CHƯƠNG 1: TONG QUAN 1. Giới thiệu về khang sinh nhóm nitrofuran 1. Nhóm nitrofuran là gi? Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp có chứa nhóm 5-nitro, thường được sử dụng làm thức ăn gia súc kích thích sự tăng trưởng, chủ yếu đối với gia súc (như gia cầm, lợn), nuôi trồng thủy sản (cá, tôm) và nuôi ong để điều trị các vi khuan và sinh vật đơn bào nhiễm trùng như viêm ruột tiêu hóa gây ra bởi Escherichia coli và Salmonella spp, gia cầm bệnh tả và bênh cầu trùng màu den đầu [12]. Các chất nhóm nitrofuran Các chất nhómn itrofuran bao gồm Furazolidone, furaltadone, furazolidone, nitrofurazone, khi đi vào cơ thé sinh vật nó tạo thành các chất chuyển hóa tương ứng (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) liên kết trong các mô tổn tại trong nhiều tuần sau khi sử dụng [12].
Ví dụ như quá trình chuyên hóa của nitrofurazone như sau: (a) le) lo) Jk Metabolism | J Nitrofurazone Tissue bound SEM 0 (b) 0 0 NO; NO; I A HCL I CHO —> \v NH `NH; TỶ À = NH NH N “Hg NN Hydrolysis HN + Derivatisation Tissue bound SEM SEM o-NBA NPSEM Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học của một số chất nhóm nitrofuran được xác định trong đề tài Khoi „ lượng. Công thức os STT Cac chat nitrofuran. phan Công thức cầu tạo phân tử. tu (g/mol) | a 3-amoni-2-oxazolidinone CạH¿N;O; oe | 102,09 f đc se NPAOZ 3-(2-nitrobenzylidenamino)- SSN 2 C¡oHoNO¿ 235,2 h co 2-oxazolidinone) ` AMOZ 1 3_ | 3-amomi-5-morpholinomethyl | CgH¡zNÑ:O 201,22 - -J- gfl15N303 , H ae 2 CÍ 2 -1,3-oxazolidinone NPAMOZ 0 5-(morpholinomethyl)-3-(2- AyXd Ao.
0 4 | nitrobenzylidenamino)-2- C,5HigN4,O5 | 334,33 No, Lo) oxazolidinone NPAMOZ 5 AHD C3H;N30 116,05 ~N Ỷ NH 1-aminohydantoin oe HN L | No fe) NPAHD NO, Jk 6 | [3-(2-nitrobenzylidenamino) | C¡oHyN¿O¿ | 248,19 NHÀ NH -2,4-imidazolidinedione] No le) 7 SEM semicarbazide ^ CH;NạO 75,08 HạN wt Mu | NPSEM R 8 3[(2-nitrophenyl)methylene]- | CgHgN,O3 208,174 92 Soy Jk NH, hydrazinecarboxamide 1. Tác dung của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran McCracken và các cộng sự 1995, Nouws và Laurensen 1990 chỉ ra rằng các hợp chất nhóm nitrofuran sau khi vào cơ thể tạo thành các chất chuyển hóa tương ứng liên kết trong các mô. Về mặt cơ chế tác dụng, các chất chuyên hóa từ nitrofuran đã kìm hãm hoặc pha hủy các hệ thống men điều hòa trao đôi chất ở vi khuẩn. Do đó vi khuẩn không phát triển và không sinh sản được nữa.
Tác dụng tốt với vi khuẩn gram âm và gram dương. Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác dụng tốt trong việc giệt trừ giun đũa [7]. Với nồng độ thấp, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác dụng diệt khuẩn. Theo nhiều báo cáo, nitrofuran tác dụng rất tốt trong việc diệt khuẩn salmonellosis, colisepticeamia.
Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dưỡng. Trộn nitrofuran với thức ăn, theo tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho ga va lon còn tang trọng nhanh. Nitrofuran ảnh hưởng đến sức khỏe con người như gây ung thư và đột biến [7]. khi thực pham có tồn dư nitrofuran và các dẫn xuất của nó.
Do đó hau hết các nước trên thế giới đã cam sử dụng kháng sinh nhóm nitrofuran trong chăn nuôi. Ở Việt Nam, bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định cắm sử dụng ni trofuran cho vào trong thức ăn chăn nuôi [9]. EU đã quy định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phương pháp (MRPL) đối với các chất chuyên hóa nhóm nitrofuran là 1 ug/kg [29]. Dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm Từ năm 2002 — 2003 nitrofuran thường xuyên được phát hiện thấy trong thịt gia cầm và các sản phâm nuôi trồng thủy sản nhập khâu vào các nước EU từ Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, An Độ, Việt Nam, Ecuador và Brazil [25].
Hơn nữa, dư lượng nitrofuran cũng được tìm thấy trong sản pham gia súc và gia cam ở Châu Âu như: Bồ Đào Nha, Y, Hy Lap, Romania va Bulgari. Sau đó EU đã kiểm tra và cho thấy nitrofuran 6 nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn 9 quốc gia trong năm 2007, tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc (37%), Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phâm bao gồm tôm, mật ong và thịt hộp [25]. Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiện thủy sản nhập khẩu từ Trung Quốc có nhiễm nitrofuran. Kết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê, cá ba sa.cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cắm nitrofuran trong tôm [11].
Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát của TS. Nguyễn Quốc Ân , phó trưởng phòng quản lý thuốc, cục thú y vào năm 2007 đã phát hiện 5 mẫu thủy sản nuôi lẫy tại ao nuôi nhiễm SEM (3 mau tôm, 1 mẫu cá và 1 mẫu cua lột) với hàm lượng từ 0 — 3,55 ng/g. Năm 2008 phát hiện 1 mẫu tôm thẻ chân trang tại Phú Mỹ — Bình Dinh nhiễm AOZ với hàm lượng 12,6 ng/g; 2/754 mẫu cua lột tại Cần Guộc — Long An nhiễm SEM với hàm lượng từ 2 — 2,2 ng/g [1]. Cac phương pháp xác định kháng sinh nhóm nitrofuran Hiện nay có nhiều phương pháp dé xác định kháng sinh nhóm nitrofuran , bao gồm: phương pháp sắc ký lỏngv ới detector UV , phương pháp vi sinh (kỹ thuật Elisa), phương pháp sắc ký lỏng với detector MS/MS.
Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV Một số tác giả đã sử dụng phương pháp sắc ký long với detector tử ngoại khả kiến (HPLC-UV-VIS) dé phân tích kháng sinh nhóm nitrofuran và các dẫn xuất của nó trong một số đối tượng thực phẩm. Horne và cộng sự, đã xây dựng phương pháp xác định AOZ, AMOZ trong gan lợn sử dụng HPLC — UV. Phương pháp dựa trên sự dẫn xuất các nitrofuran với 2-nitrobenzaldehyde, sau đó chiết với ethyl acetate, làm sạch bằng n-hexan và phân tích bằng HPLC-UV sử dụng cột C18 kết hợp với detector UV ở bước sóng 275nm. Giới han phát hiện của phương pháp là 5 và 10 ug/kg tương ứng cho AOZ và AMOZ với độ thu hồi trong khoảng 71-101% [18].
Tac gia Cooper và cộng sự cũng giới thiệu phương pháp xác định AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong gan và thận của lợn dùng HPLC-UV đã tách được 4 chất chuyền hóa nhóm nitrofuran. Giới hạn phát hiện của phương pháp là từ 2 - 5 ug/kg [21]. Phương pháp HPLC -UV có ưu điểm là dé thực hiện , và có thé ứng dung phân tích rộng rãi. Tuy nhiên phương pháp lại không đáp ứng được yêu cau về độ nhạy dé phân tích các nitrofuran trong thực phẩm vì hiện nay giới hạn cần phải đạ t tới (MRPL) là 1 pg/kg.
Phuong phap phan tich vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assay- ELISA) Hiện nay, ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên tắc chung đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme, enzyme sẽ thủy phân thành một chất có màu. Phòng thí nghiệm randox của Anh đã nghiên cứu xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran sử dụng phương pháp Elisa: mẫu được đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng o-NBA trong môi trường axit HCl , trung hòa axit bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu bang ethyl acetate va n-hexane. Giới han phát hiện của phương pháp từ 0,2 — 0,6 ng/g [28].
Vass và cộng sự (2008) sử dụng kỹ thuật Elisa trực tiếp sử dụng kháng thé đặc hiệu cho NPSEM, khang thé được gắn 1 enzym HRP xác định SEM trong trứng với quy trình xử lý mẫu: mẫu được đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng o-NBA trong môi trường axit HCl , sau do trung hòa bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu bang ethyl acetate và n-hexane. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,13 ug/kg, CC, = 0,3 ug/kg [25]. Diblikova và cộng sự (2005) giới thiệu kỹ thuật Elisa trực tiếp, sử dụng kháng thể đặc hiệu cho NPAOZ, kháng thể được gan 1 enzym HRP xac dinh AOZ trong tôm, thịt gà, thịt lợn, thịt bò với CC, là 0,4 g/kg, độ thu hồi từ 66 — 119% [20]. Lui và cộng sự (2007) giới thiệu kỹ thuật Elisa gián tiếp, sử dung khang thé NFT, kháng thể được gắn 1 enzym HRP xác định AHD trong nước.
Giới hạn phát hiện là 0,2 ug/1, độ thu hồi từ 88 — 103% [31]. Tương tự Chang và cộng sự (2008) xác định trong gan lợn, gan gà va cá với giới hạn phát hiện lần lượt là 0,19; 0,24; 0,18 ng/kg [15]. Phương pháp Elisa dap ứng được yêu cau về độ nhạy , đơn giản dễ thực hiện, tuy nhiên độ đặc hiệu bị giới hạn vì phải đánh dấu cho từng kháng thé chuyên biệt cho từng đối tượng. Phương pháp sắc ký lỏng khối pho LC/MS/MS Đây là một phương pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời dư lượng nitrofuran.
Sau khi qua cột tach, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hoa bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, các gốc tự do. Sau đó, các ion duoc đưa sang bộ phận tach theo khối lượng. Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng 1on phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh 1on phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, người ta định tinh và định lượng được chất phân tích một cách chính xác. Ở Việt Nam năm 2004, Bộ Thủy sản (nay là Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn) đã ban hành TCN 194:2004 xác định các chất chuyền hóa thuộc nhóm nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phố phân tích dư lượng liên kết với mô của các chất chuyên hóa nhóm nitrofuran trong sản phẩm thủy sản được thủy phân bằng axit clohydric loãng dé thu được mạch nhánh của các chất nhóm nitrofuran.
Các mạch nhánh này được dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyde, sau đó đưa pH đến 7 và được chiết bằng ethyl axetat. Dịch chiết được thôi khô băng N> đến cạn, hòa tan cặn, sau đó đo dung dich mẫu nay bang hệ thống LC/MS/MS với pha động kênh A là axit acetic , kênh B là acetonitril. Giới han phát hiện của phương pháp là 1 pg/kg [10]. Năm 2002 phòng thử nghiệm thức ăn chăn nuôi của Thái Lan đưa ra quy trình phân tích 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) bằng LC/MS/MS giới hạn phát hiện lần lượt của từng chất là AHD 0,1 ug/kg; AOZ 0,04 ng/kg; SEM 0,15 pg/kg; AMOZ 0,02 pg/kg [29].