ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, đây là điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng hết sức thuận lợi cho việc phát triển các vùng chuyên canh trồng hành ta. Cây hành ta (Allium ascalonicum L) là loại cây quen thuộc chủ yếu được sử dụng phổ biến làm gia vị và thực phẩm. Ngoài ra, còn được sử dụng làm thuốc theo kinh nghiệm dân gian để điều trị nhiều loại bệnh liên quan đến tim mạch, đau đầu, hen suyễn, côn trùng cắn, giun sán [1]. Ngày nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh hành ta có nhiều tác dụng sinh học như tăng cường miễn dịch, ức chế tế bào ung thư, hạ lipid máu, hạ glucose máu, điều trị rối loạn trào ngược dạ dày [2].
Ngoài ra, những năm gần đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu phát triển công nghệ lên men các loại thực vật họ Hành (Liliaceae) nhằm tìm kiếm và tối ưu hóa các hoạt chất cũng như tác dụng sinh học mới trong đó có các dược liệu điển hình như tỏi và hành. Lên men dược liệu là một quá trình chuyển hóa sinh học dưới tác động của vi sinh vật, enzym hoặc là tự chuyển hóa diễn ra ngay bên trong dược liệu dưới tác động của nhiệt độ, độ ẩm và thời gian. Lên men giúp cho chuyển hóa các chất cao phân tử thành các chất có khối lượng phân tử thấp hơn làm cho chúng trở thành một phân tử mới, không độc, dễ hấp thu hoặc hoạt tính mạnh hơn, thậm chí có hoạt tính hoàn toàn khác với chất ban đầu [3]. Nhiều nghiên cứu đã áp dụng lên men với các dược liệu như lên men trà xanh (Camellia sinensis L.), tỏi (Allium sativum L.) … các sản phẩm sau khi lên men đều tăng hàm lượng hoạt chất và tác dụng sinh học.
Đồng thời khắc phục được một số nhược điểm về mùi vị khi sử dụng ở dạng tươi (như các dược liệu họ hành), nhờ đó tạo thêm một nguyên liệu tốt cho sản xuất dược phẩm, thực phẩm, góp phần chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Hiện nay, các nghiên cứu về lên men hành đen từ hành ta còn ít và chưa 2 toàn diện, từ nghiên cứu về các điều kiện lên men để tối ưu hóa thành phần hoạt chất cũng như cải thiện tác dụng sinh học hay tìm kiếm tác dụng mới; nghiên cứu sự biến đổi thành phần hóa học; nghiên cứu chiết xuất bào chế cao khô dược liệu bằng các công nghệ mới để tiện sử dụng, tăng tính ổn định của các sản phẩm, đến các nghiên cứu về đánh giá tác dụng sinh học của dạng cao khô [4]. Vì vậy, chưa khai thác hết được tiềm năng và giá trị của hành ta là loại cây trồng khá phổ biến tại Việt Nam. Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài: “Nghiên cứu bào chế, đánh giá độc tính và một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen” được thực hiện với các mục tiêu sau: 1.
Xây dựng được quy trình lên men tạo hành đen từ hành ta (Allium ascalonicum L.) quy mô phòng thí nghiệm. Xây dựng được quy trình bào chế, tiêu chuẩn cơ sở và bước đầu đánh giá độ ổn định của cao khô hành đen. Đánh giá được độc tính và một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen trên thực nghiệm. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
TỔNG QUAN VỀ CÂY HÀNH TA Hành ta có tên khoa học là Allium ascalonicum L., thuộc họ Hành (Liliaceae) [1]. Đặc điểm thực vật và phân bố Cây thảo, sống 1 - 2 năm, cao 15 - 50 cm. Bản chất hình thái thân hành ta phình to nên thường gọi là củ hành, có kích thước thay đổi, có cạnh, gồm nhiều vẩy thịt mỏng như giấy, có chứa nhiều chất dinh dưỡng. Hành ta có hình dạng trong hơi dẹt, hình bầu dục hoặc hình bầu dục dài, thường có màu đỏ, tím hay màu trắng.
Lá dài, hình trụ, nhọn, rỗng, tròn, màu xanh mốc. Cụm hoa dạng tán ở đầu một cán cao 20 - 50 cm, rộng, tán hoa hình cầu. Hoa có 6 phiến hoa rời, màu trắng, hồng hay tím nhạt, cuống hoa dài 1 - 1,5 cm [1]. Hình ảnh hành ta * Nguồn: Ảnh chụp tại huyện đảo Lý Sơn tháng 8 năm 2017 Phân bố: Cây trồng làm rau ăn từ lâu đời, đầu tiên được trồng ở Tadzhikistan, Afghanistan, Iran sau đó du nhập khắp thế giới.
Ở nước ta cây hành ta được trồng ở nhiều nơi như huyện Kinh Môn (tỉnh Hải Dương), huyện đảo Lý Sơn (tỉnh Quảng Ngãi), huyện Ninh Hải (tỉnh Ninh Thuận), thị xã Vĩnh Châu (tỉnh Sóc Trăng), huyện Gò Công Đông (tỉnh Tiền Giang) nhưng 4 nổi tiếng nhất là ở thị xã Vĩnh Châu và huyện đảo Lý Sơn. Thường trồng ở rẫy và vùng đồng bằng. Cây chịu được lạnh vào mùa đông. Vào tháng 7 - 8, lúc lá khô, đào lấy củ đem phơi khô, rồi để trong bóng mát [5].
Bộ phận dùng: Thân hành hay còn gọi là củ hành. Thành phần hóa học Theo các tài liệu thu thập được, thành phần hóa học của hành ta chủ yếu là các flavonoid, các hợp chất lưu huỳnh và các saponin. Các hợp chất flavonoid Flavonoid trong hành ta chủ yếu thuộc nhóm flavonol như kaempferol, isorhamnetin, dẫn chất của quercetin: isoquercetin, quercetin monoglucosid, quercetin diglucosid và quercetin tự do. Theo nghiên cứu của Fattorusso E.
và cộng sự, sau khi thu nhận cao methanol từ hành ta và phân lập bằng các hỗn hợp dung môi như n-butanol và nước, methanol và nước, thông qua nhiều loại cột khác nhau đã xác định được một số flavonoid và glycosid của chúng như quercetin, quercetin-4'-glucosid (spiraeosid), quercetin-7-glucosid, quercetin-3-4'-diglucosid, isorhamnetin và isorhamnetin-3-4'-diglucosid [2]. và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu đánh giá hàm lượng flavonol glucosid trong một số loài hành, bằng phương pháp HPLC-DAD-ESI-MS-MS. Kết quả cho thấy hành ta có chứa các hợp chất quercetin 3,7,4'-triglucosid, quercetin 7,4'-diglucosid, quercetin 3,4'- diglucosid, isorhamnetin 3,4'-diglucosid, quercetin 3-glucosid, quercetin 4'- glucosid và isorhamnetin 4'-glucosid, trong đó quercetin 3,4'-diglucosid và quercetin 4'-glucosid có hàm lượng cao nhất, tương ứng là 516-605 mg/kg và 392-509 mg/kg [6]. Ngoài ra trong hành ta còn có một số glucosid khác của quercetin và isorhamnetin như quercetin-3-rhamnosid (quercitrin) và isorhamnetin-3- glucosid [7].
5 Theo kết quả của các nghiên cứu đã được thực hiện, các hợp chất flavonoid phân lập được từ hành ta được trình bày ở bảng 1. Các hợp chất flavonoid trong hành ta STT Tên hợp chất TLTK 1 Quercetin (1) [2], [7] 2 Quercetin 4'-O-glucosid (2) [7] 3 Quercetin 3-O-rhamnosid (3) [7] 4 Quercetin 3,4'-O-diglucosid (4) [7] 5 Quercetin 7-glucosid (5) [6] 6 Quercetin 3-glucosid (6) [6] 7 Quercetin 7,4'-diglucosid (7) [6] 8 Quercetin 3,7,4'-triglucosid (8) [6] 9 Isorhamnetin (9) [2] 10 Isorhamnetin 3,4'-O-diglucosid (10) [7] 11 Isorhamnetin 4'-glucosid (11) [6] 12 Isorhamnetin 3-O-glucosid (12) [7] 13 Kaemferol 3-O-glucosid (13) [7] 14 Kaemferol 3,4'-O-glucosid (14) [7] R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 (1) H H H H (7) H Glc H Glc (2) H H H Glc (8) Glc Glc H Glc (3) Rha H H H (9) H H CH3 H (4) Glc H H Glc (10) Glc H CH3 Glc (5) H Glc H H (11) H H CH3 Glc (6) Glc H H H (12) Glc H CH3 H R1 R2 (13) Glc H (14) Glc Glc Hình 1. Cấu trúc của các flavonoid phân lập từ hành ta * Nguồn: Theo Fatturuso E. Các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ Các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ trong hành ta tồn tại dưới 3 dạng chính là cystein sulfoxyd, γ-glutamylcystein và các hợp chất lưu huỳnh dễ bay hơi khác [8].
Hợp chất γ-glutamylcystein dễ bị oxy hóa và thủy phân thành thiosulfinat như là S-alky(en)yl-cystein sulfoxyd (ACSO) đại diện là các chất như alliin, isoalliin, methiin và propiin [8], [9], [10]. ACSO và các thiosulfinat khác có thể chuyển đổi thành các hợp chất có chứa lưu huỳnh dễ bay hơi như dithiin, allicin, vinyldithiin, bởi enzym allinase [8], [11]. Tuy nhiên, cycloalliin (CYC) không bị chuyển đổi thành thiosulfinat bởi enzym allinase và vẫn ổn định trong quá trình cắt hoặc nghiền hành ta [12], [13]. * Cycloalliin a) Nguồn gốc - CYC là một sulfoxyd mạch vòng bền vững với nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, thuộc nhóm organosulfur, có màu trắng.
- CYC có nhiều trong hành ta, hành tây, hẹ và tỏi tây. - CYC sử dụng trong các nghiên cứu thường ở dạng cycloalliin hydroclorid monohydrat [8], [12], [13]. b) Công thức hóa học Hình 1. Công thức hóa học của cycloalliin * Nguồn: Theo Ichikawa M.
(2006) [12] - Tên IUPAC: (1S, 3R, 5S)-5-methyl-1,4-thiazan-3-carboxylic acid 1- oxyd. - Công thức phân tử: C6H11NO3S 7 - Khối lượng mol phân tử: 177,22 đvC [14]. c) Tính chất vật lý - Cảm quan: Bột tinh thể màu trắng. - Độ tan: Trong môi trường nước là 52,3 g/l.
- Khối lượng riêng: 1,4 g/cm3 [14]. - Một đặc điểm quan trọng của cycloalliin là có khả năng hấp thụ tia tử ngoại, có cực đại hấp thụ tại bước sóng 210 nm [15], [16]. d) Độ ổn định - CYC ổn định trong các dung dịch acid, dung dịch kiềm và các dịch sinh học như máu toàn phần, huyết tương. - CYC ổn định trong dung dịch HCl 0,1M và NaOH 0,1M ở 70°C trong 3 giờ, hầu như không chuyển hóa thành chất khác, lượng thu hồi là hơn 98%.
Khi thêm CYC vào máu và huyết tương chuột thì hơn 96% CYC được thu hồi. Trong các thí nghiệm với các chất đồng nhất của gan chuột, hơn 97% CYC không bị phân hủy sau khi ủ ở 37°C, thời gian là 7 giờ và không có chất chuyển hóa nào của CYC được phát hiện [15]. e) Các phương pháp định lượng - Ichikawa M. và cộng sự sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng CYC.
Pha động là hỗn hợp acetonitril/nước với tỷ lệ 84:16 (thể tích/ thể tích) và 0,2% acid phosphoric. Điều kiện sắc ký: Cột Shodex Asahipak NH2P-50 2D (150 mm x 2 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 25°C, tốc độ dòng 0,2 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 1 µl và detector UV với bước sóng 210 nm [16]. và cộng sự cũng định lượng CYC theo phương pháp được mô tả bởi Ichikawa M. và cộng sự với một số thay đổi như cột sắc ký là cột Shodex Asahipak NH2P-50 4E (250 mm x 4,6 mm), pha động là dung dịch A 8 (0,2%, thể tích/thể tích, acid phosphoric trong nước) và dung dịch B (0,2%, thể tích/thể tích, acid phosphoric trong acetonitril) chạy theo chương trình gradient (0-5 phút: 84% B, 5-15 phút: 84-80% B, 15-20 phút: 80-84% B, 20- 30 phút: 84% B), nhiệt độ cột 30°C, tốc độ dòng 1,5 ml/phút và thể tích tiêm mẫu là 10 µl [17].
f) Tác dụng dược lý CYC có tác dụng giảm nguy cơ mắc ung thư và bệnh tim mạch, cũng như đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm chất béo trung tính trong huyết thanh ở chuột [18], [19].