Đặt vấn ề Trong nhiều năm qua, thuốc tr sâu sinh học t vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) đã được nghiên cứu và ứng dụng để diệt tr các loại côn trùng hại cây trồng và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Cùng với sự phát triển kinh tế - xã hội, nhu cầu sử dụng các sản phẩm nông nghiệp sạch, hạn chế mức thấp nhất thuốc tr sâu hóa học trong sản xuất nông nghiệp của con người ngày càng cao. Thuốc tr sâu sinh học Bt đã được sử dụng, do chúng khắc phục được tính kháng thuốc của côn trùng và chỉ diệt các loài côn trùng có hại mà không ảnh hưởng đến môi trường sinh thái cũng như sức khỏe con người. Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn Bt sản sinh một số chất chuyển hóa có tiềm năng ứng dụng như: enzym thủy phân chitin (chitinase) và chất kháng sinh.
Các sản phẩm chuyển hóa này có thể ức chế vi khuẩn gây bệnh qua thực phẩm ho c kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh như vi khuẩn, nấm. Vì vậy, việc tạo ra một lượng lớn enzym, đ c biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học Bt để tăng hoạt tính diệt côn trùng là rất cần thiết.14) thuộc nhóm enzym thủy phân, xúc tác quá trình phân hủy cơ chất chitin không tan trong nước thành các sản phẩm chitin-oligosaccharide hòa tan trong nước thông qua quá trình thủy phân liên kết β-(1,4)- glucoside giữa C- 1 và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Hiện nay, chitinase được ứng dụng chủ yếu trong sản xuất chitooligosaccharide, nano-chitin, N-acetyl-D-glucosamine. Đây là những sản phẩm giá trị ứng dụng cao và được sử dụng trong thực phẩm, nông nghiệp, y dược.
Ngoài ra, chitinase đ c biệt là endochitinase còn được sử dụng như thuốc tr sâu sinh học trong nông nghiệp nhờ khả năng phân hủy chitin cấu trúc trong thành tế bào của nấm, côn trùng gây bệnh và xử lý các chất thải giàu chitin. Do kiểu phân cắt mà endochitinase phân cắt cơ chất chitin và vách tế bào nấm chứa chitin tốt hơn so với chitobiosidase và N – acetylglucosaminidase. Vì vậy, việc phân lập tìm ra chủng Bt sinh endochitinase 2 cao và qui trình tạo ra endochitinase có hoạt tính cao bằng công nghệ gen nhằm góp phần tăng hiệu quả của chế phẩm sinh học là rất cần thiết. Xuất phát t những lý do trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài luận án: “Tách d ng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất c a endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam”.
M c tiêu nghiên cứu 2. M c tiêu chung Tuyển chọn được chủng vi khuẩn B. thuringiensis bản địa có khả năng sinh chitinase cao và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong E. coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả năng diệt côn trùng của chế phẩm BT và ức chế nấm hại cây trồng.
M c tiêu c thể (1) Sàng lọc và thu nhận được chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao và xác định được trình tự nucleotide của gen mã hóa chitinase t chủng vi khuẩn Bt đã tuyển chọn. (3) Đánh giá được tác dụng tương hỗ của chitinase tái tổ hợp với protein tinh thể Cry trong diệt côn trùng và khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật. Nội dung nghiên cứu (1) Phân lập và nghiên cứu đ c điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn B.
thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao; (2) Nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng B. thuringiensis tuyển chọn; (3) Nghiên cứu tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa chitinase phân lập t chủng B. thuringiensis tuyển chọn; (4) Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chitinase t chủng B. thurigiensis tuyển chọn được và tinh sạch chitinase tái tổ hợp; (5) Nghiên cứu một số tính chất hóa lý của chitinase tái tổ hợp; 3 (6) Nghiên cứu khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật của chitinase tái tổ hợp và tác dụng hỗ trợ của chitinase đối với khả năng diệt côn trùng của protein tinh thể Cry.
Nh ng ng g p mới c a luận án (1) Tuyển chọn được 36 chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 của Việt Nam có khả năng bảo vệ kép (Dual control) - v a kháng nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani gây bệnh thực vật v a tăng hoạt tính diệt côn trùng của chế phẩm BT nhằm phục vụ cho phát triển thuốc tr sâu bệnh sinh học thế hệ mới. (3) Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen chitinase của các chủng B.
thuringiensis Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu, đào tạo và ứng dụng sau này. Ý nghĩa khoa học và th c tiễn c a ề tài 5. Ý nghĩa khoa học Bổ sung thêm cơ sở dữ liệu về gen mã hóa chitinase t các chủng vi khuẩn phân lập ở Việt Nam, làm cơ sở khoa học và nguyên liệu di truyền để tạo các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp và thu hồi chitinase cao hơn so với chủng tự nhiên, có thể ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. Kết quả của luận án còn góp phần phát triển công nghệ lên men vi sinh vật tái tổ hợp sản xuất chitinase có hiệu suất cao.
Công trình đã làm phong phú thêm thông tin trong lĩnh vực công nghệ enzym nhờ những nghiên cứu về sinh tổng hợp, tinh sạch, đ c tính lí hóa và định hướng ứng dụng của chitinase. Ý nghĩa th c tiễn Kết quả luận án góp phần khai thác có hiệu quả tiềm năng nguồn gen vi sinh vật trong nước nói chung và gen chiA nói riêng nhằm tạo ra các sản phẩm enzym công nghiệp có giá trị ứng dụng trong các lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, 4 hướng tới phát triển công nghệ sạch và sản phẩm sạch có ích cho sức khỏe con người, không gây ô nhiễm môi trường. Tạo được chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện cao chitinase t chủng B.
thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 của Việt Nam và bước đầu nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học BT diện côn trùng và nấm gây bệnh nhằm hỗ trợ và thay thế thuốc tr sâu hóa học. 5 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi khu n Bacillus thuringiensis l c v B. thuringiensis Bacillus thuringiensis (Bt) là vi khuẩn đất thuộc chi Bacillus, môi trường sống chính của Bt gồm đất, côn trùng, hạt ngũ cốc, bề m t thực vật.
thuringiiensis có dạng hình que, gram dương, hô hấp hiếu khí ho c kị khí không bắt buộc, sinh bào tử, bào tử hình oval, trong quá trình hình thành bào tử hầu hết các chủng Bt đều tổng hợp protein tinh thể. Tinh thể có kích thước 0,6 - 2 µm, có hình dạng không cố định có thể là hình lập phương, hình lưỡng tháp ho c hình cầu. Tinh thể có thể chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào. Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm coomassie brilliant blue và quan sát dưới kính hiển vi, tinh thể Bt bắt màu xanh đậm còn bào tử bắt màu xanh nhạt.
Trong môi trường lỏng Bt có khả năng chuyển động nhờ các lông roi trên bề m t tế bào (Hình 1. Bt có khả năng sinh trưởng, phát triển trong khoảng nhiệt độ 20 - 40ºC, nhiệt độ tối ưu là 28 - 32ºC, Bt phát triển tối ưu ở pH = 7. Bt được phân loại theo nhiều phương pháp khác nhau: dựa trên đ c điểm hình thái và đ c điểm sinh hoá, theo ngoại hình enzym lipase, theo typ huyết thanh kháng nguyên - O, theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể, theo typ huyết thanh kháng nguyên - H, theo nguồn bệnh và theo gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng. Trong đó, phương pháp phân loại theo de Barjac và Bonnefoi dựa trên nguyên lý của phản ứng kháng nguyên - kháng thể được sử dụng rộng rãi (khi kháng nguyên tiêm mao kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết tạo c n lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường.
Dưới kính hiển vi quang học ho c đối pha có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được (Hình 1. Đến năm 1999, đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của Bt (de Barjac và Bonnefoi, 1962). 6 Axit nucleic Màng tế bào Thành tế bào Tiêm mao Ribosome Plasmide Mezosome Hình đồ cấu tạo tế bào B. thuringiensis (Ngu n: Ngô Đ nh nh, 2011 Tế bào vi khuẩn Phân tử kháng thể với kháng nguyên với hai vị trí liên bề m t kết đ c hiệu Phản ứng ngưng kết Hình 2 Phản ứng ng ng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên tiêm mao H Ngu n: Ngô Đ nh nh, 2011 Các tinh thể protein được hình thành trong quá trình tạo bào tử, chúng được tạo thành t một ho c một vài gen cry (crystal) và gen cyt (cytolytic) mã hóa tinh thể độc nằm trên các plasmid lớn và một số ít xuất hiện cả trên nhiễm sắc thể.
Tùy theo thành phần protein cấu tạo khác nhau mà các tinh thể có hình dạng khác nhau. Hầu hết các tinh thể có hoạt tính với côn trùng bộ cánh vảy có dạng hình lưỡng tháp, tinh thể có hoạt tính với côn trùng bộ hai cánh có dạng hình cầu, tinh thể có hoạt tính với côn trùng bộ cánh cứng có dạng hình cầu, hình khối lập phương. Ngoài ra, trong quá trình sinh trưởng, phát triển vi khuẩn Bt còn sản sinh chất chuyển hóa có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: môi trường, thực phẩm, y tế, nông nghiệp, công nghiệp, công nghệ sinh học…đó chính là enzym 7 thủy phân chitin (chitinase). Hiện nay, trên thế giới có khoảng 38 gen chitinase đã được công bố thuộc các dưới loài khác nhau như: kenyea, pakistani, colmeri, canadiensis, entomocidus, kurstaki, israelensis và konkukian.
Trong đó chủ yếu được tách dòng ở Trung Quốc (55%), còn lại là ở Mexico, M , Ai Cập, Thổ Nhĩ Kỳ, Thái Lan, Ấn Độ, Pakistan, Tunisia và Hàn Quốc (http://www. 2 phát tri n v ứng ng của chitinase t B thuringiensis trên thế giới Enzym thủy phân chitin (chitinase) t Bt được biết đến t đầu những năm 1970 do tác dụng tương hỗ giữa chitinase và thuốc tr sâu sinh học. Ấu trùng của Choristoneura fumiferana gây bệnh trên cây thông khi xử lý với hỗn hợp Bt- chitinase thì chết nhanh hơn và nhiều hơn khi xử lý với một mình chitinase ho c Bt (Smirnoff, 1973; Morris, 1976). Trộn chitinase với Bt cho thấy t lệ chết của bướm đêm (Lymantria dispar) tăng nhanh hơn khi thử nghiệm chỉ với Bt (Dubois, 1977).
Hoạt tính diệt ấu trùng sâu bướm tăng khoảng 5 lần khi có sự tương trợ của chitinase vi khuẩn Bt (Gunner et al.