Nghiên Cứu Phát Triển Hệ Thống Chuyển Gen Mới Phục Vụ Cải Biến Di Truyền Nấm Sợi Aspergillus

• Tác giả: Thái Hạnh Dung
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Văn Tuấn
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phát Triển Hệ Thống Chuyển Gen Mới Để Cải Biến Di Truyền Nấm Sợi Aspergillus
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Giới thiệu về chi Aspergillus
• 1.2. Đặc điểm phân loại
• 1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hóa
• 1.4. Di truyền học và hệ gen nấm
• 1.5. Vai trò ứng dụng trong công nghệ sinh học và công nghiệp
• 1.6. Đặc điểm hình thái
• 1.7. Sinh thái học và ý nghĩa kinh tế
• 1.8. Một số phương pháp chuyển gen phục vụ cải biến di truyền ở nấm sợi
• 1.8.1. Chuyển gen bằng xung điện
• 1.8.2. Chuyển gen bằng sóng xung kích
• 1.8.3. Chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast-mediated transformation, PMT)
• 1.8.4. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT)
• 1.9. Marker chọn lọc dùng trong chuyển gen
• 1.9.1. Marker chọn lọc là gen kháng thuốc
• 1.9.2. Marker chọn lọc là gen dinh dưỡng
• 1.10. Một số protein điều hoà quan trọng ở nấm sợi Aspergillus
• 1.11. Các chiến lược tăng cường sản xuất enzyme/protein ở A.
• 1.11.1. Tối ưu hóa cấu trúc biểu hiện gen
• 1.11.2. Giảm sự phân hủy protein ngoại bào
• 1.11.3. Cải biến hình thái học hệ sợi nấm
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Các chủng vi sinh vật và vector sử dụng trong nghiên cứu
• 2.1.1. Các chủng vi sinh vật
• 2.1.2. Các vector sử dụng trong nghiên cứu
• 2.2. Môi trường nuôi cấy
• 2.3. Các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR
• 2.4. Thiết bị, hóa chất
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Thu bào tử và hệ sợi nấm
• 2.5.2. Tách chiết DNA tổng số, tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA
• 2.5.3. Tạo các vector dùng cho xoá gen và biểu hiện gen ở A.
• 2.5.4. Chuyển gen vào A. niger nhờ vi khuẩn Ag. tumefaciens sử dụng marker chọn lọc là các gen dinh dưỡng
• 2.5.5. Sàng lọc, đánh giá và kiểm tra khả năng sinh trưởng và tiết protein/enzyme của các chủng chuyển gen
• 2.5.6. Xác định số bản sao và mức độ hoạt động của gen phyA thông qua real-time PCR
• 2.5.7. Xác định và phân tích các gen ở A.
• 2.5.8. Phân tích và xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phát triển hệ thống chuyển gen mới với marker chọn lọc là gen dinh dưỡng hisB phục vụ cải biến di truyền nấm sợi A.
• 3.1.1. Tạo chủng đột biến khuyết dưỡng histidine nhờ xóa gen hisB theo cơ chế trao đổi chéo tương đồng
• 3.1.2. Chuyển gen vào A. niger sử dụng phương pháp ATMT với marker chọn lọc là hisB
• 3.1.3. Tạo các chủng đột biến khuyết dưỡng kép nhờ giải pháp tái sử dụng marker chọn lọc pyrG
• 3.1.4. Xây dựng và đánh giá hiệu quả chuyển gen của các vector nhị thể mới
• 3.1.5. Hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn Ag. tumefaciens (ATMT) mới phát triển cho phép thực hiện nghiên cứu về chức năng của các gen
• 3.1.6. Tạo vector nhị thể pKH1 phục vụ xóa gen
• 3.1.7. Xoá và bổ trợ thành công gen điều hòa laeA ở A. niger bằng cách sử dụng hệ thống ATMT đã xây dựng
• 3.1.8. Đánh giá hiệu quả xoá gen sử dụng hệ thống ATMT mới và xác định vai trò của một số gen cụ thể
• 3.1.9. Sử dụng marker hisB phục vụ xóa gen stuA ở A.
• 3.1.10. So sánh hiệu quả xóa một số gen điều hòa ở A.
• 3.1.11. Hệ thống chuyển gen 2 marker hisB và pyrG mới cho phép dễ dàng tạo chủng đột biến xóa kép
• 3.1.12. Thiết lập chiến lược mới để tăng hiệu quả xoá gen A.
• 3.1.12.1. Chiến lược tăng tỷ lệ xoá gen ở nấm sợi A.
• 3.1.12.2. Khai thác các hệ thống chuyển gen mới phát triển để biểu hiện enzyme tái tổ hợp
• 3.1.13. Tạo vector nhị thể mang cấu trúc biểu hiện gen phyA và chuyển thành công vào nấm sợi A.
• 3.1.14. Xác định số bản sao gen phyA của các chủng chuyển gen và xác định hoạt tính enzyme phytase ở các chủng chuyển gen
• 3.1.15. Áp dụng hệ thống chuyển gen mới để tuyển chọn các chủng nấm sợi A. niger đột biến phục vụ biểu hiện enzyme tái tổ hợp hiệu suất cao
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Hệ Thống Chuyển Gen Nấm Sợi Aspergillus

Chi Aspergillus là một trong những chi nấm được nghiên cứu rộng rãi, nổi tiếng với khả năng phân giải polysaccharide và tiết enzyme. Hai loài Aspergillus oryzae và Aspergillus niger được FDA công nhận an toàn và sử dụng phổ biến trong công nghiệp sản xuất enzyme và axit hữu cơ. Aspergillus niger còn là một nhà máy tế bào tiềm năng cho các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, năng suất tự nhiên thường thấp, đòi hỏi cải biến di truyền để tạo ra các chủng hiệu quả hơn. Các kỹ thuật di truyền có thể giúp tạo ra các chủng đột biến có năng lực sinh tổng hợp các sản phẩm với hiệu suất cao. Một số gen liên quan đến sinh tổng hợp protease, điều hòa trao đổi chất, kiểm soát hình thái tế bào và tiết sản phẩm cần được hiệu chỉnh để tạo ra các chủng nấm có đặc tính mới, phù hợp cho biểu hiện enzyme/protein tái tổ hợp. Mục tiêu là tạo ra hệ thống chuyển gen mới ở A. niger không dùng gen kháng kháng sinh, giúp cải biến các chủng nấm tự nhiên để tạo ra các chủng nấm tái tổ hợp có năng suất cao và an toàn. Theo Micheli (1729), chi Aspergillus được đặt tên dựa trên hình dạng cấu trúc bào tử giống như bình rảy nước thánh.

1.1. Đặc Điểm Phân Loại và Hình Thái Nấm Aspergillus

Đặc điểm chính để xác định chi Aspergillus là cấu trúc mang bào tử giống aspergillum. Trong quá trình biệt hóa sợi nấm, một số tế bào phình to, hình thành các tế bào chân. Nhánh sợi nấm phát triển từ tế bào chân gọi là cuống sinh bào tử (conidiophore), mở rộng ở đỉnh tạo thành một túi hình tròn, hình elip hoặc hình que. Vùng giàu dinh dưỡng của túi là một lớp tế bào gọi là phialide (thể bình), hay steigmata trong tài liệu cũ, tạo ra chuỗi dài các bào tử gọi là conidia (bào tử đính) hoặc conidiospore nhờ quá trình sinh sản vô tính. Kích thước và sự sắp xếp của các thành phần này là yếu tố quan trọng trong phân loại. Aspergillus phát triển mạnh trên thảm thực vật mục nát và các vật liệu hữu cơ khác.

1.2. Ứng Dụng Công Nghiệp Của Nấm Sợi Aspergillus

Aspergillus oryzae và Aspergillus niger được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và sản xuất enzyme. Aspergillus niger đặc biệt quan trọng trong sản xuất axit citric và các enzyme công nghiệp khác. Khả năng tiết enzyme vượt trội, sinh trưởng nhanh và dễ nuôi cấy với chi phí thấp khiến nấm sợi Aspergillus trở thành lựa chọn hàng đầu cho sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp. Việc cải thiện năng suất và đặc tính của các chủng Aspergillus thông qua cải biến di truyền nấm sợi là mục tiêu quan trọng trong công nghệ sinh học.

II. Thách Thức Trong Cải Tiến Di Truyền Nấm Sợi Aspergillus

Mặc dù nấm sợi Aspergillus có nhiều tiềm năng, việc cải biến di truyền vẫn đối mặt với nhiều thách thức. Các phương pháp chuyển gen truyền thống như sử dụng tế bào trần (protoplast) thường phức tạp, tốn kém và thiếu ổn định. Việc sử dụng gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc cũng gây lo ngại về an toàn sinh học và phát tán các chủng kháng kháng sinh ra môi trường. Do đó, cần phát triển các hệ thống chuyển gen mới hiệu quả hơn, an toàn hơn và chi phí thấp hơn. Việc loại bỏ các gen không mong muốn như protease và amylase cũng là một thách thức quan trọng để cải thiện chất lượng sản phẩm tái tổ hợp. Theo nghiên cứu, phương pháp chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast) bao gồm nhiều bước thực hiện phức tạp, chi phí cao và kết quả thí nghiệm thiếu ổn định ở những lần lặp lại.

2.1. Hạn Chế Của Phương Pháp Chuyển Gen Tế Bào Trần Protoplast

Phương pháp chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast-mediated transformation, PMT) có nhiều hạn chế, bao gồm quy trình phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật cao và tốn nhiều thời gian. Hiệu quả chuyển gen thường thấp và không ổn định, gây khó khăn trong việc tạo ra các chủng nấm sợi Aspergillus được cải biến di truyền thành công. Ngoài ra, quá trình tạo tế bào trần có thể gây tổn thương tế bào, ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm.

2.2. Rủi Ro Từ Việc Sử Dụng Marker Kháng Kháng Sinh

Việc sử dụng gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc trong chuyển gen có thể gây ra những rủi ro về an toàn sinh học. Các gen kháng kháng sinh có thể lan truyền sang các vi sinh vật khác trong môi trường, góp phần vào sự gia tăng của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, gây nguy hiểm cho sức khỏe con người và động vật. Do đó, cần tìm kiếm các marker chọn lọc thay thế an toàn hơn, chẳng hạn như các gen dinh dưỡng.

2.3. Vấn Đề Loại Bỏ Gen Không Mong Muốn Trong Nấm Sợi

Trong quá trình cải biến di truyền nấm sợi, việc loại bỏ các gen không mong muốn như gen mã hóa protease (gây phân giải sản phẩm enzyme/protein tái tổ hợp) và gen sinh tổng hợp amylase (gây cản trở việc thu hồi và tinh chế sản phẩm tái tổ hợp) là rất quan trọng. Tuy nhiên, việc loại bỏ gen đòi hỏi các kỹ thuật phức tạp và hiệu quả chưa cao, gây khó khăn trong việc tạo ra các chủng nấm sợi Aspergillus có đặc tính mong muốn.

III. Phát Triển Hệ Thống Chuyển Gen Mới Dựa Trên ATMT

Để giải quyết các thách thức trên, nghiên cứu tập trung vào phát triển hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (ATMT) với marker chọn lọc là gen dinh dưỡng. Phương pháp ATMT có ưu điểm là hiệu quả cao, chi phí thấp và dễ thực hiện. Việc sử dụng gen dinh dưỡng làm marker chọn lọc giúp đảm bảo an toàn sinh học và giảm thiểu rủi ro phát tán gen kháng kháng sinh. Hệ thống chuyển gen mới này sẽ là công cụ đắc lực để cải biến di truyền nấm sợi Aspergillus, tạo ra các chủng có năng suất cao và an toàn cho sản xuất công nghiệp. Theo nghiên cứu, hiệu suất chuyển gen của phương pháp này có thể đạt đến 97% và thậm chí cao hơn phương pháp chuyển gen thông qua tế bào trần lên tới 400 lần ở nấm Aspergillus awamori.

3.1. Ưu Điểm Của Phương Pháp Chuyển Gen ATMT

Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (ATMT) có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống. ATMT có hiệu quả chuyển gen cao, quy trình đơn giản, dễ thực hiện và chi phí thấp. ATMT cũng ít gây tổn thương tế bào hơn so với phương pháp tế bào trần, giúp duy trì khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm sợi Aspergillus.

3.2. Sử Dụng Gen Dinh Dưỡng Làm Marker Chọn Lọc

Việc sử dụng gen dinh dưỡng làm marker chọn lọc trong chuyển gen giúp đảm bảo an toàn sinh học và giảm thiểu rủi ro phát tán gen kháng kháng sinh. Các gen dinh dưỡng thường là các gen mã hóa enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng của nấm. Các chủng nấm đột biến khuyết dưỡng (không có khả năng tổng hợp chất dinh dưỡng) chỉ có thể sinh trưởng trên môi trường bổ sung chất dinh dưỡng đó, giúp dễ dàng chọn lọc các thể chuyển gen thành công.

3.3. Ứng Dụng ATMT Để Cải Biến Di Truyền Nấm Sợi Aspergillus

Hệ thống chuyển gen ATMT với marker chọn lọc là gen dinh dưỡng có thể được sử dụng để cải biến di truyền nấm sợi Aspergillus theo nhiều hướng khác nhau. Có thể sử dụng ATMT để xóa gen, chèn gen, hoặc thay đổi trình tự gen, tạo ra các chủng nấm có đặc tính mong muốn, chẳng hạn như tăng năng suất enzyme, cải thiện khả năng phân giải cơ chất, hoặc loại bỏ các gen không mong muốn.

IV. Ứng Dụng Hệ Thống Chuyển Gen Mới Để Xóa Gen Mục Tiêu

Hệ thống chuyển gen ATMT được sử dụng để xóa các gen điều hòa quan trọng như laeA, stuA, amyR, prtT, và veA ở A. niger. Việc xóa các gen này có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, biệt hóa tế bào, phân giải cơ chất và tiết sản phẩm của nấm. Nghiên cứu đánh giá hiệu quả của việc xóa gen và xác định vai trò của các gen này trong các quá trình sinh học khác nhau. Việc xóa gen laeA và stuA có thể ảnh hưởng đến khả năng sản xuất enzyme và axit hữu cơ của A. niger.

4.1. Xóa Gen Điều Hòa laeA và Ảnh Hưởng Đến Sản Xuất Enzyme

Gen laeA là một gen điều hòa quan trọng trong nấm sợi Aspergillus, có vai trò kiểm soát biểu hiện của nhiều gen liên quan đến sản xuất enzyme. Việc xóa gen laeA có thể dẫn đến sự thay đổi trong khả năng sản xuất enzyme của nấm, có thể làm tăng hoặc giảm năng suất của một số enzyme nhất định. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của việc xóa gen laeA đến sản xuất các enzyme công nghiệp quan trọng như amylase, cellulase, và protease.

4.2. Xóa Gen Điều Hòa stuA và Ảnh Hưởng Đến Hình Thái Tế Bào

Gen stuA là một gen điều hòa khác có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát hình thái tế bào của nấm sợi Aspergillus. Việc xóa gen stuA có thể dẫn đến sự thay đổi trong hình dạng và cấu trúc của sợi nấm, ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của việc xóa gen stuA đến hình thái tế bào và khả năng hình thành bào tử của A. niger.

4.3. Đánh Giá Ảnh Hưởng Của Việc Xóa Gen Đến Quá Trình Sinh Trưởng

Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của việc xóa các gen điều hòa khác nhau đến quá trình sinh trưởng của A. niger. Các chủng nấm đột biến xóa gen được so sánh với chủng nấm gốc về tốc độ sinh trưởng, khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau, và khả năng chịu đựng các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Kết quả nghiên cứu giúp hiểu rõ hơn về vai trò của các gen điều hòa trong việc kiểm soát quá trình sinh trưởng của nấm sợi Aspergillus.

V. Tăng Cường Biểu Hiện Gen phyA Mã Hóa Enzyme Phytase

Hệ thống chuyển gen mới được sử dụng để tăng cường biểu hiện gen phyA mã hóa enzyme phytase ở A. niger. Enzyme phytase có ứng dụng quan trọng trong thức ăn chăn nuôi, giúp cải thiện khả năng hấp thụ phosphorus của động vật. Nghiên cứu tạo ra các chủng A. niger biểu hiện quá mức enzyme phytase và đánh giá hoạt tính enzyme của các chủng này. Việc tăng cường biểu hiện gen phyA có thể giúp giảm chi phí sản xuất thức ăn chăn nuôi và cải thiện hiệu quả sử dụng phosphorus.

5.1. Ứng Dụng Của Enzyme Phytase Trong Thức Ăn Chăn Nuôi

Enzyme phytase có vai trò quan trọng trong thức ăn chăn nuôi, giúp phân giải phytate (một dạng phosphorus không tiêu hóa được) thành phosphorus dễ hấp thụ. Việc bổ sung enzyme phytase vào thức ăn chăn nuôi giúp cải thiện khả năng hấp thụ phosphorus của động vật, giảm lượng phosphorus thải ra môi trường, và giảm chi phí sản xuất thức ăn chăn nuôi.

5.2. Tạo Chủng Nấm Aspergillus Biểu Hiện Quá Mức Phytase

Nghiên cứu sử dụng hệ thống chuyển gen ATMT để tạo ra các chủng A. niger biểu hiện quá mức gen phyA mã hóa enzyme phytase. Các chủng nấm được cải biến di truyền để có nhiều bản sao của gen phyA và được đặt dưới sự kiểm soát của các promoter mạnh, giúp tăng cường biểu hiện của gen và sản xuất enzyme phytase với năng suất cao.

5.3. Đánh Giá Hoạt Tính Enzyme Phytase Của Các Chủng Chuyển Gen

Hoạt tính enzyme phytase của các chủng A. niger biểu hiện quá mức phyA được đánh giá bằng các phương pháp sinh hóa. Các chủng nấm được nuôi cấy trong môi trường thích hợp và enzyme phytase được thu hồi từ môi trường nuôi cấy. Hoạt tính enzyme được đo bằng cách xác định lượng phosphorus được giải phóng từ phytate trong một khoảng thời gian nhất định. Kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng cải biến di truyền có hoạt tính enzyme phytase cao hơn đáng kể so với chủng nấm gốc.

VI. Kết Luận và Triển Vọng Phát Triển Hệ Thống Chuyển Gen

Nghiên cứu đã phát triển thành công hệ thống chuyển gen ATMT hiệu quả với marker chọn lọc là gen dinh dưỡng, mở ra triển vọng mới cho việc cải biến di truyền nấm sợi Aspergillus. Hệ thống này có thể được sử dụng để tạo ra các chủng nấm có đặc tính ưu việt, phục vụ sản xuất enzyme, protein tái tổ hợp và các sản phẩm công nghiệp khác. Việc tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện hệ thống chuyển gen sẽ góp phần thúc đẩy sự phát triển của công nghệ sinh học và ứng dụng của nấm sợi Aspergillus trong nhiều lĩnh vực.

6.1. Đánh Giá Ưu Điểm Của Hệ Thống Chuyển Gen Mới

Hệ thống chuyển gen ATMT với marker chọn lọc là gen dinh dưỡng có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống, bao gồm hiệu quả cao, chi phí thấp, dễ thực hiện, và an toàn sinh học. Hệ thống này là công cụ đắc lực để cải biến di truyền nấm sợi Aspergillus và tạo ra các chủng nấm có đặc tính mong muốn.

6.2. Triển Vọng Ứng Dụng Trong Công Nghiệp Sinh Học

Hệ thống chuyển gen mới có triển vọng ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sinh học, đặc biệt trong sản xuất enzyme, protein tái tổ hợp, và các sản phẩm công nghiệp khác. Việc tạo ra các chủng nấm sợi Aspergillus có năng suất cao và đặc tính ưu việt có thể giúp giảm chi phí sản xuất và cải thiện chất lượng sản phẩm.

6.3. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Để Hoàn Thiện Hệ Thống

Để hoàn thiện hệ thống chuyển gen, cần tiếp tục nghiên cứu và tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen, chẳng hạn như loại vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, điều kiện nuôi cấy, và cấu trúc vector chuyển gen. Ngoài ra, cần phát triển các marker chọn lọc mới an toàn và hiệu quả hơn, và nghiên cứu các phương pháp cải biến di truyền tiên tiến khác như CRISPR-Cas9.