Tổng quan luận án

U nguyên bào võng mạc (Retinoblastoma) là khối u ác tính nội nhãn nguyên phát thường gặp nhất ở trẻ em sau sinh, chiếm tỷ lệ khoảng 3% trong tổng số các khối u ác tính ở lứa tuổi nhi đồng. Khối u có nguồn gốc phát sinh từ các tế bào tiền thân của tế bào nón trên võng mạc. Tần suất mắc bệnh trong quần thể dao động từ 1/15.000 đến 1/18.000 trẻ sơ sinh sống. Về mặt phân bố giải phẫu, phần lớn các trường hợp xảy ra ở một bên mắt, trong khi khoảng 25% đến 30% trường hợp biểu hiện tổn thương ở cả hai bên mắt. Cơ chế bệnh sinh phân tử của u nguyên bào võng mạc được xác định là do sự bất hoạt hoặc đột biến mất chức năng của cả hai alen của gen RB1 định vị trên nhiễm sắc thể 13q14.2, dẫn đến việc thiếu hụt hoặc bất hoạt protein ức chế khối u pRB, khiến tế bào võng mạc phân chia không kiểm soát.

Về phương diện dịch tễ và tiên lượng, u nguyên bào võng mạc có sự phân hóa rõ rệt giữa các khu vực địa lý trên thế giới. Tại các quốc gia phát triển, nhờ việc sàng lọc phát hiện sớm và tiếp cận các liệu pháp phối hợp, tỷ lệ sống sót của bệnh nhi đạt trên 95%. Ngược lại, tại các quốc gia đang phát triển thuộc Châu Á và Châu Phi, tỷ lệ tử vong do bệnh vẫn ở mức cao, dao động từ 40% đến 70%. Nguyên nhân chủ yếu xuất phát từ việc chẩn đoán muộn khi khối u đã phá hủy cấu trúc nhãn cầu, xâm lấn thần kinh thị giác hoặc di căn ra ngoài hốc mắt.

Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu trước đây về u nguyên bào võng mạc (điển hình như nghiên cứu của nhóm tác giả Lê Thúy Quỳnh, Nguyễn Minh Châu, Trần Thu Hương giai đoạn 2010–2012 và Phạm Bảo Nghĩa năm 2013 tại Bệnh viện Mắt Trung ương) chủ yếu dừng lại ở việc mô tả các triệu chứng lâm sàng, dấu hiệu cận lâm sàng và đánh giá kết quả điều trị can thiệp tại mắt. Các số liệu về sinh học phân tử liên quan đến gen RB1 còn hạn chế. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào phân tích một cách hệ thống mối liên quan giữa các dạng đột biến gen RB1 với đặc điểm lâm sàng nhằm phục vụ công tác tiên lượng bệnh, tối ưu hóa phác đồ điều trị và tư vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân.

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài luận án “Nghiên cứu đột biến gen RB1 và mối liên quan đến đặc điểm lâm sàng trên bệnh nhân U nguyên bào võng mạc” được thực hiện nhằm giải quyết 2 mục tiêu cụ thể:

  1. Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân u nguyên bào võng mạc.
  2. Phân tích đột biến gen RB1 và mối liên quan đến đặc điểm lâm sàng trên bệnh nhân u nguyên bào võng mạc.

Phạm vi và đối tượng nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: 43 bệnh nhân được chẩn đoán xác định u nguyên bào võng mạc dựa trên tiêu chuẩn lâm sàng và chẩn đoán hình ảnh.
  • Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu được triển khai phối hợp giữa Bệnh viện Mắt Trung ương, Bệnh viện Nhi Trung ương (thực hiện khám lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh, phẫu thuật, giải phẫu bệnh và theo dõi sau điều trị) và Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein thuộc Trường Đại học Y Hà Nội (thực hiện các kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử).
  • Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10 năm 2014 đến tháng 10 năm 2016.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Lịch sử nghiên cứu u nguyên bào võng mạc

Lịch sử y văn ghi nhận những mô tả đầu tiên về khối u ác tính nội nhãn từ năm 1597 bởi Peter Pawius (Hà Lan) với trường hợp u xâm lấn hốc mắt, vùng thái dương và nội sọ. Đến năm 1809, James Wardrop (Scotland) đã mô tả toàn diện bệnh cảnh lâm sàng, khẳng định khối u có nguồn gốc từ võng mạc, đồng thời ghi nhận sự xâm lấn của khối u vào thần kinh thị giác, xâm nhập mô não và di căn xa tới nhiều cơ quan trong cơ thể.

Về mặt mô bệnh học, Flexner (1891) và Wintersteiner (1897) đã phát hiện các cấu trúc tế bào u sắp xếp hình hoa hồng đặc trưng có sự tương đồng với các tế bào cảm thụ ánh sáng của võng mạc trưởng thành (sau này được định danh là thể hoa hồng Flexner–Wintersteiner). Thuật ngữ “U nguyên bào võng mạc” (Retinoblastoma) chính thức được Verhoeff đề xuất vào năm 1920 và được Hiệp hội Nhãn khoa Hoa Kỳ phê chuẩn vào năm 1926.

Bước ngoặt về lý thuyết di truyền học u nguyên bào võng mạc được thiết lập vào năm 1971 khi Alfred Knudson đề xuất giả thuyết “hai lần tác động” (two-hit hypothesis). Năm 1986, gen RB1 được xác định là gen ức chế khối u đầu tiên ở người. Sau phát minh kỹ thuật PCR của Kary Mullis năm 1993, các nghiên cứu sinh học phân tử về RB1 phát triển mạnh mẽ:

  • Fung và cộng sự (1987) khảo sát 16 mẫu trong 40 bệnh nhân u nguyên bào võng mạc, phát hiện các biến đổi cấu trúc gen RB1, hiện tượng xóa đoạn đồng hợp tử và xác định các vị trí điểm nóng (hot spots).
  • Bookstein và cộng sự (1988) xác định ít nhất 20 exon đầu tiên của gen RB1, làm sáng tỏ cơ chế mất đoạn exon 2–6 dẫn đến suy giảm phiên mã mRNA.
  • Dunn và cộng sự (1989) sử dụng PCR giải trình tự 15/21 mẫu u, nhận diện 4 đột biến dòng tế bào mầm và 3 đột biến soma gây biến đổi vị trí ghép nối làm mất exon.
  • Dryja và cộng sự (1989) chứng minh các đột biến điểm chuyển đổi nucleotide từ C thành T trên các exon 21–24 ở bệnh nhân u nguyên bào võng mạc rải rác.

Dịch tễ học và biểu hiện lâm sàng

Theo báo cáo tổng kết toàn cầu của Kivela (2009), ước tính mỗi năm có khoảng 7.202 đến 8.102 trẻ mắc mới u nguyên bào võng mạc. Tỷ lệ tử vong ghi nhận có sự phân hóa sâu sắc: Châu Phi chiếm 70%, Châu Á (không bao gồm Nhật Bản) chiếm 38%, Châu Mỹ La-tinh chiếm 20%, Châu Đại Dương chiếm 10%, trong khi Châu Âu chiếm 5%, Bắc Mỹ và Nhật Bản chỉ chiếm 3%. Tại Hoa Kỳ, Broaddus và cộng sự (1975–2004) ghi nhận tỷ lệ mắc ổn định là 11,8 ca/triệu trẻ trong nhóm 0–4 tuổi. Tại Anh, MacCarthy và cộng sự (2009) báo cáo tỷ lệ sống sót 5 năm tăng từ 85% (1963–1967) lên 97% (1998–2002) đối với thể một mắt, và từ 88% lên 100% đối với thể hai mắt.

Về biểu hiện lâm sàng, triệu chứng xuất hiện phổ biến nhất tại các nước phát triển là dấu hiệu ánh đồng tử trắng (leukocoria / ánh mắt mèo) và lác mắt (strabismus):

  • Abramson và cộng sự (Hoa Kỳ) nghiên cứu 1.265 bệnh nhân (1960–1990) ghi nhận: ánh đồng tử trắng chiếm 56%, lác chiếm 24%, giảm thị lực chiếm 8%.
  • Nghiên cứu tại Đài Loan trên 56 bệnh nhân ghi nhận: ánh đồng tử trắng 71%, đau đỏ mắt 18%, lác 14%.
  • Báo cáo tại Trung Quốc trên 470 bệnh nhân ghi nhận: ánh đồng tử trắng 73%.
  • Nghiên cứu tại Thụy Sĩ trên 139 bệnh nhân (1963–2004) ghi nhận: ánh đồng tử trắng 48%, lác 20%.

Trái lại, tại các quốc gia kém phát triển, bệnh nhân thường đến viện ở giai đoạn muộn với triệu chứng lồi mắt và u xuất ngoại: Sudan ghi nhận 56% lồi mắt (tuổi trung bình chẩn đoán 36 tháng, ánh đồng tử trắng 32%); Nigeria ghi nhận 85% lồi mắt; Nepal ghi nhận 33% lồi mắt; Mali ghi nhận 55% lồi mắt (tuổi trung bình chẩn đoán 4 tuổi).

Các nghiên cứu phát hiện đột biến gen RB1 và mối liên quan lâm sàng

Tỷ lệ phát hiện đột biến gen RB1 có sự dao động phụ thuộc vào quần thể nghiên cứu và kỹ thuật xét nghiệm được áp dụng:

Tác giả / Năm công bố Quốc gia Cỡ mẫu Phương pháp xét nghiệm Tỷ lệ phát hiện đột biến
Lohmann D (1996) Đức 71 SSCP, Giải trình tự 72%
Alonso J (2001) Tây Ban Nha 43 Giải trình tự, RT-PCR 67%
Choy K (2002) Trung Quốc 42 MS-PCR, SSCP 19%
Sugano (2004) Nhật Bản 51 SSCP, DHPLC, FISH 39%
Houdayer (2004) Pháp 192 DHPLC, QMPSF 46%
Dalamón V (2004) Argentina 21 Giải trình tự 24%
Alonso J (2005) Tây Ban Nha, Colombia, Cuba 107 Giải trình tự, Microsatellite 50%
Nichols KE (2005) Bắc Mỹ 180 Giải trình tự, RT-PCR, QSBA, LOH 50%
Sampieri (2006) Ý 35 SSCP, Giải trình tự, RT-PCR 37%
Macias M (2008) Mexico 48 SSCP, Giải trình tự 19%
Rushlow D (2009) Châu Âu, Bắc Mỹ, Châu Á 1.020 QM-PCR, Giải trình tự, AS-PCR 49%
Abouzeid H (2009) Thụy Sĩ 65 DHPLC, Giải trình tự 45%
Parsam VL (2009) Ấn Độ 74 QM-PCR, RFLP, FG, Giải trình tự 66%
Pradhan MA (2010) New Zealand 20 Giải trình tự, MLPA, FISH 50%
Abidi (2011) Maroc 41 PCR, Giải trình tự 24,39%
Jeridi (2015) Tunisia 37 Giải trình tự, MLPA, PCR 81%
Mohd Khalid (2015) Malaysia 19 Giải trình tự, PCR, MLPA 52,6%
Frenkel (2016) Israel 164 Giải trình tự, AS-PCR, MLPA 90,8%
Swati Tomar (2017) Singapore 59 Giải trình tự, MLPA, MS-PCR, QM-PCR, Microsatellite 84,7%

Về mối liên quan giữa đột biến và lâm sàng:

  • Thống kê quốc tế chỉ ra tuổi trung bình khi chẩn đoán ở thể hai mắt là 12,5 tháng, sớm hơn có ý nghĩa thống kê so với thể một mắt là 24,8 tháng ($p = 0,006$).
  • Các nghiên cứu của Lohmann (1996), Choy (2002), Ata-ur-Rasheed (2002), Albrecht (2005), Qi (2005) và Joseph (2006) không tìm thấy mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa đột biến tạo mã kết thúc sớm với các triệu chứng lâm sàng, tuổi chẩn đoán hay phân nhóm ICRB.
  • Tuy nhiên, He và cộng sự (2014) tại Trung Quốc nghiên cứu trên 31 bệnh nhân đã ghi nhận: nhóm có đột biến gây cắt ngắn cấu trúc protein pRB có 96,8% bệnh nhân bị bệnh ở cả hai mắt (so với 66,7% ở nhóm đột biến không cắt ngắn) và tuổi khởi phát trung bình sớm hơn (10,7 tháng so với 13,5 tháng).

Khoảng trống nghiên cứu của luận án

Tại Việt Nam, các nghiên cứu chuyên sâu về phân tích mối liên hệ giữa kiểu gen đột biến RB1 với đặc điểm lâm sàng, phân loại nguy cơ và mô bệnh học chưa từng được thực hiện đầy đủ. Luận án được định vị nhằm giải quyết khoảng trống học thuật này, cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử đầu tiên kết hợp lâm sàng trên bệnh nhân u nguyên bào võng mạc người Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và sinh học phân tử

Luận án dựa trên nền tảng thuyết di truyền học ung thư và sinh học phân tử của gen RB1:

  • Giả thuyết "hai lần tác động" của Knudson (1971): Sự hình thành u nguyên bào võng mạc đòi hỏi việc bất hoạt cả hai alen của gen RB1. Ở thể di truyền (chiếm khoảng 40% tổng số ca, 30% có tiền sử gia đình), đột biến thứ nhất xảy ra ở dòng tế bào mầm (germline mutation), đột biến thứ hai xuất hiện trong tế bào võng mạc trong quá trình biệt hóa. Ở thể không di truyền (chiếm 60% tổng số ca, thường là các ca đơn phát một mắt), cả hai lần đột biến đều xảy ra độc lập tại tế bào soma của võng mạc.
  • Cấu trúc gen RB1 và protein pRB: Gen RB1 định vị tại dải 13q14.2 trên nhiễm sắc thể số 13, có kích thước khoảng 180 kb với 27 exon và 26 intron, mã hóa chuỗi polypeptide gồm 928 acid amin tạo nên protein ức chế khối u pRB. Protein pRB gồm 4 miền cấu trúc chính: miền đầu N (N-terminus), miền A, miền B (miền A/B tương tác với các yếu tố phiên mã họ E2F và các protein chứa motif LxCxE) và miền đầu C (C-terminus, chứa tín hiệu định vị nhân NLS và vị trí liên kết với các phức hợp Cyclin-CDK).
  • Cơ chế điều hòa chu kỳ tế bào: Protein pRB ở trạng thái giảm phosphoryl hóa liên kết chặt chẽ với các yếu tố phiên mã E2F, ức chế quá trình phiên mã các gen cần thiết cho sự chuyển tiếp từ pha G1 sang pha S. Khi pRB bị phosphoryl hóa liên tiếp bởi các kinase phụ thuộc cyclin (CDK4/6–Cyclin D, CDK2–Cyclin E, CDK2–Cyclin A/B), phức hợp pRB–E2F phân ly, giải phóng E2F tự do thúc đẩy tế bào phân chia. Đột biến làm mất chức năng của pRB khiến tế bào tiền thân nón võng mạc tăng sinh không kiểm soát, hình thành khối u.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

  • Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
  • Cỡ mẫu và chọn mẫu: Chọn mẫu thuận tiện gồm 43 bệnh nhân được chẩn đoán xác định u nguyên bào võng mạc tại Bệnh viện Mắt Trung ương và Bệnh viện Nhi Trung ương trong giai đoạn từ tháng 10/2014 đến tháng 10/2016.
  • Tiêu chuẩn lựa chọn: Bệnh nhân đáp ứng các tiêu chuẩn chẩn đoán u nguyên bào võng mạc theo phân loại hình thái và kích thước của Ramasubramanian và Shields:
    • Khối u nhỏ 1–3 mm: tròn hoặc bầu dục, màu xám/trắng xám, bờ rõ, nằm trên võng mạc.
    • Khối u 4–5 mm: màu trắng đục hoặc vàng đục, mạch máu võng mạc bề mặt thay đổi.
    • Khối u 6–10 mm: màu trắng đục do canxi hóa, giãn động mạch trung tâm võng mạc, hoại tử u.
    • Khối u > 10 mm: phát triển vào buồng dịch kính, gây bong võng mạc hoặc xuất ngoại.
    • Khối u kèm reo rắc tế bào trong dịch kính hoặc dịch dưới võng mạc.
    • Triệu chứng lâm sàng bán phần trước và chẩn đoán hình ảnh (siêu âm, CT, MRI) xác định khối u nội nhãn có vôi hóa.
  • Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân và gia đình không đồng ý tham gia nghiên cứu.

Quy trình thu thập dữ liệu và kỹ thuật xét nghiệm

  1. Khám lâm sàng và chẩn đoán hình ảnh:
    • Hỏi bệnh: Khai thác tiền sử gia đình, thời điểm phát hiện triệu chứng đầu tiên (ánh đồng tử trắng, lác, đau đỏ mắt), thời gian diễn biến bệnh.
    • Khám mắt toàn diện: Khám bán phần trước (giác mạc, tiền phòng, mống mắt, thể thủy tinh); soi đáy mắt sau khi tra giãn đồng tử tối đa (khám dưới gây mê hoặc gây tê) để xác định vị trí, kích thước, số lượng khối u và tình trạng reo rắc tế bào u.
    • Chẩn đoán hình ảnh: Siêu âm mắt (A-scan, B-scan) đánh giá kích thước khối u và nốt vôi hóa; chụp cắt lớp vi tính (CT-Scanner); chụp cộng hưởng từ (MRI) sọ não và hốc mắt đánh giá thâm nhiễm hắc mạc, củng mạc, thần kinh thị giác và tầm soát u ba nơi.
  2. Giải phẫu bệnh mô bệnh học:
    • Thực hiện trên các mẫu nhãn cầu khoét bỏ ở giai đoạn muộn (nhóm D, E).
    • Đánh giá mức độ biệt hóa tế bào (thể hoa hồng Flexner–Wintersteiner, hoa hồng Homer–Wright), hiện tượng hoại tử, canxi hóa, và mức độ xâm lấn (bán phần trước, hắc mạc, thị thần kinh trước/sau lá sàng, củng mạc, hốc mắt).
    • Phân giai đoạn mô bệnh học theo hệ thống pTNM lần thứ 7 của AJCC/UICC (từ pT1 đến pT4b).
  3. Phân loại mức độ nghiêm trọng của bệnh theo Qi – Joseph:
    • Mức độ nặng: Thỏa mãn một hoặc nhiều tiêu chí: Bị hai mắt có tuổi phát hiện < 12 tháng hoặc một mắt có tuổi phát hiện < 24 tháng kèm phân nhóm ICRB nhóm D, E; có yếu tố nguy cơ cao trên giải phẫu bệnh; lâm sàng tiến triển nặng (glôcôm tân mạch, xâm lấn bán phần trước, giãn lồi củng mạc); hoặc phải cắt bỏ cả hai nhãn cầu.
    • Mức độ nhẹ: Bị một mắt có tiền sử gia đình; hoặc bị hai mắt có tuổi phát hiện > 12 tháng kèm phân nhóm ICRB nhóm A, B.
    • Mức độ trung bình: Các trường hợp không thỏa mãn đầy đủ tiêu chí của mức độ nặng hoặc nhẹ.
  4. Quy trình phân tích sinh học phân tử:
    • Lấy 2–3 mL máu tĩnh mạch ngoại vi chống đông bằng EDTA (1,5 mg/mL), bảo quản lạnh và chuyển về Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein Trường Đại học Y Hà Nội.
    • Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp Phenol/chloroform truyền thống: Phá màng hồng cầu và màng tế bào bằng dung dịch Lysis buffer $\rightarrow$ xử lý protein bằng SDS 10% và Proteinase K ở 56°C trong 2 giờ $\rightarrow$ chiết tách với hỗn hợp Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1) $\rightarrow$ ly tâm thu pha nước chứa DNA $\rightarrow$ tủa DNA và hòa tan.
    • Thực hiện phản ứng chuỗi polymerase (PCR) khuếch đại các exon và vùng ranh giới exon–intron của gen RB1, sau đó tiến hành giải trình tự DNA trực tiếp bằng phương pháp Sanger.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng hợp toàn diện các cơ sở lý luận, dữ liệu dịch tễ học, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, giải phẫu bệnh và cơ chế bệnh học phân tử của bệnh u nguyên bào võng mạc:

  • Đặc điểm dịch tễ và lâm sàng: Hệ thống hóa tỷ lệ mắc bệnh, sự chênh lệch tỷ lệ tử vong giữa các nhóm quốc gia phát triển và đang phát triển. Phân tích các dấu hiệu lâm sàng khởi phát thường gặp (ánh đồng tử trắng chiếm 60–80%, lác mắt chiếm khoảng 20%) và các biểu hiện tiến triển muộn (lồi mắt, glôcôm tân mạch, giả mủ tiền phòng).
  • Chẩn đoán phân biệt: Trình bày chi tiết các tiêu chuẩn phân biệt u nguyên bào võng mạc với các bệnh lý nhãn khoa khác ở trẻ em như bệnh Coats, tồn lưu mạch máu dịch kính nguyên thủy (PHPV), bệnh võng mạc trẻ đẻ non (ROP), viêm màng bồ đào/võng mạc do nhiễm trùng (Herpes, CMV, Toxoplasma, Toxocara) và bệnh Norrie.
  • Chẩn đoán hình ảnh và Cận lâm sàng: Phân tích vai trò của siêu âm (phát hiện canxi hóa ở trên 95% khối u), CT-Scanner (đánh giá cấu trúc xương và vôi hóa nhưng bị hạn chế do nguy cơ ung thư thứ phát từ tia bức xạ), MRI (phương pháp tối ưu đánh giá mô mềm, thâm nhiễm thần kinh thị và hắc mạc trên các chuỗi xung T1, T2 có tiêm đối quang từ), và hệ thống Ret-Cam (chụp ảnh màu và chụp mạch huỳnh quang góc rộng).
  • Phân loại quốc tế ICRB (International Classification for Retinoblastoma):
Nhóm ICRB Tiêu chuẩn phân nhóm theo mức độ lan rộng và kích thước Định hướng xử trí
Nhóm A Khối u nhỏ $\le 3$ mm, cách hoàng điểm $\ge 3$ mm, cách đĩa thị $\ge 1,5$ mm. Không có reo rắc tế bào u. Điều trị tại chỗ đơn thuần (laser, lạnh đông). Tiên lượng rất tốt.
Nhóm B Khối u $> 3$ mm hoặc nằm gần hoàng điểm ($\le 3$ mm) / đĩa thị ($\le 1,5$ mm); dịch dưới võng mạc $\le 3$ mm từ viền u. Chưa có reo rắc tế bào u. Hóa trị liệu toàn thân kết hợp điều trị củng cố tại chỗ.
Nhóm C Khối u có reo rắc tế bào u khu trú trong dịch kính hoặc dưới võng mạc $\le 3$ mm từ khối u. Dịch dưới võng mạc khu trú ở một góc 1/4. Hóa trị liệu toàn thân trước khi điều trị can thiệp khu trú.
Nhóm D Reo rắc tế bào u lan tỏa trong dịch kính hoặc dưới võng mạc diện rộng; dịch dưới võng mạc $> 1/4$ đáy mắt hoặc bong võng mạc toàn bộ. Hóa trị liệu toàn thân tích cực, xem xét bảo tồn hoặc phẫu thuật.
Nhóm E Khối u kích thước lớn phá hủy cấu trúc nhãn cầu: glôcôm tân mạch, xuất huyết nội nhãn, hoại tử u, u chạm mặt sau thể thủy tinh, thâm nhiễm tỏa lan. Chỉ định khoét bỏ nhãn cầu ngay; không còn khả năng bảo tồn.
  • Giải phẫu bệnh và phân giai đoạn pTNM 7th AJCC/UICC: Đánh giá cấu trúc đại thể (hướng nội, hướng ngoại, hỗn hợp), vi thể (không biệt hóa, biệt hóa tạo thể hoa hồng Flexner–Wintersteiner hoặc Homer–Wright). Phân giai đoạn giải phẫu bệnh từ pT1 (u khu trú nội nhãn) đến pT4b (u xâm lấn qua diện cắt thị thần kinh và xuất ngoại nhãn cầu).
  • Cơ sở sinh học phân tử và phân bố đột biến gen RB1: Tổng kết cơ sở dữ liệu RBGMdb với 932 đột biến ghi nhận trên 25/27 exon và vùng promoter. Xác định 17 đột biến điểm phổ biến nhất trên thế giới:
    • 12 đột biến vô nghĩa (nonsense mutations): p.Arg320X (exon 10), p.Arg579X (exon 18), p.Arg251X (exon 8), p.Arg255X (exon 8), p.Arg445X (exon 14), p.Arg455X (exon 14), p.Arg552X (exon 17), p.Arg556X (exon 17), p.Arg787X (exon 23)... Phần lớn các đột biến này do thay thế nucleotide từ C sang T tại bộ ba mã hóa Arginine (CGA).
    • 2 đột biến sai nghĩa (missense mutations): p.Arg661Trp và p.Arg656Trp đều nằm tại exon 20 trong miền cấu trúc A/B của protein pRB.
    • 3 đột biến tại vị trí nối (splicing mutations): Đột biến thay thế G thành T tại vị trí nucleotide đầu tiên của intron 6, intron 12 và intron 19.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình tổ chức nghiên cứu và các kỹ thuật thực nghiệm được triển khai:

  • Tiêu chuẩn tuyển chọn và loại trừ bệnh nhân chặt chẽ trên 43 ca bệnh thu nhận trong 2 năm (10/2014–10/2016).
  • Quy trình phối hợp liên viện giữa Bệnh viện Mắt Trung ương, Bệnh viện Nhi Trung ương và Trường Đại học Y Hà Nội trong việc thu thập mẫu bệnh phẩm và quản lý dữ liệu bệnh án thống nhất.
  • Quy trình chuẩn hóa kỹ thuật tách chiết DNA bộ gen từ máu ngoại vi bằng phương pháp Phenol/chloroform, xử lý enzym Proteinase K ở 56°C.
  • Quy trình giải trình tự gen Sanger trực tiếp trên gen RB1, phân tích các dạng đột biến (vô nghĩa, sai nghĩa, dịch khung, mất đoạn, đột biến vị trí nối).
  • Thiết lập khung phân tích thống kê xác định mối liên quan giữa kiểu đột biến gen RB1 (nhóm đột biến gây cắt ngắn cấu trúc pRB so với nhóm không gây cắt ngắn) với các biến số lâm sàng: tuổi phát hiện bệnh, thể bệnh một mắt hay hai mắt, phân nhóm ICRB và mức độ nặng của bệnh theo thang phân loại Qi – Joseph.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

  • Luận án hệ thống hóa cơ sở dữ liệu học thuật toàn diện về bệnh lý u nguyên bào võng mạc, từ cơ chế bệnh sinh phân tử của gen ức chế khối u RB1 đến các phân loại lâm sàng và giải phẫu bệnh quốc tế hiện hành.
  • Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam về đặc điểm sinh học phân tử của gen RB1, đóng góp vào ngân hàng dữ liệu các biến dị di truyền ở bệnh nhân u nguyên bào võng mạc người Việt.

Đóng góp về mặt thực tiễn

  • Thiết lập quy trình phối hợp đa chuyên khoa (Nhãn khoa – Ung bướu Nhi – Giải phẫu bệnh – Di truyền sinh học phân tử) trong việc chẩn đoán, phân tầng nguy cơ và lập kế hoạch điều trị cho bệnh nhân u nguyên bào võng mạc.
  • Ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp để phát hiện đột biến gen RB1 từ mẫu máu ngoại vi, phục vụ công tác chẩn đoán xác định thể bệnh di truyền, phát hiện người lành mang gen trong gia đình và hỗ trợ tư vấn di truyền trước sinh.
  • Ứng dụng hệ thống phân nhóm quốc tế ICRB và phân tầng mức độ nghiêm trọng Qi – Joseph, hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng đưa ra quyết định điều trị bảo tồn nhãn cầu hoặc chỉ định phẫu thuật khoét bỏ nhãn cầu đúng thời điểm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Cỡ mẫu nghiên cứu còn hạn chế (43 bệnh nhân) do đặc thù bệnh lý u nguyên bào võng mạc là bệnh hiếm gặp và sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện.
  • Nguồn mẫu phân tích di truyền chủ yếu dựa trên DNA tách chiết từ máu ngoại vi, chưa thực hiện giải trình tự song song trên mẫu mô khối u tươi đối với tất cả các trường hợp phẫu thuật để phân tích toàn diện các đột biến soma.
  • Kỹ thuật giải trình tự Sanger đơn thuần có thể bỏ sót các dạng mất đoạn lớn nhiều exon hoặc các biến đổi biểu sinh (như hiện tượng tăng methyl hóa vùng promoter gen RB1) vốn đòi hỏi các kỹ thuật chuyên biệt như MLPA hay MS-PCR.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Mở rộng quy mô nghiên cứu đa trung tâm trên phạm vi toàn quốc để tăng kích thước mẫu bệnh nhân.
  • Kết hợp đồng thời các kỹ thuật sinh học phân tử chuyên sâu (như MLPA, MS-PCR, giải trình tự thế hệ mới NGS) trên cả mẫu máu ngoại vi và mẫu mô khối u nhằm xác định đầy đủ các đột biến cấu trúc lớn, đột biến thể khảm mầm và biến đổi methyl hóa.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên sau đại học và giảng viên: Công trình là tài liệu tham khảo chuyên sâu về chuyên ngành Nhãn khoa, Di truyền Y học và Ung bướu học; cung cấp tài liệu tổng quan toàn diện về bệnh học phân tử của gen RB1 và phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp thực nghiệm sinh học phân tử.
  • Đối với bác sĩ lâm sàng Nhãn khoa và Ung bướu Nhi: Cung cấp tài liệu tra cứu thực hành về các dấu hiệu lâm sàng, chẩn đoán phân biệt, tiêu chuẩn đọc hình ảnh siêu âm/MRI và hệ thống phân nhóm ICRB phục vụ phân tầng điều trị.
  • Đối với các đơn vị tư vấn di truyền: Cung cấp cơ sở khoa học và quy trình kỹ thuật để triển khai xét nghiệm sàng lọc gen RB1 cho các thành viên trong gia đình bệnh nhân u nguyên bào võng mạc.

Câu hỏi thường gặp

1. Giả thuyết "hai lần tác động" (two-hit hypothesis) của Knudson giải thích sự khác biệt giữa thể bệnh di truyền và không di truyền như thế nào?

Theo Knudson (1971), sự hình thành u nguyên bào võng mạc đòi hỏi việc bất hoạt cả hai alen của gen RB1. Ở thể di truyền, đột biến thứ nhất xảy ra ở dòng tế bào mầm và hiện diện trong mọi tế bào của cơ thể; đột biến thứ hai xảy ra tại tế bào võng mạc trong quá trình biệt hóa, dẫn đến bệnh xuất hiện sớm (tuổi trung bình 12,5 tháng) và thường biểu hiện ở cả hai mắt hoặc đa ổ. Ở thể không di truyền, cả hai lần đột biến đều diễn ra độc lập tại tế bào soma của võng mạc sau sinh; quá trình tích lũy hai đột biến độc lập này cần thời gian dài hơn, giải thích vì sao thể không di truyền thường xuất hiện ở lứa tuổi lớn hơn (tuổi trung bình 24,8 tháng) và chỉ biểu hiện ở một bên mắt.

2. Dấu hiệu lâm sàng khởi phát nào phổ biến nhất ở bệnh nhân u nguyên bào võng mạc?

Dấu hiệu khởi phát sớm và phổ biến nhất là ánh đồng tử trắng (leukocoria / ánh mắt mèo), chiếm tỷ lệ từ 60% đến 80% trường hợp tại các nước phát triển (Mỹ 56%, Đài Loan 71%, Trung Quốc 73%). Dấu hiệu phổ biến thứ hai là lác mắt (chiếm khoảng 20%). Tại các quốc gia kém phát triển (như Mali, Sudan, Nigeria), do tiếp cận y tế muộn, triệu chứng thường gặp nhất khi đến khám lại là lồi mắt (chiếm 55% đến 85%) do khối u đã hoại tử và xâm lấn ra ngoài nhãn cầu.

3. Cấu trúc và chức năng chính của gen RB1 và protein pRB là gì?

Gen RB1 nằm tại vị trí 13q14.2 trên nhiễm sắc thể 13, gồm 27 exon và 26 intron, mã hóa cho prot