Nghiên Cứu Định Lượng Chondroitin Sulfate Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu công nghệ thực phẩm nghiên cứu định lượng chrondoitin sulfate bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Phan Bảo Dung
• Người hướng dẫn: GS. Đống Thị Anh Đào
• Trường học: Đại học Bách Khoa
• Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
• Đề tài: Nghiên Cứu Định Lượng Chondroitin Sulfate Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Chondroitin Sulfate Ứng Dụng

Chondroitin sulfate (CS) đang ngày càng được sử dụng rộng rãi, đặc biệt trong các sản phẩm thực phẩm chức năng kết hợp với Glucosamine, vitamin và MSM để điều trị các bệnh liên quan đến thoái hóa sụn khớp. Việc định lượng Chondroitin sulfate trong nguyên liệu và các chế phẩm này là vô cùng quan trọng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả. Tuy nhiên, ở Việt Nam, chưa có phương pháp định lượng Chondroitin sulfate chính thức được công nhận trong các tiêu chuẩn ngành và quốc gia. Do đó, việc nghiên cứu và xây dựng quy trình phân tích Chondroitin sulfate hiệu quả là cần thiết. Nghiên cứu này tập trung vào việc phát triển một quy trình sắc ký lỏng hiệu năng cao đơn giản, nhanh chóng, chính xác và có tính ứng dụng cao cho mục đích này. Phương pháp này sẽ được thẩm định để có thể áp dụng rộng rãi trong kiểm tra chất lượng các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng chứa Chondroitin sulfate.

1.1. Vai trò của Chondroitin Sulfate trong cơ thể

Chondroitin sulfate (CS) là một glycosaminoglycan (GAG) quan trọng, tham gia vào cấu trúc tế bào, đặc biệt là trong mô sụn và xương. CS đảm bảo độ chắc và tính đàn hồi cho sụn và xương, đồng thời là nguyên liệu cần thiết cho quá trình tái tạo mô sụn và xương. Ngoài ra, CS còn được tìm thấy trong hoạt dịch khớp, giúp bôi trơn và giảm ma sát. Theo nghiên cứu của Davidson và Meyer từ những năm 60, CS là một polyme mạch thẳng gồm các đơn vị cơ bản cấu tạo bởi 2 gốc đường (disaccharide) N- acetyl-D-galactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen kẽ nhau. Công thức hoá học của CS (C14H21NO14S)n.

1.2. Ứng dụng Chondroitin Sulfate trong Dược phẩm và TPCN

Chondroitin sulfate không chỉ đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc và chức năng của sụn khớp, mà còn được ứng dụng rộng rãi trong dược phẩm và thực phẩm chức năng. CS được sử dụng để điều trị các bệnh về xương khớp, hỗ trợ bảo vệ và tái tạo sụn, giảm đau và viêm khớp. Bên cạnh đó, Chondroitin sulfate cũng có tác dụng trong cấu trúc và đàn hồi của giác mạc, duy trì các hoạt động sinh lý bình thường của mắt. Các nhà nghiên cứu đã cho thấy CS có trong thành phần của phim nước mắt, góp phần bảo vệ tế bào biểu mô giác mạc. Theo [5], CS được dùng trong thuốc nhỏ mắt để phòng ngừa và điều trị các tình trạng khô mắt.

II. Thách Thức Định Lượng Chondroitin Sulfate Chính Xác

Việc định lượng Chondroitin sulfate gặp nhiều thách thức do cấu trúc phức tạp và sự đa dạng về nguồn gốc và thành phần. Các phương pháp truyền thống thường không đủ độ nhạy và độ đặc hiệu để phân tích chính xác các mẫu chứa Chondroitin sulfate. Hơn nữa, sự thiếu hụt các tiêu chuẩn và phương pháp phân tích Chondroitin sulfate được công nhận ở Việt Nam gây khó khăn cho việc kiểm soát chất lượng các sản phẩm chứa Chondroitin sulfate. Chính vì vậy, việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp phân tích Chondroitin sulfate tiên tiến, đáng tin cậy là rất cần thiết để đảm bảo chất lượng và an toàn của các sản phẩm liên quan.

2.1. Sự Phức Tạp của Cấu Trúc Chondroitin Sulfate

Cấu trúc hóa học của Chondroitin sulfate (CS) rất phức tạp, với sự biến đổi về số lượng và vị trí của nhóm sulfate trên chuỗi polysaccharide. CS có 3 loại chính là A, B và C, chúng đặc trưng bởi số lượng và vị trí của nhóm sulfate trong nhóm disaccharide lặp lại của chuỗi polysaccharide: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 (Chondroitin-4-sulfate, CS4), có nhiều ở mô sụn, CS có thể kết hợp với protein tạo nên Chondromucoid. gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 (Chondroitin-6-sulfate, CS6). acid iduronic thay thế acid glucuronic. Do đó, việc phân tích và định lượng Chondroitin sulfate đòi hỏi các kỹ thuật phân tích có độ phân giải cao và độ đặc hiệu tốt.

2.2. Thiếu Tiêu Chuẩn và Phương Pháp Định Lượng Chuẩn

Một trong những thách thức lớn nhất trong việc định lượng Chondroitin sulfate ở Việt Nam là sự thiếu hụt các tiêu chuẩn và phương pháp phân tích Chondroitin sulfate được công nhận. Hiện tại, chưa có phương pháp định lượng Chondroitin sulfate chính thức trong các tiêu chuẩn ngành và quốc gia. Điều này gây khó khăn cho việc kiểm soát chất lượng và so sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm khác nhau. Do đó, việc xây dựng và thẩm định các phương pháp phân tích Chondroitin sulfate chuẩn là cần thiết để đảm bảo tính tin cậy và khả năng so sánh của kết quả phân tích Chondroitin sulfate.

III. Phương Pháp HPLC Định Lượng Chondroitin Sulfate Hiệu Quả

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ, được sử dụng rộng rãi để phân tích Chondroitin sulfate. HPLC cho phép tách, định tính và định lượng Chondroitin sulfate với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Bằng cách tối ưu hóa các điều kiện sắc ký như pha động, pha tĩnh, nhiệt độ và tốc độ dòng, có thể đạt được sự phân tách tốt các thành phần Chondroitin sulfate và các tạp chất. Điều này đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả định lượng Chondroitin sulfate.

3.1. Nguyên Tắc Cơ Bản của Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế : hấp phụ, phân tán, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt [3], [4].

3.2. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng đến Quá Trình Tách HPLC

Hiệu quả của quá trình sắc ký lỏng hiệu năng cao phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm lựa chọn pha tĩnh và pha động, nhiệt độ cột, tốc độ dòng và kích thước hạt pha tĩnh. Pha tĩnh thường là các vật liệu có bề mặt được biến đổi hóa học, chẳng hạn như C18 (octadecylsilane), cho phép tương tác với các phân tử phân tích dựa trên tính chất kỵ nước. Pha động thường là hỗn hợp của nước và dung môi hữu cơ, chẳng hạn như acetonitrile hoặc methanol, có thể điều chỉnh để tối ưu hóa sự phân tách các chất phân tích. Nghiên cứu của Phan Bảo Dung (2017) đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sắc ký của Chondroitin sulfate như nồng độ muối, nồng độ TEA, pH dung dịch đệm, tỉ lệ đệm – ACN, tốc độ dòng, nhiệt độ cột và thể tích tiêm.

IV. Xây Dựng Quy Trình HPLC Chuẩn Cho Chondroitin Sulfate

Để xây dựng một quy trình HPLC chuẩn cho định lượng Chondroitin sulfate, cần thực hiện các bước sau: (1) Xác định điều kiện sắc ký tối ưu: bao gồm lựa chọn pha động, pha tĩnh, tốc độ dòng, nhiệt độ cột và bước sóng phát hiện. (2) Thẩm định phương pháp: bao gồm đánh giá tính đặc hiệu, độ tuyến tính, khoảng định lượng, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chính xác và độ đúng. (3) Áp dụng quy trình cho các mẫu thực tế: bao gồm nguyên liệu, dược phẩm và thực phẩm chức năng chứa Chondroitin sulfate.

4.1. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Sắc Ký cho Chondroitin Sulfate

Việc tối ưu hóa điều kiện sắc ký là bước quan trọng để đảm bảo sự phân tách tốt và độ nhạy cao trong định lượng Chondroitin sulfate bằng HPLC. Các yếu tố cần được tối ưu hóa bao gồm: (1) Pha động: lựa chọn tỷ lệ phù hợp giữa dung môi phân cực (ví dụ: nước) và dung môi hữu cơ (ví dụ: acetonitrile) để điều chỉnh độ phân cực của pha động. (2) Pha tĩnh: lựa chọn pha tĩnh phù hợp với tính chất của Chondroitin sulfate, thường sử dụng pha đảo C18. (3) Tốc độ dòng: điều chỉnh tốc độ dòng để tối ưu hóa thời gian phân tích và độ phân giải. (4) Nhiệt độ cột: kiểm soát nhiệt độ cột để cải thiện sự phân tách và độ ổn định của các chất phân tích.

4.2. Thẩm Định Phương Pháp HPLC theo Tiêu Chuẩn ACTR 2008

Sau khi tối ưu hóa điều kiện sắc ký, cần thẩm định phương pháp HPLC theo các tiêu chuẩn quốc tế như ACTR (2008) để đảm bảo tính tin cậy và độ chính xác của kết quả định lượng Chondroitin sulfate. Các thông số thẩm định bao gồm: (1) Tính đặc hiệu: khả năng phân biệt Chondroitin sulfate với các chất khác trong mẫu. (2) Độ tuyến tính: mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ Chondroitin sulfate và tín hiệu phát hiện. (3) Khoảng định lượng: khoảng nồng độ mà phương pháp có thể định lượng Chondroitin sulfate một cách chính xác và tin cậy. (4) Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): nồng độ thấp nhất mà phương pháp có thể phát hiện và định lượng Chondroitin sulfate một cách tin cậy. (5) Độ chính xác: mức độ gần nhau giữa các kết quả định lượng Chondroitin sulfate khi thực hiện lặp lại. (6) Độ đúng: mức độ gần nhau giữa kết quả định lượng Chondroitin sulfate và giá trị thực tế.

V. Ứng Dụng HPLC Định Lượng Chondroitin Sulfate Thực Tế

Quy trình HPLC đã được xây dựng và thẩm định có thể được ứng dụng để định lượng Chondroitin sulfate trong các mẫu thực tế, bao gồm nguyên liệu thô, dược phẩm và thực phẩm chức năng. Kết quả định lượng Chondroitin sulfate trong các mẫu này cung cấp thông tin quan trọng để đánh giá chất lượng sản phẩm, đảm bảo tuân thủ các tiêu chuẩn và quy định, và cung cấp thông tin cho người tiêu dùng.

5.1. Định Lượng Chondroitin Sulfate trong Nguyên Liệu Thô

Việc định lượng Chondroitin sulfate trong nguyên liệu thô là bước quan trọng để kiểm soát chất lượng đầu vào và đảm bảo rằng nguyên liệu đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng. Kết quả định lượng Chondroitin sulfate trong nguyên liệu thô có thể được sử dụng để điều chỉnh công thức sản phẩm và đảm bảo rằng sản phẩm cuối cùng chứa hàm lượng Chondroitin sulfate như mong muốn.

5.2. Định Lượng Chondroitin Sulfate trong Dược Phẩm và TPCN

Việc định lượng Chondroitin sulfate trong dược phẩm và thực phẩm chức năng là cần thiết để đảm bảo rằng sản phẩm chứa hàm lượng Chondroitin sulfate được ghi trên nhãn và đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng. Kết quả định lượng Chondroitin sulfate có thể được sử dụng để so sánh với các sản phẩm khác trên thị trường, đánh giá hiệu quả điều trị và cung cấp thông tin cho người tiêu dùng.

VI. Kết Luận Hướng Phát Triển Định Lượng Chondroitin

Nghiên cứu về định lượng Chondroitin sulfate bằng phương pháp HPLC đã mang lại một quy trình phân tích đơn giản, nhanh chóng, chính xác và có tính ứng dụng cao. Quy trình này có thể được sử dụng để kiểm tra chất lượng các sản phẩm chứa Chondroitin sulfate, đảm bảo an toàn và hiệu quả cho người tiêu dùng. Trong tương lai, có thể tiếp tục nghiên cứu để cải tiến quy trình HPLC, phát triển các phương pháp phân tích Chondroitin sulfate mới và khám phá các ứng dụng tiềm năng của Chondroitin sulfate trong lĩnh vực y tế và dinh dưỡng.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả và Ưu Điểm của Phương Pháp HPLC

Phương pháp HPLC cho định lượng Chondroitin sulfate đã chứng minh được tính hiệu quả, độ chính xác và độ tin cậy cao. Các ưu điểm của phương pháp bao gồm: (1) Khả năng phân tách tốt các thành phần Chondroitin sulfate và các tạp chất. (2) Độ nhạy cao, cho phép định lượng Chondroitin sulfate ở nồng độ thấp. (3) Tính linh hoạt, có thể điều chỉnh các điều kiện sắc ký để phù hợp với các loại mẫu khác nhau. (4) Khả năng tự động hóa, giúp giảm thiểu sai sót và tăng năng suất.

6.2. Triển Vọng và Hướng Nghiên Cứu Định Lượng Chondroitin Sulfate

Trong tương lai, có nhiều hướng nghiên cứu tiềm năng để cải tiến và mở rộng ứng dụng của phương pháp định lượng Chondroitin sulfate. Các hướng nghiên cứu có thể bao gồm: (1) Phát triển các cột HPLC mới với độ phân giải cao hơn. (2) Sử dụng các detector tiên tiến hơn để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu. (3) Nghiên cứu các phương pháp chuẩn bị mẫu đơn giản và hiệu quả hơn. (4) Khám phá các ứng dụng mới của Chondroitin sulfate trong lĩnh vực y tế và dinh dưỡng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Chondroitin Sulfate (CS) Từ thập niên 70, một số nghiên cứu của các nhà khoa học xác minh rằng sụn cá mập có chứa các hoạt chất có khả năng ức chế hệ miễn dịch, giúp giảm nhẹ các chứng miễn dịch như thấp khớp, đau nhức xương (phong thấp), vẩy nến, chàm (eczema), luput đỏ,. Từ sụn cá mập người ta đã chiết rút ra Chondroitin sulfate (CS) - một loại glycosaminoglycan (GAG) tạo ra từ cơ thể bằng sự phối hợp giữa glucose với glutamine nhờ enzyme tổng hợp glucose [26]. GAG tham gia vào cấu trúc tế bào, có trong thành phần của sợi collagen các mạch máu lớn, chiếm tỷ lệ lớn trong chất căn bản của mô sụn và xương, đảm bảo cho sụn và xương không những có độ chắc mà còn có tính đàn hồi, đồng thời là nguyên liệu quan trọng trong tái tạo mô sụn, xương, cải tạo chức năng xương [12]. Thêm vào đó CS còn được tìm thấy trong hoạt dịch, chất lỏng bao quanh khớp, giúp bôi trơn khớp.

Sụn cá mập bảo vệ xương khớp bằng cơ chế ức chế men phá hủy chất sụn trong khớp [8]. Từ đó CS còn được điều chế thành thuốc và sử dụng như chất bổ sung hàng ngày trong điều trị các bệnh về xương khớp [1]. Đối với mắt, CS có tác dụng quan trọng trong cấu trúc trong suốt và đàn hồi của giác mạc, duy trì các hoạt động sinh lý bình thường của mắt. Các nhà nghiên cứu đã cho thấy CS có trong thành phần của phim nước mắt, góp phần bảo vệ tế bào biểu mô giác mạc.

Khi được nhỏ vào mắt, CS có tác dụng tạo nên một lớp chất nhầy giữ cho nước mắt lưu lại trên bề mặt nhãn cầu lâu hơn, chống khô mắt. Với phát hiện này, CS được dùng trong thuốc nhỏ mắt để phòng ngừa và điều trị các tình trạng khô mắt. Ngoài ra, CS còn được sử dụng để điều chế chất nhầy, một chất thường dùng trong phẫu thuật lấy thủy tinh thể và đặt thủy tinh thể nhân tạo nhằm bảo vệ biểu mô và nội mô của giác mạc [5].1 Đặc điểm và cấu trúc của CS CS được phát hiện và lần đầu tiên được tách chiết từ những năm 60 do Davidson và Meyer. CS thuộc nhóm chất heteropolysaccharide gọi là glycosaminoglycan (GAG) ngoại bào được tìm thấy trong tự nhiên như một polyme 2 mạch thẳng gồm các đơn vị cơ bản cấu tạo bởi 2 gốc đường (disaccharide) N- acetyl-D-galactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen kẽ nhau (polymeric D-galactosamine and D-glucuronic acid), các gốc đường này được sulfate hoá hay không bị sulfate hoá [16], một số gốc GlcA bị epime hoá thành L- iduronic acid (IdoA).

CS là một polyme có phân tử lớn gồm 15 - 150 đơn vị cấu trúc 2 đường đơn của GlcA và GalNAc. Khối lượng phân tử của CS thường biến động trong khoảng 10 – 100 kD [18]. Sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO4)2- của gốc đường với các nhóm carboxyl (COO-) của gốc đường acid làm cho phân tử Chondroitin sulfate có mật độ điện tích âm rất cao (anionic polysaccharide) dễ dàng liên kết đồng hoá trị với các protein trong cấu tạo của PG. Chuỗi CS được gắn với nhóm _OH của gốc serine ở một số protein.

Các protein gắn chọn lọc chính xác như thế nào với GAG vẫn chưa được làm sáng tỏ. GAG được tổng hợp trong mạng nội bào và trong thể Golgi. Sự gắn kết của chuỗi GAG bắt đầu với 4 gốc đường đơn theo phương thức cố định là Xyl-Gal- Gal-GlcA, xylose được gắn với protein trong mạng lưới nội bào, còn các phân tử đường khác được gắn trong hệ Golgi [29]. CS ưa nước vì thế hàm lượng nước trong mô sụn cao.

Các điều kiện thủy phân cũng có thể làm giảm khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm thu được. Mỗi phân tử đường có thể không bị sulfate hoá hoặc bị sulfate hoá 1 hay 2 lần. Đa phần nhóm _OH ở vị trí carbon 4 và 6 của GalNAc được sulfate hoá, đối với một số chuỗi GAG khác thì ở vị trí 2 của GlcA. Quá trình sulfate hoá là nhờ các enzyme sulfotransferase đặc hiệu.

Việc sulfate hoá ở các vị trí khác nhau tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù của CS. Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá trình khác nhau như: điều hòa hoạt động của enzyme và sự bám dính, phát triển và di thực của tế bào [20], [28], [30]. GAG còn có chức năng cấu trúc và điều khiển trong cơ thể sống. Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mô sụn (như một aggrecan).

Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết với protein trong mô tế bào nhờ có điện 3 tích âm, mối quan hệ này rất quan trọng cho việc điều hoà các hoạt động của tế bào. Phân tử PG của mô sụn (chứa khoảng 80 - 100 mạch CS) cùng với protein gắn kết và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học có khả năng nén thuận nghịch rất cần thiết cho sụn để chống lại sự ép nén với sự biến dạng nhỏ nhất [16]. Công thức hoá học của CS (C14H21NO14S)n : Hình 1. 1: Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi CS Chondroitin-4-sulfate: R1 = H; R2 = SO3H; R3 = H Chondroitin-6-sulfate: R1 = SO3H; R2 = H, R3 = H Hình 1.

2: Cấu trúc mạch của các CS CS có 3 loại chính là A, B và C, chúng đặc trưng bởi số lượng và vị trí của nhóm sulfate trong nhóm disaccharide lặp lại của chuỗi polysaccharide: CS A: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 (Chondroitin-4-sulfate, CS4), có nhiều ở mô sụn, CS có thể kết hợp với protein tạo nên Chondromucoid. CS C: gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 (Chondroitin-6-sulfate, CS6). CS B: acid iduronic thay thế acid glucuronic. Loại A và B (CS4) thường được tìm thấy ở sụn động vật có vú (bò và lợn), ngược lại loại C (CS6) được tìm thấy chủ yếu ở các loài cá sụn (cá mập, cá đuối.

Tuy nhiên CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích 4 thước, chúng chứa ở mức độ nhiều hay ít một số lượng các isome của CS, có tới 16n isome của CS, phụ thuộc vào sự thay đổi vị trí sulfate hoá của các cặp đường đôi tạo nên 16 isome/mỗi cặp [25]. Trong đó CS A và CS C là những thành phần chủ yếu hình thành PG [29].  Chondroitin Sulfate A ((GlcA-GalNAc-4S); CS4) Hình 1. 3: Chondroitin Sulfate A  Chondroitin Sulfate B ((IdoA-GalNAc-4S); CS4) Tên cũ là dermatan sulfate (iduronic acid thay cho glucuronic acid), thường có nhiều ở da, còn thấy có ở van tim, gân, thành mạch.

Vị trí bị sulfate hoá ở C-4 của GlcNAc và C-5 của glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic acid. 4: Chondroitin sulfate B  Chondroitin Sulfate-C ((GlcA-GalNAc-6S); CS6) Hình 1. 5: Chondroitin Sulfate C 5 CS được tách chiết trước khi cấu trúc của nó được xác định. Vì vậy tên gọi của CS cũng có sự thay đổi.

Ngoài ra còn có CS D và E. Phân loại các CS được tóm tắt trong bảng 1. 1: Phân loại CS Tên Vị trí bị sulfate hoá Tên phân loại Carbon 4 của đường -N- Chondroitin-4-sulfate (CS4); Chondroitin sulfate A acety-D-galactosamine ở người có trong: sụn khớp, (GalNAc) giác mạc, da, thành mạch. Chondroitin sulfate B Carbon 4 của GalNAc - Chondroitin-4-sulfate (CS4) ( Dermatan sulfate) L-iduronic acid Chondroitin-6-sulfate (CS6); Chondroitin sulfate C Carbon 6 của GalNAc trong thành phần của sụn và da Carbon 2 của glucuronic Chondroitin-2,6-sulfate Chondroitin sulfate D acid and 6 của GalNAc (C2,6S) Carbon 4 và 6 của Chondroitin-4,6-sulfate Chondroitin sulfate E GalNAc (C4,6S) CS tinh chế là chất bột màu trắng hoặc trắng ngà, hòa tan tốt trong nước, rất dễ hút ẩm; nhưng không hoà tan trong ethanol, methanol, acetone.

Khối lượng phân tử của CS nguyên liệu thường được sử dụng trong chế phẩm thuốc là thấp hơn, khoảng 15  20kDa [29].2 Nguyên liệu chứa CS CS là thành phần cơ bản của proteoglycan chứa trong xương sụn. Có hai loại sụn là sụn khớp và sụn chêm. Thành phần hoá học của cả hai loại sụn nêu trên đều bao gồm hai pha chủ yếu là pha lỏng bao gồm nước và các chất điện phân, pha rắn do các đại phân tử tạo thành gồm sợi collagen (collagen loại II trong sụn chêm và loại I trong sụn khớp), proteoglycan và tế bào sụn (chondrocytes). Tế bào sụn tạo nên chất cơ bản (matrix) của sụn [16].

2: Thành phần chính của mô sụn Mô Nước (%) Collagen (%) Proteoglycan (%) Sụn khớp 68,0 - 85,0 10,0 - 20,0 ( loại I) 5,0 - 10,0 Sụn chêm 60,0 - 70,0 15,0 - 25,0 ( loại II) 1,0 - 2,0 Bảng 1. 3: Hàm lượng CS từ các nguồn sụn khác nhau STT Nguyên liệu C4S (%) C6S (%) Loại CS 1 Vây cá mập 9,60 ± 1,05 8,76 ± 0,96 CS6, CS4 Cá sấu Sụn lưỡi 14,84 ± 0,38 2 Xương sườn 5,56 ± 0,96 13,54 ± 0,35 CS6, CS4 Xương ức 11,55 ± 0,88 10,54 ± 0,80 CS6, CS4 Cổ họng 9,51 ± 1,99 8,68 ± 1,81 CS6, CS4 3 Cá đuối 5,27 ± 0,91 4,81 ± 0,84 CS4, CS6 Xương lưỡi hái 4 14,08 ± 2,51 3,38 ± 4,74 CS4, CS6 của gà 5 Sụn mũi bò 11,50 CS4, CS6 7 1.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High Performance Liquid Chromatography) 1.1 Khái niệm về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế : hấp phụ, phân tán, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt [3], [4].2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định.

Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của của quá trình sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion.

Khi đặt chất phân tích lên đầu cột pha tĩnh rồi cho pha động liên tục đi qua cột chúng ta đã thực hiện quá trình sắc ký. Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng các tương tác: - Tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1). - Tương tác giữa chất phân tích và pha động (F2). - Tương tác giữa pha tĩnh và pha động (F3).

Trong đó tương tác F1 và F2 đóng vai trò quyết định [3], [4].