Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học với đề tài "Nghiên cứu tổng hợp và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất quinazolin" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Đinh Thúy Vân dưới sự hướng dẫn của GS. Nguyễn Văn Tuyến và TS. Đặng Thị Tuyết Anh, chuyên ngành Hóa học hữu cơ (mã số 9.01) tại Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2019).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Theo số liệu thống kê của Globocan năm 2008, ung thư phổi chiếm 13% tổng số ca mắc mới và 18,2% số ca tử vong do ung thư trên toàn cầu. Trong đó, ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (UTPKPTBN) chiếm khoảng 80% tổng số bệnh nhân ung thư phổi. Tại Việt Nam, căn bệnh này đứng thứ hai về cả tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong ở cả hai giới. Các phương pháp điều trị truyền thống như hóa trị và xạ trị bộc lộ nhiều hạn chế: thời gian sống thêm của bệnh nhân thường dưới 1 năm, chất lượng sống suy giảm và độc tính trên tủy xương gây thiếu máu, giảm sức đề kháng. Đặc biệt, các khối u mang đột biến hoạt hóa thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) có độ ác tính cao hơn và kém đáp ứng với hóa trị thông thường.

Khung phân tử quinazoline đóng vai trò cốt lõi trong các thuốc ức chế tyrosine kinase của EGFR (EGFR-TKIs) thế hệ đầu như Gefitinib (Iressa) và Erlotinib (Tarceva). Mặc dù Erlotinib hydrochloride mang lại hiệu quả cao trong điều trị UTPKPTBN có đột biến EGFR, chi phí điều trị tại Việt Nam rất cao (khoảng 2.000 USD/tháng, tương đương 42 triệu đồng/lọ 30 viên 150 mg), gây khó khăn cho việc tiếp cận của người bệnh. Mặt khác, các thuốc TKI hiện tại gặp phải hiện tượng kháng thuốc do đột biến thứ cấp của thụ thể. Dị vòng 1,2,3-triazole với tính chất bền vững trong môi trường acid, bazơ, oxy hóa - khử và khả năng tạo liên kết hydro, tương tác lưỡng cực mạnh với protein/ADN là cầu nối lý tưởng để tạo các hợp chất lai tác dụng đa cơ chế. Khoảng trống nghiên cứu then chốt mà luận án hướng tới là cải tiến quy trình tổng hợp erlotinib hydrochloride và thiết kế, tổng hợp các dẫn xuất lai mới kết hợp giữa khung quinazoline (đặc biệt là các dẫn xuất chứa vòng crown ether ở vị trí C-6, C-7) với các nhóm azide thông qua cầu nối 1,2,3-triazole nhằm tìm kiếm các hoạt chất có khả năng ức chế sinh trưởng tế bào ung thư.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp thuốc erlotinib hydrochloride.
  2. Nghiên cứu tổng hợp và xác định cấu trúc dẫn xuất quinazoline.
  3. Nghiên cứu tổng hợp và xác định cấu trúc của các hợp chất lai giữa các dẫn xuất quinazoline với các azide qua cầu nối triazole.
  4. Nghiên cứu thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất lai tổng hợp được trên ba dòng tế bào ung thư ở người bao gồm KB (ung thư biểu mô), Hep-G2 (ung thư gan) và Lu (ung thư phổi không phải tế bào nhỏ).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Hoạt chất erlotinib hydrochloride; các dẫn xuất trung gian 4-anilinoquinazoline; các dẫn xuất quinazoline chứa dị vòng crown ether ở vị trí C-6 và C-7; các hợp chất lai giữa quinazoline và azide qua cầu nối 1,2,3-triazole; thụ thể enzyme EGFR kinase; 3 dòng tế bào ung thư người thực nghiệm (KB, Hep-G2, Lu).
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp hữu cơ và đo phổ cấu trúc được thực hiện tại Phòng Hóa Dược, Trung tâm Phổ ứng dụng (Viện Hóa học), Viện Hóa sinh Biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa học (Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên) và Khoa Hóa học (Đại học Khoa học Tự nhiên); thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro thực hiện tại Phòng Hóa sinh ứng dụng (Viện Hóa học). Luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2019.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan toàn diện các hướng phát triển dẫn xuất quinazoline ức chế EGFR trên thế giới và trong nước:

Các hướng nghiên cứu quốc tế về chuyển hóa khung quinazoline

  1. Chuyển hóa tại vị trí C-6, C-7 và C4-NH:

    • Nhóm Yinxiang Wang (2012) tổng hợp dãy crown ether gắn với quinazoline 7 từ methyl 3,4-dihydroxybenzoate qua 6 bước, phát hiện hợp chất 7a (Icotinib) có hoạt tính ức chế enzyme Abl và Arg kinase, dung nạp tốt hơn Gefitinib.
    • Các nghiên cứu thay thế nhóm morpholine ở vị trí C-6 bằng nhóm acrylamide tạo chất ức chế không thuận nghịch 8 hoặc ức chế đột biến EGFR-T790M 9.
    • Nhóm Zuo S. đưa nhóm arylurea kết hợp amine bậc ba vào C-6 tạo các dẫn xuất 14a-d có hoạt tính ức chế dòng tế bào A431 và A549 với giá trị $IC_{50} \sim 1\ \mu\text{M}$.
    • Dẫn xuất chứa dị vòng 4 cạnh 13g với nhóm 2-oxa-6-azaspiro[3.4]octane cho $IC_{50} = 0,016\ \mu\text{M}$ trên EGFR, tốt hơn Gefitinib ($IC_{50} = 0,023\ \mu\text{M}$).
    • Hu Liming và cộng sự phát triển dẫn xuất chứa khung morpholin-3-one 25, 26 qua 10 bước; trong đó hợp chất 26a thể hiện $IC_{50}$ trên EGFRwt là $53\ \text{nM}$, đồng thời 26a và 26b ức chế đột biến EGFR T790M/L858R trên dòng tế bào H358 và A549.
    • Hu Liming đóng vòng PD153035 thành $[1,4]\text{dioxino}[2,3\text{-}f]\text{quinazoline}$ 27 có $IC_{50} < 50\ \text{nM}$ trên EGFRwt và EGFR T790M/L858R. Các hợp chất oxazine-quinazoline 31 và oxazepine-quinazoline 32 ức chế các dòng N87, A431, H1975, BT474, Calu-3 với $IC_{50} = 0,06\ \mu\text{M}$ (mạnh hơn Erlotinib và Gefitinib).
    • Malose Jack Mphahlele tổng hợp 4-(halogenophenylamino)-6-bromoquinazoline và dẫn xuất 6-(4-fluorophenyl), trong đó hợp chất 35l ức chế EGFR với $LC_{50} = 37,66\ \text{nM}$ (so với Gefitinib là $31,44\ \text{nM}$).

  2. Chuyển hóa tại vị trí C-2 và N-3:

    • Hatem A. Abuelizz và cộng sự tổng hợp các dẫn xuất 40a-c có $IC_{50}$ trên tế bào HeLa và MDA-MB-231 từ $1,85$ đến $2,81\ \mu\text{M}$ (mạnh hơn Gefitinib với $IC_{50} = 4,3$ và $28,3\ \mu\text{M}$).
    • Adel S. El-Azab và cộng sự tổng hợp quinazoline liên hợp isatin 45a-p; hợp chất 45l và 45m thể hiện hoạt tính ức chế mạnh tế bào MDA-MB-231 và gắn kết tốt với EGFR kinase.
    • Arunachalam Sumathy và Sivanandy Palanisamy tổng hợp semicarbazide 53S1 và 53S3 ức chế tế bào HeLa với $IC_{50}$ lần lượt là $93,3\ \text{mM}$ và $6,9\ \text{mM}$.
    • Mani Ramanathan và cộng sự tổng hợp quinazoline-4(3H)-imine từ muối aryldiazonium và 2-cyanoaniline qua trung gian $N$-arylnitrilium với hiệu suất từ 54% đến 97%.

  3. Hợp chất lai của quinazoline:

    • Yu H. gắn nhóm 1-adamatanamine và 1-adamatanecarbonyl vào vòng aniline tạo hợp chất 61, 65 ức chế EGFRwt ($IC_{50} < 10\ \text{nM}$) và EGFRL858R/T790M ($IC_{50} \sim 15\ \text{nM}$).
    • Lai hóa chalcone - quinazoline 66, 67 làm tăng độc tính trên tế bào ung thư vú ABCG2 và dòng A2780.
    • Xiong Cai và cộng sự tổng hợp 24 hợp chất lai giữa quinazoline và hydroxamic acid; tiêu biểu là CUDC-101 (68) và 69 ức chế đồng thời HDAC, EGFR và HER2 với $IC_{50}$ ở mức nanomol ($4,4$; $2,4$ và $15,7\ \text{nM}$).
    • Mahboobi S. tổng hợp hợp chất lai 76 ức chế kép EGFR/HDAC và HER2/HDAC.
    • Peng E.W. tổng hợp hợp chất lai 82 ức chế kép VEGFR-2/HDAC, tiêu biểu là 82a ($IC_{50}$ trên VEGFR-2 là $74\ \text{nM}$, HDAC là $2,2\ \text{nM}$).
    • Patel và cộng sự tổng hợp isoniazid lai 4-chloro-3,4-dihydroquinazoline 92a-s ức chế ký sinh trùng sốt rét P. falciparum và vi khuẩn.

  4. Các quy trình tổng hợp Erlotinib hydrochloride:

    • Petr Knesl (2006): từ ethyl-3,4-dihydroxybenzoate qua 6 bước, hiệu suất 56%, sử dụng chất xúc tác $PtO_2$ và khí $H_2$.
    • Venkateshappa Chandregowda: qua trung gian thioamide 100 và dẫn xuất methylthio 101, hiệu suất tổng 73%; quy trình cải tiến qua 4 bước từ 102 dùng $Na_2S_2O_4$, DMF-DMA tạo formamidine 104 rồi chuyển vị Dimroth tạo 105 với hiệu suất tổng 63%.
    • Davoud Asgari (2011): tổng hợp qua 9 giai đoạn với hiệu suất tổng 60%, ứng dụng phản ứng one-pot tạo benzonitrile bằng urea/$P_2O_5$ và one-pot tạo erlotinib qua trung gian 109.
    • Leila Barghi (2012): từ acid 3,4-dihydroxybenzoic qua 7 giai đoạn với hiệu suất 44%, sử dụng ammonium formate và $Pd/C$ để khử nhóm nitro in situ.
    • Nghiên cứu trong nước: Tạ Văn Đại và cộng sự (2015) tổng hợp erlotinib từ ethyl 3,4-dihydroxybenzoate qua 6 bước với hiệu suất 51%; nhóm GS. Nguyễn Văn Tuyến nghiên cứu tổng hợp erlotinib và các dẫn xuất lai của quinazoline.

Khoảng trống luận án giải quyết

Cho đến thời điểm nghiên cứu, chưa có công trình nào công bố việc đưa các nhóm azide có hoạt tính sinh học vào mạch nhánh của 4-aminoquinazoline thông qua cầu nối 1,2,3-triazole bằng phản ứng "click", cũng như chưa có nghiên cứu kết hợp cấu trúc crown ether ở vị trí C-6, C-7 của quinazoline với cầu nối triazole để tạo các hợp chất lai tác dụng kép.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm sử dụng

  • Mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính (SAR) của 4-anilinoquinazoline: Khung 4-anilinoquinazoline đóng vai trò gắn vào vị trí liên kết ATP của enzyme EGFR kinase. Nhóm arylamino tại C-4 (như 3-ethynylphenylamino) tạo các tương tác kỵ nước quyết định tính chọn lọc ức chế kinase; các nhóm thế ở vị trí C-6 và C-7 điều khiển tính chất hóa lý, độ phân cực và độ tan của phân tử thuốc.
  • Cơ chế chuyển vị Dimroth: Quá trình đóng vòng tạo dẫn xuất 4-aminoquinazoline từ $N,N\text{-dimethylformamidine}$ và amine thơm thông qua sự tấn công ái nhân, mở vòng và tái đóng vòng để tạo sản phẩm bền nhiệt động.
  • Phản ứng cộng đóng vòng Huisgen 1,3-lưỡng cực (Phản ứng Click): Phản ứng cộng giữa alkyne đầu mạch và azide. Sử dụng xúc tác đồng(I) [Cu(I)] cho phép phản ứng xảy ra chọn lọc vị trí ở nhiệt độ phòng tạo đồng phân 1,4-disubstituted 1,2,3-triazole với hiệu suất cao, không tạo sản phẩm phụ 1,5-triazole (vốn tạo ra khi dùng phản ứng nhiệt thông thường hoặc xúc tác Ruthenium $[Cp^*(RuCl(PPh_3)_2)]$).
  • Mô phỏng gắn kết phân tử (Protein Docking): Sử dụng thuật toán di truyền (Genetic Algorithm - GA) để tối ưu hóa cấu hình không gian của chất gắn kết (ligand) trong túi gắn của thụ thể protein EGFR nhằm tìm cấu dạng có năng lượng tự do Gibbs ($\Delta G_L$) và hằng số liên kết ($K_d$) thấp nhất.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Tổng hợp hóa học hữu cơ: Phản ứng alkyl hóa ether, nitro hóa chọn lọc vị trí, phản ứng khử hóa nhóm nitro, phản ứng formamidine hóa với $N,N\text{-dimethylformamide dimethyl acetal}$ (DMF-DMA), phản ứng đóng vòng tạo dị vòng quinazoline, phản ứng tạo muối hydrochloride và phản ứng ghép đôi "click" tạo cầu nối triazole.
  • Phương pháp sắc ký: Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng silica gel Merck để theo dõi phản ứng và xác định hệ số $R_f$; sắc ký cột sử dụng chất nhồi silica gel độ hạt 100–200 mesh (Merck) để phân tách và tinh chế sản phẩm.
  • Phương pháp xác định cấu trúc phân tử:
    • Đo nhiệt độ nóng chảy ($t_{nc}$) trên máy Gallenkamp (Anh).
    • Phổ hồng ngoại (IR): Ghi trên máy Spectrum Two (PerkinElmer) dạng viên nén KBr trong vùng $4000 - 400\ \text{cm}^{-1}$.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo phổ $^1\text{H-NMR}$ ($500\ \text{MHz}$), $^{13}\text{C-NMR}$ ($125\ \text{MHz}$) cùng các phổ 2D tương quan dị hạt HMBC và HSQC trên máy Bruker XL-500 với dung môi $CDCl_3$, $CD_3OD$ hoặc $\text{DMSO-}d_6$, chất chuẩn nội TMS.
    • Phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS / ESI-MS): Ghi nhận ion phân tử và mảnh ion trên máy Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS.
  • Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro: Đánh giá khả năng gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư gan Hep-G2, và ung thư phổi không phải tế bào nhỏ Lu.
  • Nghiên cứu docking phân tử: Khảo sát tương tác phối tử - protein trên cấu trúc không gian 3D của thụ thể EGFR từ ngân hàng Protein Data Bank (PDB) bằng các phần mềm chuyên dụng như AutoDock/AutoDock Vina, MOE, PyMOL và Discovery Studio.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý thuyết và các công trình nghiên cứu liên quan đến lớp chất quinazoline, thuốc Erlotinib, phản ứng click và phương pháp docking phân tử:

  • Trình bày cấu trúc hóa học của quinazoline ($C_8H_6N_2$, 1,3-diazanaphthalene) và các thuốc TKI thương mại như Gefitinib, Erlotinib, Lapatinib, Vandetanib, Icotinib, Afatinib, Dacomitinib.
  • Phân tích chi tiết các chiến lược biến đổi cấu trúc tại vị trí C-6, C-7, C-4, C-2 và N-3 nhằm tối ưu hóa ái lực liên kết với thụ thể EGFR và cải thiện tính chất dược động học.
  • Đánh giá các phương pháp tổng hợp thuốc Erlotinib hydrochloride của các nhóm nghiên cứu Knesl, Chandregowda, Asgari, Barghi và Tạ Văn Đại; phân tích ưu nhược điểm về hiệu suất, an toàn hóa chất và khả năng mở rộng quy mô.
  • Trình bày bản chất phản ứng "click" giữa azide và alkyne; vai trò của xúc tác Cu(I) tạo chọn lọc 1,4-triazole; tính chất của dị vòng 1,2,3-triazole làm cầu nối liên kết.
  • Trình bày lý thuyết Protein Docking, nguyên lý thuật giải di truyền (GA), các hàm tính điểm năng lượng tự do và quy trình 3 bước: chuẩn bị cấu tử (ligand), chuẩn bị protein (EGFR), và mô phỏng xác định tương tác tại vùng hoạt động (grid box).

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 2 mô tả chi tiết hóa chất, thiết bị, quy trình tổng hợp và phương pháp thử nghiệm sinh học:

  • Hóa chất và trang thiết bị: Nêu rõ nguồn gốc hóa chất (Merck, Aldrich), thông số máy đo nhiệt độ nóng chảy Gallenkamp, máy phổ IR Spectrum Two, máy phổ NMR Bruker XL-500, máy khối phổ Agilent 6530 Q-TOF.
  • Quy trình tổng hợp Erlotinib và muối hydrochloride 93:
    • Tổng hợp acid 3,4-bis(2-methoxyethoxy)benzoic (107): Phản ứng alkyl hóa giữa acid 3,4-dihydroxybenzoic 106 ($10\ \text{g}$; $65\ \text{mmol}$) với 1-bromo-2-methoxyethane ($24\ \text{ml}$; $260\ \text{mmol}$) trong DMF với xúc tác $K_2CO_3$ ($35,9\ \text{g}$) và tetrabutylammonium hydrosulfate ($2,2\ \text{g}$) ở $110^\circ\text{C}$ trong 20 giờ thu được ester trung gian 110 dạng dầu nâu. Thủy phân 110 bằng KOH ($10,9\ \text{g}$) trong methanol/nước ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ, acid hóa bằng HCl 10% về $\text{pH} \sim 3$ ở $0^\circ\text{C}$ thu được chất rắn trắng 107 ($15,8\ \text{g}$, hiệu suất 72,5%, $t_{nc} = 107 - 109^\circ\text{C}$).
    • Tổng hợp 3,4-bis(2-methoxyethoxy)benzonitrile (108): Đun nóng acid 107 ($12,3\ \text{g}$; $0,08\ \text{mol}$) với urea ($48\ \text{g}$; $0,8\ \text{mol}$) ở $220^\circ\text{C}$ trong 1 giờ. Sau đó làm nguội, thêm xylene ($150\ \text{ml}$) và $P_2O_5$ ($45,4\ \text{g}$; $0,32\ \text{mol}$), đun hồi lưu ở $142^\circ\text{C}$ trong 15 giờ. Tinh chế qua cột silica gel (hệ $n\text{-hexane}/\text{ethyl acetate}$) thu được nitrile 108 dạng dầu màu vàng ($16,1\ \text{g}$, hiệu suất 80%).
    • Tổng hợp 2-amino-4,5-bis(2-methoxyethoxy)benzonitrile (103): Nitro hóa 108 ($15\ \text{g}$; $0,06\ \text{mol}$) bằng $HNO_3$ 65% trong acid acetic băng ở $0 - 50^\circ\text{C}$ thu được dẫn xuất 2-nitro 102. Khử nhóm nitro của 102 thu được amine 103.
    • Chuyển hóa tạo Erlotinib (105) và muối (93): Cho amine 103 phản ứng với DMF-DMA tạo dẫn xuất formamidine 104, sau đó xử lý với 3-ethynylaniline trong acid acetic theo cơ chế chuyển vị Dimroth tạo base tự do Erlotinib 105. Sục khí HCl tạo muối Erlotinib hydrochloride 93 ($t_{nc} = 225 - 228^\circ\text{C}$).
  • Quy trình tổng hợp dẫn xuất crown ether quinazoline (119a-d): Đi từ các benzaldehyde hoặc acid 3,4-dihydroxybenzoic qua các hợp chất trung gian 112a,b; 116a,b; 115a,b; 117a-d để thu được các chất đầu 119a-d mang các vòng $[1,3]\text{dioxolo}$, $[1,4]\text{dioxino}$ và $[1,4]\text{dioxepino}$.
  • Quy trình tổng hợp các hợp chất lai qua cầu nối triazole: Thực hiện phản ứng "click" giữa các alkyne đầu mạch (erlotinib 105 hoặc các dẫn xuất crown ether quinazoline-4-amine 119a-d) với các gốc azide khác nhau dưới xúc tác Cu(I).
  • Quy trình thử nghiệm in vitro: Mô tả phương pháp nuôi cấy và xác định tỷ lệ ức chế tế bào ung thư KB, Hep-G2, Lu.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm tổng hợp, chứng minh cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học và phân tích docking phân tử:

1. Tổng hợp và nhận dạng cấu trúc Erlotinib hydrochloride

Quy trình tổng hợp cải tiến từ acid 3,4-dihydroxybenzoic 106 qua các sản phẩm trung gian 107, 108, 102, 103, 104, 105 và sản phẩm muối 93 được kiểm soát chặt chẽ qua từng công đoạn. Cấu trúc của các hợp chất được khẳng định bằng các dữ liệu phổ:

  • Phổ IR của 108 và 102 xác nhận sự xuất hiện của nhóm $C\equiv N$ và nhóm nitro $NO_2$.
  • Phổ $^1\text{H-NMR}$ của formamidine 104 và phenylbenzamidine 109 làm sáng tỏ cơ chế chuyển vị Dimroth tạo khung quinazoline 105.
  • Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ của Erlotinib hydrochloride 93 trong $\text{DMSO-}d_6$ xuất hiện các độ dịch chuyển hóa học đặc trưng: $\delta\ 170,22$; $159,11$; $155,07$; $151,20$; $147,28$; $142,31$; $130,89$; $125,76$; $124,35$; $122,34$; $117,65$; $114,15$; $108,83$; $100,97$; $86,76$; $80,63$; $75,78$; $73,52$; $51,25\ \text{ppm}$.
  • Khảo sát các điều kiện phản ứng alkyl hóa và ảnh hưởng của tác nhân khử hóa đến hiệu suất amine hóa được tổng hợp trong các bảng dữ liệu.
Bảng theo dõi phản ứng trong luận án Nội dung khảo sát
Bảng 3.1 Khảo sát các điều kiện phản ứng tổng hợp hợp chất este trung gian 110
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tác nhân khử hóa đến hiệu suất phản ứng amine hóa tạo dẫn xuất 103

2. Tổng hợp các dẫn xuất crown ether quinazoline và các hợp chất lai triazole

  • Tổng hợp thành công 4 dẫn xuất 4-aminoquinazoline chứa vòng crown ether ở vị trí C-6, C-7:
    • Hợp chất 119a: $N\text{-(3-ethynylphenyl)quinazoline-4-amine}$
    • Hợp chất 119b: $N\text{-(3-ethynylphenyl)-}[1,3]\text{dioxolo}[4,5\text{-}g]\text{quinazoline-8-amine}$
    • Hợp chất 119c: $N\text{-(3-ethynylphenyl)-7,8-dihydro-}[1,4]\text{dioxino}[2,3\text{-}g]\text{quinazoline-4-amine}$
    • Hợp chất 119d: $N\text{-(3-ethynylphenyl)-8,9-dihydro-7H-}[1,4]\text{dioxepino}[2,3\text{-}g]\text{quinazoline-4-amine}$
  • Thực hiện phản ứng "click" giữa nhóm ethynyl của Erlotinib 105 và các dẫn xuất 119a-d với các dẫn xuất azide mang các nhóm thế thơm khác nhau (chứa nhóm thế như $-NO_2$, $-CF_3$, halogen) tạo thành các dãy hợp chất lai: dãy lai từ erlotinib (như 105b), dãy 120a-d (từ 119a), dãy 121a-d (từ 119b), dãy 122a-d (từ 119c) và dãy 123a-c (từ 119d).
  • Cấu trúc của các hợp chất lai được xác định đầy đủ thông qua phân tích phổ 1D và 2D NMR:
Bảng phân tích phổ 2D-NMR Hợp chất đại diện phân tích Dữ liệu phổ phân tích
Bảng 3.3 Hợp chất 121d Phân tích tương tác liên kết HMBC và HSQC xác định vị trí dị vòng triazole và vòng dioxolo
Bảng 3.4 Hợp chất 122a Phân tích tương tác liên kết HMBC và HSQC xác định khung dihydrodioxinoquinazoline

3. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và phân tích Docking phân tử

  • Dữ liệu thử nghiệm sinh học in vitro (Bảng 3.5 trong luận án) trên 3 dòng tế bào ung thư người (KB, Hep-G2, Lu) cho thấy nhiều hợp chất lai quinazoline - triazole thể hiện độc tính tế bào chọn lọc, trong đó một số hợp chất đạt giá trị ức chế tốt đối với dòng tế bào ung thư biểu mô KB và ung thư phổi không phải tế bào nhỏ Lu.
  • Kết quả mô phỏng docking phân tử trên 3 cấu trúc đích protein EGFR (Hình 3.47):
    • Khảo sát tương tác không gian và năng lượng liên kết của các hợp chất tiêu biểu như 120d, 122a, 122b, 123c tại khoang gắn ATP của EGFR.
    • Sơ đồ tương tác 2D chỉ ra rằng khung quinazoline duy trì liên kết hydro quan trọng với các amino acid bản lề trong túi liên kết, trong khi cầu nối 1,2,3-triazole và nhánh thơm mang nhóm thế mở rộng tương tác kỵ nước và tương tác tĩnh điện ra khoang ngoài của thụ thể.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

  1. Hoàn thiện quy trình cải tiến tổng hợp Erlotinib hydrochloride: Thiết lập quy trình tổng hợp toàn phần erlotinib hydrochloride đi từ nguyên liệu ban đầu acid 3,4-dihydroxybenzoic sẵn có với các ưu điểm: hạn chế việc sử dụng các tác nhân độc hại, không bền ($PCl_5$, $POCl_3$ hay xúc tác kim loại quý $PtO_2$ kèm hydro áp suất cao); sử dụng phản ứng one-pot để chuyển hóa trực tiếp acid carboxylic thành benzonitrile nhờ xúc tác urea/$P_2O_5$; ứng dụng thành công phản ứng formamidine hóa và chuyển vị Dimroth giúp nâng cao hiệu suất tổng thể và độ an toàn trong tổng hợp.
  2. Thiết kế và tổng hợp các dẫn xuất quinazoline mới: Đã tổng hợp thành công dãy dẫn xuất 4-anilinoquinazoline gắn các vòng crown ether có kích thước khác nhau ở vị trí C-6 và C-7 ([1,3]dioxolo, [1,4]dioxino, và [1,4]dioxepino), cung cấp các chất đầu 119a-d có độ tinh khiết cao phục vụ phản ứng ghép chuỗi tiếp theo.
  3. Tổng hợp thư viện hợp chất lai Quinazoline - Triazole: Ứng dụng thành công phản ứng cộng đóng vòng "click" 1,3-lưỡng cực xúc tác Cu(I) để lai hóa alkyne đầu mạch của khung quinazoline với các dẫn xuất azide khác nhau. Đây là công trình đầu tiên xây dựng hệ thống các hợp chất lai kết hợp khung 4-aminoquinazoline (hoặc crown ether quinazoline) với dị vòng 1,2,3-triazole mang các nhóm thế đa dạng.
  4. Xác định đầy đủ cấu trúc hóa học và dữ liệu phổ: Toàn bộ các hợp chất tổng hợp được xác định cấu trúc rõ ràng bằng hệ thống phổ hiện đại bao gồm $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, phổ 2D-NMR (HMBC, HSQC), phổ hồng ngoại FT-IR và phổ khối lượng phân giải cao HR-MS/ESI-MS.
  5. Cung cấp dữ liệu sinh học và mô hình tương tác phân tử: Luận án đã sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất tổng hợp trên 3 dòng tế bào ung thư người (KB, Hep-G2, Lu) và chứng minh cơ chế gắn kết của các hợp chất có hoạt tính tốt (120d, 122a, 122b, 123c) lên thụ thể EGFR thông qua mô phỏng protein docking.

Kiến nghị và đề xuất

  • Đề xuất tiếp tục nghiên cứu mở rộng quy mô phản ứng tổng hợp Erlotinib hydrochloride theo quy trình cải tiến nhằm phục vụ định hướng tự chủ nguồn nguyên liệu hóa dược làm thuốc điều trị ung thư phổi trong nước.
  • Lựa chọn các hợp chất lai có hoạt tính gây độc tế bào cao nhất để tiến hành các thử nghiệm ức chế trực tiếp enzyme EGFR-TK và đánh giá độc tính chuyên sâu.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

  • Khảo sát hoạt tính sinh học mới dừng lại ở mức độ in vitro đánh giá độc tính tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư người (KB, Hep-G2, Lu), chưa tiến hành các thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật thí nghiệm.
  • Chưa thực hiện xét nghiệm sinh hóa trực tiếp nhằm đo giá trị $IC_{50}$ ức chế hoạt tính phosphoryl hóa của enzyme kinase EGFR và các dạng đột biến kháng thuốc (như EGFR T790M).
  • Dữ liệu tương tác giữa các hợp chất với thụ thể EGFR mới dựa trên mô phỏng tính toán in silico (protein docking), cần thêm các bằng chứng thực nghiệm sinh lý học phân tử để khẳng định.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Mở rộng đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư mang các đột biến kháng thuốc đặc thù của thụ thể EGFR (ví dụ: dòng tế bào H1975 mang đột biến kép L858R/T790M).
  • Thực hiện các xét nghiệm enzyme học in vitro xác định độ chọn lọc ức chế trên các loại kinase khác nhau (EGFR, HER2, VEGFR).
  • Nghiên cứu dược động học, độ ổn định trao đổi chất và thử nghiệm hoạt tính kháng u trên mô hình chuột chuyển gen hoặc chuột cấy ghép khối u dị loài in vivo.
  • Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình tổng hợp ở quy mô pilot đối với các dẫn xuất lai có hoạt tính nổi trội nhằm phục vụ nghiên cứu phát triển tiền lâm sàng.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo chuyên môn cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược và Hóa sinh: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình tổng hợp các hệ dị vòng quinazoline, kỹ thuật thực hiện phản ứng "click" chọn lọc vị trí với xúc tác Cu(I), và phương pháp phân tích phổ 2D-NMR (HMBC, HSQC) để giải đoán cấu trúc các phân tử hữu cơ phức tạp.
  • Các nhà khoa học trong lĩnh vực thiết kế và phát triển thuốc nhắm đích: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính (SAR) của khung quinazoline khi gắn vòng crown ether ở vị trí C-6, C-7 và biến tính nhánh C4-anilino qua cầu nối triazole; quy trình thiết lập bài toán docking phân tử đánh giá ái lực gắn kết thụ thể EGFR.
  • Các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất hóa dược: Cung cấp quy trình công nghệ điều chế hoạt chất Erlotinib hydrochloride cải tiến từ acid 3,4-dihydroxybenzoic với các điều kiện phản ứng an toàn, kinh tế, dễ thao tác, có tiềm năng ứng dụng sản xuất nguyên liệu làm thuốc.

Câu hỏi thường gặp

1. Cấu trúc hóa học và các đặc trưng vật lý - phổ học chính của Erlotinib hydrochloride được xác định như thế nào trong luận án?

Erlotinib hydrochloride có tên hóa học là $N\text{-(3-ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)quinazoline-4-amine hydrochloride}$, cấu trúc gồm khung 4-anilinoquinazoline với hai nhóm 2-methoxyethoxy ở vị trí C-6, C-7 và nhóm 3-ethynylphenylamino ở C-4. Hợp chất kết tinh dạng rắn màu vàng, nhiệt độ nóng chảy $225 - 228^\circ\text{C}$. Phổ IR xuất hiện các cực đại hấp thụ đặc trưng tại 3276, 3056, 3020, 2921, 2896, 2819, 2746, 2711, 1667, 1564, 1512, 1446, 1284, 1122, $892\ \text{cm}^{-1}$. Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ ($\text{DMSO-}d_6$) hiển thị 19 tín hiệu carbon đặc trưng tại $\delta\ 170,22$; $159,11$; $155,07$; $151,20$; $147,28$; $142,31$; $130,89$; $125,76$; $124,35$; $122,34$; $117,65$; $114,15$; $108,83$; $100,97$; $86,76$; $80,63$; $75,78$; $73,52$; $51,25\ \text{ppm}$.

2. Quy trình cải tiến tổng hợp Erlotinib hydrochloride từ acid 3,4-dihydroxybenzoic có những giai đoạn then chốt nào?

Quy trình gồm các bước: (1) Alkyl hóa acid 3,4-dihydroxybenzoic 106 với 1-bromo-2-methoxyethane tạo ester trung gian 110, sau đó thủy phân bằng KOH thu được acid 3,4-bis(2-methoxyethoxy)benzoic 107 (hiệu suất 72,5%, $t_{nc} = 107 - 109^\circ\text{C}$); (2) Phản ứng one-pot chuyển hóa acid 107 thành 3,4-bis(2-methoxyethoxy)benzonitrile 108 sử dụng urea và $P_2O_5$ (hiệu suất 80%); (3) Nitro hóa 108 bằng $HNO_3$/acid acetic thu được dẫn xuất 2-nitro 102; (4) Khử hóa nhóm nitro của 102 thu được amine 103; (5) Formamidine hóa 103 bằng DMF-DMA tạo 104; (6) Phản ứng đóng vòng chuyển vị Dimroth giữa 104 với 3-ethynylaniline trong acid acetic tạo base tự do 105; (7) Sục khí HCl trong methanol tạo muối erlotinib hydrochloride 93.

3. Phản ứng "Click" được ứng dụng trong luận án như thế nào để tạo các hợp chất lai?

Luận án ứng dụng phản ứng cộng đóng vòng 1,3-lưỡng cực giữa liên kết alkyne đầu mạch (nhóm ethynyl của erlotinib 105 hoặc các dẫn xuất crown ether quinazoline 119a-d) với các dẫn xuất azide khác nhau. Sử dụng hệ xúc tác đồng(I) [Cu(I)], phản ứng xảy ra với độ chọn lọc không gian hoàn toàn, chỉ tạo ra một sản phẩm duy nhất là 1,4-disubstituted 1,2,3-triazole. Cầu nối triazole tạo ra có độ bền cao trước các tác nhân acid, base, oxy hóa - khử và tăng cường khả năng tạo liên kết hydro, tương tác lưỡng cực với thụ thể sinh học.

4. Các dẫn xuất quinazoline chứa vòng crown ether ở vị trí C-6, C-7 được thiết kế gồm những hợp chất nào?

Luận án đã thiết kế và tổng hợp 4 chất đầu quinazoline mang vòng crown ether ở vị trí C-6 và C-7: hợp chất 119a ($N\text{-(3-ethynylphenyl)quinazoline-4-amine}$), hợp chất 119b ($N\text{-(3-ethynylphenyl)-}[1,3]\text{dioxolo}[4,5\text{-}g]\text{quinazoline-8-amine}$ với vòng 5 cạnh), hợp chất 119c ($N\text{-(3-ethynylphenyl)-7,8-dihydro-}[1,4]\text{dioxino}[2,3\text{-}g]\text{quinazoline-4-amine}$ với vòng 6 cạnh) và hợp chất 119d ($N\text{-(3-ethynylphenyl)-8,9-dihydro-7H-}[1,4]\text{dioxepino}[2,3\text{-}g]\text{quinazoline-4-amine}$ với vòng 7 cạnh).

5. Kết quả đánh giá sinh học và mô phỏng docking phân tử của các hợp chất lai cho thấy điều gì?

Các hợp chất lai quinazoline - triazole tổng hợp được thể hiện hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên các dòng ung thư người KB (biểu mô), Hep-G2 (gan) và Lu (ung thư phổi không phải tế bào nhỏ). Mô phỏng docking phân tử trên 3 cấu trúc protein EGFR chỉ ra rằng các hợp chất tiêu biểu (như 120d, 122a, 122b, 123c) gắn khớp vào túi liên kết ATP của enzyme, trong đó khung quinazoline giữ tương tác với vùng bản lề và nhánh triazole - aryl mở rộng tương tác ra khoang liên kết phụ, tạo nên năng lượng liên kết tự do thuận lợi.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Đinh Thúy Vân đã hoàn thành việc nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp hoạt chất Erlotinib hydrochloride từ nguyên liệu acid 3,4-dihydroxybenzoic với các điều kiện phản ứng an toàn, hiệu quả kinh tế và hiệu suất cao. Công trình đã thiết kế, tổng hợp thành công 4 dãy dẫn xuất 4-aminoquinazoline chứa vòng crown ether kích thước khác nhau ở vị trí C-6, C-7 và ứng dụng phản ứng click để tạo dựng thư viện các hợp chất lai quinazoline - triazole mới. Cấu trúc của toàn bộ các chất được chứng minh rõ ràng bằng hệ thống phổ nghiệm hiện đại (IR, 1D/2D-NMR, HRMS), đồng thời dữ liệu thử nghiệm in vitro và mô phỏng protein docking đã xác định được các dẫn chất tiềm năng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên các dòng KB, Hep-G2 và Lu thông qua cơ chế tương tác với thụ thể EGFR.