MỞ ĐẦU Metagenomics là một nghành nghiên cứu mới, độc đáo và có thể áp dụng rộng rãi trong lĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học. Công nghệ metagenomics kết hợp với kỹ thuật gen, kỹ thuật protein sẽ cung cấp các hiểu biết sâu sắc về các vấn đề trong tiến hóa gen hoặc thông tin về các sinh vật mà hiện nay vẫn đang là bí ẩn vì chúng khó có thể đƣợc nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm. Môi trƣờng đất rất phức tạp khi nghiên cứu số lƣơng và sự đa dạng các loài trong hệ vi sinh vật. Dựa trên việc phân lập DNA từ một vài mẫu đất khác nhau, số lƣợng các sinh vật nhân sơ đƣợc xác định từ khoảng 2000 đến 18000 bộ gen trên một gram đất.
Số lƣợng này là rất thấp bởi vì các bộ gen của các loài hiếm và chƣa đƣợc biết đến đã bị loại ra trong quá trình phân tích. Do đó, số lƣợng và sự đa dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1 gram đất phải lớn hơn rất nhiều. Trong khi đó, phƣơng pháp nuôi cấy trực tiếp hoặc không trực tiếp để khám phá và khai thác sự đa dạng của hệ vi sinh vật có trong đất. Nuôi cấy và phân lập DNA của vi sinh vật là phƣơng pháp phổ biến nhƣng chỉ đƣợc từ 0,1 đến 1% vi sinh vật là có thể đƣợc nuôi cấy sử dụng các phƣơng pháp tiêu chuẩn, vì vậy sự đa dạng của hệ vi sinh vật vẫn chƣa đƣợc khám phá hết.
Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm họ Trầm, bộ Bông là lớp Cây gỗ lớn thuộc ngành Mộc Lan. Chi Trầm có tất cả 25 loài khác nhau phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á và miền Nam Trung Quốc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 3 c Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường Tại Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đới thƣờng xanh, rừng ẩm nguyên sinh. Trầm hƣơng đƣợc sử dụng để chữa một số bệnh hiểm nghèo, có tác dụng kháng khuẩn, có tính kháng sinh.
Giá trị quan trọng nhất của cây dó bầu là nguồn vật liệu sinh trầm hƣơng. Trầm hƣơng đƣợc coi là một loại lâm sản ngoài gỗ có giá trị thƣơng mại quốc tế nhất. Trên thế giới, Trầm hƣơng đƣợc sử dụng để chƣng cất tinh dầu trầm, một chất quan trọng cho ngành công nghiệp mỹ phẩm cao cấp. Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, đƣợc dùng trong công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loại nƣớc hoa cao cấp, giá trị.
Hệ vi sinh vật vùng rễ đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trƣởng và phát triển của cây dó bầu. Tuy nhiên, vai trò của chúng chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ cũng nhƣ chƣa có một nghiên cứu nào về sự tác động của hệ vi sinh vật đến khả năng tạo trầm. Vì vậy, nghiên cứu này tập trung vào sử dụng kỹ thuật mới metagenomic để nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định đƣợc thành phần giới, họ, chi, loài của các mẫu nghiên cứu - So sánh sự giống và khác nhau của các mẫu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu - Phân lập DNA tổng số từ đất của các mẫu nghiên cứu - Gắn adapter với mỗi mẫu nghiên cứu - Xác định trình tự 16S của các mẫu nghiên cứu - Xác định độ đa dạng của các mẫu nghiên cứu - Xác định thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu - So sánh thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 4 c Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cây dó bầu và khả năng tạo trầm 1. Nguồn gốc, phân bố Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm (Aquilaria), họ Trầm (Thymelaeaceae), bộ Bông (Malvales), lớp Cây gỗ lớn thuộc ngành Mộc Lan.
Chi Trầm có tất cả 25 loài khác nhau, tuy nhiên chỉ có 15 loài có khả năng cho trầm hƣơng gồm: Aquilaria crassna; A.rugosa, trong đó loài A rugosa đƣợc Kiet và cộng sự phát hiện năm 2005 (Kiet et al. Chi Trầm phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á và miền Nam Trung Quốc. Tại Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đới thƣờng xanh, rừng ẩm nguyên sinh thuộc các tỉnh Tuyên Quang, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt là từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang và đảo Phú Quốc (Hình 1, Danh lục các loài thực vật Việt Nam). Trầm hƣơng phân bố tại Việt nam có 4 loài là: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 5 c Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường Trầm hƣơng (A.crassna Pierre ex Lecomte); dó baillon (A.
baillonii Pierre ex Lecomte), dó bana (A.) (Phạm Hoàng Hộ 1992) và dó quả nhăn (A. Kiet & Krbler) (Lê Công Kiệt et al. Trong đó, cây dó bầu A. crassna là loài đƣợc trồng phổ biến nhất vì khả năng loại trầm tốt nhất thế giới (Hoàng Cảnh 2006).
banaensae) và dó quả nhăn (A. rugosa) đều là đặc hữu có thể bắt gặp tại một vài địa điểm thuộc Quảng Trị, Thừa Thiên Huế và Quảng Nam. Trong kho đó, dó quả nhăn (A. rugosa) là loài mới đƣợc phát hiện tại Kon Tum.
Phân bố dó bầu tại Việt Nam Hiện nay, các cá thể trƣởng thành của trầm hƣơng cơ bản bị tuyệt diệt trong tự nhiên. Vùng trọng điểm gây trồng cây dó trầm hiện nay ở nƣớc ta là Bán Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, và Tây Nam Bộ. Trong đó, vùng Bắc Trung Bộ tập trung chủ yếu tại Hà Tĩnh,vùng Nam Trung Bộ tập trung chủ yếu tại Quảng Nam, vùng Tây Nguyên chủ yếu tập trung tại Kon Tum, Đông Nam Bộ tập trung chủ yếu tại Bình Phƣớc, Tây Nam Bộ tập trung chủ yếu tại Kiên Giang và An Giang. Giá trị kinh tế, dược liệu và sinh thái Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 6 c Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường Giá trị kinh tế: Giá trị quan trọng nhất của cây dó bầu là nguồn vật liệu sinh trầm hƣơng.
Trầm hƣơng đƣợc coi là một loại lâm sản ngoài gỗ có giá trị thƣơng mại quốc tế nhất. Trên thế giới, Trầm hƣơng đƣợc sử dụng để chƣng cất tinh dầu trầm, một chất quan trọng cho ngành công nghiệp mỹ phẩm cao cấp. Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, đƣợc dùng trong công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loại nƣớc hoa cao cấp, giá trị. Theo công ƣớc về buôn bán quốc tế những loài động thực vật hoang dã nguy cấp, khối lƣợng mua bán trầm hƣơng trên thị trƣờng thế giới thời kỳ 1995 – 1997 khoảng 1.
Giá mua bán Trầm hƣơng đƣợc tính theo kg tùy thuộc vào chất lƣợng. Giá bán Trầm tại thị trƣờng Dubai (Arabia Saudi) vào năm 1993 dao động từ 27 đô la Mỹ/kg (loại thấp nhất) đến 10.000 đô la Mỹ/kg (loại tốt nhất) (Barden et al. Giá trị dược liệu: Trong y học, trầm hƣơng còn đƣợc sử dụng để chữa một số bệnh hiểm nghèo, chữa các bệnh đau bụng, đau ngực, nôn mửa, hen suyển, lợi tiểu, giảm đau, trấn tĩnh, hạ sốt, cấm khẩu, thổ huyết, khó thở, kích dục… Trầm hƣơng có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt là với các loại khuẩn Mycobacterium tuberculosis và Shigella flexneri, có tính khánh sinh, tạo kháng thể mạnh (diệt khuẩn, làm lành vết thƣơng), có tác dụng chữa một số bệnh nhƣ bệnh về tim mạch (suy tim, đau ngực), bệnh về hô hấp (hen suyễn), bệnh về thần kinh (an thần, mất ngủ, giảm đau, trấn tĩnh….), bệnh về tiêu hoá (đau bụng, buồn nôn, tiêu chảy), bệnh về tiết niệu (bí tiểu tiện). Đặc biệt có thể dùng trầm hƣơng để chữa ung thƣ tuyến giáp.
Giá trị sinh thái: Đối với môi trƣờng sinh thái và phát triển bền vững, việc đƣa dó bầu (Aquilaria sp.) vào cơ cấu cây rừng với mục tiêu 5 triệu hecta rừng tại tỉnh Hà Tĩnh nói riêng và trong cả nƣớc nói chung đã góp phần thúc đẩy tăng độ che phủ của rừng, chống xói mòn đất và bảo vệ môi trƣờng. Cây gió bầu góp phần bảo tồn và phát triển loài cây đặc hữu, qúy hiếm, có giá trị về khoa học và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 7 c Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường kinh tế của nƣớc ta, đây còn là giải pháp phù hợp với quy luật sản xuất đi đôi với bảo vệ môi trƣờng, kết hợp lợi ích trƣớc mắt với lợi ích lâu dài, làm giàu trên cơ sở khai thác và tái tạo lợi thế đặc hữu, ƣu việt của tài nguyên quốc gia. Hơn nữa, cây dó bầu còn có ý nghĩa tạo công ăn việc làm cho ngƣời lao động, mở ra hƣớng phát triển kinh tế bền vững cho nông thôn, vùng sâu vùng xa (Thái Thành Lƣợm 2009). Khả năng sinh trầm của dó bầu Sự tạo trầm trong tự nhiên của cây dó bầu là sự biến đổi của các phần tử gỗ do tác động bệnh lý bởi vết nứt gãy, sự xâm nhập của các loài nấm…Có 3 giả thuyết tồn tại đến sự tạo trầm liên quan đến các tác nhân bệnh lý, thƣơng tích bệnh lý hoặc thƣơng tích không bệnh lý (Ng et al.
Kết quả của nghiên cứu không cung cấp đƣợc bằng chứng thuyết phục là tác nhân nào trong số 3 tác nhân trên tác động đến sự tạo trầm của cây. Ngoài ra, nghiên cứu của Oldfield et al. (1998) cho rằng quá trình tạo trầm có liên quan đến sự đáp ứng của cây với nấm. Hơn nữa, Heuveling và Phillips (1999) cho rằng nó liên quan đến đáp ứng với thƣơng tích.
Nghiên cứu cho rằng sự xâm nhiễm của nấm có thể làm tăng sự tạo trầm cũng nhƣ sự đáp ứng của tế bào chủ với vết sự phát triển của nấm xâm nhiễm. Dó bầu có thể đƣợc xâm nhiễm tự nhiên bởi một vài các loại nấm nhƣ: Aspergillus spp, Botryodyplodia spp, Diplodia spp, Fusarium bulbiferum, F. solani, Penicillium spp, and Pythium spp. Sự tƣơng tác giữa tế bào chủ với nấm hay các tác nhân khác để tạo thành trầm vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ.
Sự tƣơng tác này xảy ra một cách tự nhiên năm này sang năm khác. Căn cứ vào sự hóa nhựa nhiều hay ít mà có những sản phẩm nhƣ: Tóc, Trầm hƣơng và Kỳ nam. Thực tế cho thấy những cây dó bầu sau khi chết rục thì lƣợng Kỳ nam hoặc Trầm hƣơng thƣờng đƣợc phát hiện ở phần gốc rễ, nơi thƣờng tiếp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 8 c Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường xúc với hệ sinh vật đất.