằng vòng crown ether tại C-6, C-7 làm giảm hao phí entropy khi ligand khớp vào trung tâm hoạt động của EGFR kinase.

2. Điểm cải tiến phương pháp luận tổng hợp so với y văn quốc tế? So với quy trình 6 bước dùng xúc tác dễ cháy $PtO_2/H_2$ của Petr Knesl (2006) hay quy trình 7 bước qua muối ammonium formate của Leila Barghi (2012), luận án đã kết hợp phản ứng cyano hóa one-pot bằng $Urea/P_2O_5$ và chuyển vị Dimroth trực tiếp từ intermediate formamidine 104, giúp bỏ qua hoàn toàn giai đoạn tạo dẫn xuất 4-chloroquinazoline kém bền, đạt hiệu suất cao và độ sạch vượt trội.

3. Phát hiện thực nghiệm gây bất ngờ nhất trong nghiên cứu? Sự kết hợp giữa vòng crown ether 7 cạnh (dioxepino, $119d$) và cầu nối triazole mang nhóm thế thơm không làm giảm ái lực do cản trở không gian mà ngược lại, các dẫn xuất $122a, 123c$ lại thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh tương đương và năng lượng liên kết docking thấp hơn cả hoạt chất chuẩn Erlotinib.

4. Luận án có cung cấp đầy đủ quy trình lặp lại thực nghiệm (Replication Protocol) không? Toàn bộ quy trình tổng hợp, tỷ lệ mol (chất phản ứng, dung môi, xúc tác), nhiệt độ, thời gian, phương pháp tinh chế cột silica gel và dữ liệu phổ đầy đủ ($R_f$, điểm nóng chảy, FT-IR, $^1H-NMR, ^{13}C-NMR, HR-MS, HMBC, HSQC$) được trình bày chi tiết và chuẩn hóa, đảm bảo khả năng tái lặp độc lập 100%.

5. Kế hoạch nghiên cứu 10 năm được định hình như thế nào? Lộ trình phát triển 10 năm bao gồm: hoàn thiện nghiên cứu tiền lâm sàng/lâm sàng cho dẫn chất lai ưu tú nhất ($122a/123c$), xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và hồ sơ đăng ký thuốc cho Erlotinib hydrochloride sản xuất trong nước, mở rộng công nghệ Click đa chiều trên các khung dị vòng chống ung thư thế hệ mới.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Đinh Thúy Vân đã đạt được 5 đóng góp học thuật và thực tiễn mang tính then chốt:

1. Hoàn thiện quy trình công nghệ tổng hợp Erlotinib hydrochloride từ acid 3,4-dihydroxybenzoic đạt hiệu suất cao, an toàn và có tính khả thi công nghiệp vượt trội.
2. Thiết kế và tổng hợp thành công 4 dãy dẫn xuất dị vòng quinazoline dung hợp crown ether tại vị trí C-6, C-7.
3. Chế tạo thành công thư viện các hợp chất lai cấu trúc mới Quinazoline - Crown Ether - 1,2,3-Triazole thông qua phản ứng Click CuAAC chọn lọc vùng thế 1,4.
4. Khẳng định cấu trúc phân tử chính xác của toàn bộ các hợp chất mới bằng hệ phương pháp phổ tiên tiến ($^1H, ^{13}C, 2D-NMR, HR-MS$).
5. Phát hiện các phân tử lai $120d, 122a, 122b, 123c$ có hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh trên 3 dòng KB, Hep-G2, Lu và giải thích thỏa đáng cơ chế liên kết thông qua mô phỏng protein docking trên miền kinase EGFR.

Công trình tạo ra bước đột phá quan trọng trong lĩnh vực hóa dược dị vòng tại Việt Nam, mở ra hướng nghiên cứu mới về thuốc ức chế kinase đa đích và đóng góp thiết thực vào nền y học nước nhà.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Theo số liệu thống kê của Globocan, trên biểu đồ các bệnh ung thư toàn cầu năm 2008, ung thư phổi chiếm 13% tổng số ca bệnh mới và 18,2% số ca tử vong. Ung thư phổi là một trong những bệnh nguy hiểm hiện nay trên thế giới, trong đó ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (UTPKPTBN) rất phổ biến và được xem là một căn bệnh nguy hiểm (Ung thư phổi không tế bào nhỏ bắt đầu hình thành từ các tế bào khỏe mạnh trong phổi. Vì một lý do nào đó, phần lớn là do hút thuốc lá hoặc tiếp xúc thường xuyên với khói thuốc lá, các tế bào khỏe mạnh đột nhiên phân chia không kiểm soát, từ đó hình thành khối u tại phổi. Khối u có thể lành tính hoặc ác tính).

Căn bệnh này đang gia tăng đáng kể ở các nước thu nhập thấp và trung bình. Tại Việt Nam, ung thư phổi đứng hàng thứ 2 về số ca bệnh và số lượng bệnh nhân tử vong trong tổng số các loại ung thư hàng năm ở cả hai giới nam và nữ. Ung thư phổi được chia làm hai loại: ung thư phổi tế bào nhỏ và UTPKPTBN. Mỗi loại phát triển theo những cách khác nhau và hướng điều trị cũng khác nhau.

Trong đó, UTPKPTBN chiếm khoảng 80% tổng số ca bệnh ung thư phổi. Việc điều trị UTPKPTBN thường được biết đến với phương pháp hóa trị hoặc xạ trị. Tuy nhiên, các liệu pháp này có một số hạn chế như khả năng kéo dài thời gian sống của bệnh nhân thường ngắn, thông thường dưới 1 năm đi kèm với chất lượng sống bị ảnh hưởng nặng nề. Người bệnh phải gánh chịu nhiều tác dụng phụ của thuốc, đặc biệt là các tác dụng phụ trên tủy xương, gây ra tình trạng thiếu máu, chảy máu và giảm sức đề kháng của cơ thể dẫn đến các khả năng nhiễm khuẩn huyết làm cho bệnh nhân sớm tử vong.

Với các UTPKPTBN có đột biến hoạt hóa EGFR sẽ làm cho bệnh với mức độ ác tính mạnh hơn và thời gian sống của bệnh nhân ngắn hơn, khả năng đáp ứng với hóa trị liệu thông thường kém hơn. Quinazoline là lớp chất đầy tiềm năng trong thiết kế tổng hợp các loại thuốc chống ung thư theo cơ chế ức chế enzyme kinase [1-4]. Gefitinib (Iressa), erlotinib (Tarceva), lapatinib (Tykerb) và vandetanib (Caprelsa) là các hợp chất quinazoline tiêu biểu đã được đưa vào sản xuất thuốc điều trị ung thư. Trong đó Gefitinib và Erlotinib là thuốc hoá trị liệu thụ thể yếu tố tăng sinh biểu bì (EGFR) thế hệ đầu tiên được sử dụng để điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ.

Thuốc Erlotinb là một dẫn xuất của quinazoline có tên thương mại là Tarceva, được sản xuất bởi hãng dược phẩm Hoffmann - La Roche. Thuốc được sử dụng có hiệu quả cao cho điều trị bệnh 1 ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (UTPKPTBN) có đột biến hoạt hóa EGFR. Đây là phương pháp đột phá trong điều trị UTPKPTBN tạo ra cơ hội kéo dài thời gian sống với chất lượng sống cao hơn. Ở Việt Nam, thuốc Tarceva có thành phần là erlotinib hydrochloride chưa được sử dụng rộng rãi, trước hết vì chi phí điều trị bằng Tarceva rất đắt tiền, 2.000 USD/chu kỳ điều trị (một chu kỳ =1 tháng), giá bán trên thị trường Việt Nam khoảng 42 triệu đồng/ lọ/30 viên loại 150mg.

Trong nhiều nghiên cứu trước đó, hợp chất 1,2,3-triazole cho hoạt tính chống ung thư, kháng khuẩn và kháng nấm mạnh. Triazole là hợp chất dị vòng thơm năm cạnh với 3 nguyên tử nitơ có moment lưỡng cực cao, dễ dàng tham gia quá trình hình thành liên kết hydro và các tương tác lưỡng cực với ADN, protein hoặc các tế bào. Hợp chất dị vòng này không bị thủy phân trong môi trường axit và bazơ cũng như không bị phá huỷ trong quá trình khử và oxy hóa. Với những tính năng ưu việt về mặt hoá học cũng như hoạt tính sinh học, 1,2,3-triazole vừa là tác nhân vừa là cầu nối lý tưởng để lai hoá với các lớp chất có dược tính khác ví dụ như 4-aminoquinazoline.

Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu tổng hợp và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất quinazolin” là hướng nghiên cứu rất có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Mục tiêu luận án: 1. Nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp thuốc erlotinib hydrocloride. Nghiên cứu tổng hợp và xác định cấu trúc dẫn xuất quinazoline.

Nghiên cứu tổng hợp và xác định cấu trúc của các hợp chất lai giữa các dẫn xuất quinazoline với các azide qua cầu nối triazole. Nghiên cứu thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất lai tổng hợp được trên ba dòng tế bào ung thư ở người bao gồm KB (ung thư biểu mô, Hep-G2 (ung thư gan) và Lu (ung thư phổi không phải tế bào nhỏ). 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. TỔNG QUAN VỀ LỚP CHẤT QUINAZOLINE Quinazoline là một hợp chất hữu cơ với công thức C8H6N2.

Nó là một dị vòng thơm với một cấu trúc lưỡng tính bao gồm một vòng benzen và một vòng pyrimidine. Quinazoline là một phân tử phẳng. Nó là đồng phân với các diazanaphthalen khác của nhóm phụ benzodiazine: cinnoline, quinoxaline và phthalazine.1: Cấu trúc của Quinazoline Quinazoline là một chất rắn tinh thể màu vàng sáng, hòa tan được trong nước, còn được gọi là 1,3-diazanaphthalene, tên gọi quinazoline được xuất phát từ một dẫn xuất aza của quinoline. Mặc dù phân tử quinazoline mẹ hiếm khi được đề cập trong tài liệu kỹ thuật nhưng các dẫn xuất thay thế của nó đã và đang được quan tâm nghiên cứu tổng hợp cho các mục đích y học như thuốc chống sốt rét và thuốc chống ung thư.

Bằng cách ức chế enzim Tyrosine Kinase [1-4] thì những thuốc chống ung thư được tổng hợp từ lớp chất Quinazoline đang đem lại những đột phá trong trị liệu ung thư hiện nay. Một số những hợp chất quinazoline tiêu biểu như Gefitinib (Iressa), erlotinib (Tarceva), lapatinib (Tykerb) và vandetanib (Caprelsa) đã được đưa vào sản xuất thuốc điều trị ung thư. Trong đó Gefitinib và erlotinib là hai thuốc hoá trị liệu thụ thể yếu tố tăng sinh biểu bì (EGFR) thuộc thế hệ đầu tiên được sử dụng để điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ. Lapatinib được dùng làm thuốc điều trị bệnh ung thư vú và các khối u rắn khác bằng cách ức chế tyrosine kinase kép HER2/neu và EGFR.

Vandetanib được dùng trong điều trị bệnh ung thư tuyến giáp thể tuỷ di căn, bằng cách ức chế kinase của một số thụ thể tế bào, chủ yếu là các mạch máu nội mạc thụ thể yếu tố tăng trưởng (VEGFR), EGFR và kinase RET-tyrosine. Tuy nhiên, hiệu quả của các thuốc này bị giới hạn trong một nhóm nhỏ các bệnh nhân do sự không đồng nhất các phân tử bên trong khối u và giữa các khối u với nhau, khả năng đáp ứng thuốc kém và kháng thuốc do đột biến thụ thể [5-9]. Vì 3 vậy, nghiên cứu thiết kế và tổng hợp các hợp chất mới với mục tiêu ức chế EGFR hoặc ức chế đa chức năng là cần thiết. Hiện nay, các dẫn xuất của 4- anilinoquinazoline chủ yếu được tổng hợp bằng cách đưa các nhóm thế khác nhau vào vị trí C-6, C-7 của khung quinazoline và vòng aniline nhằm tổng hợp các hoạt chất mới để tìm kiếm các dẫn chất có hoạt tính cao hơn.

Chỉ có một số nhỏ công trình đã nghiên cứu tổng hợp các hợp chất lai giữa quinazoline với các chất chống ung thư theo cơ chế tác dụng khác và nhận được kết quả đáng khích lệ. F O Cl N F O O O S HN HN Cl HN O HN O O N O N N O O N O N N Gefitinib Erlotinib Lapatinib F Br F O HN HN HN Cl O O O HN N N N O N O O N N O N N O Vandetanib Icotinib Carnetinib F F O O Cl Cl O O N HN Cl N HN Cl HN HN N N O O N O N Afatinib Dacomitinib Hình 1.2: Cấu trúc hóa học một số hợp chất quinazoline ức chế EGFR Trong phân tử 4-anilinoquinazoline, khung 4-anilinoquinazoline quyết định khả năng ức chế EGFR, còn các nhóm thế ở vị trí C-6 và C-7 quyết định tính chất hóa lý của hợp chất này [14-16]. Các nhóm aniline ở vị trí C-4 của khung quinazoline được lựa chọn phù hợp để tạo ra các tương tác kỵ nước quan trọng nhằm ức chế EGFR hiệu quả. Những nghiên cứu về sự tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học (SAR) của các hợp chất quinazoline chỉ ra rằng kích thước và bản chất của gốc aniline quyết định sự ức chế chọn lọc enzym kinase, trong khi đó nhóm ưa nước ở vị trí C-6 của khung quinazoline làm cải thiện các tính chất vật lý có lợi cho tác dụng dược lý của thuốc [15, 16].

Các nhóm arylamino, phổ biến nhất là 3-ethynylphenylamino và 3-chloro-4-flouro-phenylamino, thường được dùng để thiết kế tổng hợp các chất ức chế EGFR. Với những lợi thế trên thì việc thiết kế 4 tổng hợp để đưa các nhóm thế khác nhau vào các vị trí C-6, C-7 và C-4 của khung quinazoline đang là hướng nghiên cứu nhiều tiềm năng. Những nghiên cứu ngoài nước về tổng hợp dẫn xuất quinazoline 1. Chuyển hóa ở vị trí C-6, C-7 và C4-NH của khung quinazoline Những nghiên cứu trước đây về erlotinib cho thấy rõ vai trò quan trọng của nhóm chức ether được gắn với khung quinazoline.

Các hợp chất tạo ra có hoạt tính chống ung thư mạnh. Kế thừa và phát triển các nghiên cứu trước thì nhóm tác giả Yinxiang Wang vào năm 2012 đã tổng hợp một dãy các crown ether gắn với khung quinazoline 7 bằng phương pháp truyền thống đi từ nguyên liệu ban đầu metyl 3,4- dihydroxy-benzoat 1 qua 6 bước phản ứng (sơ đồ 1. Kết quả thử hoạt tính của các dẫn xuất crown ether quinazoline 7 trên các dòng enzym Abl và Arg kinaza cho thấy hợp chất 7a có hoạt tính mạnh nhất. Icotinib đã được đưa vào thử nghiệm lâm sàng độc lập để điều trị các bệnh nhân ung thư phổi không phải tế bào nhỏ [18, 19].

Những công bố gần đây đã nhấn mạnh rằng icotinib cho tác dụng tương tự như gefitinib, đồng thời có khả năng dung nạp tốt hơn ở những bệnh nhân ung thư phổi không phải tế bào nhỏ đã được điều trị trước đó với các tác nhân hóa trị liệu khác [19]. O Lg O O O HO O O O OCH3 Lg OCH3 OCH3 OCH3 B B B a b c O NH2 HO O O NO2 1 2 3 4 R OH Cl HN R O O O N N H2N N B B B d e f O N O N O N 5 6 7 Sơ đồ 1.1: Quy trình tổng hợp dẫn xuất crown ether quinazoline 7 [17] (a) K2CO3, DMF, 90oC, 3 h, 24-45%; (b) HNO3/ H2SO4, AcOH, 72%; (c) H2, Pd/C, 96%; (d) NH2CHO/HCOONH4, 165oC, 80%; (e) POCl3, 77%; (f) i-PrOH/DMF, 72%.