Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Trong canh tác nông nghiệp hiện đại, nhu cầu sử dụng các sản phẩm nông sản sạch và giảm thiểu dư lượng thuốc trừ sâu hóa học nhằm bảo vệ sức khỏe cộng đồng cùng hệ sinh thái ngày càng trở nên cấp thiết. Chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) đã được ứng dụng rộng rãi nhờ khả năng tiêu diệt chọn lọc côn trùng gây hại thông qua hệ thống protein độc tố tinh thể (Cry, Cyt) mà không gây độc hại cho môi trường. Trong chu trình sinh trưởng, B. thuringiensis còn tiết ra enzym thủy phân chitin (chitinase, đặc biệt là endochitinase - EC 3.2.1.14) có khả năng phân hủy lớp chitin cấu trúc trong thành tế bào nấm bệnh và màng peritrophic ở ruột giữa côn trùng.

Tuy nhiên, khả năng sinh tổng hợp chitinase tự nhiên từ các chủng Bt hoang dại thường thấp và chịu ảnh hưởng lớn bởi điều kiện môi trường. Tại Việt Nam, nguồn gen vi sinh vật bản địa phân lập từ các vùng sinh thái đa dạng chưa được khai thác toàn diện; các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào việc tối ưu hóa điều kiện lên men chủng tự nhiên hoặc biểu hiện chitinase trong nấm men, thực vật. Khoảng trống nghiên cứu mà tác giả xác định là: thiếu các công trình nghiên cứu hệ thống từ phân lập, tuyển chọn các chủng B. thuringiensis bản địa có hoạt tính chitinase cao, đến việc tách dòng, giải trình tự gen chiA, biểu hiện tái tổ hợp trong Escherichia coli, tinh sạch và đánh giá tác động hiệp đồng của enzym này với protein tinh thể Cry trong phòng trừ sâu bệnh hại thực vật. Do đó, đề tài luận án "Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam" được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu

  1. Mục tiêu chung: Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis bản địa có khả năng sinh chitinase cao và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong E. coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả năng diệt côn trùng của chế phẩm BT và ức chế nấm hại cây trồng.
  2. Mục tiêu cụ thể:
    • (1) Sàng lọc và thu nhận được chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao và xác định được trình tự nucleotide của gen mã hóa chitinase từ chủng vi khuẩn Bt đã tuyển chọn.
    • (2) Tách dòng, tối ưu hóa điều kiện biểu hiện gen mã hóa chitinase trong E. coli và tinh sạch chitinase tái tổ hợp.
    • (3) Đánh giá được tác dụng tương hỗ của chitinase tái tổ hợp với protein tinh thể Cry trong diệt côn trùng và khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật.

Nội dung nghiên cứu của luận án

Văn bản luận án xác định 6 nội dung nghiên cứu trọng tâm:

  1. Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao.
  2. Nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng B. thuringiensis tuyển chọn.
  3. Nghiên cứu tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa chitinase phân lập từ chủng B. thuringiensis tuyển chọn.
  4. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chitinase từ chủng B. thuringiensis tuyển chọn được và tinh sạch chitinase tái tổ hợp.
  5. Nghiên cứu một số tính chất hóa lý của chitinase tái tổ hợp.
  6. Nghiên cứu khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật của chitinase tái tổ hợp và tác dụng hỗ trợ của chitinase đối với khả năng diệt côn trùng của protein tinh thể Cry.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis bản địa phân lập tại Việt Nam, chủng chuẩn B. thuringiensis serovar kurstaki 4D4, chủng Bt SP10.6 mang gen cry1Ab, cry1Ac.
    • Chủng vi khuẩn chủ Escherichia coli DH10B và E. coli BL21 (DE3); plasmid tách dòng pGEM-Teasy, vector biểu hiện pET28b(+).
    • Các chủng nấm kiểm định: Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Mucor sp.
    • Các đối tượng côn trùng thử nghiệm: Sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu khoang (Spodoptera litura).
  • Phạm vi nghiên cứu:
    • Phạm vi không gian: Thu thập 274 mẫu đất và 46 mẫu lá tại 7 địa phương đại diện cho 7 vùng địa lý sinh thái của Việt Nam.
    • Phạm vi thực nghiệm: Thực hiện tại Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật và Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trên thế giới

Tác giả điểm lại lịch sử nghiên cứu enzym chitinase từ B. thuringiensis từ đầu những năm 1970 với các mốc công trình quan trọng:

  • Nghiên cứu tính tương hỗ diệt côn trùng: Smirnoff (1973) và Morris (1976) chứng minh hỗn hợp Bt-chitinase làm ấu trùng Choristoneura fumiferana chết nhanh hơn. Dubois (1977) ghi nhận tỷ lệ chết của bướm đêm Lymantria dispar tăng khi bổ sung chitinase vào Bt. Gunner et al. công bố hoạt tính diệt ấu trùng sâu bướm tăng khoảng 5 lần khi có sự tương trợ của chitinase. Regev et al. chỉ ra độc tính với Spodoptera littoralis tăng khi dùng hỗn hợp độc tố Bt tái tổ hợp nồng độ thấp với endochitinase từ Serratia marcescens, đồng thời phối hợp protein Cry1Ac chống Helicoverpa armigera và Cry1C chống Spodoptera littoralis. Wiwat et al. ghi nhận bổ sung chitinase vào bào tử và tinh thể chủng B. kurstaki HD-1 gây tổn thương và phân hủy biểu mô ruột giữa sâu bướm. Liu et al. (2002) chứng minh chitinase từ Bt. pakistani tăng hoạt tính diệt ấu trùng Spodoptera exigua của chủng DL5789 lên 2,35 lần. Lertcanawanichakul et al. (2003) chuyển gen chitinase vào chủng Bt. aizawai, làm tăng hoạt tính chitinase gấp 15 lần. Arora et al. (2003) biểu hiện gen chitinase của chủng Bt HD-1 trong E. coli và phối hợp với protein Vip để kháng sâu khoang Spodoptera litura.
  • Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm: Reyes-Ramirez et al. (2004) chứng minh chitinase từ Bt. israelensis ức chế 100% nấm Sclerotium rolfsii, 55-82% các nấm Aspergillus flavus, Nigrospora sp., Fusarium sp., Absidia sp., Helminthosporium sp., và nâng tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu tương nhiễm nấm từ 25% lên 90%. Driss et al. (2005) phát hiện gen chi255 từ Bt. kurstaki thuộc lớp chitobiosidase có tính kháng nấm cao. Kamil et al. (2007) phân lập chủng Bt MS4 kháng mạnh nấm S. rolfsii. Usharani (2011) phân lập gen exochitinase kích thước 1129 bp (mã hóa 360 axit amin) kháng 4 loại nấm. Gomaa (2012) chứng minh chitinase từ Bt hiệu quả hơn từ B. licheniformis trong việc nâng tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu. Kuzu et al. (2012) phân lập chủng B. kurstaki HBK-51 sinh chitinase bền nhiệt (duy trì 96% hoạt tính ở 110ºC) và bền kiềm (duy trì 98% hoạt tính ở pH 9-12). Ni et al. (2015) gây đột biến gen chiA họ GH18 từ B. thuringiensis YBT-9602 tạo biến thể ChiW50A tăng 60% hoạt tính thủy phân, kiểm soát sâu H. armigera, Caenorhabditis elegans và ức chế nấm bệnh. de la Fuente-Salcido et al. (2016) tạo dòng và biểu hiện gen chiA từ B. tenebrionis DSM-2803 trong E. coli gắn đuôi 6-Histidine, enzym tinh sạch làm giảm sự tăng trưởng của nấm Colletotrichum gloeosporioides.
  • Tách dòng và biểu hiện chitinase từ các nguồn vi sinh vật khác: Tsujibo et al. (1993) tách dòng gen chitinase dài 3394 bp (820 axit amin, 87 kDa) từ Alteromonas sp. mã số O-7 trong E. coli JM109 qua vector pUC18. Lan et al. (2006) phân lập gen endochitinase (chiA, 865 axit amin, 91,6 kDa) từ Aeromonas hydrophila SUWA-9. Yang et al. tạo dòng gen chi18 từ B. subtilis CHU26 qua vector pGCHI18 và pYCHI18 làm giảm hoạt tính gây bệnh của R. solani hơn 90%. Lobo et al. (2013) biểu hiện chitinase 43,8 kDa từ Chromobacterium violaceum trong E. coli. Castañeda-Ramírez et al. (2013) biểu hiện chiA74 của Bt trong E. coli K12 đạt mức biểu hiện xấp xỉ 500%. Mehtap et al. (2015) biểu hiện 3 gen chiA, chiB, chiC từ Serratia.

Các hướng nghiên cứu tại Việt Nam

  • Nguyễn Thị Ngọc Liên et al. (2012, 2013) nghiên cứu endochitosanase tái tổ hợp bền ở 20-70ºC, pH 4-8, tối ưu tại 45ºC và pH 5; biểu hiện gen csn từ B. cereus HN90 trong nấm men dòng L6 đạt hoạt tính 322,4 U/ml.
  • Nguyễn Ngọc Mai và Vũ Văn Hạnh (2013), Nguyễn Hồng Minh et al., Nguyễn Hữu Quân et al. (2015) sử dụng đột biến nấm Lecanicillium lecanii để nâng cao hoạt tính chitinase lên 1,611 U/ml và tinh sạch chitinase 33 kDa (hoạt tính riêng 167,5 U/mg).
  • Đinh Minh Hiệp (2012) nghiên cứu chitinase và β-glucanase từ Trichoderma spp. kiểm soát sinh học nấm bệnh.
  • Hà Hồng Hạnh et al. (2013) phân lập gen mã hóa chitinase và thiết kế vector biểu hiện thực vật.
  • Quách Ngọc Tùng et al. (2012, 2013) tối ưu sinh tổng hợp chitinase từ B. licheniformis DS23 đạt 110,3 U/ml; biểu hiện gen chi của B. licheniformis KNUC213 trong E. coli thu enzym 60 kDa có hoạt tính tăng 9,5 lần.
  • Vũ Thị Thanh et al. (2013) khảo sát lên men rắn chủng nấm Penicillium sp. M4 trên cơ chất bột ngô đạt hoạt tính 8,02 U/ml, diệt 92,3% rệp ngô.

Vị trí và khoảng trống luận án giải quyết

Phần lớn các nghiên cứu trong nước trước đây tập trung vào việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng hoang dại hoặc chuyển gen vào nấm men/thực vật. Luận án này định vị việc khai thác trực tiếp nguồn gen B. thuringiensis bản địa của Việt Nam, thực hiện tách dòng và biểu hiện mức độ cao gen chiA trong hệ thống E. coli BL21 (DE3) sử dụng vector pET28b(+), tinh sạch qua cột ái lực niken để thu nhận chế phẩm endochitinase tái tổ hợp có hoạt tính cao, đánh giá đồng thời hai tác động: ức chế nấm bệnh (F. oxysporum, R. solani) và hỗ trợ độc tính diệt sâu hại (P. xylostella, S. litura) của protein Cry.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và cấu trúc enzym chitinase

  • Cơ chất Chitin: Polysaccharide mạch thẳng tạo bởi các đơn phân N-acetyl glucosamine qua liên kết $\beta$-(1,4)-glucoside. Công thức phân tử: $(C_8H_{13}O_5N)_n$, khối lượng phân tử: $(203,09)_n$ (thành phần: C = 47,29%; H = 6,4%; O = 39,4%; N = 6,91%). Tồn tại 3 dạng cấu trúc tự nhiên: $\alpha$-chitin (các chuỗi xuôi và ngược xen kẽ, phổ biến nhất ở bộ xương ngoài côn trùng, giáp xác, vách nấm), $\beta$-chitin (các chuỗi xếp song song cùng hướng, có ở mực), và $\gamma$-chitin (hỗn hợp 2 chuỗi xuôi xen kẽ 2 chuỗi ngược).
  • Phân loại Chitinase:
    • Theo IUBMB: Thuộc phân lớp 3 (hydrolase), tổ 2 (glycosidase), nhóm 1 (thủy phân liên kết O- và S-glycoside).
    • Theo cơ chế phân cắt: Endochitinase (EC 3.2.1.14 - phân cắt ngẫu nhiên liên kết nội mạch tạo chitotriose, chitotetraose, diacetylchitobiose); Exochitinase gồm Chitobiosidase (EC 3.2.1.29 - cắt giải phóng diacetylchitobiose từ đầu không khử) và N-acetyl glucosaminidase (EC 3.2.1.52 - cắt oligomer giải phóng đơn phân GlcNAc).
    • Theo cấu trúc phân tử: Họ Glycohydrolase 18 (GH18 - tâm hoạt động tạo bởi 8 sợi xoắn $\alpha/\beta$ cuộn tròn, bị ức chế bởi allosamidin), họ GH19 (cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn, không bị ức chế bởi allosamidin), và họ GH20.
  • Cấu trúc miền chức năng của ChiA74 (B. thuringiensis):
    • Vùng xúc tác (catalytic domain): Vị trí hoạt động từ amino acid 203 đến 211 (chuỗi Phe-Asp-Gly-Val-Asp-Leu-Asp-Trp-Glu), chứa các gốc thơm bảo tồn Trp171, Phe177 và Trp210.
    • Vùng fibronectin (FLD - fibronectin-like domain): Hỗ trợ gắn kết cơ chất.
    • Vùng liên kết cơ chất chitin (CBDs - Chitin binding domains): Nằm ở đầu C (từ amino acid 587 đến 629), chứa các gốc thơm bảo tồn Trp591, Tyr595 và Trp626.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Phương pháp vi sinh

  • Phân lập B. thuringiensis: Tiến hành theo phương pháp của Thiery và Frachon (1997). Mẫu đất (10 g pha trong 90 ml nước cất vô trùng) hoặc mẫu lá (khử trùng cồn 70% 3 lần, nghiền nát) được đun cách thủy 70ºC trong 10 phút để chọn lọc bào tử. Cấy gạt dịch pha loãng ($10^{-3}$ đến $10^{-5}$) lên môi trường MPA, ủ 28ºC trong 72 giờ. Nhuộm vết bôi bằng Coomassie Brilliant Blue 0,133% và quan sát tinh thể dưới kính hiển vi quang học (vật kính dầu).
  • Phân loại bằng phản ứng ngưng kết tiêm mao H: Cấy vi khuẩn vào ống Craigie chứa môi trường Craige, ủ 28ºC trong 24-48 giờ để tuyển chọn vi khuẩn di động. Cấy chuyển vào môi trường MPB, nuôi lắc 12-14 giờ. Nhỏ 2 µl dịch nuôi và 2 µl kháng huyết thanh chuẩn 4D4 (pha loãng 50 lần) lên phiến kính lõm; quan sát hiện tượng vi khuẩn bị ngưng kết mất khả năng chuyển động dưới kính hiển vi.
  • Khảo sát điều kiện lên men chủng Bt MSS1.1: Lần lượt tối ưu hóa qua 7 yếu tố: Thời gian nuôi (0-144 giờ), nhiệt độ (25, 28, 30, 37ºC), loại cơ chất (chitin huyền phù, vảy tôm, vảy cua 1%), nồng độ cơ chất (0; 0,2; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0 và 3,0%), pH ban đầu (5,0-9,0), nguồn carbon thay thế (glucose, saccharose, lactose, bột ngô, cám gạo, tinh bột), và nguồn nitơ thay thế (cao nấm men, peptone, $(NH_4)_2SO_4$, bột đậu tương, cao thịt, urê).

2. Phương pháp hóa sinh

  • Định tính chitinase: Khuếch tán giếng thạch (đường kính lỗ 0,8 cm) trên đĩa thạch chứa 0,5% chitin huyền phù. Tra 100 µl dịch enzym thô, giữ 4ºC trong 2-3 giờ, ủ 37ºC trong 14-16 giờ, nhuộm dung dịch Lugol 1%. Đo đường kính vòng phân giải $D - d$ (mm).
  • Định lượng hoạt tính chitinase (phương pháp DNS theo Miller, 1959): Phản ứng gồm 0,3 ml dịch enzym và 0,3 ml colloidal chitin 1% trong đệm phosphate 100 mM, ủ 40ºC trong 60 phút. Dừng phản ứng bằng cách đun sôi 5 phút. Ly tâm lấy 0,5 ml dịch nổi, thêm 0,75 ml thuốc thử DNS, đun sôi 10 phút, đo $OD_{540\text{ nm}}$. Đối chứng âm sử dụng enzym bất hoạt nhiệt (100ºC trong 5 phút). Đường chuẩn glucose/N-acetyl D-glucosamine có phương trình: $y = 0,3208x - 0,021$ ($R^2 = 0,9942$). $$\text{Hoạt độ chitinase } (U/ml) = \frac{A}{T \times V}$$ (Trong đó: $A$ là nồng độ N-acetyl D-glucosamine tính theo đường chuẩn ($\mu M$); $V$ là thể tích enzym (ml); $T$ là thời gian phản ứng = 60 phút).
  • Định lượng protein tổng số: Phương pháp Bradford (1976), tạo phức hợp màu giữa protein và Coomassie Brilliant Blue G-250, đo mật độ quang tại bước sóng 595 nm, đối chiếu đường chuẩn BSA.

3. Phương pháp sinh học phân tử

  • Tách chiết DNA: Phương pháp tách chiết alkaline lysis của Sambrook và Russell (2001) sử dụng dung dịch Sol I, Sol II, Sol III, xử lý RNase (37ºC, 1 giờ), tinh sạch bằng chloroform/isoamyl alcohol (24:1 v/v) và kết tủa bằng ethanol tuyệt đối.
  • Khuếch đại gen chiA bằng PCR: Cặp mồi đặc hiệu:
    • chiF: 5'-ATAGAATTCATGGCTATGAGGTCTCAAAAA-3' (bổ sung vị trí cắt EcoRI).
    • chiR: 5'-ATACTCGAGGTTTTCGCTAATGACGGCATT-3' (bổ sung vị trí cắt XhoI).
    • Thành phần phản ứng ($20\ \mu l$): $2\ \mu l$ dNTPs, $2\ \mu l$ buffer, $1\ \mu l$ mồi xuôi (10 pmol/$\mu$l), $1\ \mu l$ mồi ngược (10 pmol/$\mu$l), $1\ \mu l$ glycerol, $1\ \mu l$ DMSO, $0,3\ \mu l$ Taq polymerase, $2\ \mu l$ DNA khuôn, $9,7\ \mu l\ H_2O$.
    • Chu trình nhiệt: 94ºC (2 phút); 30 chu kỳ gồm [94ºC (30 giây), 60ºC (30 giây), 72ºC (1 phút 30 giây)]; kéo dài 72ºC (10 phút); giữ tại 4ºC. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
  • Tách dòng và giải trình tự: Sản phẩm PCR tinh sạch được nối vào vector pGEM-Teasy nhờ T4 DNA ligase (ủ 4-6ºC trong 14-16 giờ), biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10B (xử lý bằng $CaCl_2$ 0,1 M và sốc nhiệt 42ºC trong 90 giây). Sàng lọc khuẩn lạc trắng/xanh trên môi trường LB bổ sung ampicillin ($100\ \mu g/ml$) và X-gal ($40\ \mu g/ml$). Giải trình tự Sanger hai chiều tại Macrogen (Hàn Quốc) bằng cặp mồi M13. Dịch mã và phân tích căn gióng bằng công cụ Translate, BLAST và Clustal-X.
  • Thiết kế vector biểu hiện pET28b(+)-chiA: Cắt vector pET28b(+) và plasmid tái tổ hợp mang gen chiA bằng cặp enzym cắt hạn chế EcoRI và XhoI, nối ghép tạo khung đọc mở liên tục chứa đuôi 6-Histidine ở đầu C và T7-tag ở đầu N. Biến nạp vào chủng E. coli BL21 (DE3).
  • Khảo sát biểu hiện và tinh sạch rChiA: Tối ưu hóa nồng độ chất cảm ứng IPTG (0,05 - 1,5 mM), lactose (1 - 10 mM), thời gian sau cảm ứng (3, 6, 9, 12 giờ), nhiệt độ cảm ứng (25, 28, 30, 34, 37ºC) và mật độ quang tế bào khi cảm ứng ($OD_{600}$ từ 0,2 đến 1,2). Điện di biến tính SDS-PAGE 12,6% theo phương pháp Laemmli (1970). Tinh sạch protein tái tổ hợp có đuôi 6xHis bằng cột sắc ký ái lực ProBond Nickel Resin (Thermo Fisher Scientific).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa toàn diện các cơ sở lý luận và thực tiễn liên quan đến đề tài:

  1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis: Đặc điểm hình thái (trực khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện, sinh bào tử hình oval kèm tinh thể protein độc tố Cry/Cyt chiếm tới 30% khối lượng khô tế bào, kích thước tinh thể 0,6-2 µm), phân loại huyết thanh học tiêm mao H (82 thứ huyết thanh thuộc 69 typ huyết thanh theo hệ thống de Barjac và Bonnefoi).
  2. Tổng quan về enzym chitinase: Phân loại theo cấu trúc (họ GH18, GH19, GH20), phân loại theo vị trí tác dụng (endochitinase, chitobiosidase, N-acetylglucosaminidase). Đặc tính cấu trúc không gian 3 miền của ChiA74 (catalytic domain mang motif Phe-Asp-Gly-Val-Asp-Leu-Asp-Trp-Glu, miền FLD, miền CBDs).
  3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính và sinh tổng hợp chitinase: Nhiệt độ tối ưu (thường 20-50ºC), pH tối ưu (dao động 3,5-8,0 đối với vi sinh vật), vai trò kích hoạt của các cation kim loại ($Co^{2+}$, $Mg^{2+}$, $Ca^{2+}$, $Ba^{2+}$) và ức chế của $Zn^{2+}$, $Cu^{2+}$, EDTA; ảnh hưởng của chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, SDS); nguồn dinh dưỡng carbon (bột ngô, cám gạo, chitin huyền phù) và nitơ (cao nấm men, peptone, casein).
  4. Công nghệ sản xuất chitinase tái tổ hợp: Ưu điểm của hệ biểu hiện E. coli BL21 (DE3) mang promoter T7 mạnh kết hợp vector dòng pET mang đuôi His-tag; các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình lên men cảm ứng (nồng độ IPTG, cảm ứng bằng lactose, thời gian cảm ứng nhằm tránh sự phân hủy của protease nội bào).
  5. Ứng dụng của chitinase và tình hình sâu bệnh hại:
    • Ứng dụng nông nghiệp: Ứng dụng đối kháng nấm bệnh thực vật và cơ chế phối hợp với protein Cry (phân hủy màng peritrophic ruột giữa côn trùng, tạo điều kiện cho độc tố Cry tiếp cận thụ thể biểu mô ruột).
    • Tình hình sâu bệnh: Tác hại của nấm Rhizoctonia solani (gây đốm vằn lúa, lở cổ rễ, thiệt hại 5-50%), Fusarium oxysporum (gây bệnh héo vàng cà chua, thối củ khoai tây), Mucor sp. (thối quả sau thu hoạch); tác hại nghiêm trọng của sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu khoang (Spodoptera litura) trên cây trồng họ hoa thập tự.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ vật liệu sinh học, hóa chất, thiết bị và quy trình thao tác thực nghiệm:

Bảng 1: Thành phần các môi trường nuôi cấy chính

Tên môi trường Thành phần định lượng (trên 1 lít) Mục đích sử dụng
MPA Cao thịt 5 g; peptone 10 g; NaCl 5 g; Agar 18 g; pH 7,0 - 7,2 Phân lập, duy trì chủng B. thuringiensis
LB Cao nấm men 5 g; Tryptone 10 g; NaCl 5 g; pH 7,0 - 7,2 Nuôi cấy, nhân dòng và biểu hiện trong E. coli
Lên men cơ sở Glucose 10 g; $K_2HPO_4$ 1 g; $KH_2PO_4$ 1 g; cao nấm men 2 g; NaCl 2 g; $MgSO_4$ 0,5 g; $CaCl_2$ 1 g; $MnSO_4$ 0,01 g; $ZnSO_4$ 0,01 g; $FeSO_4$ 0,01 g; pH 7,0 - 7,2 Khảo sát sinh tổng hợp chitinase ở Bt
Craige Cao thịt 4 g; NaCl 5 g; peptone 10 g; Bacto agar 8 g; pH 7,0 - 7,2 Tuyển chọn vi khuẩn di động cho phản ứng H
Khoai tây Khoai tây 200 g; glucose 10 g; agar 18 g Nuôi cấy và duy trì các chủng nấm kiểm định

Bảng 2: Thành phần các dung dịch đệm và hóa chất chuyên dụng

Tên dung dịch Thành phần và nồng độ Ứng dụng
Thuốc thử DNS DNS 0,53%, NaOH 0,99%, KNa-tartrate 15,3%, $Na_2S_2O_5$ 0,415%, phenol 0,38% (w/v) Định lượng đường khử xác định hoạt độ chitinase
Đệm TAE (50X) Tris base 48,4 g; $CH_3COOH$ 11,44 ml; EDTA 0,5 M (pH 8,0) 20 ml; bổ sung nước đến 200 ml Điện di kiểm tra DNA trên gel agarose
Dung dịch Sol I Tris-HCl 1 M (pH 8,0) 2 ml; glucose 0,72 g; EDTA 0,5 M (pH 8,0) 1,6 ml; định mức 80 ml Phá vỡ và ổn định tế bào vi khuẩn tách plasmid
Dung dịch Sol II NaOH 3 M $100\ \mu l$; SDS 10% $150\ \mu l$; nước deion $1250\ \mu l$ Biến tính màng tế bào và DNA
Dung dịch Sol III $CH_3COOK$ 3 M 23,52 g; $CH_3COOH$ 9,2 ml Trung hòa và kết tủa protein/DNA nhiễm sắc thể
Đệm mẫu protein (5X) Tris-HCl 1 M (pH 6,8) 0,6 ml; Glycerol 50% 5 ml; SDS 10% 2 ml; 2-mercaptoethanol 0,5 ml; Bromophenol blue 1% 1 ml; nước deion 10 ml Biến tính và tra mẫu protein cho SDS-PAGE

Bảng 3: Thành phần pha gel polyacrylamide 12,6% (theo Laemmli, 1970)

Hóa chất thành phần Gel tách (Resolving Gel) Gel cô (Stacking Gel)
$dH_2O$ 1,968 ml 0,85 ml
Tris-HCl (3 M; pH 8,8) 1,0 ml 165,25 $\mu$l
Acrylamide - bis 30% 3,36 ml 212,5 $\mu$l
Glycerol 50% 1,6 ml -
SDS 10% 40 $\mu$l 6,25 $\mu$l
APS 10% 40 $\mu$l 12,5 $\mu$l
TEMED 6,4 $\mu$l 1,0 $\mu$l

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Tuyển chọn được 36 chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis bản địa của Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp enzym chitinase cao từ 274 mẫu đất và 46 mẫu lá thu thập trên 7 vùng địa lý sinh thái.
  2. Tách dòng, giải trình tự và biểu hiện thành công enzym endochitinase tái tổ hợp (rChiA) từ chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 của Việt Nam trong hệ biểu hiện E. coli BL21 (DE3) - pET28b(+). Enzym tái tổ hợp thể hiện tiềm năng bảo vệ kép (Dual control): vừa có hoạt tính ức chế các nấm gây bệnh thực vật nguy hiểm (Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani), vừa làm tăng rõ rệt hoạt tính diệt ấu trùng côn trùng (Plutella xylostella, Spodoptera litura) của protein tinh thể Cry.
  3. Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen chiA mã hóa endochitinase của các chủng B. thuringiensis phân lập tại Việt Nam vào ngân hàng gen, cung cấp nguyên liệu di truyền phục vụ nghiên cứu công nghệ sinh học và đào tạo.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

  • Ý nghĩa khoa học: Cung cấp dẫn liệu khoa học về đặc điểm sinh học, di truyền và hoạt tính hóa sinh của hệ enzym chitinase từ B. thuringiensis bản địa; hoàn thiện quy trình công nghệ tạo dòng, lên men biểu hiện nồng độ cao và tinh sạch endochitinase tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực kim loại.
  • Ý nghĩa thực tiễn: Khai thác hiệu quả tiềm năng nguồn gen vi sinh vật bản địa nhằm định hướng sản xuất enzym công nghiệp phục vụ nông nghiệp sạch; tạo tiền đề sản xuất chế phẩm sinh học phối hợp (BT - Chitinase) thay thế thuốc trừ sâu bệnh hóa học độc hại, bảo vệ môi trường sinh thái. Đề xuất quy trình cảm ứng bằng lactose thay thế IPTG giúp giảm chi phí sản xuất ở quy mô lớn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Các đánh giá về hoạt tính ức chế nấm (F. oxysporum, R. solani, Mucor sp.) và hiệu lực tương hỗ diệt côn trùng (P. xylostella, S. litura) của endochitinase tái tổ hợp mới được thực hiện trong phạm vi điều kiện phòng thí nghiệm (in vitro và quy mô phòng), chưa triển khai thử nghiệm diện rộng ngoài đồng ruộng.
  • Quy trình lên men biểu hiện rChiA trong E. coli sử dụng hệ vector pET28b(+) chủ yếu tối ưu hóa ở quy mô bình tam giác phòng thí nghiệm, chưa hoàn thiện thông số điều khiển tự động hóa trên hệ thống nồi lên men công nghiệp (bioreactor).

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Nghiên cứu mở rộng thử nghiệm chế phẩm phối trộn giữa endochitinase tái tổ hợp (rChiA) và protein tinh thể Cry trên cây trồng thực tế ngoài nhà lưới và đồng ruộng để đánh giá độ ổn định sinh học và thời gian bảo vệ cây trồng.
  • Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình công nghệ lên men quy mô pilot, tận dụng các nguồn cơ chất phế phụ phẩm nông nghiệp giàu chitin giá rẻ (vỏ tôm, vỏ cua) để hạ giá thành chế phẩm.
  • Khảo sát mở rộng phổ kháng nấm của rChiA trên các đối tượng nấm bệnh thực vật khác (Colletotrichum sp., Phytophthora sp., Sclerotium sp.).

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên: Chuyên ngành Vi sinh vật học, Sinh học phân tử, Công nghệ sinh học nông nghiệp và Bảo vệ thực vật.
  • Các nhà khoa học tại các viện nghiên cứu: Quan tâm đến công nghệ protein tái tổ hợp, cơ chế hiệp đồng giữa enzym thủy phân và độc tố sinh học trong kiểm soát dịch hại.
  • Các kỹ sư công nghệ và doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học: Cần tài liệu tham khảo về quy trình lên men, tinh sạch enzym và thiết kế công thức chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh sinh học.

Các nội dung đáng tham khảo

  • Quy trình phân lập và định danh Bacillus thuringiensis bằng phản ứng ngưng kết tiêm mao H trong ống Craigie.
  • Thiết kế cặp mồi đặc hiệu (chiF, chiR), quy trình tách dòng vào pGEM-Teasy và tạo vector biểu hiện pET28b(+)-chiA mang đuôi 6xHis.
  • Phương pháp định lượng hoạt tính chitinase bằng phản ứng DNS và xây dựng đường chuẩn N-acetyl D-glucosamine.
  • Quy trình điện di biến tính SDS-PAGE 12,6% và phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực ProBond Nickel Resin.

Câu hỏi thường gặp

1. Cặp mồi nào được sử dụng để nhân dòng gen chiA và đặc điểm thiết kế là gì?

Cặp mồi đặc hiệu được sử dụng gồm:

  • Mồi xuôi chiF: 5'-ATAGAATTCATGGCTATGAGGTCTCAAAAA-3' (được thiết kế bổ sung vị trí nhận biết của enzym cắt hạn chế EcoRI).
  • Mồi ngược chiR: 5'-ATACTCGAGGTTTTCGCTAATGACGGCATT-3' (được thiết kế bổ sung vị trí nhận biết của enzym cắt hạn chế XhoI). Cặp mồi này được thiết kế dựa trên trình tự gen chiA của chủng B. thuringiensis serovar kurstaki HD-73, cho phép khuếch đại chính xác khung đọc mở của gen và tạo thuận lợi cho việc gắn định hướng vào vector biểu hiện pET28b(+).

2. Nguyên tắc định lượng hoạt tính chitinase theo phương pháp DNS trong luận án là gì?

Phương pháp dựa trên sự thủy phân cơ chất chitin dạng keo (colloidal chitin 1%) bởi enzym chitinase, giải phóng đường khử N-acetyl D-glucosamine (GlcNAc). Đường khử này phản ứng với thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) ở nhiệt độ sôi (100ºC) tạo phức màu hấp thụ quang học tại bước sóng 540 nm. Một đơn vị hoạt tính (U) được định nghĩa là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 $\mu$mol N-acetyl D-glucosamine trong thời gian 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn (40ºC, pH 6,0), tính toán theo công thức: $\text{Hoạt độ } (U/ml) = A / (T \times V)$.

3. Cấu trúc miền protein của endochitinase ChiA74 từ B. thuringiensis gồm những vùng nào?

Phân tử endochitinase ChiA74 có cấu trúc gồm 3 vùng chức năng điển hình:

  1. Vùng xúc tác (catalytic domain): Chứa trình tự bảo tồn từ amino acid 203 đến 211 (Phe-Asp-Gly-Val-Asp-Leu-Asp-Trp-Glu) thuộc họ GH18 cùng các gốc thơm bảo tồn Trp171, Phe177 và Trp210 có vai trò quan trọng trong thủy phân liên kết glycoside.
  2. Vùng fibronectin (FLD): Đóng vai trò liên kết cấu trúc và hỗ trợ tiếp xúc cơ chất.
  3. Vùng liên kết cơ chất chitin (CBDs): Nằm ở đầu C (amino acid 587-629) chứa các axit amin thơm bảo tồn Trp591, Tyr595 và Trp626 chịu trách nhiệm gắn bám đặc hiệu lên bề mặt cơ chất chitin.

4. Cơ chế tương hỗ giữa chitinase và protein tinh thể Cry của Bt trong việc diệt sâu hại diễn ra như thế nào?

Ruột giữa của côn trùng được bao bọc bởi màng peritrophic có cấu trúc mạng lưới gồm protein và sợi chitin. Màng này đóng vai trò như hàng rào bảo vệ ngăn chặn vi sinh vật xâm nhập. Khi có mặt enzym endochitinase, enzym này thủy phân ngẫu nhiên các liên kết nội mạch chitin, làm màng peritrophic bị suy yếu và thủng. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho các phân tử protein độc tố tinh thể Cry tiếp cận nhanh chóng và gắn kết với các thụ thể đặc hiệu trên tế bào biểu mô ruột giữa côn trùng, đẩy nhanh quá trình gây độc tế bào và làm tăng tỷ lệ ấu trùng chết.

5. Vector pET28b(+) mang những đặc điểm gì giúp tối ưu hóa việc biểu hiện và tinh sạch enzym tái tổ hợp?

Vector pET28b(+) sở hữu các đặc tính ưu việt:

  • Mang promoter T7 mạnh và đặc hiệu cao, chịu sự điều hòa chặt chẽ bởi hệ thống lac operator cảm ứng bằng IPTG hoặc lactose.
  • Mang đoạn trình tự mã hóa cho 6 gốc Histidine (His-tag) nằm ở đầu C và T7-tag ở đầu N. Đuôi His-tag tích điện âm có ái lực liên kết mạnh với ion $Ni^{2+}$ trên cột sắc ký ái lực ProBond Nickel Resin, cho phép rửa trôi tạp chất và thu hồi protein rChiA tinh sạch đơn giản bằng dung dịch đệm chứa imidazole.

Kết luận

Luận án đã thực hiện nghiên cứu toàn diện từ khâu phân lập, sàng lọc 36 chủng Bacillus thuringiensis bản địa Việt Nam sinh chitinase cao đến việc tách dòng và biểu hiện thành công gen endochitinase (chiA) từ chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 trong hệ biểu hiện E. coli BL21 (DE3) - pET28b(+). Enzym tái tổ hợp rChiA được tinh sạch hiệu quả thông qua sắc ký ái lực niken, thể hiện hoạt tính kép trong việc ức chế các loài nấm gây bệnh thực vật nguy hiểm (Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani) và tăng cường độc lực diệt sâu hại (Plutella xylostella, Spodoptera litura) khi phối hợp cùng protein tinh thể Cry. Các kết quả đạt được cung cấp nguồn dẫn liệu di truyền học giá trị và quy trình công nghệ tiềm năng, mở ra hướng ứng dụng sản xuất các chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật thế hệ mới thân thiện với môi trường tại Việt Nam.