Tổng quan nghiên cứu

Peptide có hoạt tính chống oxy hóa ngày càng được quan tâm trong các lĩnh vực y dược và bảo quản thực phẩm do khả năng loại bỏ các gốc tự do gây hại cho cơ thể sống. Theo ước tính, các gốc tự do như hydroxyl (OH·), ABTS·+ và các ion sắt Fe3+ đóng vai trò quan trọng trong quá trình oxy hóa sinh học, gây tổn thương tế bào và liên quan đến nhiều bệnh lý. Nghiên cứu này tập trung đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH, một peptide có nguồn gốc từ loài ếch Litoria rubella, bằng các phương pháp thực nghiệm bắt gốc tự do Hydroxyl, ABTS và khử sắt FRAP.

Mục tiêu chính của luận văn là khảo sát quy trình đánh giá khả năng bắt gốc tự do và khử sắt của peptide này, đồng thời tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm theo tiêu chuẩn TCVN ISO 17025:2017. Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm phân tích thí nghiệm của Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh trong năm 2023. Kết quả nghiên cứu không chỉ góp phần làm rõ hoạt tính sinh học của peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH mà còn mở ra hướng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và phát triển y học, đặc biệt trong việc tìm kiếm các chất chống oxy hóa tự nhiên an toàn và hiệu quả.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Lý thuyết gốc tự do và chất chống oxy hóa: Gốc tự do là các phân tử có electron chưa ghép đôi, rất dễ phản ứng và gây tổn thương tế bào. Chất chống oxy hóa hoạt động bằng cách chuyển electron hoặc cho nguyên tử hydro để trung hòa gốc tự do, ngăn ngừa quá trình oxy hóa gây hại.

  • Mô hình peptide chống oxy hóa: Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH được tổng hợp dựa trên cấu trúc peptide tryptophyllin L từ da ếch Litoria rubella, trong đó tryptophan được thay thế bằng 5-hydroxytryptophan (5HTP) – một amino acid có khả năng chống oxy hóa cao.

  • Khái niệm và phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa: Sử dụng ba phương pháp chính gồm:

    • Phương pháp bắt gốc tự do Hydroxyl (OH·) dựa trên phản ứng ức chế oxy hóa deoxyribose.
    • Phương pháp bắt gốc ABTS·+ sử dụng khả năng khử màu của gốc tự do ABTS.
    • Phương pháp khử sắt FRAP đo khả năng khử ion Fe3+ thành Fe2+ tạo phức màu xanh.

Các khái niệm chuyên ngành như TEAC (khả năng chống oxy hóa tương đương Trolox), peptide, liên kết peptide, và các thuật ngữ hóa học phân tích UV-Vis cũng được áp dụng để phân tích và đánh giá kết quả.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH được tổng hợp với độ tinh khiết khoảng 95% qua phương pháp tổng hợp pha rắn Fmoc, xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khối phổ (MS).

  • Phương pháp phân tích:

    • Phương pháp FRAP: Đo khả năng khử sắt trong huyết tương bằng phản ứng tạo phức Fe2+-TPTZ, hấp thu ở bước sóng 593 nm.
    • Phương pháp ABTS: Đo khả năng bắt gốc tự do ABTS·+ qua giảm độ hấp thu ở bước sóng 734 nm.
    • Phương pháp Hydroxyl: Đánh giá khả năng bắt gốc tự do OH· dựa trên ức chế phản ứng oxy hóa deoxyribose, đo quang ở bước sóng 532 nm.
  • Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành trong năm 2023 tại phòng thí nghiệm trường Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh, bao gồm các bước khảo sát điều kiện tối ưu, xây dựng đường chuẩn, thực hiện thí nghiệm và phân tích kết quả.

  • Cỡ mẫu và chọn mẫu: Mẫu peptide được chuẩn bị đồng nhất với các nồng độ từ 1 µM đến 30 µM để khảo sát khả năng chống oxy hóa theo từng phương pháp.

  • Đánh giá phương pháp: Độ lặp lại (repeatability) được kiểm tra bằng cách thực hiện thí nghiệm nhiều lần trên cùng mẫu, tính toán hệ số biến thiên (RSD%) để đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Khả năng khử sắt FRAP của peptide:

    • Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH thể hiện khả năng khử sắt tăng theo nồng độ, với giá trị hấp thu quang tại 593 nm tăng từ 0.12 đến 0.85 khi nồng độ peptide tăng từ 1 µM đến 30 µM.
    • So sánh với chất chuẩn Trolox và peptide nội sinh Glutathione, peptide nghiên cứu đạt khoảng 75% khả năng khử sắt của Trolox ở nồng độ 20 µM.
  2. Khả năng bắt gốc tự do ABTS:

    • Peptide có khả năng bắt gốc ABTS·+ với hiệu quả đạt 68% so với Trolox ở nồng độ 15 µM.
    • Đường chuẩn Trolox tuyến tính trong khoảng 0.25 – 20 µM với hệ số hồi quy R² = 0.998, đảm bảo độ tin cậy của phép đo.
  3. Khả năng bắt gốc tự do Hydroxyl:

    • Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH ức chế phản ứng oxy hóa deoxyribose với hiệu suất lên đến 70% ở nồng độ 10 µM.
    • Thời gian ủ phản ứng tối ưu là 60 phút ở 37°C, đảm bảo độ bền màu và độ nhạy của phương pháp.
  4. Tối ưu hóa điều kiện thực nghiệm:

    • Phổ hấp thu tối ưu của các phương pháp lần lượt là 593 nm (FRAP), 734 nm (ABTS) và 532 nm (Hydroxyl).
    • Tỷ lệ thể tích thuốc thử và mẫu được tối ưu để đạt hiệu quả phản ứng cao nhất, ví dụ tỷ lệ 1:5 (mẫu: thuốc thử) trong phương pháp FRAP.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH có hoạt tính chống oxy hóa toàn diện, thể hiện qua khả năng bắt gốc tự do Hydroxyl, ABTS và khử sắt FRAP. Sự thay thế tryptophan bằng 5-hydroxytryptophan (5HTP) trong cấu trúc peptide được cho là tăng cường khả năng chống oxy hóa nhờ nhóm hydroxyl trên vòng indole, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về hoạt tính của 5HTP riêng lẻ.

So với peptide Phe-Pro-Trp-Leu (NH2) được báo cáo có hoạt tính chống oxy hóa, peptide nghiên cứu có hiệu quả tương đương hoặc cao hơn trong một số thử nghiệm, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng trong y học và bảo quản thực phẩm. Các biểu đồ so sánh khả năng khử sắt và bắt gốc tự do giữa peptide, Trolox và Glutathione minh họa rõ sự tương đồng và ưu thế của peptide mới.

Việc tối ưu hóa các thông số kỹ thuật như bước sóng đo, tỷ lệ thuốc thử và thời gian ủ phản ứng giúp nâng cao độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp, đồng thời đảm bảo tính khả thi khi áp dụng quy trình trong nghiên cứu và sản xuất.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Phát triển quy trình tổng hợp peptide quy mô lớn: Tăng cường hợp tác với các đơn vị sản xuất peptide để mở rộng quy mô tổng hợp peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH, nhằm đáp ứng nhu cầu nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm trong vòng 2 năm tới.

  2. Nghiên cứu sâu về cơ chế chống oxy hóa in vivo: Thực hiện các thử nghiệm trên mô hình tế bào và động vật để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của peptide trong môi trường sinh học thực tế, dự kiến hoàn thành trong 3 năm.

  3. Ứng dụng peptide trong bảo quản thực phẩm: Thử nghiệm sử dụng peptide như chất bảo quản tự nhiên trong các sản phẩm thực phẩm dễ bị oxy hóa, nhằm giảm thiểu việc sử dụng chất bảo quản tổng hợp có hại, với mục tiêu triển khai thử nghiệm tại một số cơ sở sản xuất trong 1-2 năm.

  4. Phát triển sản phẩm dược phẩm hỗ trợ sức khỏe: Khai thác tiềm năng peptide trong các sản phẩm bổ sung chống oxy hóa, hỗ trợ phòng ngừa các bệnh liên quan đến stress oxy hóa, phối hợp với các trung tâm nghiên cứu y sinh để phát triển sản phẩm trong 3-5 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Hóa phân tích, Hóa dược: Luận văn cung cấp phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa peptide bằng các kỹ thuật UV-Vis, FRAP, ABTS và Hydroxyl, giúp mở rộng kiến thức và ứng dụng trong nghiên cứu peptide sinh học.

  2. Chuyên gia phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng và bảo quản: Thông tin về hoạt tính chống oxy hóa của peptide tự nhiên hỗ trợ trong việc lựa chọn nguyên liệu và thiết kế sản phẩm an toàn, hiệu quả, thay thế chất bảo quản tổng hợp.

  3. Doanh nghiệp sản xuất peptide và dược phẩm: Quy trình tổng hợp và đánh giá peptide được mô tả chi tiết, giúp doanh nghiệp nâng cao chất lượng sản phẩm và phát triển các dòng sản phẩm mới có hoạt tính sinh học.

  4. Cơ quan quản lý và kiểm định chất lượng: Kết quả nghiên cứu và quy trình thẩm định theo tiêu chuẩn TCVN ISO 17025:2017 cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng peptide và các sản phẩm liên quan.

Câu hỏi thường gặp

  1. Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH có nguồn gốc từ đâu?
    Peptide này được tổng hợp dựa trên cấu trúc peptide tự nhiên được phân lập từ tuyến da của loài ếch Litoria rubella, với sự thay thế tryptophan bằng 5-hydroxytryptophan (5HTP) để tăng cường hoạt tính chống oxy hóa.

  2. Phương pháp FRAP đánh giá hoạt tính chống oxy hóa như thế nào?
    Phương pháp FRAP đo khả năng khử ion Fe3+ thành Fe2+ tạo phức màu xanh, hấp thu ở bước sóng 593 nm. Khả năng khử sắt càng cao chứng tỏ hoạt tính chống oxy hóa càng mạnh.

  3. Tại sao cần sử dụng nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa?
    Mỗi phương pháp phản ánh một khía cạnh khác nhau của hoạt tính chống oxy hóa (bắt gốc tự do, khử sắt, ức chế oxy hóa hydroxyl), do đó sử dụng đa phương pháp giúp đánh giá toàn diện và chính xác hơn.

  4. Peptide này có thể ứng dụng trong lĩnh vực nào?
    Peptide có thể được ứng dụng trong phát triển dược phẩm chống oxy hóa, thực phẩm chức năng, chất bảo quản tự nhiên trong thực phẩm và nghiên cứu sinh học liên quan đến stress oxy hóa.

  5. Độ tinh khiết của peptide được đảm bảo như thế nào?
    Peptide được tổng hợp bằng phương pháp pha rắn Fmoc với độ tinh khiết khoảng 95%, được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khối phổ (MS), đảm bảo chất lượng cho các thí nghiệm.

Kết luận

  • Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH có khả năng chống oxy hóa toàn diện, thể hiện qua các phương pháp bắt gốc Hydroxyl, ABTS và khử sắt FRAP với hiệu quả cao so với các chất chuẩn như Trolox và Glutathione.
  • Quy trình đánh giá hoạt tính chống oxy hóa được tối ưu hóa theo tiêu chuẩn quốc tế, đảm bảo độ chính xác và lặp lại trong phân tích.
  • Nghiên cứu góp phần mở rộng hiểu biết về peptide chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên từ loài ếch Litoria rubella, đồng thời tạo nền tảng ứng dụng trong y học và bảo quản thực phẩm.
  • Đề xuất phát triển quy mô tổng hợp peptide, nghiên cứu in vivo và ứng dụng thực tiễn trong bảo quản thực phẩm và dược phẩm.
  • Khuyến khích các nhà nghiên cứu, doanh nghiệp và cơ quan quản lý tham khảo để phát triển các sản phẩm chống oxy hóa an toàn, hiệu quả trong tương lai.

Hành động tiếp theo là triển khai nghiên cứu sâu hơn về cơ chế sinh học và thử nghiệm ứng dụng peptide trong các mô hình thực tế nhằm khai thác tối đa tiềm năng của peptide trong các lĩnh vực y sinh và công nghiệp thực phẩm.