MỞ ĐẦU Chondroitin sulfate là thành phần cơ bản cấu tạo nên sụn khớp và các tổ chức sợi chun (gân, cơ, dây chằng…) giúp cho sự vận động linh hoạt và tính đàn hồi trong hoạt động khớp, tạo độ bền khi bị nén ép. Chondroitin sulfate cũng làm tăng sản xuất chất nhầy và khả năng bôi trơn của dịch khớp, đảm bảo sự vận động linh hoạt của khớp [21, 23]. Chondroitin sulfate còn có vai trò bảo vệ sụn khớp bằng cách ức chế các enzyme phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2, N-acetylglucosamindase. Vì vậy, chondroitin sulfate được sử dụng để hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp và hạn chế quá trình thoái hoá sụn khớp.
Ngoài ra, chondroitin sulfate cũng góp phần nuôi duỡng và tái tạo các tế bào của giác mạc mắt [21, 23, 39]. Chondroitin sulfate chủ yếu được thu nhận từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên, trong đó, có sụn cá mà đặc biệt là sụn cá mập do sụn cá mập thường có hàm lượng chondroitin sulphat cao hơn sụn các loại động vật khác [21, 39]. Chính vì thế, người ta thường sử dụng sụn cá mập dưới dạng bột khô trong sản xuất viên nén thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị các bệnh xương khớp [39, 43, 47÷49]. Tuy thế, trong sụn cá mập, chondroitin sulfate thường liên kết với protein bằng liên kết o-glycosid tạo thành phức hợp proteoglycan (glucoprotein) nằm trong cấu trúc của mô sụn nên con người rất khó hấp thụ [21, 23, 24, 63].
Hiện có một số nghiên cứu sử dụng tác nhân hóa học hoặc enzyme thủy phân sụn cá khô hoặc tươi sau đó kết tủa thu chondroitin sulfate dùng trong sản xuất thực phẩm chức năng [23, 39, 42, 63÷70]. Tuy vậy, việc chỉ thu nhận chondroitin sulfate dẫn đến sự lãng phí các chất tự nhiên từ sụn cá và hiệu quả sử dụng trong điều trị các bệnh lý về xương khớp không cao cũng như giá thành sản phẩm cao nên hiệu quả hạn chế [23, 39, 42, 44, 45, 63÷70]. Để khắc phục hiện tượng này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sử dụng enzyme trong thủy phân sụn cá mập tươi với mong muốn tạo ra dịch thủy phân chứa các chất tự nhiên từ sụn cá và chondroitin sulphat để định hướng sử dụng làm thực phẩm chức năng cung cấp các thành phần thiết yếu giúp hỗ trợ điều trị bệnh lý xương khớp và chống thoái hóa xương khớp. Việt Nam có bờ biển dài hơn 3260km, sản lượng khai thác thủy sản lớn và trong quá trình khai thác thủy sản, số lượng cá mập mắc lưới khá lớn [14, 23, 26, 27].
Hiện cá mập được người dân sử dụng để thu cước cá phần còn lại chiếm tỷ trọng lớn là sụn cá 1 và vi cá thường phơi khô bán cho thương lái Trung Quốc với giá rẻ [38]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu thủy phân sụn sụn cá mập tươi còn rất mới mẻ và chưa có một công trình nào đề cập đến vấn đề này. Do vậy, Luận án tiến hành: “Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập trắng (Carcharhinus dussumieri) bằng enzyme protease”. Mục đích của luận án: Tận dụng nguồn nguyên liệu còn lại - sụn cá mập tươi trong chế biến tạo dịch thủy phân và bột đạm chứa chondroitin sulfate và các chất tự nhiên từ sụn cá mập (C.
dussumieri) bằng công nghệ sử dụng enzyme protease thân thiện với môi trường để định hướng sử dụng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị chống thoái hóa xương khớp. Nội dung nghiên cứu của luận án: 1) Nghiên cứu thủy phân sụn cá mập (C. dussumieri) bằng enzyme protease. 2) Đánh giá chất lượng dịch thủy phân sụn cá mập và xác định cấu trúc chondroitin sulfate.
3) Nghiên cứu sấy phun tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate. Ý nghĩa khoa học của luận án: Luận án lần đầu tiên tiến hành nghiên cứu một cách toàn diện từ công đoạn thủy phân sụn cá mập tươi, … cho tới nghiên cứu sấy khô tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate. Do vậy luận án có ý nghĩa về khoa học, thể hiện ở chỗ đã chứng minh rằng có thể thủy phân sụn cá mập bằng tổ hợp enzyme protease và thu dịch thủy phân chứa các chất dinh dưỡng từ sụn cá mập để ứng dụng trong thực phẩm và sấy phun tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate, đây một sản phẩm hoàn toàn mới trước đây chưa có ai nghiên cứu. Mặt khác các số liệu nghiên cứu của luận án là thông tin khoa học có giá trị và tài liệu tham khảo phục vụ cho việc giảng dạy, các học viên cao học và nghiên cứu sinh quan tâm tới lĩnh vực này.
Ý nghĩa thực tiễn của luận án: Luận án lần đầu tiên tạo ra dịch thủy phân sụn cá mập và sản phẩm bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate, dễ hấp thụ và tiện lợi khi sử dụng làm thực phẩm chức năng. Đặc biệt sản phẩm bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate thích hợp cho 2 những người bị bệnh về xương khớp, hơn nữa sản phẩm khô dễ bảo quản và vận chuyển. Do vậy, luận án có ý nghĩa thực tiễn cao là cơ sở cho việc định hướng sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị chống thoái hóa xương khớp. GIỚI THIỆU VỀ CHONDROITIN SULFATE VÀ ỨNG DỤNG 1.
Cấu trúc chondroitin sulfate Chondroitin sulfate (CS) là một polysaccharid, thuộc nhóm heteropolysaccharid gọi là glycosaminoglycan (GAG), được tìm thấy trong tự nhiên ở dạng một polyme mạch thẳng gồm các đơn vị cơ bản được cấu tạo bởi 2 loại đường là N-acetyl-D- galactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen kẽ nhau (polymeric D- galactosamine and D-glucuronic acid). Các gốc đường này có thể được sulphate hóa hay không bị sulphate hoá [23, 63], một số gốc GlcA bị epime hoá thành L-iduronic acid (IdoA). Chondroitin sulfate là một polyme tự nhiên có chứa 15÷150 đơn vị cấu trúc của đơn vị cơ bản gồm 2 loại đường là GlcA và GalNAc. Khối lượng phân tử của CS thường biến động trong khoảng 10.
Năm 1950, Julia Einbinder và Maxwell Schubert lần đầu tiên phát hiện và tách chiết được chondroitin sulfate từ sụn bằng cách kỹ thuật chiết rút chondroitin sulfate trong dung dịch natri hydroxit 2%. Sau đó, Julia Einbinder và Maxwell Schubert đã tinh sạch được chondroitin sulfate bằng cách sử dụng canxi clorua khử protein ra khỏi dịch chiết, thu được chondroitin sulfate [65]. công bố nghiên cứu về CS và cho rằng CS thường gắn với các protein bằng liên kết o-glycosid tạo thành một phức chất proteoglycan (PG) (glucoprotein) - là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharid [56, 57, 65, 81, 84, 85]. Sự kết hợp giữa nhóm sulphate (SO42-) với các nhóm carboxyl (COO-) làm cho phân tử chondroitin sulfate có mật độ điện tích âm rất cao dễ dàng liên kết đồng hoá trị với các protein trong cấu tạo của PG.
Trong cấu trúc của proteoglycan, CS thường gắn với nhóm OH của acid amin serine nằm trong chuỗi polypeptid của protein. Các nhà khoa học vẫn chưa biết được cách protein gắn chọn lọc chính xác với GAG. Tuy thế, họ cho rằng GAG được tổng hợp trong mạng lưới nội bào và trong thể Golgi. Sự gắn kết của chuỗi GAG với 4 gốc đường đơn theo phương thức cố định là Xyl-Gal-Gal-GlcA trong đó xylose gắn với protein trong mạng lưới nội bào, còn các phân tử đường khác được gắn trong hệ Golgi [45, 48, 79].
4 Chondroitin sulfate là polyme ưa nước vì thế mô sụn có hàm lượng nước cao. Phân tử đường trong cấu trúc của CS có thể không bị sulphate hoá, bị sulphate hoá 1 lần hay 2 lần, đa phần nhóm OH ở vị trí carbon 4 và 6 của GalNAc được sulphate hoá, đối với một số chuỗi GAG có thể bị sulphate hoá ở vị trí 2 của GlcA. Quá trình sulphate hoá là nhờ các enzyme sulfotransferase đặc hiệu. Việc sulphate hoá ở các vị trí khác nhau tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù cho CS [39, 45, 48÷50].
Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá trình khác nhau như: điều hòa hoạt động enzyme và sự bám dính, phát triển và di thực của tế bào [39, 45, 48÷50]. GAG còn có chức năng cấu trúc và điều khiển trong cơ thể sống. Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mô sụn. Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết với protein trong mô tế bào nhờ có điện tích âm, mối quan hệ này rất quan trọng cho việc điều hoà các hoạt động của tế bào.
Phân tử PG của mô sụn (chứa khoảng 80÷100 mạch CS) cùng với protein và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thủy động học có khả năng nén thuận nghịch giúp cho mô sụn chống lại sự ép nén với sự biến dạng nhỏ nhất [38]. Công thức và cấu trúc hoá học của một đơn vị trong cấu trúc của chondroitin sulfate (C14H21NO14S)n được trình bày ở hình 1. Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi chondroitin sulfate [23,56] Chondroitin-4-sulphate: R1 = H; R2 = SO3H; R3 = H. Chondroitin-6-sulphate: R1 = SO3H; R2, R3 = H.
Cấu trúc mạch của các chondroitin sulfate [23, 56] 5 Chondroitin có 3 loại chính là A, B và C được đặc trưng bởi số lượng và vị trí của nhóm sulphate trong disaccharid lặp lại của chuỗi polysaccharid. Chondroitin sulfate A: gốc sulphate gắn ở vị trí C-4 (chondroitin-4-sulphate, GlcA-GalNAc-4S, CS4) (Hình 1.3), kết hợp với protein tạo nên chondromucoid và có nhiều ở mô sụn. Chondroitin sulfate C: gốc sulphate gắn ở vị trí C-6 (chondroitin-6-sulphate, CS6). Chondroitin sulfate B (IdoA-GalNAc-4S, CS4): acid iduronic thay thế acid glucuronic (hình 1.
CS4 còn được gọi là dermatant sulphate (iduronic acid thay cho glucuronic acid), thường có nhiều ở da, ngoài ra còn gặp ở van tim, gân, thành mạch. Vị trí bị sulphate hoá ở C-4 của GlcNAc và C-5 của glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic acid [23, 56]. Loại A và B (CS4) thường được tìm thấy ở sụn động vật có vú (bò và lợn), ngược lại loại C (CS6) thường được tìm thấy chủ yếu ở các loài cá sụn (cá mập, cá đuối,. Tuy nhiên, CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, chúng chứa nhiều hay ít các isome của CS, có tới 16 isome của CS, phụ thuộc vào vị trí sulphate hóa của các cặp đường đôi tạo nên 16 isome/ mỗi cặp.
Trong đó CS A và CS C là những thành phần chủ yếu hình thành PG. Cấu trúc một đơn vị của Hình 1. Cấu trúc của chondroitin chondroitin sulfate A sulfate B Hình 1. Cấu trúc của chondroitin sulfate - C (GlcA-GalNAc-6S) - CS6 Người ta tách chiết được CS trước khi cấu trúc của nó được xác định.
Do vậy, tên gọi của CS cũng có sự thay đổi. Phân loại CS được tóm tắt trong bảng 1.