Nghiên cứu quy trình đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của peptide Phe - Pro - 5HTP - Leu(OH)

Tài liệu nghiên cứu Nghiên cứu quy trình đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của peptide phe pro 5thp leuoh có nguồn gốc, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Nguyễn Bảo Hưng
• Người hướng dẫn: TS. Trần Thị Thanh Nhã
• Trường học: Trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Tính Chống Oxy Hóa Của Peptide Phe - Pro - 5HTP - Leu(OH) Từ Loài Ếch Litoria Rubella
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• Mục tiêu nghiên cứu
• Đối tượng và nhiệm vụ nghiên cứu
• Ý nghĩa của đề tài
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU
• 1.1. Tổng quan về peptide
• 1.1.1. Phân loại peptide
• 1.1.2. Danh pháp peptide
• 1.1.3. Ứng dụng của peptide có hoạt tính chống oxi hóa
• 1.2. Gốc tự do và chất chống oxy hóa
• 1.2.1. Gốc tự do
• 1.2.2. Ảnh hưởng của gốc tự do đối với cơ thể sinh vật
• 1.2.3. Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa
• 1.2.4. Peptide chống oxy hóa nội sinh (GSH) và khả năng chống oxy hóa tương đương Trolox (TEAC)
• 1.3. Tổng quan về peptide Phe - Pro - 5HTP - Leu - OH
• 1.3.1. Giới thiệu về ếch Litoria rubella
• 1.3.2. Tổng quan về peptide tryptophyllin L tổng hợp từ da của ếch Litoria rubella
• 1.3.3. Tổng quan về peptide Phe - Pro - 5HTP - Leu - OH
• 1.4. Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
• 1.4.1. Phương pháp khử sắt FRAP
• 1.4.2. Phương pháp bắt gốc ABTS+
• 1.4.3. Phương pháp bắt gốc Hydroxyl
• 1.5. Phương pháp phân tích UV-Vis
• 1.5.1. Nguyên tắc và cơ sở định lượng
• 1.5.2. Trang bị và sơ đồ khối của một máy UV-VIS
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Nội dung nghiên cứu
• 2.1.1. Phương pháp khử sắt trong huyết tương FRAP của peptide
• 2.1.2. Phương pháp bắt gốc tự do ABTS của peptide
• 2.1.3. Phương pháp bắt gốc tự do Hydroxyl của peptide
• 2.1.4. Đánh giá phương pháp phân tích
• 2.2. Khảo sát các thông số tối ưu của phương pháp FRAP
• 2.2.1. Khảo sát phổ hấp thu tối ưu của phương pháp FRAP
• 2.2.2. Khảo sát thể tích hỗn hợp thuốc thử FRAP trong phương pháp FRAP
• 2.2.3. Xây dựng đường chuẩn của phương pháp FRAP
• 2.3. Nghiên cứu khả năng khử sắt của peptide theo phương pháp FRAP
• 2.3.1. Khảo sát khả năng khử sắt của peptide theo nồng độ trong phương pháp FRAP
• 2.3.2. Khảo sát điểm kết thúc của phản ứng trong phương pháp FRAP
• 2.3.3. Phân tích mẫu trong phương pháp FRAP
• 2.4. Khảo sát các thông số tối ưu của phương pháp ABTS
• 2.4.1. Khảo sát phổ hấp thu tối ưu của phương pháp ABTS
• 2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích hỗn hợp thuốc thử ABTS
• 2.4.3. Xây dựng đường chuẩn trolox trong phương pháp ABTS
• 2.5. Nghiên cứu khả năng bắt gốc tự do ABTS của Peptide theo phương pháp ABTS
• 2.5.1. Khảo sát khả năng bắt gốc tự do của ABTS
• 2.5.2. Khảo sát điểm kết thúc của phản ứng
• 2.5.3. Phân tích mẫu của phương pháp ABTS
• 2.6. Khảo sát các thông số bắt gốc tự do HYDROXYL
• 2.6.1. Khảo sát phổ hấp thu tối ưu của phương pháp HYDROXYL
• 2.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Deoxyrebose trong phương pháp HYDROXYL
• 2.6.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH trong phương pháp HYDROXYL
• 2.6.4. Khảo sát tỷ lệ hỗn hợp phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL trong phương pháp HYDROXYL
• 2.6.5. Khảo sát thời gian ủ của hỗn hợp phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL trong phương pháp HYDROXYL
• 2.6.6. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của quá trình phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL trong phương pháp HYDROXYL
• 2.6.7. Khảo sát thời gian bền màu của phương pháp HYDROXYL
• 2.6.8. Nghiên cứu khả năng bắt gốc tự do của Peptide theo phương pháp HYDROXYL
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả khảo sát các thông số tối ưu của phương pháp FRAP
• 3.1.1. Kết quả khảo sát phổ hấp thu tối ưu của phương pháp FRAP
• 3.1.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ hỗn hợp thuốc thử FRAP trong phương pháp FRAP
• 3.1.3. Kết quả xây dựng đường chuẩn của phương pháp FRAP
• 3.2. Kết quả nghiên cứu khả năng khử sắt của peptide đã được tối ưu của phương pháp FRAP
• 3.2.1. Kết quả khảo sát khả năng khử sắt của peptide theo nồng độ của phương pháp FRAP
• 3.2.2. Kết quả khảo sát điểm kết thúc của phản ứng của phương pháp FRAP
• 3.2.3. Kết quả phân tích mẫu của phương pháp FRAP
• 3.3. Kết quả khảo sát các thông số tối ưu của phương pháp ABTS
• 3.3.1. Kết quả khảo sát phổ hấp thu tối ưu của phương pháp ABTS
• 3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ hỗn hợp thuốc thử ABTS trong phương pháp ABTS
• 3.3.3. Xây dựng đường chuẩn trolox của phương pháp ABTS
• 3.4. Nghiên cứu khả năng bắt gốc tự do ABTS của Peptide theo phương pháp ABTS
• 3.4.1. Khảo sát khả năng bắt gốc tự do của peptide theo nồng độ của phương pháp ABTS
• 3.4.2. Khảo sát điểm kết thúc của phản ứng của phương pháp ABTS
• 3.4.3. Phân tích mẫu của phương pháp ABTS
• 3.5. Kết quả khảo sát các thông số tối ưu bắt gốc tự do HYDROXYL trong phương pháp HYDROXYL
• 3.5.1. Kết quả khảo sát phổ hấp thu tối ưu của phương pháp HYDROXYL
• 3.5.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Deoxyrebose của phương pháp HYDROXYL
• 3.5.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH của phương pháp HYDROXYL
• 3.5.4. Kết quả khảo sát tỷ lệ hỗn hợp phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL trong phương pháp HYDROXYL
• 3.5.5. Kết quả khảo sát nhiệt độ ủ của hỗn hợp phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL trong phương pháp HYDROXYL
• 3.5.6. Kết quả khảo sát thời gian ủ của hỗn hợp phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL trong phương pháp HYDROXYL
• 3.5.7. Kết quả khảo sát thời gian bền màu của phương pháp HYDROXYL
• 3.5.8. Kết quả nghiên cứu khả năng bắt gốc tự do của Peptide theo phương pháp Hydroxyl
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên cứu Hoạt Tính Chống Oxy Hóa Peptide

Cơ thể sống được cấu thành từ vô số tế bào, mỗi tế bào chứa đựng hàng ngàn protein và peptide liên kết chặt chẽ. Protein và Peptide đảm nhiệm nhiều vai trò sinh học quan trọng trong cơ thể. Tuy nhiên, peptide dễ bị tác động bởi môi trường, dẫn đến biến tính có lợi. Vì vậy, việc nghiên cứu và tổng hợp peptide từ động vật, đặc biệt là lưỡng cư, với khả năng kháng khuẩn, kháng viêm, và đặc biệt là hoạt tính chống oxy hóa, đang thu hút sự quan tâm của giới khoa học. Những thành công bước đầu đã được ghi nhận, đặc biệt trong lĩnh vực Y dược (tăng trưởng, tiêu hóa, trao đổi chất) và trong ngành thực phẩm (chất phụ gia, bảo quản thực phẩm tự nhiên). Nghiên cứu này tập trung vào peptide có nguồn gốc từ ếch Litoria rubella. Việc đánh giá toàn diện hoạt tính chống oxy hóa của peptide là vô cùng quan trọng.

1.1. Tổng quan về ếch Litoria rubella và peptide da

Ếch Litoria rubella từ Úc, đã được nghiên cứu trong nhiều thập kỷ. Các tuyến trên da lưng của chúng tiết ra các peptide nhỏ chứa trình tự Pro-Trp, gọi là peptit tryptophyllin L. Các peptide từ da ếch nhiều chi tại Úc đã được báo cáo có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, nhưng các hoạt tính sinh học của họ peptide này vẫn chưa được khám phá hết. Peptide từ da ếch giúp chúng thích nghi với sự thay đổi mạnh mẽ của khí hậu từ khô cằn đến ẩm ướt. Chính vì thế, việc nghiên cứu sâu hơn về các loại peptide này là vô cùng cần thiết.

1.2. Tầm quan trọng của chất chống oxy hóa tự nhiên từ peptide

Việc phát hiện ra peptide chống oxy hóa (AOPs) từ các loài ếch khác nhau đã thu hút sự chú ý lớn. Các peptide có đóng vai trò vừa là bằng chứng vừa là lời giải thích cho phản ứng của các loài đó đối với quá trình chuyển đổi sự sống từ môi trường dưới nước lên trên cạn. Khả năng chống oxy hóa giúp ếch thích nghi với sự thay đổi mạnh mẽ của khí hậu. Vì vậy, việc nghiên cứu peptide tự nhiên có khả năng chống oxy hóa có ý nghĩa quan trọng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là y học và thực phẩm.

II. Thách Thức Stress Oxy Hóa và Nhu Cầu Chất Chống Oxy Hóa

Stress oxy hóa là một quá trình sinh học gây hại do sự mất cân bằng giữa gốc tự do và hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể. Quá trình này gây ra nhiều bệnh lý nguy hiểm. Nhu cầu tìm kiếm các nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên ngày càng tăng. Peptide từ động vật, đặc biệt là lưỡng cư, nổi lên như một nguồn tiềm năng. Nghiên cứu này tập trung giải quyết vấn đề tìm kiếm và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của một peptide cụ thể (Phe-Pro-5HTP-Leu(OH)) từ ếch Litoria rubella. Việc hiểu rõ cơ chế chống oxy hóa của peptide này sẽ mở ra hướng ứng dụng mới.

2.1. Ảnh hưởng của gốc tự do và vai trò của chất chống oxy hóa

Gốc tự do là các phân tử không ổn định, có khả năng gây tổn thương tế bào và DNA, dẫn đến quá trình lão hóa và nhiều bệnh lý. Chất chống oxy hóa có vai trò trung hòa gốc tự do, bảo vệ tế bào khỏi tổn thương. Việc bổ sung chất chống oxy hóa, đặc biệt là từ nguồn tự nhiên, là rất quan trọng để duy trì sức khỏe.

2.2. Peptide như một giải pháp tiềm năng cho stress oxy hóa

Peptide là các chuỗi amino acid ngắn, có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, bao gồm cả khả năng chống oxy hóa. Peptide có thể hoạt động như một chất chống oxy hóa bằng cách loại bỏ gốc tự do, ức chế quá trình oxy hóa. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tiềm năng của peptide trong việc giảm stress oxy hóa và phòng ngừa bệnh tật.

2.3. Giới thiệu về peptide Phe Pro 5HTP Leu OH và tiềm năng

Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu(OH) là một peptide đặc biệt, có nguồn gốc từ ếch Litoria rubella. Điểm đặc biệt của peptide này là sự thay thế tryptophan bằng 5-hydroxytryptophan (5HTP). 5-hydroxytryptophan là một amino acid chuyển hóa của tryptophan, đã được chứng minh có khả năng chống oxy hóa cao. Do đó, việc nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của peptide Phe-Pro-5HTP-Leu(OH) là rất hứa hẹn.

III. Phương Pháp Đánh Giá Hoạt Tính Chống Oxy Hóa Peptide

Nghiên cứu này chuẩn hóa quy trình đánh giá khả năng chống oxy hóa của peptide Phe-Pro-5htp-Leu-OH bằng phương pháp ức chế oxy hóa gốc tự do Hydroxyl (OH ). Đồng thời, nghiên cứu khả năng chống oxy hóa với gốc tự do thương mại bằng các thí nghiệm khả năng khử sắt trong huyết tương (FRAP) và tương tác gốc tự do ABTS. Việc kết hợp các phương pháp này giúp đánh giá toàn diện khả năng chống oxy hóa của peptide.

3.1. Phương pháp FRAP Khả năng khử sắt của peptide

Phương pháp FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) đánh giá khả năng khử sắt (Fe3+ thành Fe2+) của peptide. Khả năng khử sắt càng cao, hoạt tính chống oxy hóa càng mạnh. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của nhiều hợp chất.

3.2. Phương pháp ABTS Tương tác với gốc tự do ABTS

Phương pháp ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) đánh giá khả năng của peptide trong việc trung hòa gốc tự do ABTS. Gốc tự do ABTS là một gốc tự do tổng hợp, thường được sử dụng để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa. Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS càng cao, hoạt tính chống oxy hóa càng mạnh.

3.3. Phương pháp bắt gốc tự do Hydroxyl Mô phỏng stress oxy hóa

Phương pháp bắt gốc tự do Hydroxyl sử dụng gốc Hydroxyl (OH’) là nhóm nội sinh cụ thể trong cơ thể sinh vật. Gốc tự do Hydroxyl là một gốc tự do cực kỳ hoạt động, có khả năng gây tổn thương nghiêm trọng cho tế bào. Đánh giá khả năng của peptide trong việc loại bỏ gốc tự do Hydroxyl giúp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trong môi trường sinh học.

IV. Kết Quả Hoạt Tính Chống Oxy Hóa Của Peptide Phe Pro 5HTP

Các thử nghiệm chỉ ra rằng peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH có khả năng bắt gốc tự do Hydroxyl và cũng thể hiện khả năng chống oxy hóa qua hai thử nghiệm đó là bắt gốc ABTS và khử sắt FRAP. Điều này góp phần cho việc khám phá các peptide mới ứng dụng cho phát triển y học và bảo quản thực phẩm. Kết quả cho thấy tiềm năng ứng dụng rộng rãi của peptide này.

4.1. Peptide Phe Pro 5HTP hiệu quả trong thử nghiệm FRAP

Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu(OH) cho thấy khả năng khử sắt đáng kể trong thử nghiệm FRAP. Khả năng khử sắt này cho thấy peptide có thể hoạt động như một chất chống oxy hóa bằng cách khử các ion kim loại, ngăn chặn chúng tham gia vào các phản ứng tạo gốc tự do.

4.2. Khả năng bắt gốc tự do ABTS của Peptide Phe Pro 5HTP

Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu(OH) cũng cho thấy khả năng bắt gốc tự do ABTS hiệu quả. Khả năng này cho thấy peptide có thể trực tiếp loại bỏ gốc tự do, ngăn chặn chúng gây tổn thương cho tế bào.

4.3. Chứng minh khả năng loại bỏ gốc Hydroxyl của peptide

Kết quả cho thấy peptide Phe-Pro-5HTP-Leu(OH) có khả năng loại bỏ gốc tự do Hydroxyl, một trong những gốc tự do gây hại nhất trong cơ thể. Khả năng này cho thấy peptide có thể bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do stress oxy hóa.

V. Ứng Dụng Tiềm Năng Của Peptide Trong Y Học và Thực Phẩm

Nghiên cứu về peptide và phát triển peptide như dược phẩm hoặc chất bảo quản thực phẩm đang là một xu hướng của giới khoa học và công nghiệp thế giới. Vì vậy, tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của peptide tự nhiên là một trong số nghiên cứu quan trọng vì chúng sẽ góp phần mở rộng ngân hàng các peptide thuộc nhóm này, làm cơ sở cho việc dự đoán và thiết kế các peptide chống oxy hóa. Ngoài ra nó góp phần vào thúc đẩy những phát triển xa hơn trong các lĩnh vực hóa dược và hóa thực phẩm khi các peptide này được...

5.1. Ứng dụng y học Phát triển dược phẩm từ peptide chống oxy hóa

Các peptide chống oxy hóa có tiềm năng lớn trong việc phát triển các dược phẩm mới để điều trị các bệnh liên quan đến stress oxy hóa, chẳng hạn như bệnh tim mạch, ung thư, Alzheimer và Parkinson. Peptide có thể được sử dụng để bảo vệ tế bào khỏi tổn thương, giảm viêm và cải thiện chức năng của các cơ quan.

5.2. Ứng dụng thực phẩm Peptide như chất bảo quản tự nhiên

Peptide có thể được sử dụng như một chất bảo quản tự nhiên trong thực phẩm để ngăn chặn quá trình oxy hóa và kéo dài thời hạn sử dụng của sản phẩm. Peptide có thể bảo vệ thực phẩm khỏi sự biến chất, ôi thiu và mất chất dinh dưỡng.

VI. Kết Luận Peptide Phe Pro 5HTP Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH có tiềm năng lớn trong việc phát triển các ứng dụng trong y học và thực phẩm. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc tìm hiểu sâu hơn về cơ chế chống oxy hóa của peptide, tối ưu hóa quá trình tổng hợp và đánh giá hiệu quả của peptide trong các mô hình in vivo. Việc phát triển các sản phẩm dựa trên peptide sẽ góp phần cải thiện sức khỏe con người và nâng cao chất lượng thực phẩm.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu và đóng góp khoa học

Nghiên cứu này đã chứng minh hoạt tính chống oxy hóa của peptide Phe-Pro-5HTP-Leu(OH) thông qua nhiều phương pháp khác nhau. Kết quả này góp phần mở rộng kiến thức về peptide chống oxy hóa và cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các ứng dụng trong tương lai.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo và tiềm năng ứng dụng rộng rãi

Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc đánh giá hiệu quả của peptide Phe-Pro-5HTP-Leu(OH) trong các mô hình in vivo, tìm hiểu sâu hơn về cơ chế chống oxy hóa và tối ưu hóa quá trình tổng hợp. Tiềm năng ứng dụng của peptide này là rất lớn, đặc biệt trong lĩnh vực y học và thực phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Peptide có hoạt tính chống oxy hóa ngày càng được quan tâm trong các lĩnh vực y dược và bảo quản thực phẩm do khả năng loại bỏ các gốc tự do gây hại cho cơ thể sống. Theo ước tính, các gốc tự do như hydroxyl (OH·), ABTS·+ và các ion sắt Fe3+ đóng vai trò quan trọng trong quá trình oxy hóa sinh học, gây tổn thương tế bào và liên quan đến nhiều bệnh lý. Nghiên cứu này tập trung đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH, một peptide có nguồn gốc từ loài ếch Litoria rubella, bằng các phương pháp thực nghiệm bắt gốc tự do Hydroxyl, ABTS và khử sắt FRAP.

Mục tiêu chính của luận văn là khảo sát quy trình đánh giá khả năng bắt gốc tự do và khử sắt của peptide này, đồng thời tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm theo tiêu chuẩn TCVN ISO 17025:2017. Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm phân tích thí nghiệm của Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh trong năm 2023. Kết quả nghiên cứu không chỉ góp phần làm rõ hoạt tính sinh học của peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH mà còn mở ra hướng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và phát triển y học, đặc biệt trong việc tìm kiếm các chất chống oxy hóa tự nhiên an toàn và hiệu quả.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết gốc tự do và chất chống oxy hóa: Gốc tự do là các phân tử có electron chưa ghép đôi, rất dễ phản ứng và gây tổn thương tế bào. Chất chống oxy hóa hoạt động bằng cách chuyển electron hoặc cho nguyên tử hydro để trung hòa gốc tự do, ngăn ngừa quá trình oxy hóa gây hại.

• Mô hình peptide chống oxy hóa: Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH được tổng hợp dựa trên cấu trúc peptide tryptophyllin L từ da ếch Litoria rubella, trong đó tryptophan được thay thế bằng 5-hydroxytryptophan (5HTP) – một amino acid có khả năng chống oxy hóa cao.

• Khái niệm và phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa: Sử dụng ba phương pháp chính gồm:

  • Phương pháp bắt gốc tự do Hydroxyl (OH·) dựa trên phản ứng ức chế oxy hóa deoxyribose.
  • Phương pháp bắt gốc ABTS·+ sử dụng khả năng khử màu của gốc tự do ABTS.
  • Phương pháp khử sắt FRAP đo khả năng khử ion Fe3+ thành Fe2+ tạo phức màu xanh.

Các khái niệm chuyên ngành như TEAC (khả năng chống oxy hóa tương đương Trolox), peptide, liên kết peptide, và các thuật ngữ hóa học phân tích UV-Vis cũng được áp dụng để phân tích và đánh giá kết quả.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH được tổng hợp với độ tinh khiết khoảng 95% qua phương pháp tổng hợp pha rắn Fmoc, xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khối phổ (MS).

• Phương pháp phân tích:

  • Phương pháp FRAP: Đo khả năng khử sắt trong huyết tương bằng phản ứng tạo phức Fe2+-TPTZ, hấp thu ở bước sóng 593 nm.
  • Phương pháp ABTS: Đo khả năng bắt gốc tự do ABTS·+ qua giảm độ hấp thu ở bước sóng 734 nm.
  • Phương pháp Hydroxyl: Đánh giá khả năng bắt gốc tự do OH· dựa trên ức chế phản ứng oxy hóa deoxyribose, đo quang ở bước sóng 532 nm.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành trong năm 2023 tại phòng thí nghiệm trường Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh, bao gồm các bước khảo sát điều kiện tối ưu, xây dựng đường chuẩn, thực hiện thí nghiệm và phân tích kết quả.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: Mẫu peptide được chuẩn bị đồng nhất với các nồng độ từ 1 µM đến 30 µM để khảo sát khả năng chống oxy hóa theo từng phương pháp.

• Đánh giá phương pháp: Độ lặp lại (repeatability) được kiểm tra bằng cách thực hiện thí nghiệm nhiều lần trên cùng mẫu, tính toán hệ số biến thiên (RSD%) để đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Khả năng khử sắt FRAP của peptide:

   • Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH thể hiện khả năng khử sắt tăng theo nồng độ, với giá trị hấp thu quang tại 593 nm tăng từ 0.12 đến 0.85 khi nồng độ peptide tăng từ 1 µM đến 30 µM.
   • So sánh với chất chuẩn Trolox và peptide nội sinh Glutathione, peptide nghiên cứu đạt khoảng 75% khả năng khử sắt của Trolox ở nồng độ 20 µM.

2. Khả năng bắt gốc tự do ABTS:

   • Peptide có khả năng bắt gốc ABTS·+ với hiệu quả đạt 68% so với Trolox ở nồng độ 15 µM.
   • Đường chuẩn Trolox tuyến tính trong khoảng 0.25 – 20 µM với hệ số hồi quy R² = 0.998, đảm bảo độ tin cậy của phép đo.

3. Khả năng bắt gốc tự do Hydroxyl:

   • Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH ức chế phản ứng oxy hóa deoxyribose với hiệu suất lên đến 70% ở nồng độ 10 µM.
   • Thời gian ủ phản ứng tối ưu là 60 phút ở 37°C, đảm bảo độ bền màu và độ nhạy của phương pháp.

4. Tối ưu hóa điều kiện thực nghiệm:

   • Phổ hấp thu tối ưu của các phương pháp lần lượt là 593 nm (FRAP), 734 nm (ABTS) và 532 nm (Hydroxyl).
   • Tỷ lệ thể tích thuốc thử và mẫu được tối ưu để đạt hiệu quả phản ứng cao nhất, ví dụ tỷ lệ 1:5 (mẫu: thuốc thử) trong phương pháp FRAP.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH có hoạt tính chống oxy hóa toàn diện, thể hiện qua khả năng bắt gốc tự do Hydroxyl, ABTS và khử sắt FRAP. Sự thay thế tryptophan bằng 5-hydroxytryptophan (5HTP) trong cấu trúc peptide được cho là tăng cường khả năng chống oxy hóa nhờ nhóm hydroxyl trên vòng indole, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về hoạt tính của 5HTP riêng lẻ.

So với peptide Phe-Pro-Trp-Leu (NH2) được báo cáo có hoạt tính chống oxy hóa, peptide nghiên cứu có hiệu quả tương đương hoặc cao hơn trong một số thử nghiệm, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng trong y học và bảo quản thực phẩm. Các biểu đồ so sánh khả năng khử sắt và bắt gốc tự do giữa peptide, Trolox và Glutathione minh họa rõ sự tương đồng và ưu thế của peptide mới.

Việc tối ưu hóa các thông số kỹ thuật như bước sóng đo, tỷ lệ thuốc thử và thời gian ủ phản ứng giúp nâng cao độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp, đồng thời đảm bảo tính khả thi khi áp dụng quy trình trong nghiên cứu và sản xuất.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình tổng hợp peptide quy mô lớn: Tăng cường hợp tác với các đơn vị sản xuất peptide để mở rộng quy mô tổng hợp peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH, nhằm đáp ứng nhu cầu nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm trong vòng 2 năm tới.

2. Nghiên cứu sâu về cơ chế chống oxy hóa in vivo: Thực hiện các thử nghiệm trên mô hình tế bào và động vật để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của peptide trong môi trường sinh học thực tế, dự kiến hoàn thành trong 3 năm.

3. Ứng dụng peptide trong bảo quản thực phẩm: Thử nghiệm sử dụng peptide như chất bảo quản tự nhiên trong các sản phẩm thực phẩm dễ bị oxy hóa, nhằm giảm thiểu việc sử dụng chất bảo quản tổng hợp có hại, với mục tiêu triển khai thử nghiệm tại một số cơ sở sản xuất trong 1-2 năm.

4. Phát triển sản phẩm dược phẩm hỗ trợ sức khỏe: Khai thác tiềm năng peptide trong các sản phẩm bổ sung chống oxy hóa, hỗ trợ phòng ngừa các bệnh liên quan đến stress oxy hóa, phối hợp với các trung tâm nghiên cứu y sinh để phát triển sản phẩm trong 3-5 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Hóa phân tích, Hóa dược: Luận văn cung cấp phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa peptide bằng các kỹ thuật UV-Vis, FRAP, ABTS và Hydroxyl, giúp mở rộng kiến thức và ứng dụng trong nghiên cứu peptide sinh học.

2. Chuyên gia phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng và bảo quản: Thông tin về hoạt tính chống oxy hóa của peptide tự nhiên hỗ trợ trong việc lựa chọn nguyên liệu và thiết kế sản phẩm an toàn, hiệu quả, thay thế chất bảo quản tổng hợp.

3. Doanh nghiệp sản xuất peptide và dược phẩm: Quy trình tổng hợp và đánh giá peptide được mô tả chi tiết, giúp doanh nghiệp nâng cao chất lượng sản phẩm và phát triển các dòng sản phẩm mới có hoạt tính sinh học.

4. Cơ quan quản lý và kiểm định chất lượng: Kết quả nghiên cứu và quy trình thẩm định theo tiêu chuẩn TCVN ISO 17025:2017 cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng peptide và các sản phẩm liên quan.

Câu hỏi thường gặp

1. Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH có nguồn gốc từ đâu?
   Peptide này được tổng hợp dựa trên cấu trúc peptide tự nhiên được phân lập từ tuyến da của loài ếch Litoria rubella, với sự thay thế tryptophan bằng 5-hydroxytryptophan (5HTP) để tăng cường hoạt tính chống oxy hóa.

2. Phương pháp FRAP đánh giá hoạt tính chống oxy hóa như thế nào?
   Phương pháp FRAP đo khả năng khử ion Fe3+ thành Fe2+ tạo phức màu xanh, hấp thu ở bước sóng 593 nm. Khả năng khử sắt càng cao chứng tỏ hoạt tính chống oxy hóa càng mạnh.

3. Tại sao cần sử dụng nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa?
   Mỗi phương pháp phản ánh một khía cạnh khác nhau của hoạt tính chống oxy hóa (bắt gốc tự do, khử sắt, ức chế oxy hóa hydroxyl), do đó sử dụng đa phương pháp giúp đánh giá toàn diện và chính xác hơn.

4. Peptide này có thể ứng dụng trong lĩnh vực nào?
   Peptide có thể được ứng dụng trong phát triển dược phẩm chống oxy hóa, thực phẩm chức năng, chất bảo quản tự nhiên trong thực phẩm và nghiên cứu sinh học liên quan đến stress oxy hóa.

5. Độ tinh khiết của peptide được đảm bảo như thế nào?
   Peptide được tổng hợp bằng phương pháp pha rắn Fmoc với độ tinh khiết khoảng 95%, được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khối phổ (MS), đảm bảo chất lượng cho các thí nghiệm.

Kết luận

• Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH có khả năng chống oxy hóa toàn diện, thể hiện qua các phương pháp bắt gốc Hydroxyl, ABTS và khử sắt FRAP với hiệu quả cao so với các chất chuẩn như Trolox và Glutathione.
• Quy trình đánh giá hoạt tính chống oxy hóa được tối ưu hóa theo tiêu chuẩn quốc tế, đảm bảo độ chính xác và lặp lại trong phân tích.
• Nghiên cứu góp phần mở rộng hiểu biết về peptide chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên từ loài ếch Litoria rubella, đồng thời tạo nền tảng ứng dụng trong y học và bảo quản thực phẩm.
• Đề xuất phát triển quy mô tổng hợp peptide, nghiên cứu in vivo và ứng dụng thực tiễn trong bảo quản thực phẩm và dược phẩm.
• Khuyến khích các nhà nghiên cứu, doanh nghiệp và cơ quan quản lý tham khảo để phát triển các sản phẩm chống oxy hóa an toàn, hiệu quả trong tương lai.

Hành động tiếp theo là triển khai nghiên cứu sâu hơn về cơ chế sinh học và thử nghiệm ứng dụng peptide trong các mô hình thực tế nhằm khai thác tối đa tiềm năng của peptide trong các lĩnh vực y sinh và công nghiệp thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN VỀ LĨNH vực NGHIÊN cứu 1.1 Peptide Định nghĩa: Peptide là chuỗi axit amin ngắn được liên kết bởi liên kết peptide. Polypeptide là chuỗi peptide dài hơn, liên tục và không phân nhánh. Polypeptide có khối lượng phân tử từ 10.000 Da trở lên được gọi là protein. Các chuỗi có ít hơn 20 axit amin được gọi là oligopeptide và bao gồm các dipeptide, tripeptide và tetrapeptide [ 11.

Các axit amin đã được tích hợp vào peptide được gọi là các tiểu phân. Một phân tử nước được giải phóng trong quá trình hình thành mỗi liên kết amit. Tất cả các peptide ngoại trừ peptide vòng đều có đầu tận cùng N (nhóm amin) và đầu c (nhóm cacboxyl) ở cuối peptide (như minh họa cho tetrapeptide trong hình) [ 11. cấu trúc peptide: Hình 1.1 Liên kết amide/peptide trong các phân tử peptide và protein Liên kết peptide: Trong hóa học hữu cơ, liên kết peptide là một loại liên kết cộng hóa trị amit, hên kết hai axit alpha-amino liên tiếp từ C1 (cacbon số một) của một axit alpha-amino và N2 (nitơ số hai) của một axit khác, dọc theo một peptide hoặc protein chuỗi.

Nó cũng có thể được gọi là hên kết eupeptide để phân biệt với liên kết isopeptide, là một loại liên kết amit khác giữa hai axit amin [1-3]. Khi hai axit amin tạo thành một dipeptide thông qua một liên kết peptide đó là một loại phản ứng ngưng tụ. Trong kiểu ngưng tụ này, hai axit amin tiếp cận nhau, với gốc axit cacboxylic không chuỗi bên (Cl) của một axit đến gần gốc axit amin không chuỗi bên (N2) của axit kia. Một loại mất hydro và oxy từ nhóm cacboxyl (COOH) 5 và loại kia mất hydro từ nhóm amino (NH2) của nó.

Phản ứng này tạo ra một phân tử nước (H2O) và hai axit amin nối vói nhau bằng liên kết peptide (-CO-NH-). Hai axit amin tham gia được gọi là một dipeptide [1-3]. Sự hình thành liên kết peptide tiêu thụ năng lượng, mà ở các sinh vật năng lượng này được lấy từ ATP. Peptide và protein là các chuỗi axit amin được liên kết với nhau bằng liên kết peptide (và đôi khi bằng một vài liên kết isopeptide).

Các sinh vật sử dụng enzym để tạo ra các peptide có hoạt tính tốt và ribosome để tạo ra protein thông qua các phản ứng khác nhau về chi tiết so với quá trình tổng hợp mất nước [1]. Một số peptide, chẳng hạn như alpha-amanitin, được gọi là peptide ribosome vì chúng được tạo ra bởi các ribosome, nhưng nhiều peptide không thuộc ribosome vì chúng được tổng hợp bởi các enzyme chuyên biệt chứ không phải ribosome. Ví dụ, tripeptide glutathione được tổng họp theo hai bước từ các axit amin tự do, bởi hai enzyme: glutamate-cysteine ligase (tạo liên kết isopeptide, không phải là liên kết peptide) và glutathione synthetase (tạo liên kết peptide) [1]. Liên kết amit được tổng hợp khi nhóm cacboxyl của một phân tử axit amin này phản ứng với nhóm amin của phân tử axit amin kia, gây ra sự giải phóng một phân tử nước (H2O), do đó quá trình này là phản ứng tổng hợp khử nước [2].1 Phân loại peptide: Các peptide được phân thành hai loại.

Oligopeptide gồm các peptide có từ 2 đến 10 gốc a-amino acid và được gọi là dipeptide, tripeptide, tetrapeptide. với so amino acid tưong ứng. Polipeptide gồm các peptide có từ 11 đến 50 gốc a-amino acid [1] Do sự thay đổi vị trí của các amino acid thành phần trong một peptide. Nếu phân tử peptide chứa n gốc a-amino acid khác nhau thì số đồng phân loại peptide sẽ là n!.

Neu trong phân tử peptide có i cặp gốc a-amino acid giống nhau thì số đồng phân chỉ còn n!. Ví dụ, nếu peptide chỉ chứa hai amino acid là serine và alanine, có hai cách sắp xếp hai amino acid này trong thành phần peptide, tùy vào gốc amino của serine sẽ liên kết vói gốc carboxylic của alanine hay gốc amino của alanine sẽ liên kết vói 6 gốc carboxyl của serine. Ồ trường hợp thứ nhất ta có alanylserine peptide, hường hợp thứ hai ta có serylalanine peptide [1].2 Danh pháp peptide: Peptide là bất kỳ polymer nào của các axit amin được liên kết bằng liên kết amit giữa nhóm am in của một axit amin và nhóm cacboxyl của axit amin lân cận. Mỗi đơn vị axit amin trong peptide được gọi là thừa (dư axit amin) [ 1-3].

Thuật ngữ “peptide” biểu thị các hợp chất tương đối nhỏ, giống với protein ngoại trừ việc chúng bao gồm ít hơn 50 gốc axit amin. olypeptide có trên 50 gốc amin được gọi là protein. Theo quỵ ước, một peptide được viết với axit amin gốc có nhóm amino tự do (NH3+) ở bên trái và gốc axit amin có nhóm cacboxyl tự do (CƠ2 ■) ở bên phải [1-2] Theo quy ước, peptide có công thức phân tử là amino acid đầu N (còn gốc NỈỈ3+ tự do) thì nằm ở bên trái và amino acid đầu c nằm bên phải [2]. /V-terminal end C-terminal end „ H O H „ h2n-c-c-nh0-cooh R R' Peptide bond Phần cuối của peptide với nhóm amino tự do được gọi là đầu N hoặc đầu N và phần cuối với nhóm carboxyl tự do được gọi là đầu c [2] 1.3 ứng dụng của peptide cỏ hoạt tính chống oxì hóa Do có những tính chất và vai trò đặt biệt có khả năng ảnh hưởng đến các chức năng sinh lý bên trong của cơ thể sinh vật nên các peptide có hoạt tính chống oxy hóa được ứng dụng trong nghành y dược và cũng được ứng dụng trong nghành thực phẩm.

7 Nghành ỵ dược: Tất cả các peptide kháng sinh và aspartame vào thì peptide cũng chỉ chiếm khoảng 0.0025% (khối lượng) của dược phẩm sản xuất hằng năm, nhưng peptide có vai trò rất quan trọng trongnghiên cứu và điều trị bệnh. Peptide hoạt tính sinh học được xem là một tiềm năng rất lớn để giải quyết các vấn đề quan trọng như: tăng trưởng, tiêu hóa, trao đổi chất. [4] Có nhiều peptide được sản xuất có nhỏ hon 40 amino acid bằng các phưong pháp hóa học. Phưong pháp hoá học cổ điển (tiến hành phản ứng trong dung dịch) phù hợp cho sản xuất những peptide ngắn mạch cho tới trung bình, hiệu suất tối đa có thể đạt tới vài trăm kg cho tói vài tấn trên năm [4].

Nghành thực phẩm: Trái ngược với các sinh vật sống, sự thối rửa của thực phẩm không thể phục hồi đối vói chất lượng của nó, có thể bị giảm từ vài giờ đến vài tháng và có thể hàng năm khi các chiến lược thích hợp được thực hiện và áp dụng. Việc sử dụng chất chống oxy hóa để làm phụ gia thực phẩm là hướng gia tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm. Nhu cầu sử dụng thực phẩm không chất phụ gia tổng hợp không tự nhiên, do những ảnh hưởng có hại cho sức khỏe của sinh vật đặt biệt là con người, đã làm cho cả ngành công nghiệp thực phẩm và các nhà nghiên cứu khám phá những công trình nghiên cứu mói để có được chất chống oxy hóa từ tự nhiên. Những xu hướng này tăng cường nhu cầu thu được và sử dụng các chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên cũng có hoạt tính sinh học [4].2 Gốc tự do và chất chống oxy hóa.1 Gốc tự do Các gốc tự do là các chất hóa học sở hữu một điện tử chưa ghép đôi có thể được coi là các mảnh phân tử và thường rất dễ phản ứng.

Chúng được sản xuất liên tục trong các té bào hoặc là sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất. Các phản ứng quan trọng nhất trong sinh hóa gốc tự do trong tế bào hiếu khí là oxy và các dẫn xuất gốc của nó 8 (gốc superoxide và hydroxyl), hydrogen peroxide và các kim loại chuyển tiếp. Các gốc tự do có thể tích điện dương, tích điện âm hoặc trung hòa về điện [5] Các gốc tự do phản ứng hình thành trong tế bào có thể oxy hóa các phân tử sinh học và dẫn đến chết tế bào và tổn thưong mô. Việc xác định sự tham gia của các gốc tự do trong cơ chế bệnh sinh của một căn bệnh là vô cùng khó khăn do thời gian sống của các gốc tự do này rất ngắn [5].

Mục tiêu của các gốc tự do bao gồm tất cả các loại phân tử trong cơ thể. Trong số đó, lipid, axit nucleic và protein là những mục tiêu chính. Các gốc tự do và các ROS khác có nguồn gốc từ các quá trình trao đổi chất thiết yếu bình thường trong cơ thể con người hoặc từ các nguồn bên ngoài như tiếp xúc với tia X, ozone, hút thuốc lá, chất ô nhiễm không khí và hóa chất công nghiệp [5]. Gốc tự do hình thành từ hai nguồn, đó là nguồn nội sinh và nguồn ngoại sinh.

Ở nguồn nội sinh, gốc tự do hình thành từ chuỗi chuyền điện tử trong ty thể (các phản ứng phosphoryl oxy hóa của mitochondria): superoxide anion (Ơ2*), peroxynitrate (ONO-), hydrogen peroxide (H2O2), goc hydroxyl (OH*). Nguồn nội sinh thứ 2 là từ hoạt động hô hấp của leucocyte, gốc tự do hình thành để giết vi khuẩn. Từ quá trình tự chết của tế bào (apoptosis): bang in vitro, người ta thấy chất oxy hóa nội sinh AXO có thể ngăn trở apoptosis. Ở nguồn ngoại sinh, gốc tự do hình thành từ khí ozone, bức xạ tử ngoại, khói thuốc lá [5].2 Ảnh hưởng của gốc tự do đoi với cơ thể sình vật.

Gốc tự do sinh ra nhiều sẽ vượt qua hệ thống enzym bảo vệ cơ thể và các gốc này sẽ tấn công vào các chất của cơ thể. Những thành phần té bào như ADN, protein, phospholipid, carbohydrat. dễ bị gốc tự do tấn công gây ra các bệnh nguy hiểm [5]. Gốc tự do tấn công vào phospholipid màng tế bào gây ra quá trình peroxy hóa lipid.

Quá trình peroxy hóa lipid xảy ra mãnh liệt ở cơ quan, tổ chức tế bào khiến chúng bị phá hủy một cách nghiêm trọng dẫn đến đột biến, ung thư hoặc tổn thương các phân tử and [5] 9 Sự tác động đến các yếu tố gây viêm, sự hủy hoại các phân tử polysaccharid do oxy hóa có thể làm mất tính nhớt của acid hyalunoric (một chất làm tron khớp), ảnh hưởng tói quá trình viêm có thể dẫn tói bệnh viêm khớp dạng thấp, lupus ban đỏ. Gốc tự do liên quan đến các chất tiết ra từ thành mạch máu sẽ quyết định khả năng bám dính của tiểu cầu và mảng xo vữa, là nguyên nhân của các bệnh tim mạch (tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim.) [5], Nói chung gốc tự do liên quan đến khá nhiều bệnh tật trong cơ thể vì thế nếu khả năng chống oxy hóa của cơ thể cao thì xác suất mắc bệnh và mức độ bệnh tật sẽ giảm. Vì thế người ta không ngừng nghiên cứu, tìm kiếm các chất chống oxy hóa cho cơ thể nhằm nâng cao và bảo vệ sức khỏe con người [5].