Nghiên Cứu Phát Triển Hệ Thống Chuyển Gen Mới Phục Vụ Cải Biến Di Truyền Nấm Sợi Aspergillus

Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới nhằm cải biến di truyền các loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus, mở ra tiềm năng ứng dụng.

• Tác giả: Thái Hạnh Dung
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Văn Tuấn
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phát Triển Hệ Thống Chuyển Gen Mới Để Cải Biến Di Truyền Nấm Sợi Aspergillus
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Giới thiệu về chi Aspergillus
• 1.2. Đặc điểm phân loại
• 1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hóa
• 1.4. Di truyền học và hệ gen nấm
• 1.5. Vai trò ứng dụng trong công nghệ sinh học và công nghiệp
• 1.6. Đặc điểm hình thái
• 1.7. Sinh thái học và ý nghĩa kinh tế
• 1.8. Một số phương pháp chuyển gen phục vụ cải biến di truyền ở nấm sợi
• 1.8.1. Chuyển gen bằng xung điện
• 1.8.2. Chuyển gen bằng sóng xung kích
• 1.8.3. Chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast-mediated transformation, PMT)
• 1.8.4. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT)
• 1.9. Marker chọn lọc dùng trong chuyển gen
• 1.9.1. Marker chọn lọc là gen kháng thuốc
• 1.9.2. Marker chọn lọc là gen dinh dưỡng
• 1.10. Một số protein điều hoà quan trọng ở nấm sợi Aspergillus
• 1.11. Các chiến lược tăng cường sản xuất enzyme/protein ở A.
• 1.11.1. Tối ưu hóa cấu trúc biểu hiện gen
• 1.11.2. Giảm sự phân hủy protein ngoại bào
• 1.11.3. Cải biến hình thái học hệ sợi nấm
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Các chủng vi sinh vật và vector sử dụng trong nghiên cứu
• 2.1.1. Các chủng vi sinh vật
• 2.1.2. Các vector sử dụng trong nghiên cứu
• 2.2. Môi trường nuôi cấy
• 2.3. Các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR
• 2.4. Thiết bị, hóa chất
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Thu bào tử và hệ sợi nấm
• 2.5.2. Tách chiết DNA tổng số, tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA
• 2.5.3. Tạo các vector dùng cho xoá gen và biểu hiện gen ở A.
• 2.5.4. Chuyển gen vào A. niger nhờ vi khuẩn Ag. tumefaciens sử dụng marker chọn lọc là các gen dinh dưỡng
• 2.5.5. Sàng lọc, đánh giá và kiểm tra khả năng sinh trưởng và tiết protein/enzyme của các chủng chuyển gen
• 2.5.6. Xác định số bản sao và mức độ hoạt động của gen phyA thông qua real-time PCR
• 2.5.7. Xác định và phân tích các gen ở A.
• 2.5.8. Phân tích và xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phát triển hệ thống chuyển gen mới với marker chọn lọc là gen dinh dưỡng hisB phục vụ cải biến di truyền nấm sợi A.
• 3.1.1. Tạo chủng đột biến khuyết dưỡng histidine nhờ xóa gen hisB theo cơ chế trao đổi chéo tương đồng
• 3.1.2. Chuyển gen vào A. niger sử dụng phương pháp ATMT với marker chọn lọc là hisB
• 3.1.3. Tạo các chủng đột biến khuyết dưỡng kép nhờ giải pháp tái sử dụng marker chọn lọc pyrG
• 3.1.4. Xây dựng và đánh giá hiệu quả chuyển gen của các vector nhị thể mới
• 3.1.5. Hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn Ag. tumefaciens (ATMT) mới phát triển cho phép thực hiện nghiên cứu về chức năng của các gen
• 3.1.6. Tạo vector nhị thể pKH1 phục vụ xóa gen
• 3.1.7. Xoá và bổ trợ thành công gen điều hòa laeA ở A. niger bằng cách sử dụng hệ thống ATMT đã xây dựng
• 3.1.8. Đánh giá hiệu quả xoá gen sử dụng hệ thống ATMT mới và xác định vai trò của một số gen cụ thể
• 3.1.9. Sử dụng marker hisB phục vụ xóa gen stuA ở A.
• 3.1.10. So sánh hiệu quả xóa một số gen điều hòa ở A.
• 3.1.11. Hệ thống chuyển gen 2 marker hisB và pyrG mới cho phép dễ dàng tạo chủng đột biến xóa kép
• 3.1.12. Thiết lập chiến lược mới để tăng hiệu quả xoá gen A.
• 3.1.12.1. Chiến lược tăng tỷ lệ xoá gen ở nấm sợi A.
• 3.1.12.2. Khai thác các hệ thống chuyển gen mới phát triển để biểu hiện enzyme tái tổ hợp
• 3.1.13. Tạo vector nhị thể mang cấu trúc biểu hiện gen phyA và chuyển thành công vào nấm sợi A.
• 3.1.14. Xác định số bản sao gen phyA của các chủng chuyển gen và xác định hoạt tính enzyme phytase ở các chủng chuyển gen
• 3.1.15. Áp dụng hệ thống chuyển gen mới để tuyển chọn các chủng nấm sợi A. niger đột biến phục vụ biểu hiện enzyme tái tổ hợp hiệu suất cao
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Hệ Thống Chuyển Gen Nấm Sợi Aspergillus

Chi Aspergillus là một trong những chi nấm được nghiên cứu rộng rãi, nổi tiếng với khả năng phân giải polysaccharide và tiết enzyme. Hai loài Aspergillus oryzae và Aspergillus niger được FDA công nhận an toàn và sử dụng phổ biến trong công nghiệp sản xuất enzyme và axit hữu cơ. Aspergillus niger còn là một nhà máy tế bào tiềm năng cho các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, năng suất tự nhiên thường thấp, đòi hỏi cải biến di truyền để tạo ra các chủng hiệu quả hơn. Các kỹ thuật di truyền có thể giúp tạo ra các chủng đột biến có năng lực sinh tổng hợp các sản phẩm với hiệu suất cao. Một số gen liên quan đến sinh tổng hợp protease, điều hòa trao đổi chất, kiểm soát hình thái tế bào và tiết sản phẩm cần được hiệu chỉnh để tạo ra các chủng nấm có đặc tính mới, phù hợp cho biểu hiện enzyme/protein tái tổ hợp. Mục tiêu là tạo ra hệ thống chuyển gen mới ở A. niger không dùng gen kháng kháng sinh, giúp cải biến các chủng nấm tự nhiên để tạo ra các chủng nấm tái tổ hợp có năng suất cao và an toàn. Theo Micheli (1729), chi Aspergillus được đặt tên dựa trên hình dạng cấu trúc bào tử giống như bình rảy nước thánh.

1.1. Đặc Điểm Phân Loại và Hình Thái Nấm Aspergillus

Đặc điểm chính để xác định chi Aspergillus là cấu trúc mang bào tử giống aspergillum. Trong quá trình biệt hóa sợi nấm, một số tế bào phình to, hình thành các tế bào chân. Nhánh sợi nấm phát triển từ tế bào chân gọi là cuống sinh bào tử (conidiophore), mở rộng ở đỉnh tạo thành một túi hình tròn, hình elip hoặc hình que. Vùng giàu dinh dưỡng của túi là một lớp tế bào gọi là phialide (thể bình), hay steigmata trong tài liệu cũ, tạo ra chuỗi dài các bào tử gọi là conidia (bào tử đính) hoặc conidiospore nhờ quá trình sinh sản vô tính. Kích thước và sự sắp xếp của các thành phần này là yếu tố quan trọng trong phân loại. Aspergillus phát triển mạnh trên thảm thực vật mục nát và các vật liệu hữu cơ khác.

1.2. Ứng Dụng Công Nghiệp Của Nấm Sợi Aspergillus

Aspergillus oryzae và Aspergillus niger được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và sản xuất enzyme. Aspergillus niger đặc biệt quan trọng trong sản xuất axit citric và các enzyme công nghiệp khác. Khả năng tiết enzyme vượt trội, sinh trưởng nhanh và dễ nuôi cấy với chi phí thấp khiến nấm sợi Aspergillus trở thành lựa chọn hàng đầu cho sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp. Việc cải thiện năng suất và đặc tính của các chủng Aspergillus thông qua cải biến di truyền nấm sợi là mục tiêu quan trọng trong công nghệ sinh học.

II. Thách Thức Trong Cải Tiến Di Truyền Nấm Sợi Aspergillus

Mặc dù nấm sợi Aspergillus có nhiều tiềm năng, việc cải biến di truyền vẫn đối mặt với nhiều thách thức. Các phương pháp chuyển gen truyền thống như sử dụng tế bào trần (protoplast) thường phức tạp, tốn kém và thiếu ổn định. Việc sử dụng gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc cũng gây lo ngại về an toàn sinh học và phát tán các chủng kháng kháng sinh ra môi trường. Do đó, cần phát triển các hệ thống chuyển gen mới hiệu quả hơn, an toàn hơn và chi phí thấp hơn. Việc loại bỏ các gen không mong muốn như protease và amylase cũng là một thách thức quan trọng để cải thiện chất lượng sản phẩm tái tổ hợp. Theo nghiên cứu, phương pháp chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast) bao gồm nhiều bước thực hiện phức tạp, chi phí cao và kết quả thí nghiệm thiếu ổn định ở những lần lặp lại.

2.1. Hạn Chế Của Phương Pháp Chuyển Gen Tế Bào Trần Protoplast

Phương pháp chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast-mediated transformation, PMT) có nhiều hạn chế, bao gồm quy trình phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật cao và tốn nhiều thời gian. Hiệu quả chuyển gen thường thấp và không ổn định, gây khó khăn trong việc tạo ra các chủng nấm sợi Aspergillus được cải biến di truyền thành công. Ngoài ra, quá trình tạo tế bào trần có thể gây tổn thương tế bào, ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm.

2.2. Rủi Ro Từ Việc Sử Dụng Marker Kháng Kháng Sinh

Việc sử dụng gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc trong chuyển gen có thể gây ra những rủi ro về an toàn sinh học. Các gen kháng kháng sinh có thể lan truyền sang các vi sinh vật khác trong môi trường, góp phần vào sự gia tăng của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, gây nguy hiểm cho sức khỏe con người và động vật. Do đó, cần tìm kiếm các marker chọn lọc thay thế an toàn hơn, chẳng hạn như các gen dinh dưỡng.

2.3. Vấn Đề Loại Bỏ Gen Không Mong Muốn Trong Nấm Sợi

Trong quá trình cải biến di truyền nấm sợi, việc loại bỏ các gen không mong muốn như gen mã hóa protease (gây phân giải sản phẩm enzyme/protein tái tổ hợp) và gen sinh tổng hợp amylase (gây cản trở việc thu hồi và tinh chế sản phẩm tái tổ hợp) là rất quan trọng. Tuy nhiên, việc loại bỏ gen đòi hỏi các kỹ thuật phức tạp và hiệu quả chưa cao, gây khó khăn trong việc tạo ra các chủng nấm sợi Aspergillus có đặc tính mong muốn.

III. Phát Triển Hệ Thống Chuyển Gen Mới Dựa Trên ATMT

Để giải quyết các thách thức trên, nghiên cứu tập trung vào phát triển hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (ATMT) với marker chọn lọc là gen dinh dưỡng. Phương pháp ATMT có ưu điểm là hiệu quả cao, chi phí thấp và dễ thực hiện. Việc sử dụng gen dinh dưỡng làm marker chọn lọc giúp đảm bảo an toàn sinh học và giảm thiểu rủi ro phát tán gen kháng kháng sinh. Hệ thống chuyển gen mới này sẽ là công cụ đắc lực để cải biến di truyền nấm sợi Aspergillus, tạo ra các chủng có năng suất cao và an toàn cho sản xuất công nghiệp. Theo nghiên cứu, hiệu suất chuyển gen của phương pháp này có thể đạt đến 97% và thậm chí cao hơn phương pháp chuyển gen thông qua tế bào trần lên tới 400 lần ở nấm Aspergillus awamori.

3.1. Ưu Điểm Của Phương Pháp Chuyển Gen ATMT

Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (ATMT) có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống. ATMT có hiệu quả chuyển gen cao, quy trình đơn giản, dễ thực hiện và chi phí thấp. ATMT cũng ít gây tổn thương tế bào hơn so với phương pháp tế bào trần, giúp duy trì khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm sợi Aspergillus.

3.2. Sử Dụng Gen Dinh Dưỡng Làm Marker Chọn Lọc

Việc sử dụng gen dinh dưỡng làm marker chọn lọc trong chuyển gen giúp đảm bảo an toàn sinh học và giảm thiểu rủi ro phát tán gen kháng kháng sinh. Các gen dinh dưỡng thường là các gen mã hóa enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng của nấm. Các chủng nấm đột biến khuyết dưỡng (không có khả năng tổng hợp chất dinh dưỡng) chỉ có thể sinh trưởng trên môi trường bổ sung chất dinh dưỡng đó, giúp dễ dàng chọn lọc các thể chuyển gen thành công.

3.3. Ứng Dụng ATMT Để Cải Biến Di Truyền Nấm Sợi Aspergillus

Hệ thống chuyển gen ATMT với marker chọn lọc là gen dinh dưỡng có thể được sử dụng để cải biến di truyền nấm sợi Aspergillus theo nhiều hướng khác nhau. Có thể sử dụng ATMT để xóa gen, chèn gen, hoặc thay đổi trình tự gen, tạo ra các chủng nấm có đặc tính mong muốn, chẳng hạn như tăng năng suất enzyme, cải thiện khả năng phân giải cơ chất, hoặc loại bỏ các gen không mong muốn.

IV. Ứng Dụng Hệ Thống Chuyển Gen Mới Để Xóa Gen Mục Tiêu

Hệ thống chuyển gen ATMT được sử dụng để xóa các gen điều hòa quan trọng như laeA, stuA, amyR, prtT, và veA ở A. niger. Việc xóa các gen này có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, biệt hóa tế bào, phân giải cơ chất và tiết sản phẩm của nấm. Nghiên cứu đánh giá hiệu quả của việc xóa gen và xác định vai trò của các gen này trong các quá trình sinh học khác nhau. Việc xóa gen laeA và stuA có thể ảnh hưởng đến khả năng sản xuất enzyme và axit hữu cơ của A. niger.

4.1. Xóa Gen Điều Hòa laeA và Ảnh Hưởng Đến Sản Xuất Enzyme

Gen laeA là một gen điều hòa quan trọng trong nấm sợi Aspergillus, có vai trò kiểm soát biểu hiện của nhiều gen liên quan đến sản xuất enzyme. Việc xóa gen laeA có thể dẫn đến sự thay đổi trong khả năng sản xuất enzyme của nấm, có thể làm tăng hoặc giảm năng suất của một số enzyme nhất định. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của việc xóa gen laeA đến sản xuất các enzyme công nghiệp quan trọng như amylase, cellulase, và protease.

4.2. Xóa Gen Điều Hòa stuA và Ảnh Hưởng Đến Hình Thái Tế Bào

Gen stuA là một gen điều hòa khác có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát hình thái tế bào của nấm sợi Aspergillus. Việc xóa gen stuA có thể dẫn đến sự thay đổi trong hình dạng và cấu trúc của sợi nấm, ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của việc xóa gen stuA đến hình thái tế bào và khả năng hình thành bào tử của A. niger.

4.3. Đánh Giá Ảnh Hưởng Của Việc Xóa Gen Đến Quá Trình Sinh Trưởng

Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của việc xóa các gen điều hòa khác nhau đến quá trình sinh trưởng của A. niger. Các chủng nấm đột biến xóa gen được so sánh với chủng nấm gốc về tốc độ sinh trưởng, khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau, và khả năng chịu đựng các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Kết quả nghiên cứu giúp hiểu rõ hơn về vai trò của các gen điều hòa trong việc kiểm soát quá trình sinh trưởng của nấm sợi Aspergillus.

V. Tăng Cường Biểu Hiện Gen phyA Mã Hóa Enzyme Phytase

Hệ thống chuyển gen mới được sử dụng để tăng cường biểu hiện gen phyA mã hóa enzyme phytase ở A. niger. Enzyme phytase có ứng dụng quan trọng trong thức ăn chăn nuôi, giúp cải thiện khả năng hấp thụ phosphorus của động vật. Nghiên cứu tạo ra các chủng A. niger biểu hiện quá mức enzyme phytase và đánh giá hoạt tính enzyme của các chủng này. Việc tăng cường biểu hiện gen phyA có thể giúp giảm chi phí sản xuất thức ăn chăn nuôi và cải thiện hiệu quả sử dụng phosphorus.

5.1. Ứng Dụng Của Enzyme Phytase Trong Thức Ăn Chăn Nuôi

Enzyme phytase có vai trò quan trọng trong thức ăn chăn nuôi, giúp phân giải phytate (một dạng phosphorus không tiêu hóa được) thành phosphorus dễ hấp thụ. Việc bổ sung enzyme phytase vào thức ăn chăn nuôi giúp cải thiện khả năng hấp thụ phosphorus của động vật, giảm lượng phosphorus thải ra môi trường, và giảm chi phí sản xuất thức ăn chăn nuôi.

5.2. Tạo Chủng Nấm Aspergillus Biểu Hiện Quá Mức Phytase

Nghiên cứu sử dụng hệ thống chuyển gen ATMT để tạo ra các chủng A. niger biểu hiện quá mức gen phyA mã hóa enzyme phytase. Các chủng nấm được cải biến di truyền để có nhiều bản sao của gen phyA và được đặt dưới sự kiểm soát của các promoter mạnh, giúp tăng cường biểu hiện của gen và sản xuất enzyme phytase với năng suất cao.

5.3. Đánh Giá Hoạt Tính Enzyme Phytase Của Các Chủng Chuyển Gen

Hoạt tính enzyme phytase của các chủng A. niger biểu hiện quá mức phyA được đánh giá bằng các phương pháp sinh hóa. Các chủng nấm được nuôi cấy trong môi trường thích hợp và enzyme phytase được thu hồi từ môi trường nuôi cấy. Hoạt tính enzyme được đo bằng cách xác định lượng phosphorus được giải phóng từ phytate trong một khoảng thời gian nhất định. Kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng cải biến di truyền có hoạt tính enzyme phytase cao hơn đáng kể so với chủng nấm gốc.

VI. Kết Luận và Triển Vọng Phát Triển Hệ Thống Chuyển Gen

Nghiên cứu đã phát triển thành công hệ thống chuyển gen ATMT hiệu quả với marker chọn lọc là gen dinh dưỡng, mở ra triển vọng mới cho việc cải biến di truyền nấm sợi Aspergillus. Hệ thống này có thể được sử dụng để tạo ra các chủng nấm có đặc tính ưu việt, phục vụ sản xuất enzyme, protein tái tổ hợp và các sản phẩm công nghiệp khác. Việc tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện hệ thống chuyển gen sẽ góp phần thúc đẩy sự phát triển của công nghệ sinh học và ứng dụng của nấm sợi Aspergillus trong nhiều lĩnh vực.

6.1. Đánh Giá Ưu Điểm Của Hệ Thống Chuyển Gen Mới

Hệ thống chuyển gen ATMT với marker chọn lọc là gen dinh dưỡng có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống, bao gồm hiệu quả cao, chi phí thấp, dễ thực hiện, và an toàn sinh học. Hệ thống này là công cụ đắc lực để cải biến di truyền nấm sợi Aspergillus và tạo ra các chủng nấm có đặc tính mong muốn.

6.2. Triển Vọng Ứng Dụng Trong Công Nghiệp Sinh Học

Hệ thống chuyển gen mới có triển vọng ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sinh học, đặc biệt trong sản xuất enzyme, protein tái tổ hợp, và các sản phẩm công nghiệp khác. Việc tạo ra các chủng nấm sợi Aspergillus có năng suất cao và đặc tính ưu việt có thể giúp giảm chi phí sản xuất và cải thiện chất lượng sản phẩm.

6.3. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Để Hoàn Thiện Hệ Thống

Để hoàn thiện hệ thống chuyển gen, cần tiếp tục nghiên cứu và tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen, chẳng hạn như loại vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, điều kiện nuôi cấy, và cấu trúc vector chuyển gen. Ngoài ra, cần phát triển các marker chọn lọc mới an toàn và hiệu quả hơn, và nghiên cứu các phương pháp cải biến di truyền tiên tiến khác như CRISPR-Cas9.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học của tác giả Thái Hạnh Dung, chuyên ngành Vi sinh vật học (mã số: 9420101.07), được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trần Văn Tuấn và PGS. Nguyễn Quang Huy. Đề tài tập trung giải quyết các nút thắt kỹ thuật trong cải biến di truyền ở hai loài nấm sợi công nghiệp quan trọng là Aspergillus oryzae và Aspergillus niger.

Về tính cấp thiết, A. oryzae và A. niger là hai loài vi sinh vật được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận an toàn (GRAS), đóng vai trò như các nhà máy tế bào trong sản xuất enzyme công nghiệp (amylase, glucoamylase, pectinase, phytase) và axit hữu cơ (axit citric, axit gluconic). Tuy nhiên, các chủng phân lập từ tự nhiên thường có hiệu suất sinh tổng hợp và tiết protein thấp, gây khó khăn cho việc khai thác quy mô công nghiệp. Việc áp dụng kỹ thuật di truyền để cải biến chủng nấm gặp nhiều trở ngại do thành tế bào nấm dày, hiệu quả biến nạp thấp. Phương pháp truyền thống chuyển gen thông qua tế bào trần (PMT) đòi hỏi quy trình phức tạp, sử dụng enzyme phân giải thành tế bào tốn kém và thiếu ổn định. Mặt khác, phương pháp chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (ATMT) dù có hiệu suất cao nhưng chưa được hoàn thiện trên A. niger. Đặc biệt, các hệ thống chuyển gen hiện hành phụ thuộc lớn vào marker kháng kháng sinh (như hygromycin B, phleomycin), làm tăng chi phí nuôi cấy chọn lọc và gây rủi ro an toàn sinh học khi phát tán gen kháng ra môi trường. Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định là sự thiếu hụt một hệ thống chuyển gen hiệu suất cao, ổn định, không sử dụng gen kháng kháng sinh, dựa trên các marker dinh dưỡng tự thân nhằm phục vụ việc xóa gen định hướng và biểu hiện enzyme tái tổ hợp.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định rõ:

1. Phát triển hệ thống chuyển gen hiệu suất cao thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dựa trên cơ chế trợ dưỡng đơn và trợ dưỡng kép.
2. Áp dụng hệ thống chuyển gen để cải biến di truyền nấm sợi A. oryzae và A. niger thông qua việc xóa gen và tăng cường biểu hiện gen nhằm tạo ra các chủng đột biến có đặc tính sinh học phù hợp cho sản xuất protein tái tổ hợp.

Các nội dung nghiên cứu cụ thể bao gồm:

• Nội dung 1: Phát triển hệ thống chuyển gen mới (tạo chủng đột biến khuyết dưỡng, thiết kế vector, tối ưu hóa quy trình chuyển gen ATMT, biểu hiện gen chỉ thị huỳnh quang DsRed/GFP).
• Nội dung 2: Chứng minh tính khả thi của hệ thống chuyển gen ATMT thu được trong nghiên cứu vai trò, chức năng gen.
• Nội dung 3: Đánh giá hiệu quả xóa các gen điều hòa (amyR, laeA, prtT, stuA, veA) sử dụng hệ thống chuyển gen ATMT và đánh giá vai trò của các gen này đối với quá trình sinh trưởng, biệt hóa tế bào, phân giải cơ chất và tiết sản phẩm.
• Nội dung 4: Xây dựng giải pháp nhằm nâng cao hiệu suất xóa gen ở A. niger mà không sử dụng gen kháng kháng sinh.
• Nội dung 5: Áp dụng hệ thống chuyển gen thu được để tăng cường sự biểu hiện của gen phyA mã hóa enzyme phytase ở các chủng đột biến xóa gen.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là nấm sợi Aspergillus oryzae (các chủng RIB40, AUT1-PlD) và Aspergillus niger (các chủng CBS 113.46, N402), cùng vi khuẩn trung gian Agrobacterium tumefaciens AGL1 và vi khuẩn nhân dòng Escherichia coli DH5α. Phạm vi không gian của các thực nghiệm tập trung tại Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein (KLEPT), Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Phạm vi thời gian nghiên cứu và công bố hoàn thành vào năm 2023.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các mốc nghiên cứu lịch sử và hiện đại về chi Aspergillus cũng như các công nghệ biến nạp di truyền trên nấm sợi:

• Lịch sử phân loại và hệ gen: Chi Aspergillus được Pier Antonio Micheli mô tả lần đầu vào năm 1729 dựa trên cấu trúc cuống sinh bào tử giống thiết bị vảy nước thánh (aspergillum). Năm 1867, Philippe Edouard Léon van Tieghem mô tả loài A. niger. Năm 1926, Thom và Church xuất bản chuyên khảo định danh chi nấm này. Về hệ gen học, năm 2005 đánh dấu bước chuyển khi trình tự hệ gen của A. fumigatus (29,3 Mb; 9.926 gen), A. nidulans và A. oryzae RIB40 (37,6 Mb; 12.074 gen, bởi Machida và cộng sự) được công bố đồng thời trên tạp chí Nature. Năm 2007, Pel và cộng sự công bố hệ gen chủng công nghiệp A. niger CBS 513.88 (33,9 Mb; 14.165 gen), tiếp đó là công bố hệ gen chủng sản xuất axit citric ATCC 1015 của Andersen và cộng sự (2011), cùng 10 trình tự hệ gen mới thuộc chi Aspergillus được de Vries và cộng sự công bố năm 2017.
• Ứng dụng công nghiệp: Takamine (1894) thương mại hóa chế phẩm enzyme Taka-diastase từ A. oryzae. Christensen (1988) và Huge-Jensen (1989) thiết lập hệ thống biểu hiện enzyme khác nguồn ở A. oryzae với protease aspartic và lipase từ Rhizomucor miehei. Godfrey và Reichelt (1983) xác nhận tính an toàn của protease và β-galactosidase từ A. niger.
• Phương pháp chuyển gen ở nấm sợi: Kỹ thuật chuyển gen thông qua tế bào trần (PMT) sử dụng PEG và CaCl2 được thiết lập bởi Ballance và cộng sự (1983) cũng như Tilburn và cộng sự (1983). Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện được thử nghiệm trên A. nidulans (Richey và cộng sự, 1989). Phương pháp dùng sóng xung kích (shock wave) với xung áp suất 150 MPa được Navarro và cộng sự áp dụng trên A. niger, Trichoderma reesei, Phanerochaete chrysosporium và Fusarium oxysporum. Kỹ thuật chuyển gen qua Agrobacterium tumefaciens (ATMT) được De Groot và cộng sự (1998) tiên phong ứng dụng trên nấm sợi, kế thừa hệ thống vector nhị thể (binary vector) do Hoekema, de Framond và cộng sự phát triển từ năm 1983. Gouka và cộng sự (1999) chứng minh hiệu suất ATMT cao hơn 400-600 lần so với PMT ở A. awamori. Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Trần Văn Tuấn và cộng sự (2014, 2018) đã triển khai ATMT trên Penicillium digitatum, Purpureocillium lilacinum và bước đầu trên A. oryzae.
• Marker chọn lọc: Các gen kháng kháng sinh phổ biến gồm hph/hpt (kháng hygromycin B từ E. coli) và nat (kháng nourseothricin từ Streptomyces noursei). Về marker dinh dưỡng, hệ thống gen pyrG mã hóa orotidine-5'-monophosphate decarboxylase tham gia con đường sinh tổng hợp pyrimidine được phân lập bởi van Hartingsveldt và cộng sự (1987), cho phép chọn lọc ngược bằng axit 5-fluoroorotic (5-FOA). Marker hisB (locus An15g00610 ở A. niger, độ tương đồng 57,6% với protein IGPD - imidazoleglycerol-phosphate dehydratase mã hóa bởi HIS3 của Saccharomyces cerevisiae) được nghiên cứu bởi van Leeuwe và cộng sự (2018).

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là: khắc phục các hạn chế cố hữu của ATMT trên nấm sợi A. niger, loại bỏ sự phụ thuộc vào chất kháng sinh đắt đỏ và độc hại; thiết lập hệ thống marker dinh dưỡng đôi (hisB và pyrG) kết hợp chiến lược tái sử dụng marker duy nhất (pyrG); giải quyết vấn đề tần số tích hợp ngẫu nhiên qua cơ chế nối đầu tận không tương đồng (NHEJ) nhằm nâng cao tỷ lệ tái tổ hợp tương đồng (HR) phục vụ xóa gen đích và biểu hiện enzyme tái tổ hợp.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết sinh học phân tử vi nấm, bao gồm:

1. Cơ chế biến nạp qua Agrobacterium tumefaciens: Dựa vào khả năng của vi khuẩn mang plasmid Ti chuyển đoạn T-DNA nằm giữa hai trình tự biên (Left Border - LB và Right Border - RB) vào nhân tế bào nấm dưới sự kích hoạt của các gen độc lực (vir) bởi hợp chất phenolic (acetosyringone).
2. Cơ chế tích hợp DNA ngoại lai: Tái tổ hợp tương đồng (Homologous Recombination - HR) cho phép thay thế hoặc xóa đoạn gen đích chính xác khi đoạn T-DNA mang hai nhánh tương đồng upstream và downstream; đối lập với cơ chế nối đầu tận không tương đồng (Non-Homologous End Joining - NHEJ) gây tích hợp ngẫu nhiên.
3. Cơ chế bổ trợ dinh dưỡng: Chủng đột biến mất chức năng gen hisB mất khả năng sinh tổng hợp histidine, không thể phát triển trên môi trường tối thiểu (MM). Khi nhận lại gen hisB lành lặn từ vector chuyển gen, tế bào phục hồi kiểu hình nguyên dưỡng. Tương tự, đột biến hỏng gen pyrG cần bổ sung uridine/uracil để sinh trưởng và có khả năng sống trên môi trường chứa 5-FOA; đưa pyrG chức năng vào sẽ giúp chọn lọc thể chuyển gen trên môi trường không chứa uridine.
4. Khung điều hòa phiên mã: Khảo sát tác động của 5 yếu tố điều hòa then chốt: AmyR (điều hòa phân giải tinh bột, nhận biết trình tự CGGN8(C/A)GG), LaeA (yếu tố điều hòa nhân gắn liền với trao đổi chất thứ cấp và sản xuất axit hữu cơ), PrtR/PrtT (điều hòa biểu hiện các protease ngoại bào), StuA (yếu tố phiên mã thuộc họ APSES kiểm soát phát triển vô tính và chu kỳ tế bào), và VeA (kiểm soát biệt hóa hình thái theo tín hiệu ánh sáng).

Phương pháp thực nghiệm được triển khai đồng bộ qua các kỹ thuật:

• Tạo dòng và thiết kế vector: Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB/phenol-chloroform, tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA. Thiết kế vector nhị thể dựa trên các vector khung pKG2, pKO2, pEX1, pEX2 để tạo vector phục vụ xóa gen (như pKH1) và vector biểu hiện gen phyA.
• Chuyển gen ATMT: Bào tử nấm được ủ đồng nuôi cấy với tế bào Ag. tumefaciens AGL1 đã cảm ứng bằng acetosyringone (AS) trên màng nitrocellulose hoặc giấy lọc đặt trên đĩa môi trường cảm ứng IM rắn. Sau đồng nuôi cấy, màng lọc được chuyển sang môi trường chọn lọc MM chứa kháng sinh cefotaxime/timentin để loại bỏ vi khuẩn và sàng lọc các thể nấm nguyên dưỡng.
• Phân tích phân tử và kiểu hình: Kiểm tra thể chuyển gen bằng phản ứng PCR chẩn đoán vị trí tích hợp. Định lượng số bản sao gen phyA tích hợp và mức độ biểu hiện phiên mã thông qua Real-time PCR (sử dụng phương pháp so sánh ngưỡng chu kỳ Ct). Quan sát phát huỳnh quang DsRed bằng kính hiển vi huỳnh quang.
• Đánh giá hoạt tính sinh học: Đo đường kính vòng phân giải phytate trên môi trường thạch PSM (chứa natri phytate và CaCl2). Định lượng hoạt tính enzyme phytase tiết trong môi trường nuôi cấy lỏng thông qua phản ứng so màu giải phóng phosphate vô cơ.

Nhóm vi sinh vật / Vector	Tên chủng / Vector	Đặc điểm kiểu gen / Tính chất sinh học	Nguồn gốc trong luận án
Vi khuẩn	E. coli DH5α	F- endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 deoR Δ(lacZYA-argF)	Khởi động [58]
	Ag. tumefaciens AGL1	C58, recA::bla, pTiBo542ΔT-DNA, Mop+, CbR	Khởi động [79]
Nấm sợi A. oryzae	RIB40	Chủng phân lập tự nhiên, kiểu dại	Khởi động [89]
	RIB40ΔpyrG	Chủng khuyết dưỡng uridine/uracil (ΔpyrG)	Nghiên cứu trước [106]
	RIB40ΔhisB	Chủng khuyết dưỡng histidine (pyrG+, ΔhisB)	Tạo ra trong luận án
	RIB40ΔhisBΔpyrG	Chủng khuyết dưỡng kép (ΔhisB, ΔpyrG)	Tạo ra trong luận án
	AUT1-PlD	niaD- sC- adeA- ΔargB::adeA ΔtppA::argB ΔpepE::adeA aut1- ΔligD ΔpyrG	Khởi động [169]
	AUT1ΔhisB	Chủng khuyết dưỡng histidine cải biến từ AUT1-PlD (ΔhisB::pyrG)	Tạo ra trong luận án
	AUT1ΔhisBΔpyrG	Chủng khuyết dưỡng histidine và uridine/uracil	Tạo ra trong luận án
Nấm sợi A. niger	CBS 113.46	Chủng phân lập từ tự nhiên	Khởi động [7]
	CBS 113.46ΔpyrG	Chủng đột biến khuyết dưỡng uridine/uracil	Phòng Genomic (KLEPT)
	CBS 113.46ΔhisB	Chủng khuyết dưỡng histidine (pyrG+, ΔhisB)	Tạo ra trong luận án
	N402	Chủng chuẩn phòng thí nghiệm (từ chủng NRRL3)	Khởi động [26]
	N402ΔpyrG	Chủng đột biến khuyết dưỡng uridine/uracil	Phòng Genomic (KLEPT)
	N402ΔhisB	Chủng khuyết dưỡng histidine (pyrG+, ΔhisB)	Tạo ra trong luận án
	N402ΔhisBΔpyrG	Chủng khuyết dưỡng kép (ΔhisB, ΔpyrG)	Tạo ra trong luận án
Vector khung	pKG2	Vector nhị thể mang marker pyrG từ A. niger	Phòng Genomic (KLEPT)
	pKO2	Vector nhị thể mang gen kháng nourseothricin (nat)	Phòng Genomic (KLEPT)
	pEX1	Vector nhị thể mang cấu trúc gpdA promoter - GFP - trpC terminator, marker pyrG (A. oryzae)	Nghiên cứu trước [107]
	pEX2	Vector nhị thể mang cấu trúc gpdA promoter - DsRed - trpC terminator, marker pyrG (A. oryzae)	Nghiên cứu trước [107]

Môi trường nuôi cấy được chuẩn hóa bao gồm: LB (nuôi vi khuẩn); DPY và PDA (thu bào tử nấm); MM (môi trường tối thiểu sàng lọc nấm); IM lỏng và IM rắn (môi trường cảm ứng ATMT chứa muối MM 2,5X, MES, glucose, glycerol, uracil, uridine); M + Met (chứa methionine); CDA (Czapek-Dox Agar nuôi kiểm tra hình thái); PSM (chứa natri phytate 0,4%, CaCl2 0,2% để sàng lọc phytase). Hóa chất và mồi PCR do PHUSA Biochem và IDT cung cấp.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan các vấn đề nghiên cứu

Chương 1 tổng thuật chi tiết cơ sở sinh học và công nghệ của đối tượng nghiên cứu:

• Đặc điểm sinh học và hệ gen: Chi Aspergillus có vách ngăn sợi nấm, phân nhánh nhiều; cấu trúc sinh sản vô tính đặc trưng gồm tế bào chân, cuống sinh bào tử (conidiophore), bọng phồng đỉnh mang các lớp thể bình (phialide) sinh chuỗi bào tử đính (conidia). A. oryzae có hệ sợi đường kính 5-7 μm, bào tử vàng lục hoặc vàng hoa cau; hệ gen giải trình tự đạt 37,6 Mb với 8 nhiễm sắc thể, chứa 12.074 gen mã hóa, mang nhiều cụm gen phân giải carbohydrate (đặc biệt là sự nhân đôi gen mã hóa α-amylase từ 1 đến 4 bản sao liên quan đến transposon Tc1/mariner). A. niger có cuống sinh bào tử dài 300-400 μm, bọng cầu bao phủ bởi thể bình sơ cấp và thứ cấp sinh bào tử đen có gai nhọn (đường kính 3,5-5 μm); hệ gen chủng CBS 513.88 đạt 33,9 Mb gồm 14.165 gen mã hóa protein, rất giàu gen tiết glucoamylase A và tổng hợp axit citric.
• So sánh các phương pháp chuyển gen: PMT là phương pháp phổ biến nhưng hiệu quả biến nạp thấp, cần enzyme ly giải vách tế bào đắt tiền, tế bào trần dễ vỡ do sốc thẩm thấu. Xung điện cần thiết bị đắt tiền và ít dùng cho nấm sợi. Sóng xung kích (shock wave) có thể tạo lỗ thủng màng nhờ hiện tượng tạo bọt khí vi mô ở áp suất 150 MPa nhưng gây tổn thương nhiều phân tử DNA và tạo tích hợp đa bản sao bất thường. Trong khi đó, ATMT cho phép sử dụng trực tiếp bào tử nguyên vẹn, hiệu suất chuyển gen cao (đạt tới 97% tại một số loài, vượt trội PMT 400-600 lần ở A. awamori), ưu tiên tích hợp bản sao đơn lẻ vào hệ gen.
• Đánh giá marker chọn lọc: Marker kháng kháng sinh (hph, nat) có hạn chế lớn do A. oryzae kháng tự nhiên nhiều loại kháng sinh, còn A. niger đòi hỏi nồng độ chất chọn lọc rất cao, chi phí lớn và tiềm ẩn nguy cơ phát tán gen kháng. Marker dinh dưỡng (pyrG, hisB, argB, niaD) khắc phục được các nhược điểm này. Trong đó, pyrG là marker có thể chọn lọc hai chiều (dương và âm qua 5-FOA), còn hisB (IGPD) là marker dinh dưỡng ổn định, không làm biến đổi hình thái sinh lý nấm ngoài tính khuyết dưỡng histidine.
• Phân tích các yếu tố điều hòa và chiến lược biểu hiện: Làm rõ chức năng của AmyR, LaeA, PrtR/PrtT, StuA và VeA. Tổng kết các giải pháp nâng cao biểu hiện enzyme ngoại bào ở A. niger: tối ưu promoter cơ định (gpdA, mbfA) hoặc cảm ứng; cải biến vùng 5'-UTR (ntp303, bổ sung trình tự poly(CAA)); dung hợp miền xúc tác GlaAG1 (giúp tăng sản lượng protein biểu hiện lên tới 1000 lần); tích hợp gen vào các locus biểu hiện cao (glaA, α-amylase); giảm hoạt tính protease qua xóa gen mã hóa (pepA, pepAa-d) hoặc xóa yếu tố phiên mã prtT (giảm biểu hiện 32 gen protease); và cải biến hình thái hệ sợi nấm qua điều biến các gen racA, aplD, arfA, chsC, flbA.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả hệ thống vật liệu, hóa chất, thiết bị và các quy trình kỹ thuật:

• Chuẩn bị hệ thống chủng vi sinh vật khởi động gồm 2 chủng vi khuẩn (E. coli DH5α, Ag. tumefaciens AGL1) và 14 chủng nấm sợi thuộc hai loài A. oryzae và A. niger (chi tiết tại Bảng 2.1).
• Khung vector nhị thể: pKG2 mang marker pyrG của A. niger; pKO2 mang gen nat dưới sự kiểm soát của promoter gpdA (A. nidulans); pEX1 và pEX2 mang cấu trúc biểu hiện GFP và DsRed với marker pyrG của A. oryzae.
• Quy trình nuôi cấy và thu nhận bào tử trên môi trường PDA và DPY; chuẩn bị dịch tế bào vi khuẩn Ag. tumefaciens trong môi trường cảm ứng IM lỏng có bổ sung 200 μM acetosyringone (AS) và đệm MES 1M (pH 5,3).
• Quy trình đồng nuôi cấy ATMT: Trộn huyền phù bào tử nấm với dịch vi khuẩn đã cảm ứng, trải lên màng đặt trên môi trường IM rắn (bổ sung glucose, glycerol, uracil, uridine). Nuôi cấy ở 22-25°C trong 48 giờ. Sau đó chuyển màng sang môi trường chọn lọc MM bổ sung kháng sinh diệt trừ vi khuẩn và chọn lọc thể chuyển gen dựa trên sự phục hồi nguyên dưỡng histidine hoặc uridine.
• Phương pháp tạo dòng vector xóa gen: Sử dụng kỹ thuật PCR nối đoạn để ghép các đoạn tương đồng upstream (5'-flank) và downstream (3'-flank) bao quanh marker chọn lọc (hisB hoặc pyrG), chèn vào vùng T-DNA của vector nhị thể pKH1.
• Kỹ thuật phân tích kiểu hình và sinh hóa: Sàng lọc hoạt tính phytase trên môi trường thạch PSM, đo đường kính vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc; nuôi cấy lỏng định lượng hoạt tính enzyme; tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA và thực hiện Real-time PCR để xác định số bản sao gen phyA tích hợp và mức độ biểu hiện phiên mã.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm tương ứng với 5 nội dung nghiên cứu:

1. Phát triển hệ thống chuyển gen mới với marker chọn lọc gen dinh dưỡng hisB

Tác giả xác định ortholog của gen HIS3 nấm men trong hệ gen A. niger là hisB (An15g00610). Bằng kỹ thuật trao đổi chéo tương đồng, tác giả đã tạo thành công chủng đột biến mất đoạn hisB ở cả hai loài: A. oryzae RIB40ΔhisB và A. niger N402ΔhisB, CBS 113.46ΔhisB. Các chủng đột biến này hoàn toàn không sinh trưởng trên môi trường tối thiểu MM trừ khi được bổ sung L-histidine ngoại sinh. Tiến hành tối ưu hóa quy trình ATMT sử dụng marker hisB: xác định nồng độ acetosyringone tối ưu là 200 μM, tỷ lệ bào tử nấm và tế bào vi khuẩn phù hợp, thời gian đồng nuôi cấy 48 giờ ở 22-25°C. Đưa vector mang gen chỉ thị huỳnh quang DsRed cùng marker hisB vào nấm qua ATMT chứng minh các thể chuyển gen nguyên dưỡng sinh trưởng bình thường trên MM và phát huỳnh quang đỏ đồng nhất dưới kính hiển vi huỳnh quang.

2. Xây dựng hệ thống chuyển gen trợ dưỡng kép và vector nhị thể pKH1

Từ các chủng đột biến khuyết dưỡng histidine (ΔhisB), tác giả tiếp tục loại bỏ gen pyrG để tạo ra các chủng nấm mang kiểu hình khuyết dưỡng kép ΔhisBΔpyrG trên cả A. oryzae (RIB40ΔhisBΔpyrG, AUT1ΔhisBΔpyrG) và A. niger (N402ΔhisBΔpyrG, CBS 113.46ΔhisBΔpyrG). Các chủng này đòi hỏi đồng thời cả histidine và uridine/uracil trong môi trường sinh trưởng. Tác giả thiết kế thành công vector nhị thể thế hệ mới pKH1 tích hợp các vị trí cắt giới hạn thuận lợi cho việc lắp ráp cassette xóa gen. Sử dụng hệ thống 2 marker độc lập (hisB và pyrG), tác giả chứng minh khả năng đưa đồng thời 2 gen biểu hiện độc lập vào cùng một tế bào nấm sợi thông qua hai vòng biến nạp ATMT liên tiếp mà không gây tương tác bất lợi.

3. Ứng dụng ATMT phân tích chức năng các gen điều hòa

Sử dụng hệ thống ATMT mới với marker hisB, tác giả thực hiện xóa gen điều hòa laeA ở A. oryzae và A. niger. Chủng đột biến ΔlaeA biểu hiện sự biến đổi rõ rệt về sắc tố khuẩn lạc, giảm khả năng axit hóa môi trường và suy giảm tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp. Việc đưa gen laeA lành lặn trở lại qua vector bổ trợ đã phục hồi hoàn toàn kiểu hình kiểu dại, khẳng định vai trò của LaeA. Tiếp đó, tác giả tiến hành xóa gen stuA. Các chủng đột biến ΔstuA bị khiếm khuyết nghiêm trọng trong quá trình hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử đính (conidiophore bị ngắn và tiêu giảm thể bình), tuy nhiên sự hình thành bào tử có thể được cải thiện một phần khi nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp.

Luận án tiến hành so sánh đối chứng hiệu quả xóa 5 gen điều hòa (amyR, laeA, prtT, stuA, veA) ở hai loài nấm sợi sử dụng marker hisB:

Loài nấm sợi	Gen điều hòa mục tiêu	Số thể chuyển gen phân tích	Tỷ lệ thể đột biến xóa gen chính xác (%)
Aspergillus oryzae	amyR	20	25,0%
	laeA	24	29,2%
	prtT	20	20,0%
	stuA	22	27,3%
	veA	18	22,2%
Aspergillus niger	amyR	25	8,0%
	laeA	30	10,0%
	prtT	24	8,3%
	stuA	28	10,7%
	veA	22	9,1%

Số liệu cho thấy tỷ lệ tái tổ hợp tương đồng để xóa gen ở A. oryzae dao động từ 20,0% đến 29,2%, trong khi ở A. niger đạt tỷ lệ thấp hơn nhiều (8,0% đến 10,7%), phản ánh tính ưu thế của con đường nối đầu tận không tương đồng (NHEJ) ở A. niger.

4. Chiến lược nâng cao hiệu quả xóa gen ở A. niger và tái sử dụng marker pyrG

Để giải quyết hiệu quả xóa gen thấp ở A. niger, tác giả thiết lập hai chiến lược:

• Chiến lược tái sử dụng marker pyrG: Tạo cassette xóa gen mang marker pyrG được bao bọc bởi hai trình tự lặp lại trực tiếp (direct repeats). Sau khi xóa gen đích thành công nhờ chọn lọc nguyên dưỡng uridine, thể đột biến được nuôi cấy trên môi trường chứa 5-FOA để chọn lọc sự kiện tái tổ hợp nội phân tử giữa hai đoạn lặp, loại bỏ hoàn toàn khung đọc mã của pyrG. Chủng thu được trở lại trạng thái khuyết dưỡng uridine (ΔpyrG), cho phép sử dụng lại chính marker này để xóa gen kế tiếp. Tác giả đã ứng dụng thành công chiến lược này để tạo chủng đột biến xóa kép ΔlaeAΔstuA trên A. niger.
• Chiến lược tăng tỷ lệ xóa gen đích bằng chọn lọc âm: Thiết kế cấu trúc chuyển gen mang marker dương hisB tại vị trí thay thế gen đích và marker pyrG nằm ngoài hai nhánh tương đồng (ở vùng biên T-DNA). Ở các thể tích hợp ngẫu nhiên qua cơ chế NHEJ, toàn bộ đoạn T-DNA bao gồm cả pyrG được tích hợp, khiến tế bào biểu hiện pyrG và bị tiêu diệt trên môi trường chọn lọc chứa 5-FOA. Ngược lại, sự kiện tái tổ hợp tương đồng (HR) chỉ tích hợp marker hisB và loại bỏ pyrG, giúp tế bào sống sót trên môi trường MM + histidine-free + 5-FOA. Chiến lược này giúp loại bỏ hầu hết các dòng chèn ngẫu nhiên, nâng cao tỷ lệ thu nhận thể đột biến xóa gen đích thực sự ở A. niger.

5. Khai thác hệ thống chuyển gen mới để biểu hiện enzyme phytase tái tổ hợp

Tác giả thiết kế cấu trúc biểu hiện mang gen phyA (mã hóa phytase) dưới sự điều hòa của promoter mạnh và đưa vào các chủng nấm sợi đột biến. Kiểm tra Real-time PCR trên các thể chuyển gen ở A. oryzae và A. niger cho thấy số bản sao phyA tích hợp dao động từ 1 đến 4 bản sao quy đổi. Mức độ biểu hiện phiên mã của phyA tỷ lệ thuận với số bản sao tích hợp ở mức tải hợp lý. Đánh giá hoạt tính phytase trên môi trường thạch PSM và dịch lên men lỏng cho thấy các chủng chuyển gen có hoạt tính phân giải phytate vượt trội so với chủng kiểu dại. Đặc biệt, khi biểu hiện gen phyA trên nền chủng đột biến xóa kép A. niger N402ΔlaeAΔstuA, hoạt tính phytase tiết ra môi trường đạt mức cao nhất, chứng minh hiệu quả của việc kết hợp cải biến hình thái/điều hòa sinh lý với biểu hiện enzyme tái tổ hợp.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các đóng góp mới về lý luận và thực tiễn, được tác giả đúc kết cụ thể:

1. Đã xây dựng được phương pháp tối ưu cho chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở nấm sợi A. oryzae và A. niger dựa trên cơ chế trợ dưỡng đơn (trợ dưỡng histidine với marker hisB) và trợ dưỡng kép (trợ dưỡng histidine và uridine/uracil với hai marker hisB và pyrG), loại bỏ hoàn toàn việc sử dụng gen kháng kháng sinh.
2. Đã phát triển giải pháp tối ưu để xóa nhiều gen ở cùng một chủng nấm A. niger với việc chỉ sử dụng một marker chọn lọc duy nhất là pyrG thông qua cơ chế tái sử dụng marker dựa trên chọn lọc 5-FOA.
3. Đã tìm ra giải pháp mới để tăng cường hiệu quả xóa gen ở A. niger bằng cách kết hợp marker hisB để xóa gen mục tiêu và marker pyrG làm công cụ chọn lọc âm nhằm ức chế sinh trưởng của các thể tích hợp ngẫu nhiên (NHEJ).
4. Đã xây dựng bộ dữ liệu toàn diện về kiểu hình và đặc tính sinh học của các chủng đột biến xóa gen mã hóa protein điều hòa (amyR, laeA, prtT, stuA, veA) và các chủng tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme phytase (phyA) ở A. oryzae và A. niger.

Về kiến nghị và giải pháp, luận án đề xuất tiếp tục khai thác hệ thống vector nhị thể pKH1 và các chủng nền khuyết dưỡng kép đã tạo ra để biểu hiện các enzyme công nghiệp có giá trị khác như laccase, xylanase, cellulase; đồng thời nghiên cứu ứng dụng hệ thống này trên các chủng nấm sợi công nghiệp phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Về mặt hạn chế, các kết quả của luận án chủ yếu được xác lập trên các chủng phòng thí nghiệm chuẩn (A. oryzae RIB40, AUT1-PlD; A. niger N402, CBS 113.46), chưa tiến hành thử nghiệm biến nạp trên diện rộng các chủng hoang dại phân lập trực tiếp từ các nhà máy sản xuất lên men công nghiệp trong nước. Bên cạnh đó, hiệu suất tái tổ hợp tương đồng tự nhiên ở A. niger vẫn còn thấp do hệ thống sửa chữa DNA theo con đường nối đầu tận không tương đồng (NHEJ) hoạt động mạnh; luận án sử dụng giải pháp chọn lọc âm để loại bỏ thể chèn ngẫu nhiên nhưng chưa trực tiếp làm bất hoạt các gen thuộc phức hệ NHEJ (như ku70, ku80 hoặc ligD ở A. niger). Số lượng gen điều hòa khảo sát dừng lại ở 5 yếu tố phiên mã và enzyme mô hình là phytase.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được xác định:

• Hoàn thiện chủng nền A. niger thiếu hụt hệ thống NHEJ (đột biến Δku70 hoặc ΔligD) kết hợp với các marker dinh dưỡng hisB/pyrG nhằm nâng tỷ lệ tái tổ hợp tương đồng lên mức tối đa.
• Tích hợp hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR-Cas với phương thức chuyển gen ATMT để thực hiện can thiệp đa gen chính xác mà không cần để lại marker chọn lọc.
• Mở rộng ứng dụng biểu hiện các enzyme xử lý môi trường (laccase xử lý nước thải dệt nhuộm) và các protein dược liệu trên chủng nền đột biến xóa protease.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn trong lĩnh vực công nghệ sinh học vi sinh vật và kỹ thuật di truyền nấm sợi:

• Đối với nghiên cứu sinh và học viên cao học: Luận án cung cấp cẩm nang chi tiết về kỹ thuật chuyển gen ATMT trên nấm sợi chi Aspergillus, quy trình thiết kế vector nhị thể, các công thức môi trường chuyên biệt (IM lỏng, IM rắn, MM, CDA, PSM) và phương pháp đánh giá chức năng gen thông qua phân tích kiểu hình và biểu hiện phiên mã.
• Đối với giảng viên và các nhà nghiên cứu di truyền vi sinh vật: Tài liệu cung cấp dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác về hiệu quả xóa gen tương đối giữa các locus điều hòa (amyR, laeA, prtT, stuA, veA), cơ chế tái sử dụng marker dinh dưỡng pyrG, và giải pháp chọn lọc âm chống tích hợp ngẫu nhiên.
• Đối với các đơn vị sản xuất và cơ quan quản lý: Nghiên cứu đưa ra định hướng công nghệ sạch cho sản xuất chế phẩm sinh học: việc loại bỏ gen kháng kháng sinh trong các chủng nấm tái tổ hợp đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn an toàn sinh học GRAS của FDA, tạo thuận lợi cho quy trình đăng ký cấp phép lưu hành sản phẩm enzyme trong công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.

Phần đáng tham khảo nhất là Chương 2 (chi tiết thành phần môi trường và quy trình biến nạp ATMT) và Chương 3 (sơ đồ nguyên lý vector pKH1, quy trình tái sử dụng marker pyrG, và chiến lược chọn lọc âm bằng marker kép).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao luận án lựa chọn phát triển phương pháp chuyển gen ATMT thay vì tiếp tục sử dụng phương pháp tế bào trần (PMT)?
Phương pháp chuyển gen thông qua tế bào trần (PMT) đòi hỏi phải sử dụng enzyme đắt tiền để ly giải vách tế bào nấm, quá trình xử lý làm tế bào trần suy giảm sức sống và kết quả thí nghiệm thiếu ổn định giữa các lần lặp lại. Ngược lại, phương pháp ATMT sử dụng trực tiếp bào tử nấm nguyên vẹn, quy trình đơn giản hơn, cho hiệu suất chuyển gen cao hơn (ở A. awamori cao hơn tới 400-600 lần so với PMT) và có đặc tính ưu việt là ưu tiên tích hợp đơn bản sao vào hệ gen vật chủ.

2. Marker dinh dưỡng hisB có nguồn gốc và chức năng sinh hóa như thế nào trong hệ thống chuyển gen của luận án?
Marker hisB là một ortholog duy nhất (mã số locus An15g00610) trong hệ gen của A. niger, có độ tương đồng 57,6% về trình tự protein với gen HIS3 của nấm men Saccharomyces cerevisiae. Gen này mã hóa enzyme imidazoleglycerol-phosphate dehydratase (IGPD), tham gia vào con đường sinh tổng hợp L-histidine. Đột biến xóa đoạn gen này tạo ra các chủng khuyết dưỡng histidine chỉ sống được khi bổ sung histidine ngoại sinh. Khi đưa gen hisB chức năng vào vector chuyển gen, thể chuyển gen phục hồi kiểu hình nguyên dưỡng và sinh trưởng bình thường trên môi trường tối thiểu MM mà không gây ra bất kỳ biến đổi hình thái hay trao đổi chất bất lợi nào khác.

3. Luận án giải quyết hạn chế về số lượng marker chọn lọc khi muốn xóa nhiều gen liên tiếp trên cùng một chủng nấm như thế nào?
Tác giả đã phát triển giải pháp tái sử dụng marker chọn lọc duy nhất là pyrG. Cấu trúc xóa gen được thiết kế sao cho marker pyrG được kẹp giữa hai trình tự lặp lại trực tiếp. Sau khi chuyển gen và chọn lọc thành công thể đột biến nguyên dưỡng uridine, chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường thạch chứa axit 5-fluoroorotic (5-FOA). Sự kiện tái tổ hợp tương đồng nội phân tử giữa hai đoạn lặp sẽ loại bỏ hoàn toàn gen pyrG, giúp tế bào sống sót trên môi trường 5-FOA và quay trở lại trạng thái khuyết dưỡng uridine (ΔpyrG). Nhờ đó, marker pyrG có thể được tiếp tục sử dụng cho các vòng xóa gen tiếp theo trên cùng một chủng nấm.

4. Sự khác biệt về hiệu quả xóa gen định hướng giữa A. oryzae và A. niger trong các thí nghiệm của luận án là gì?
Khi khảo sát trên 5 gen điều hòa (amyR, laeA, prtT, stuA, veA) sử dụng marker hisB, tỷ lệ xóa gen chính xác qua cơ chế trao đổi chéo tương đồng ở A. oryzae đạt từ 20,0% đến 29,2%. Trong khi đó, ở A. niger, tỷ lệ này thấp hơn rõ rệt, chỉ dao động từ 8,0% đến 10,7%. Nguyên nhân do ở A. niger, con đường sửa chữa đứt gãy sợi kép DNA bằng cơ chế nối đầu tận không tương đồng (NHEJ) chiếm ưu thế áp đảo so với cơ chế tái tổ hợp tương đồng (HR), dẫn đến phần lớn các thể chuyển gen bị tích hợp ngẫu nhiên.

5. Cơ chế chọn lọc âm nhằm loại bỏ các thể tích hợp ngẫu nhiên ở A. niger được thiết lập ra sao?
Tác giả thiết kế vector mang marker hisB nằm giữa hai nhánh tương đồng của gen đích, đồng thời gắn thêm marker pyrG ở vị trí ngoài vùng trao đổi chéo (nằm sát biên T-DNA). Trong sự kiện tái tổ hợp tương đồng (HR), chỉ đoạn DNA giữa hai nhánh tương đồng mang marker hisB được tích hợp vào hệ gen, còn đoạn pyrG bị loại bỏ, giúp tế bào sinh trưởng được trên môi trường thiếu histidine có bổ sung 5-FOA. Ngược lại, trong sự kiện tích hợp ngẫu nhiên qua NHEJ, toàn bộ đoạn T-DNA mang cả hisB và pyrG đều bị gắn vào hệ gen; sự có mặt của enzyme do pyrG mã hóa sẽ biến đổi 5-FOA thành chất độc ức chế sinh trưởng, tiêu diệt các thể chèn ngẫu nhiên và chỉ giữ lại các thể xóa gen chính xác.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Thái Hạnh Dung đã hoàn thành việc nghiên cứu, thiết kế và tối ưu hóa hệ thống chuyển gen mới trên hai loài nấm sợi công nghiệp Aspergillus oryzae và Aspergillus niger thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Công trình đã giải quyết triệt để vấn đề phụ thuộc vào gen kháng kháng sinh bằng việc ứng dụng các marker trợ dưỡng tự thân hisB và pyrG, đồng thời phát triển thành công giải pháp tái sử dụng marker và chiến lược chọn lọc âm giúp nâng cao hiệu suất xóa gen đích ở A. niger. Các chủng đột biến xóa gen điều hòa sinh lý, biệt hóa hình thái và chủng biểu hiện enzyme phytase tái tổ hợp thu được trong luận án là nguồn vật liệu sinh học giá trị, cung cấp cơ sở khoa học và công nghệ vững chắc cho việc phát triển các chủng nấm sợi sản xuất enzyme quy mô công nghiệp an toàn và hiệu quả.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Giới thiệu về chi Aspergillus Aspergillus là một trong những chi nấm lâu đời nhất được đặt tên bởi Pier Antonio Micheli vào năm 1729 (Hình 1. Khi quan sát cấu trúc sinh bào tử của chi nấm này qua kính hiển vi, Micheli đã nhớ đến một thiết bị được giáo sĩ Công giáo La Mã sử dụng để vảy nước thánh gọi là asperges. Kể từ năm 1926, sau khi Tom và Church xuất bản sách chuyên khảo lớn đầu tiên về chi nấm này, Aspergillus đã trở thành một trong những nhóm nấm mốc được biết đến và được nghiên cứu nhiều nhất.

Sự phổ biến của chúng trong môi trường tự nhiên, khả năng dễ nuôi cấy trên môi trường nhân tạo và tầm quan trọng kinh tế của một số loài Aspergillus đã thu hút nhiều nhà khoa học. Aspergillus phát triển mạnh dưới dạng sinh vật hoại sinh trên thảm thực vật mục nát, trên các nguyên liệu đa dạng như phân, mô người và giấy da cổ [16]. Hình ảnh Aspergillus conidiophore mô tả bởi Pier Micheli [45] 1. Đặc điểm phân loại Đặc điểm xác định của chi Aspergillus là cấu trúc mang bào tử giống aspergillum.

Đây là đặc điểm hiển vi quan trọng nhất được sử dụng trong phân loại Aspergillus. Trong quá trình biệt hóa sợi nấm, một số tế bào phình to, hình thành các tế bào chân. Nhánh sợi nấm phát triển từ tế bào chân gọi là cuống sinh bào tử (conidiophore), mở rộng ở đỉnh tạo thành một túi hình tròn, hình elip hoặc hình que. Vùng giàu dinh dưỡng của túi là một lớp tế bào gọi là phialide (thể bình), hay steigmata trong tài liệu cũ, tạo ra chuỗi dài các bào tử gọi là conidia (bào tử đính) 14 hoặc conidiospore nhờ quá trình sinh sản vô tính.

Kích thước và sự sắp xếp của các conidia cũng như màu sắc của bào tử là đặc điểm nhận dạng quan trọng. Ví dụ, các loài trong nhóm A. niger có bào tử màu đen, nhóm A. ochraceus có màu vàng đến nâu, trong khi A.

flavus có màu xanh lá cây. Các đặc điểm nuôi cấy chính được sử dụng trong việc xác định loài là màu sắc của khuẩn lạc, tốc độ sinh trưởng và khả năng chịu nhiệt. Aspergillus có đặc điểm hình thái và sinh trưởng khác nhau trên các nguồn dinh dưỡng khác nhau. Các nhà phân loại học hiện nay thường nuôi cấy các chủng nấm trên một số loại môi trường nhất định, ở một số nhiệt độ khác nhau để xác định loài [9].

Ngoài conidiophore, các cấu trúc hình thái khác cũng hữu ích cho việc xác định, nhận dạng nấm, bao gồm cleistothecia (quả thể sinh sản hữu tính), tế bào Hülle (còn gọi là nursing cells, một loại tế bào đặc biệt giúp nuôi dưỡng cleistothecia) và sclerotia (một dạng tế bào ở dạng thể nghỉ). Cả cleistothecia và sclerotia đều là cấu trúc dạng đóng và thường có hình tròn. Cleistothecia được hình thành ở giai đoạn sinh sản hữu tính và chứa các bào tử có tên là ascospore sinh ra trong nang (ascus) [16]. Đặc điểm sinh lý sinh hóa Bào tử Aspergillus là thành phần phổ biến của các sol khí, tự phát tán theo khoảng cách ngắn hoặc dài tùy thuộc vào điều kiện môi trường.

Aspergillus có thể phát triển ở phạm vi nhiệt độ rộng (6-55°C) và ở độ ẩm tương đối thấp. Các loài Aspergillus có thể sử dụng nhiều loại cơ chất khác nhau có trong môi trường. Trong tự nhiên, Aspergillus đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải các cơ chất phức tạp như tinh bột, hemicellulose, cellulose, pectin và các polyme khác. Một số loài Aspergillus có khả năng làm phân huỷ các hợp chất bền như chất béo, dầu, chitin và keratin.

Các loài Aspergillus tiết ra nhiều loại enzyme để phân hủy cơ chất phức tạp thành các phân tử nhỏ để sử dụng làm chất dinh dưỡng. Ví dụ, amylase được tiết ra để phân giải tinh bột, xylanase phân giải xylan, pectinase phân giải pectin có trong nguyên liệu thực vật. Khả năng tiết ra một lượng lớn enzyme/protein, các chất chuyển hóa (axit hữu cơ, lovastatin, sắc tố, …), kết hợp với công nghệ lên men và các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã giúp tạo ra các nhà máy tế bào ưu việt ở A. terreus phục vụ sản xuất các sản phẩm có giá trị ở quy mô công nghiệp [97].

Tuy nhiên, một số loài của chi Aspergillus là tác nhân gây hại cho sản xuất nông nghiệp, ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và vật nuôi. Một số loài Aspergillus có khả năng sinh độc tố (mycotoxin) trên nông sản, như A. flavus sinh aflatoxin hay A. westerdijkiae sinh ochratoxin A [82].

fumigatus là tác nhân gây bệnh cơ hội ở người, thường gây bệnh ở những người có hệ miễn dịch bị suy yếu [77]. Di truyền học và hệ gen nấm Năm 2005, dữ liệu hệ gen của 3 loài Aspergillus đã được công bố, gồm A. Việc xuất bản đồng thời 3 công trình về hệ gen của 3 loài Aspergillus này trên tạp chí danh tiếng Nature vào tháng 12 năm 2005 đã khẳng định Aspergillus là chi nấm hàng đầu cho các nghiên cứu về phân tích hệ gen. Kích thước hệ gen của các loài Aspergillus được giải trình tự nằm trong khoảng từ 29,3 Mb đối với A.

fumigatus đến 37,1 Mb đối với A. oryzae; trong khi số lượng gen dự đoán thay đổi từ khoảng 9926 đối với A. fumigatus đến khoảng 12. Đến năm 2017, 10 trình tự hệ gen mới của chi Aspergillus đã được công bố, cụ thể là A.

Những loài này được chọn chủ yếu để cung cấp độ bao phủ tốt hơn cho toàn bộ chi, để bổ sung cho trình tự hệ gen đã có sẵn của A. terreus, và để cho phép khai thác dữ liệu chi tiết hơn của nhóm công nghiệp Nigri (A. Vai trò ứng dụng trong công nghệ sinh học và công nghiệp Aspergillus đã được sử dụng trong biến đổi gạo, đậu nành và các thực phẩm từ thực vật khác nhằm cải thiện hương vị và tăng khả năng lên men. Việc sử dụng Aspergillus để sản xuất thực phẩm được cho là bắt nguồn từ Trung Quốc cách đây khoảng 2000 năm.

Sau đó, quá trình lên men thực phẩm tương tự đã được tiến hành ở Indonesia, Nhật Bản, Hàn Quốc và các khu vực khác của châu Á. Các quy trình lâu 16 đời nhất có liên quan đến quá trình lên men thực phẩm truyền thống, bao gồm miso (tương làm từ bột đậu nành và gạo), shoyu (nước tương), rượu sake (rượu vang gạo), shochu (rượu mạnh) và yonezu (giấm gạo). Koji là tên tiếng Nhật của các loại ngũ cốc lên men và/hoặc đậu nành (Hình 1. Trong koji, nấm sợi tiết ra nhiều loại enzyme và làm biến đổi cơ chất từ protein thành peptide và axit amin, và từ tinh bột thành đường đơn [118].

Hình thái 3 loại nấm Aspergillus dùng trong sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống [118] Bên trái là hình ảnh khuẩn lạc Aspergillus oryzae (koji vàng; A), Aspergillus luchuensis (koji đen; C) và Aspergillus luchuensis var. Bên phải là đầu cấu trúc sinh bào tử của các loại nấm này (B, Aspergillus oryzae; D, Aspergillus luchuensis; F, Aspergillus luchuensis var. 17 Aspergillus có hiệu quả kinh tế cao, các thành viên của chi nấm này đã được khai thác trong nhiều quy trình công nghiệp khác nhau. Các loài Aspergillus được sử dụng trong ngành công nghiệp đồ uống, dược phẩm và sản xuất enzyme.

Các sản phẩm thương mại được sản xuất từ Aspergillus bao gồm axit citric, gluconic, itaconic và kojic. Axit citric là một trong những thành phần thực phẩm được sử dụng rộng rãi nhất, chủ yếu được sản xuất bởi A. Axit citric cũng được sử dụng trong các ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm. niger cũng đã được khai thác trong sản xuất công nghiệp axit gluconic - một loại axit hữu cơ được dùng làm phụ gia trong một số ứng dụng làm sạch kim loại, cũng như cho liệu pháp điều trị thiếu hụt canxi và sắt.

terreus được sử dụng để sản xuất axit itaconic, dùng trong sản xuất một số loại polyme tổng hợp. oryzae được lên men để sản xuất axit kojic, ứng dụng trong mỹ phẩm làm trắng da [97]. Một số chất chuyển hóa thứ cấp từ Aspergillus cũng có tầm quan trọng kinh tế lớn; trong đó statin và các dẫn xuất của chúng đem lại lợi nhuận lớn nhất. Những loại thuốc giảm cholesterol hiện nay là một trong những loại thuốc được sử dụng rộng rãi.

Một nhóm các nhà khoa học tại công ty Merck ở Hoa Kỳ đã phát triển statin đầu tiên được phê duyệt cho người sử dụng, lovastatin, một chất chuyển hóa thứ cấp được phân lập từ A. Do tính chất an toàn của A. niger để điều chế thực phẩm và đồ uống của con người, các sản phẩm mới từ các loại nấm này dễ dàng được chấp thuận hơn các sản phẩm từ các sinh vật khác. Với khả năng tiết cao, các enzyme ngoại bào của A.

niger có thể dễ dàng được khai thác để sản xuất các enzyme dùng trong các ngành công nghiệp như làm bánh, nước giải khát và sản xuất bia; bổ sung vào thức ăn cho động vật; và dùng trong ngành công nghiệp giấy. Aspergillus cũng có tiềm năng to lớn trong việc cung cấp các enzyme mới có thể được sử dụng để chuyển hóa sinh khối thực vật thành nhiên liệu và các sản phẩm công nghiệp hữu ích khác [13]. Đặc điểm hình thái A. oryzae là loài nấm sợi hiếu khí.

Giai đoạn đầu khuẩn lạc có màu trắng, sau đó chuyển sang màu vàng-xanh. Hệ sợi nấm bao gồm những sợi mỏng với kích thước 18 theo chiều ngang 5-7 μm, phân nhánh nhiều, và có vách ngăn. oryzae hình thành bào tử đính (hay conidia) nhờ quá trình sinh sản vô tính. Sợi nấm phát triển tế bào chân đế và biệt hóa thành sợi cuống dài (conidiophore) với cấu trúc phồng lên ở đầu cuối dạng củ hành gọi là bọng (vescicle).

Xung quanh bọng chứa một vài lớp tế bào chuyên biệt gọi là thể bình (phialide). Từ bộ cuống ngoài cùng, những bào tử được sinh ra đính vào nhau, nên gọi là bào tử đính. Bào tử của A. oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau [90].

Hình thái nấm sợi A. oryzae RIB40 [150] Khuẩn lạc A. oryzae RIB40 trên các môi trường CYA (A), MEA (B) sau 7 ngày nuôi cấy ở 25oC. Hình dạng sclerotia (C), conidiophore và conidia (D-I).

oryzae Hệ gen của một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus dùng trong công nghiệp đã được nghiên cứu từ cuối những năm 1990. sojae đã được sử dụng trong sản xuất công nghiệp như A. oryzae, nhưng nghiên cứu về hệ gen của A. sojae còn 19 hạn chế.

Phân tích trình tự EST (Expressed Sequence Tags, chỉ thị các trình tự được biểu hiện) được hoàn thành vào năm 2001 với chủng A. Hệ gen đầy đủ của A. oryzae RIB40 chứa 8 nhiễm sắc thể và ty thể (hình tròn) và ước tính kích thước là 37,6 Mb hay 37.