Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Giới thiệu về chi Aspergillus Aspergillus là một trong những chi nấm lâu đời nhất được đặt tên bởi Pier Antonio Micheli vào năm 1729 (Hình 1. Khi quan sát cấu trúc sinh bào tử của chi nấm này qua kính hiển vi, Micheli đã nhớ đến một thiết bị được giáo sĩ Công giáo La Mã sử dụng để vảy nước thánh gọi là asperges. Kể từ năm 1926, sau khi Tom và Church xuất bản sách chuyên khảo lớn đầu tiên về chi nấm này, Aspergillus đã trở thành một trong những nhóm nấm mốc được biết đến và được nghiên cứu nhiều nhất.
Sự phổ biến của chúng trong môi trường tự nhiên, khả năng dễ nuôi cấy trên môi trường nhân tạo và tầm quan trọng kinh tế của một số loài Aspergillus đã thu hút nhiều nhà khoa học. Aspergillus phát triển mạnh dưới dạng sinh vật hoại sinh trên thảm thực vật mục nát, trên các nguyên liệu đa dạng như phân, mô người và giấy da cổ [16]. Hình ảnh Aspergillus conidiophore mô tả bởi Pier Micheli [45] 1. Đặc điểm phân loại Đặc điểm xác định của chi Aspergillus là cấu trúc mang bào tử giống aspergillum.
Đây là đặc điểm hiển vi quan trọng nhất được sử dụng trong phân loại Aspergillus. Trong quá trình biệt hóa sợi nấm, một số tế bào phình to, hình thành các tế bào chân. Nhánh sợi nấm phát triển từ tế bào chân gọi là cuống sinh bào tử (conidiophore), mở rộng ở đỉnh tạo thành một túi hình tròn, hình elip hoặc hình que. Vùng giàu dinh dưỡng của túi là một lớp tế bào gọi là phialide (thể bình), hay steigmata trong tài liệu cũ, tạo ra chuỗi dài các bào tử gọi là conidia (bào tử đính) 14 hoặc conidiospore nhờ quá trình sinh sản vô tính.
Kích thước và sự sắp xếp của các conidia cũng như màu sắc của bào tử là đặc điểm nhận dạng quan trọng. Ví dụ, các loài trong nhóm A. niger có bào tử màu đen, nhóm A. ochraceus có màu vàng đến nâu, trong khi A.
flavus có màu xanh lá cây. Các đặc điểm nuôi cấy chính được sử dụng trong việc xác định loài là màu sắc của khuẩn lạc, tốc độ sinh trưởng và khả năng chịu nhiệt. Aspergillus có đặc điểm hình thái và sinh trưởng khác nhau trên các nguồn dinh dưỡng khác nhau. Các nhà phân loại học hiện nay thường nuôi cấy các chủng nấm trên một số loại môi trường nhất định, ở một số nhiệt độ khác nhau để xác định loài [9].
Ngoài conidiophore, các cấu trúc hình thái khác cũng hữu ích cho việc xác định, nhận dạng nấm, bao gồm cleistothecia (quả thể sinh sản hữu tính), tế bào Hülle (còn gọi là nursing cells, một loại tế bào đặc biệt giúp nuôi dưỡng cleistothecia) và sclerotia (một dạng tế bào ở dạng thể nghỉ). Cả cleistothecia và sclerotia đều là cấu trúc dạng đóng và thường có hình tròn. Cleistothecia được hình thành ở giai đoạn sinh sản hữu tính và chứa các bào tử có tên là ascospore sinh ra trong nang (ascus) [16]. Đặc điểm sinh lý sinh hóa Bào tử Aspergillus là thành phần phổ biến của các sol khí, tự phát tán theo khoảng cách ngắn hoặc dài tùy thuộc vào điều kiện môi trường.
Aspergillus có thể phát triển ở phạm vi nhiệt độ rộng (6-55°C) và ở độ ẩm tương đối thấp. Các loài Aspergillus có thể sử dụng nhiều loại cơ chất khác nhau có trong môi trường. Trong tự nhiên, Aspergillus đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải các cơ chất phức tạp như tinh bột, hemicellulose, cellulose, pectin và các polyme khác. Một số loài Aspergillus có khả năng làm phân huỷ các hợp chất bền như chất béo, dầu, chitin và keratin.
Các loài Aspergillus tiết ra nhiều loại enzyme để phân hủy cơ chất phức tạp thành các phân tử nhỏ để sử dụng làm chất dinh dưỡng. Ví dụ, amylase được tiết ra để phân giải tinh bột, xylanase phân giải xylan, pectinase phân giải pectin có trong nguyên liệu thực vật. Khả năng tiết ra một lượng lớn enzyme/protein, các chất chuyển hóa (axit hữu cơ, lovastatin, sắc tố, …), kết hợp với công nghệ lên men và các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã giúp tạo ra các nhà máy tế bào ưu việt ở A. terreus phục vụ sản xuất các sản phẩm có giá trị ở quy mô công nghiệp [97].
Tuy nhiên, một số loài của chi Aspergillus là tác nhân gây hại cho sản xuất nông nghiệp, ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và vật nuôi. Một số loài Aspergillus có khả năng sinh độc tố (mycotoxin) trên nông sản, như A. flavus sinh aflatoxin hay A. westerdijkiae sinh ochratoxin A [82].
fumigatus là tác nhân gây bệnh cơ hội ở người, thường gây bệnh ở những người có hệ miễn dịch bị suy yếu [77]. Di truyền học và hệ gen nấm Năm 2005, dữ liệu hệ gen của 3 loài Aspergillus đã được công bố, gồm A. Việc xuất bản đồng thời 3 công trình về hệ gen của 3 loài Aspergillus này trên tạp chí danh tiếng Nature vào tháng 12 năm 2005 đã khẳng định Aspergillus là chi nấm hàng đầu cho các nghiên cứu về phân tích hệ gen. Kích thước hệ gen của các loài Aspergillus được giải trình tự nằm trong khoảng từ 29,3 Mb đối với A.
fumigatus đến 37,1 Mb đối với A. oryzae; trong khi số lượng gen dự đoán thay đổi từ khoảng 9926 đối với A. fumigatus đến khoảng 12. Đến năm 2017, 10 trình tự hệ gen mới của chi Aspergillus đã được công bố, cụ thể là A.
Những loài này được chọn chủ yếu để cung cấp độ bao phủ tốt hơn cho toàn bộ chi, để bổ sung cho trình tự hệ gen đã có sẵn của A. terreus, và để cho phép khai thác dữ liệu chi tiết hơn của nhóm công nghiệp Nigri (A. Vai trò ứng dụng trong công nghệ sinh học và công nghiệp Aspergillus đã được sử dụng trong biến đổi gạo, đậu nành và các thực phẩm từ thực vật khác nhằm cải thiện hương vị và tăng khả năng lên men. Việc sử dụng Aspergillus để sản xuất thực phẩm được cho là bắt nguồn từ Trung Quốc cách đây khoảng 2000 năm.
Sau đó, quá trình lên men thực phẩm tương tự đã được tiến hành ở Indonesia, Nhật Bản, Hàn Quốc và các khu vực khác của châu Á. Các quy trình lâu 16 đời nhất có liên quan đến quá trình lên men thực phẩm truyền thống, bao gồm miso (tương làm từ bột đậu nành và gạo), shoyu (nước tương), rượu sake (rượu vang gạo), shochu (rượu mạnh) và yonezu (giấm gạo). Koji là tên tiếng Nhật của các loại ngũ cốc lên men và/hoặc đậu nành (Hình 1. Trong koji, nấm sợi tiết ra nhiều loại enzyme và làm biến đổi cơ chất từ protein thành peptide và axit amin, và từ tinh bột thành đường đơn [118].
Hình thái 3 loại nấm Aspergillus dùng trong sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống [118] Bên trái là hình ảnh khuẩn lạc Aspergillus oryzae (koji vàng; A), Aspergillus luchuensis (koji đen; C) và Aspergillus luchuensis var. Bên phải là đầu cấu trúc sinh bào tử của các loại nấm này (B, Aspergillus oryzae; D, Aspergillus luchuensis; F, Aspergillus luchuensis var. 17 Aspergillus có hiệu quả kinh tế cao, các thành viên của chi nấm này đã được khai thác trong nhiều quy trình công nghiệp khác nhau. Các loài Aspergillus được sử dụng trong ngành công nghiệp đồ uống, dược phẩm và sản xuất enzyme.
Các sản phẩm thương mại được sản xuất từ Aspergillus bao gồm axit citric, gluconic, itaconic và kojic. Axit citric là một trong những thành phần thực phẩm được sử dụng rộng rãi nhất, chủ yếu được sản xuất bởi A. Axit citric cũng được sử dụng trong các ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm. niger cũng đã được khai thác trong sản xuất công nghiệp axit gluconic - một loại axit hữu cơ được dùng làm phụ gia trong một số ứng dụng làm sạch kim loại, cũng như cho liệu pháp điều trị thiếu hụt canxi và sắt.
terreus được sử dụng để sản xuất axit itaconic, dùng trong sản xuất một số loại polyme tổng hợp. oryzae được lên men để sản xuất axit kojic, ứng dụng trong mỹ phẩm làm trắng da [97]. Một số chất chuyển hóa thứ cấp từ Aspergillus cũng có tầm quan trọng kinh tế lớn; trong đó statin và các dẫn xuất của chúng đem lại lợi nhuận lớn nhất. Những loại thuốc giảm cholesterol hiện nay là một trong những loại thuốc được sử dụng rộng rãi.
Một nhóm các nhà khoa học tại công ty Merck ở Hoa Kỳ đã phát triển statin đầu tiên được phê duyệt cho người sử dụng, lovastatin, một chất chuyển hóa thứ cấp được phân lập từ A. Do tính chất an toàn của A. niger để điều chế thực phẩm và đồ uống của con người, các sản phẩm mới từ các loại nấm này dễ dàng được chấp thuận hơn các sản phẩm từ các sinh vật khác. Với khả năng tiết cao, các enzyme ngoại bào của A.
niger có thể dễ dàng được khai thác để sản xuất các enzyme dùng trong các ngành công nghiệp như làm bánh, nước giải khát và sản xuất bia; bổ sung vào thức ăn cho động vật; và dùng trong ngành công nghiệp giấy. Aspergillus cũng có tiềm năng to lớn trong việc cung cấp các enzyme mới có thể được sử dụng để chuyển hóa sinh khối thực vật thành nhiên liệu và các sản phẩm công nghiệp hữu ích khác [13]. Đặc điểm hình thái A. oryzae là loài nấm sợi hiếu khí.
Giai đoạn đầu khuẩn lạc có màu trắng, sau đó chuyển sang màu vàng-xanh. Hệ sợi nấm bao gồm những sợi mỏng với kích thước 18 theo chiều ngang 5-7 μm, phân nhánh nhiều, và có vách ngăn. oryzae hình thành bào tử đính (hay conidia) nhờ quá trình sinh sản vô tính. Sợi nấm phát triển tế bào chân đế và biệt hóa thành sợi cuống dài (conidiophore) với cấu trúc phồng lên ở đầu cuối dạng củ hành gọi là bọng (vescicle).
Xung quanh bọng chứa một vài lớp tế bào chuyên biệt gọi là thể bình (phialide). Từ bộ cuống ngoài cùng, những bào tử được sinh ra đính vào nhau, nên gọi là bào tử đính. Bào tử của A. oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau [90].
Hình thái nấm sợi A. oryzae RIB40 [150] Khuẩn lạc A. oryzae RIB40 trên các môi trường CYA (A), MEA (B) sau 7 ngày nuôi cấy ở 25oC. Hình dạng sclerotia (C), conidiophore và conidia (D-I).
oryzae Hệ gen của một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus dùng trong công nghiệp đã được nghiên cứu từ cuối những năm 1990. sojae đã được sử dụng trong sản xuất công nghiệp như A. oryzae, nhưng nghiên cứu về hệ gen của A. sojae còn 19 hạn chế.
Phân tích trình tự EST (Expressed Sequence Tags, chỉ thị các trình tự được biểu hiện) được hoàn thành vào năm 2001 với chủng A. Hệ gen đầy đủ của A. oryzae RIB40 chứa 8 nhiễm sắc thể và ty thể (hình tròn) và ước tính kích thước là 37,6 Mb hay 37.