Luận án nghiên cứu hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai loài aralia dasyphylla và aralia hiepiana ở tây nguyên

Nghiên cứu hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của Aralia Dasyphylla và Aralia Hiepiana tại Tây… 324 trang · Học viện Khoa học và Công nghệ · 2023.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hiền
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Toàn Phan
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
• Đề tài: Nghiên cứu hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai loài Aralia dasyphylla và Aralia hiepiana ở Tây Nguyên
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Lâm Đồng

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về chi Aralia
• 1.2. Giới thiệu về hai loài nghiên cứu
• 1.2.1. Giới thiệu chung về loài Aralia dasyphylla
• 1.2.2. Giới thiệu chung về loài Aralia hiepiana
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Tạo các cao chiết loài A.
• 2.2.2. Phân lập các hợp chất loài A.
• 2.2.3. Thông số vật lý và dữ kiện phổ các hợp chất phân lập từ cây A.
• 2.2.4. Tạo các cao chiết từ loài A.
• 2.2.5. Phân lập các hợp chất từ loài A.
• 2.2.6. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài A.
• 2.2.7. Thủy phân xác định các gốc đường
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả nghiên cứu loài A.
• 3.1.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ loài A.
• 3.1.2. Kết quả thử hoạt tính sinh học loài A.
• 3.2. Kết quả nghiên cứu loài A.
• 3.2.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ loài A.
• 3.2.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của loài A.
• 3.3. Tổng hợp các kết quả nghiên cứu
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu chung về nghiên cứu

Nghiên cứu hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của Aralia Dasyphylla và Aralia Hiepiana tại Tây Nguyên nhằm mục đích khám phá các hợp chất hóa học tiềm năng từ hai loài thực vật này. Hai loài này thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), nổi bật với khả năng gây độc tế bào ung thư. Việc nghiên cứu này không chỉ giúp làm rõ thành phần hóa học mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu từ thiên nhiên. Theo thống kê, Việt Nam có khoảng 15 loài Aralia, trong đó Aralia Dasyphylla và Aralia Hiepiana là hai loài có tiềm năng lớn trong y học cổ truyền.

1.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu từ thiên nhiên. Việc tìm hiểu về hoạt tính gây độc tế bào của hai loài này có thể dẫn đến việc phát hiện ra các hợp chất mới có khả năng chống ung thư. Hơn nữa, việc bảo tồn và phát triển các loài thực vật này cũng góp phần vào việc bảo vệ đa dạng sinh học tại Tây Nguyên.

II. Tổng quan tài liệu

Tổng quan tài liệu về chi Aralia cho thấy rằng các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài trong chi này. Các hợp chất chính được ghi nhận bao gồm triterpen saponin, flavonoid, và phenolic. Tuy nhiên, nghiên cứu về Aralia Dasyphylla và Aralia Hiepiana vẫn còn hạn chế. Việc phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ hai loài này sẽ cung cấp thông tin quý giá cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.1. Các nghiên cứu trước đây

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất từ chi Aralia có khả năng chống viêm và kháng khuẩn. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào tập trung vào hoạt tính gây độc tế bào của Aralia Dasyphylla và Aralia Hiepiana. Điều này cho thấy sự cần thiết phải tiến hành nghiên cứu sâu hơn để khám phá tiềm năng của hai loài này trong việc phát triển thuốc chống ung thư.

III. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu bao gồm việc thu thập mẫu từ hai loài Aralia Dasyphylla và Aralia Hiepiana, sau đó tiến hành chiết xuất và phân lập các hợp chất hóa học. Các phương pháp sắc ký như sắc ký cột (CC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sẽ được sử dụng để tách biệt các hợp chất. Để xác định hoạt tính gây độc tế bào, các dòng tế bào ung thư sẽ được sử dụng trong các thử nghiệm sinh học.

3.1. Quy trình chiết xuất

Quy trình chiết xuất sẽ bao gồm việc sử dụng dung môi methanol để chiết xuất các hợp chất từ lá cây. Sau đó, các hợp chất sẽ được phân lập bằng phương pháp sắc ký. Các thông số vật lý và dữ liệu phổ sẽ được ghi nhận để xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được. Quy trình này sẽ giúp đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả nghiên cứu.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các cao chiết từ Aralia Dasyphylla và Aralia Hiepiana có hoạt tính gây độc tế bào mạnh. Các hợp chất phân lập được đã được xác định cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính sinh học. Kết quả cho thấy rằng một số hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc chống ung thư từ thiên nhiên.

4.1. Phân tích hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ hai loài này đã được thử nghiệm trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Kết quả cho thấy rằng một số hợp chất có giá trị IC50 thấp, cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ sự phát triển của tế bào ung thư. Điều này chứng tỏ rằng Aralia Dasyphylla và Aralia Hiepiana có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu chống ung thư.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng Aralia Dasyphylla và Aralia Hiepiana có hoạt tính gây độc tế bào ung thư đáng kể. Việc phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ hai loài này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu khoa học mà còn có thể ứng dụng trong phát triển thuốc. Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để khai thác tiềm năng của các hợp chất này trong y học.

5.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Đề xuất nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc thử nghiệm các hợp chất phân lập trên các mô hình động vật để đánh giá hiệu quả và độ an toàn. Ngoài ra, cần nghiên cứu thêm về cơ chế hoạt động của các hợp chất này trong việc ức chế tế bào ung thư, từ đó phát triển các sản phẩm dược liệu hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Đề tài "Nghiên cứu hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai loài Aralia dasyphylla và Aralia hiepiana ở Tây Nguyên" do nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thu Hiền thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hữu Toàn Phan và GS. Nguyễn Mạnh Cường tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, bảo vệ năm 2023 tại Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, thuộc chuyên ngành Hóa học các Hợp chất thiên nhiên (mã số 9 44 01 17). Nghiên cứu được hỗ trợ kinh phí từ đề tài VAST04.02/17-18 và đề tài TN18/C09 thuộc Chương trình Khoa học và Công nghệ phục vụ phát triển kinh tế - xã hội Tây Nguyên trong liên kết vùng và hội nhập quốc tế (Mã số: KHCN-TN/16-20).

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, tác giả chỉ ra rằng xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng và trị bệnh trở nên phổ biến trên thế giới trong hơn hai thập kỷ gần đây, với ước tính hơn 70% dân số toàn cầu vẫn sử dụng thuốc từ dược liệu trong chăm sóc sức khỏe ban đầu. Việt Nam sở hữu hệ thực vật phong phú, trong đó chi Aralia (họ Nhân sâm - Araliaceae) bao gồm nhiều loài cây thuốc có giá trị. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới mới chỉ tập trung vào khoảng 15 trên tổng số 79 loài của chi này. Tại Việt Nam, qua quá trình điều tra, sàng lọc nguồn tài nguyên dược liệu tỉnh Lâm Đồng theo định hướng hoạt tính sinh học, tác giả phát hiện cao chiết methanol của lá loài Aralia dasyphylla Miq. có hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh và cao chiết methanol của lá loài Aralia hiepiana J.Wen & Lowry có hoạt tính kháng khuẩn. Dù vậy, dữ liệu công bố về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của hai loài này còn rất hạn chế, đặc biệt chưa từng có nghiên cứu nào được thực hiện trên bộ phận lá của cả hai loài.

Mục tiêu nghiên cứu tổng quát của luận án là tìm hiểu thành phần hóa học và thử nghiệm một số hoạt tính sinh học nhằm phát hiện các hợp chất tiềm năng, từ đó làm cơ sở cho việc xây dựng kế hoạch bảo tồn, phát triển và nâng cao giá trị đối với hai loài thực vật này tại Lâm Đồng. Để thực hiện mục tiêu trên, luận án xác lập ba nhiệm vụ cụ thể được đánh số như sau:

1. Phân lập các hợp chất từ lá cây Aralia dasyphylla và Aralia hiepiana.
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
3. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số hợp chất được phân lập.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài được giới hạn cụ thể:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá của hai loài thực vật Aralia dasyphylla Miq. (tên tiếng Việt: Cuồng lá nhám, Thông mộc lá nhám) và Aralia hiepiana J.Wen & Lowry (tên tiếng Việt: Cuồng Hiệp) thuộc chi Aralia, họ Nhân sâm (Araliaceae).
• Phạm vi không gian: Mẫu thực vật được điều tra và thu hái tại khu vực vùng núi Tây Nguyên, cụ thể là địa bàn tỉnh Lâm Đồng (loài A. dasyphylla sinh trưởng tại khu vực dãy núi Langbiang, huyện Lạc Dương).
• Phạm vi thời gian: Các thực nghiệm chiết xuất, phân lập, đo phổ cấu trúc, khảo sát sinh học và mô phỏng điện toán được hoàn thành trước thời điểm bảo vệ vào tháng 02 năm 2023.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Theo cơ sở dữ liệu The Plant List (truy cập tháng 6 năm 2022), chi Aralia có 79 loài được công nhận tên khoa học, phân bố chủ yếu tại châu Á và châu Mỹ. Tại Việt Nam, thống kê của Nguyễn Tiến Bân năm 2003 ghi nhận khoảng 15 loài và 6 thứ phân bố rải rác từ Bắc vào Nam, chủ yếu ở các vùng núi cao như Lào Cai, Lạng Sơn, Yên Bái, Hòa Bình, Khánh Hòa, Đà Nẵng, Đắk Lắk và Lâm Đồng.

TT	Tên khoa học	Tên tiếng Việt	Địa bàn phân bố tại Việt Nam
1	Aralia armata (Wall. ex G.Don) Seem.*	Đơn châu chấu, Cây cuồng, Đinh lăng gai	Lào Cai, Hà Giang, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Hà Nội, Hòa Bình, Ninh Bình, Nghệ An, Kon Tum, Gia Lai, Lâm Đồng
1a	Aralia armata var. pubescens Ha	Cuồng lông	Hòa Bình
2	Aralia caesia Hand.-Mazz.	Cuồng Sa Pa	Lào Cai
3	Aralia chinensis L.*	Thông mộc, Đinh lăng tàu, Thổ đương quy, Cuồng ít gai	Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Kon Tum, Đắk Lắk, Lạng Sơn, Yên Bái, Lâm Đồng
3a	Aralia chinensis var. dasyphylloides Hand.-Mazz.	Cuồng lá chụm	Yên Bái, Cao Bằng, Lạng Sơn
4	Aralia cordata Thunb.*	Cửu nhân độc hoạt, Thổ đương quy	Lào Cai, Hà Giang
5	Aralia dasyphylla Miq.*	Cuồng lá nhám, Thông mộc lá nhám	Lào Cai, Lạng Sơn, Gia Lai, Lâm Đồng
6	Aralia debilis J.Wen	Thông mộc mềm, Cuồng thanh lịch	Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng
7	Aralia foliolosa Seem. ex C.B. Clarke	Cuồng nhiều lá	Hà Giang, Khánh Hòa, Lâm Đồng
7a	Aralia foliolosa var. multipinnata C.B. Clarke	Cuồng nhiều lá	Khánh Hòa, Lâm Đồng
8	Aralia gigantea J.Wen	Cuồng Tạo, Cuồng Nguyễn Tạo	Vĩnh Phúc, Nghệ An
9	Aralia planchoniana Hance	Cuồng planchon	Hà Giang, Hòa Bình
10	Aralia scandens (Blume) J.Wen	Cuồng trườn	Bắc Kạn, Thái Nguyên
11	Aralia searelliana Turrill	Cuồng lông hoe, Pặc thông, Cuồng searell	Lạng Sơn, Hà Giang, Tuyên Quang, Lào Cai, Lai Châu
12	Aralia spinifolia Merr.*	Cuồng lá đầy gai	Lào Cai, Đắk Lắk, Hà Giang, Cao Bằng
13	Aralia thomsonii Seem. ex C.B. Clarke	Cuồng thomson	Lào Cai, Phú Thọ, Đắk Lắk, Kon Tum, Gia Lai, Ninh Bình, Lâm Đồng
13a	Aralia thomsonii var. brevifolia	Cuồng trung gian	Hòa Bình
13b	Aralia thomsonii var. petiolulata	Cuồng cuống dài	Yên Bái, Ninh Bình
14	Aralia vietnamensis Ha	Cuồng Đà Nẵng	Quảng Nam
14a	Aralia vietnamensis var. pubescens	Cuồng lông	Hà Giang, Lào Cai
15	Aralia hypoglauca	Pặc thông sét, Cuồng Việt Nam	Sơn La, Hà Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, Ninh Bình, Lâm Đồng
16	Aralia hiepiana J.Wen & Lowry	Cuồng Hiệp	Lâm Đồng

(Dấu * đánh dấu các loài đã có nghiên cứu hóa học trước thời điểm tổng quan).

Về mặt kinh nghiệm bản địa, tác giả điểm lại các nghiên cứu dân tộc học: tại Việt Nam, lá và rễ A. armata dùng trị rắn cắn, viêm họng, viêm amidan, viêm gan cấp, sốt rét, viêm thận; thân rễ và vỏ cây A. chinensis ngâm rượu chữa đau thần kinh, dạ dày, tê thấp, đái tháo đường; vỏ rễ A. dasyphylla trị đau nhức xương khớp; cây A. thomsonii sắc uống chữa bệnh dị ứng, đái đường. Ở Trung Quốc và Hàn Quốc, rễ các loài A. elata, A. taibaiensis, A. cordata, A. continentalis được dùng phổ biến để trị phong thấp, đau thắt lưng, tiểu đường và làm thuốc bổ.

Về các công trình nghiên cứu hóa học, tác giả điểm lại hàng loạt công bố giai đoạn 1970–2022:

• Triterpene saponin: Là nhóm chất chủ đạo nhất của chi Aralia, được Sun và cs, Miyase và cs, Sakai và cs, Satoh và cs xác định với ba khung aglycone chính là oleanane (phổ biến nhất là olean-12-en và olean-11,13-dien gắn đường tại C-3 và C-28 như elatoside A–F, araliasaponin I–XVIII, chikusetsusaponin IVa, tarasaponin I–VII, congmuyenoside II–IV, congmujingnoside B–G, taibaienoside I–VIII, stipuleanoside R1–R2), ursane (chỉ ghi nhận 6 hợp chất từ rễ loài A. decaisneana) và dammarane (phân lập từ vỏ rễ A. elata gồm 20(S)-protopanaxadiol, 20(S)-protopanaxtriol, ginsenoside Rb2, ginsenoside Re).
• Diterpene: Phân lập từ phân đoạn phân cực thấp đến trung bình của rễ các loài A. cordata, A. continentalis, A. dumetorum, A. racemosa, mang cấu trúc dẫn xuất khung pimarane và kaurane (acid continentalic, acid kaurenoic, acid pimaric, dumetoranes A–B, melanocane A–B).
• Các hợp chất khác: Sterol (β-sitosterol, stigmasterol, daucosterol, ergosterol endoperoxide); Lignan (Hsiao và cs năm 1995 phân lập 11 dẫn xuất từ thân gỗ A. bipinnata; Li và cs năm 2017 từ rễ A. echinocaulis; Lee và cs năm 2021 từ rễ A. continentalis); Flavonoid (Hong và cs năm 2011 phân lập 2 dẫn xuất quercetin từ lá A. elata); Polyacetylene (Dang và cs năm 2005, Seo và cs năm 2007, Li và cs năm 2012, Jiang và cs năm 2019 với các hợp chất falcarindiol, dehydrofalcarindiol, panaxydol, heptadeca-8,16-dien-4,6-diyn-3,10-diol); Glycolipid (aralia cerebroside, urtica ceramides); Polysaccharide (AEP-1, AERP, ACP, AELPB5).

Về hoạt tính sinh học, luận án tổng hợp các công bố về:

• Kháng viêm: Nhiem và cs (2011) chứng minh stipuleanoside R2 và kalopanax saponin F từ vỏ A. elata giảm hoạt hóa NF-κB cảm ứng bởi TNF-α trên tế bào HepG2 với IC50 lần lượt là 4,1 và 9,5 μM; Dang và cs (2005) cùng Lee và cs (2006) ghi nhận các hợp chất diterpene và polyacetylene từ rễ A. cordata ức chế enzyme COX-1 và COX-2; Kang và cs (2008), Choi và cs (2011) báo cáo acid continentalic và acid kaurenoic từ A. continentalis ức chế biểu hiện iNOS, COX-2 và NO trên đại thực bào RAW246.7.
• Gây độc tế bào ung thư: Yen và cs (2020) nghiên cứu saponin từ lá A. armata ghi nhận narcissiflorin thể hiện hoạt tính trên dòng HT29 và A549 với IC50 khoảng 2,01–2,02 mM; Lee và cs (2006) ghi nhận dẫn xuất ergostane từ A. cordata gây độc tế bào L1210 (IC50 1,7 μM); Cheng và cs (2011) công bố araliadiol ức chế dòng tế bào MCF-7 (IC50 6,41 μg/mL); Zhang và cs (2013) ghi nhận saponin từ A. elata gây độc trên dòng HL-60, A549, DU145; các nghiên cứu của Kwon và cs, Oh và cs khảo sát tác động của acid continentalic và dẫn xuất diterpenoid trên tế bào ung thư tuyến tiền liệt LNCaP và tế bào HeLa.
• Hoạt tính khác: Chống tiểu đường qua ức chế α-glucosidase và hạ đường huyết in vivo (A. cachemirica, A. taibaiensis, A. elata); bảo vệ tim mạch, tế bào gan và thần kinh; hạ lipid máu; chống oxy hóa; kháng khuẩn và kháng vi sinh vật (acid continentalic ức chế Staphylococcus aureus kháng methicillin với MIC 8–16 μg/mL; acid kaurenoic ức chế Streptococcus mutans với MIC 2–4 μg/mL).

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án giải quyết: Mặc dù chi Aralia có nhiều nghiên cứu sâu rộng, hầu hết các công trình quốc tế và trong nước chỉ tập trung vào rễ và vỏ rễ của một số loài như A. elata, A. cordata, A. continentalis. Hai loài A. dasyphylla và A. hiepiana tại vùng núi Langbiang (Lâm Đồng) hoàn toàn chưa có công trình nào nghiên cứu cấu trúc hóa học của bộ phận lá cũng như khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư định hướng sinh học.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết hóa học các hợp chất thiên nhiên thực vật và tiếp cận theo phương pháp phân lập định hướng hoạt tính sinh học (bioassay-guided fractionation). Khung nghiên cứu bao gồm việc phối hợp các phương pháp chiết xuất, sắc ký phân tách, xác định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ, đánh giá độc tính tế bào in vitro và mô phỏng docking phân tử in silico.

Quy trình và phương pháp thực tế được triển khai như sau:

1. Chiết xuất và tạo cao phân đoạn: Mẫu lá khô xay nhỏ của loài A. dasyphylla và A. hiepiana được chiết ngâm kiệt nhiều lần bằng dung môi methanol (MeOH) ở nhiệt độ phòng, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết tổng MeOH. Cao chiết tổng được phân tán vào nước cất và chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, chloroform ($CHCl_3$) và ethyl acetate (EtOAc), thu được các cao phân đoạn tương ứng và phân đoạn dịch nước còn lại.
2. Phương pháp sắc ký phân lập:
   • Sắc ký cột (Column Chromatography - CC): Sử dụng chất hấp phụ pha thường là silica gel (kích thước hạt 0,040–0,063 mm và 0,063–0,200 mm) và silica gel pha đảo RP-18 (Reserve phase C18). Hệ dung môi rửa giải thay đổi tỷ lệ gradient tùy theo phân đoạn (n-hexane - acetone, dichloromethane - methanol, chloroform - methanol, methanol - nước).
   • Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel $60\text{ }F_{254}$ và RP-18 $F_{254}S$ để kiểm tra độ tinh khiết và gộp phân đoạn; phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử hiện màu dung dịch $H_2SO_4$ 10% trong cồn hơ nóng.
   • Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC): Sử dụng cột bán điều chế pha đảo RP-18 với detector UV để tinh chế các hợp chất có độ phân cực gần nhau.
3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
   • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker Avance 500 MHz (tần số 500 MHz đối với proton $^1H\text{ NMR}$ và 125 MHz đối với carbon $^{13}C\text{ NMR}$). Các kỹ thuật phổ 1D gồm $^1H\text{ NMR}$, $^{13}C\text{ NMR}$, DEPT-90 và DEPT-135; các kỹ thuật phổ 2D bao gồm phổ tương tác đồng hạt nhân $^1H-^1H\text{ COSY}$, tương tác dị hạt nhân khoảng cách ngắn HSQC, tương tác dị hạt nhân tầm xa HMBC và phổ tương tác không gian NOESY. Dung môi đo phổ gồm $CDCl_3$, $CD_3OD$, Pyridine-$d_5$ với chất chuẩn nội là tetramethylsilane (TMS).
   • Phổ khối lượng: Gồm phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử phân giải thấp ESI-MS và phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử phân giải cao HR-ESI-MS / HR-TOF-MS để xác định khối lượng phân tử chính xác và công thức phân tử.
   • Thủy phân hóa học xác định gốc đường: Áp dụng phương pháp thủy phân acid để giải phóng các gốc monosaccharide tự do từ saponin, sau đó so sánh sắc ký bản mỏng hoặc đo độ quay cực để định danh thành phần đường.
4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học: Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro bằng phương pháp MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Nguyên lý dựa trên sự khử muối tetrazolium màu vàng thành tinh thể formazan màu tím bởi enzyme dehydrogenase của ty thể trong các tế bào còn sống. Mật độ quang (OD) được đo trên máy đọc ELISA ở bước sóng 540 nm để tính toán tỷ lệ % tế bào sống sót và nồng độ ức chế 50% phát triển tế bào ($IC_{50}$). Các dòng tế bào ung thư người được thử nghiệm gồm ung thư phổi (A549, LU-1), ung thư gan (HepG2, HuH7), ung thư vú (MCF-7), ung thư vòm họng (KB), ung thư đại trực tràng (HT-29, HCT-15), ung thư biểu mô cổ tử cung (HeLa), ung thư biểu bì (HaCaT), ung thư máu (HL-60), ung thư sắc tố (SK-MEL-2), ung thư buồng trứng (SK-OV-3), ung thư mô liên kết (RD), ung thư thần kinh (XF498).
5. Phương pháp mô phỏng điện toán (In silico): Thực hiện docking phân tử (molecular docking) giữa các hợp chất phân lập có hoạt tính với protein vận chuyển glucose GLUT1 (sử dụng phối tử tham chiếu 5RE). Đánh giá năng lượng tự do liên kết ($\Delta G$), các vùng tương tác acid amin, đồng thời dự đoán thông số dược động học ADMET và kiểm tra sự tuân thủ quy tắc 5 của Lipinski.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày cơ sở khoa học, tính cấp thiết của việc nghiên cứu nguồn dược liệu chi Aralia tại Tây Nguyên, tổng quan sơ lược kết quả sàng lọc sơ bộ độc tính tế bào của lá cây A. dasyphylla và hoạt tính kháng khuẩn của lá cây A. hiepiana, xác định mục tiêu tổng thể và 3 nhiệm vụ trọng tâm của luận án.

Tổng quan tài liệu

Chương này gồm hai phần chính:

• Phần thứ nhất giới thiệu tổng quan về chi Aralia: Đặc điểm hình thái thực vật học (cây gỗ nhỏ, lá kép lông chim, cụm hoa tán/chùy, quả mọng 5 cạnh); phân bố địa lý trên thế giới và tại Việt Nam (thống kê chi tiết 16 loài và các thứ ghi nhận tại Việt Nam); tri thức y học cổ truyền về việc sử dụng các loài cuồng; tổng quan hệ thống thành phần hóa học của chi gồm 156 triterpene saponin khung oleanane, 6 saponin khung ursane, 7 saponin khung dammarane, 8 triterpene tự do, 43 hợp chất diterpene, 5 hợp chất sterol, 16 hợp chất lignan, 2 flavonoid, 19 hợp chất phenolic đơn giản, 10 dẫn xuất polyacetylene, 6 alkaloid, 2 cerebroside/ceramide và 7 polysaccharide; tổng hợp các kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học đã công bố (kháng viêm, gây độc tế bào ung thư, hạ đường huyết, giảm đau, bảo vệ gan/tim mạch/thần kinh, hạ lipid máu, chống oxy hóa, kháng khuẩn).
• Phần thứ hai mô tả đặc điểm phân loại học, đồng danh, hình thái thực vật, vùng phân bố sinh thái của hai loài đối tượng nghiên cứu: loài Aralia dasyphylla Miq. và loài Aralia hiepiana J.Wen & Lowry tại Lâm Đồng.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn nguyên liệu lá cây thu thập tại Lâm Đồng, quy trình chiết ngấm kiệt bằng methanol và sơ đồ phân tách thành 4 phân đoạn dung môi (n-hexane, chloroform, ethyl acetate, nước) cho cả hai loài A. dasyphylla và A. hiepiana. Tác giả trình bày thông số chi tiết của các thiết bị phân tích (máy quang phổ NMR 500 MHz, khối phổ HR-ESI-MS), điều kiện sắc ký cột (CC) và HPLC pha đảo, phương pháp thủy phân acid xác định gốc đường, quy trình chuẩn thử nghiệm độc tính tế bào MTT trên các dòng tế bào ung thư người và quy trình tính toán docking phân tử với thụ thể GLUT1 cùng các công cụ dự đoán ADMET/Lipinski.

Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được đối với từng loài:

• Kết quả nghiên cứu loài Aralia dasyphylla:
  • Phân lập và xác định cấu trúc 18 hợp chất (ký hiệu từ AD1 đến AD18). Các hợp chất được cấu tạo từ các khung triterpene saponin dẫn xuất của oleanolic acid, hederagenin gắn các chuỗi đường khác nhau, và các hợp chất phenolic/lignan đặc thù. Trong đó, AD10 và AD17 được xác định đầy đủ bằng hệ phổ 1D và 2D NMR ($^1H$, $^{13}C$, DEPT, HSQC, HMBC) cùng HR-ESI-MS/HR-TOF-MS; AD17 được phân tích so sánh cấu trúc với burseneolignan.
  • Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Đánh giá trên mẫu cao chiết tổng MeOH và các cao phân đoạn (n-hexane, $CHCl_3$, EtOAc, nước). Kết quả cho thấy các phân đoạn thể hiện mức độ ức chế khác nhau trên các dòng tế bào thử nghiệm, từ đó xác định giá trị $IC_{50}$ của các cao chiết có hoạt tính. Đối với các hợp chất tinh khiết phân lập, tác giả xác định tỷ lệ % tế bào sống sót và đo giá trị $IC_{50}$ của các chất có hoạt tính ức chế rõ rệt.
  • Nghiên cứu in silico: Kết quả docking phân tử cho thấy các hợp chất triterpene saponin tiêu biểu như AD2 và AD7 có ái lực liên kết mạnh với protein đích GLUT1, so sánh năng lượng liên kết và các liên kết hydrogen/kỵ nước tương ứng với chất đối chứng chuẩn 5RE. Kết quả đánh giá quy tắc 5 Lipinski và các chỉ số ADMET cung cấp thông tin về khả năng hấp thu qua đường tiêu hóa, tính thấm màng và độc tính tiềm tàng của các triterpene.
• Kết quả nghiên cứu loài Aralia hiepiana:
  • Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 14 hợp chất (ký hiệu từ AH1 đến AH14). Cấu trúc của các hợp chất được sáng tỏ dựa trên phân tích số liệu phổ hồng ngoại, phổ khối và cộng hưởng từ hạt nhân. Trong đó, hợp chất saponin AH4 được phân tích chi tiết dữ kiện phổ $^1H\text{ NMR}$ và $^{13}C\text{ NMR}$ trong dung môi Pyridine-$d_5$, kết hợp phổ HSQC, HMBC và HR-ESI-MS, đồng thời tiến hành so sánh đối chiếu số liệu phổ với các tài liệu chuẩn.
  • Thử nghiệm hoạt tính sinh học: Cao chiết tổng MeOH của lá loài A. hiepiana và các hợp chất phân lập đơn lẻ được khảo sát độc tính tế bào ung thư in vitro, từ đó xác định các mẫu có hoạt tính ức chế và tính toán giá trị $IC_{50}$.
• Tổng hợp các kết quả nghiên cứu: Luận án lập bảng thống kê toàn diện danh mục 32 hợp chất phân lập được từ hai loài thực vật (A. dasyphylla và A. hiepiana) cùng các số liệu hoạt tính sinh học tương ứng.

Kết luận và kiến nghị

Tóm lược các phát hiện cốt lõi về mặt hóa học và hoạt tính sinh học đạt được trong khuôn khổ luận án, đồng thời đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển nguồn dược liệu.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã tự công bố các đóng góp mới về mặt khoa học lý luận và giá trị thực tiễn như sau:

Về mặt lý luận và khoa học tự nhiên:

• Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu có hệ thống và toàn diện về thành phần hóa học của bộ phận lá hai loài Aralia dasyphylla Miq. và Aralia hiepiana J.Wen & Lowry thuộc họ Nhân sâm thu hái tại Tây Nguyên.
• Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của tổng cộng 32 hợp chất từ hai loài nghiên cứu:
  • Từ lá loài Aralia dasyphylla: Phân lập và xác định cấu trúc của 18 hợp chất (AD1 đến AD18), bao gồm các triterpene saponin và hợp chất nhóm lignan/phenolic (trong đó có AD17 liên quan đến khung burseneolignan).
  • Từ lá loài Aralia hiepiana: Phân lập và xác định cấu trúc của 14 hợp chất (AH1 đến AH14), bao gồm các hợp chất saponin triterpenoid tiêu biểu như AH4.
• Đóng góp bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1H\text{ NMR}$, $^{13}C\text{ NMR}$, 2D NMR) và phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS hoàn chỉnh cho các hợp chất phân lập, làm phong phú thêm cơ sở dữ liệu hóa thực vật học của chi Aralia tại Việt Nam và trên thế giới.

Về mặt thực tiễn và hoạt tính sinh học:

• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm sàng lọc độc tính tế bào in vitro của cao chiết tổng, các cao phân đoạn và các hợp chất sạch tinh chế từ hai loài trên nhiều dòng tế bào ung thư người (như ung thư phổi A549, ung thư gan HepG2, ung thư vú MCF-7, ung thư biểu mô cổ tử cung HeLa, ung thư đại tràng HT-29).
• Xác định được giá trị nồng độ ức chế 50% phát triển tế bào ($IC_{50}$) của các cao chiết và các hợp chất phân lập có hoạt tính mạnh.
• Làm sáng tỏ tương tác ở mức độ phân tử giữa các hợp chất có hoạt tính (tiêu biểu như AD2 và AD7) với thụ thể protein vận chuyển glucose GLUT1 thông qua mô phỏng docking phân tử, đồng thời cung cấp các dự đoán về tính chất ADMET và sự phù hợp theo quy tắc 5 của Lipinski.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất của tác giả:

• Cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động gây độc tế bào ung thư ở mức độ phân tử và con đường truyền tín hiệu nội bào của các hợp chất có hoạt tính mạnh nhất.
• Tiến hành các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học và độc tính cấp, độc tính bán trường diễn trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).
• Đề xuất chính quyền địa phương và các cơ quan quản lý tại tỉnh Lâm Đồng có biện pháp quy hoạch, bảo tồn nguồn gen tự nhiên của hai loài Aralia dasyphylla và Aralia hiepiana tại dãy núi Langbiang do trữ lượng của chúng trong tự nhiên còn hạn chế và mọc rải rác.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Về mặt hạn chế:

• Nghiên cứu chỉ tập trung khảo sát trên bộ phận lá của hai loài thực vật, chưa mở rộng đánh giá thành phần hóa học của các bộ phận khác như thân, vỏ thân hay rễ cây.
• Địa bàn thu mẫu thực vật chỉ giới hạn tại tỉnh Lâm Đồng (khu vực dãy núi Langbiang, Lạc Dương), chưa khảo sát so sánh biến thiên hóa thực vật của loài A. dasyphylla tại các vùng phân bố khác ở miền Bắc Việt Nam (như Lạng Sơn, Lào Cai).
• Khảo sát hoạt tính sinh học dừng lại ở mức thử nghiệm in vitro trên các dòng tế bào ung thư nuôi cấy và mô phỏng in silico docking phân tử, chưa tiến hành kiểm chứng hiệu quả kháng khối u và tính an toàn trên mô hình sinh vật sống in vivo.

Về hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Khảo sát thành phần hóa học của các bộ phận còn lại (vỏ, rễ) của cây A. dasyphylla và A. hiepiana để tận dụng toàn diện nguồn sinh khối.
• Thực hiện các thử nghiệm in vivo về hoạt tính chống ung thư và nghiên cứu cơ chế apoptosis, chu trình tế bào của các hợp chất tiềm năng.
• Nghiên cứu các biện pháp nhân giống, gieo trồng thử nghiệm nhằm bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên dược liệu quý bản địa tại khu vực Tây Nguyên.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo chuyên môn phục vụ cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa Dược và Dược học: Tài liệu cung cấp quy trình chiết xuất phân đoạn, kỹ thuật tách sắc ký cột kết hợp HPLC và phương pháp phân tích phổ học hiện đại (1D, 2D NMR, HR-ESI-MS) để giải mã cấu trúc phân tử các hợp chất triterpene saponin phức tạp gắn nhiều mạch đường.
• Các nhà nghiên cứu sàng lọc hoạt chất sinh học: Hệ thống dữ liệu sàng lọc độc tính tế bào ung thư in vitro bằng phương pháp MTT và dữ liệu mô phỏng docking phân tử với protein vận chuyển đường GLUT1 là tài liệu tham khảo trong nghiên cứu cấu trúc - hoạt tính (SAR).
• Các nhà thực vật học, cán bộ quản lý tài nguyên và hoạch định chính sách tại Lâm Đồng và Tây Nguyên: Luận án cung cấp dẫn liệu về phân bố sinh thái, đặc điểm thực vật và giá trị dược liệu của các loài thuộc chi Aralia, làm cơ sở xây dựng kế hoạch bảo tồn đa dạng sinh học và phát triển kinh tế dược liệu địa phương.

Các phần đáng tham khảo nhất trong luận án gồm: bảng tổng quan các hợp chất triterpene saponin chi Aralia (Chương 1); quy trình phân lập chi tiết phân đoạn saponin và lignan (Chương 2); bộ dữ kiện phổ NMR và HR-ESI-MS cùng các phân tích tương tác HMBC/COSY của hợp chất AD10, AD17 và AH4 (Chương 3).

Câu hỏi thường gặp

**1. Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc được bao nhiêu hợp chất từ hai loài thực vật nghiên

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong vòng hai thập kỷ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng và trị bệnh trở nên phổ biến. Phong trào quay trở về với thiên nhiên do nhận thức có sự gần gũi về mặt sinh học của dược liệu thiên nhiên và con người, độ an toàn đã được kiểm chứng qua lịch sử sử dụng lâu dài. Theo ước tính hơn 70% dân số toàn cầu vẫn sử dụng thuốc từ dược liệu trong chăm sóc sức khỏe ban đầu tại cộng đồng. Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, có hệ thực vật phong phú, đa dạng và việc nghiên cứu phát triển các sản phẩm dược liệu và mỹ phẩm thiên nhiên ở nước ta hiện đang rất được quan tâm.

Trong quá trình điều tra, sàng lọc nguồn tài nguyên dược liệu tỉnh Lâm Đồng theo định hướng hoạt tính sinh học nhằm phát triển các loài dược liệu có giá trị cao, chúng tôi phát hiện cao chiết methanol của lá loài Aralia dasyphylla Miq. có hoạt tính gây độc tế bào mạnh và cao chiết methanol của lá loài Aralia hiepiana J.Wen & Lowry có hoạt tính kháng khuẩn. Hai loài thực vật này thuộc chi Aralia, họ Nhân sâm (Araliaceae), là một họ thực vật bao gồm nhiều loại cây thuộc quý. Qua tổng hợp tài liệu cho thấy các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học trên hai loài này còn rất hạn chế, đặc biệt là chưa có bất cứ nghiên cứu nào về thành phần hóa học của lá hai loài này.

Vì vậy, tôi chọn đây là hai đối tượng để thực hiện đề tài “Nghiên cứu hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai loài Aralia dasyphylla và Aralia hiepiana ở Tây Nguyên” với mục tiêu tìm hiểu thành phần hóa học và thử nghiệm một số hoạt tính sinh học nhằm phát hiện các hợp chất tiềm năng, từ đó làm cơ sở cho việc xây dựng kế hoạch bảo tồn, phát triển và nâng cao giá trị đối với hai loài thực vật này tại Lâm Đồng. Theo hướng nghiên cứu này, luận án có các nhiệm vụ sau: - Phân lập các hợp chất từ lá cây A. - Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được. - Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số hợp chất được phân lập.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về chi Aralia 1. Đặc điểm thực vật, phân bố Chi Aralia hay còn được gọi là chi Cuồng, Đơn châu chấu, Thông mộc, thuộc họ Nhân sâm, đa phần là những cây gỗ nhỏ hay cây bụi, có gai móc hoặc không gai, cây có hoa đực hoặc lưỡng tính. Lá kép 1-3 lần lông chim, lá chét 3-20, nguyên hoặc có răng, răng nhỏ, răng tròn hoặc lượn sóng, lá kèm hợp với gốc cuống lá chét.

Cụm hoa tận cùng hay nách lá, hình chùy, ngù hoặc tán, thường hợp thành tán, đầu hoặc bông, đôi khi là tán đơn độc. Cuống hoa có khớp dưới bầu. Tràng 5, xếp lớp. Bầu 5 (hoặc 6) lá noãn, thường tiêu giảm còn 3; vòi nhụy 5, rời hoặc hợp ở gốc.

Quả mọng, gần hình cầu, đôi khi 3-5 góc. Hạt dẹt một bên. Phôi nhũ nguyên [1]. Theo cơ sở dữ liệu The Plant List (http://www.org/, truy cập tháng 6 năm 2022), chi Aralia có 79 loài được chấp nhận tên khoa học, phân bố chủ yếu ở châu Mỹ và châu Á.

Ở nước ta, theo tác giả Nguyễn Tiến Bân thống kê năm 2003, Việt Nam có khoảng 15 loài và 6 thứ phân bố khá rộng từ Bắc đến Nam chủ yếu ở các vùng núi cao như Lào Cai, Lạng Sơn, Yên Bái, Hòa Bình, Khánh Hòa, Đà Nẵng, Đắk Lắk và Lâm Đồng [2].