Giới thiệu dự án

Tại Việt Nam, nông nghiệp đóng vai trò xương sống với sản lượng cây trồng liên tục tăng trưởng. Theo thống kê của Tổng cục Thống kê, tổng khối lượng phụ phẩm nông nghiệp phát sinh hàng năm trên cả nước đạt trên 156,8 triệu tấn, trong đó phụ phẩm sau thu hoạch từ ngành trồng trọt chiếm tới 56,7% (tương đương 88,9 triệu tấn). Riêng đối với cây nhãn (Dimocarpus longan), sản lượng thu hoạch toàn quốc năm 2021 đạt khoảng 637.000 tấn (khu vực phía Bắc đạt 300.000 tấn tập trung chủ yếu tại Sơn La với 98.500 tấn và Hưng Yên với 50.000 tấn; khu vực phía Nam đạt 337.000 tấn). Quá trình cắt tỉa, thu hái và chế biến nhãn phát sinh hàng trăm nghìn tấn phụ phẩm bao gồm cành tỉa, lá, vỏ và hạt nhãn.

                    TỔNG PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM (156.8 TRIỆU TẤN)
        [Cây ăn trái & Rau màu]         [Cây nhãn: 637,000 tấn quả/năm]

Phần lớn nguồn sinh khối giàu tiềm năng này hiện vẫn bị đốt bỏ lộ thiên hoặc thải trực tiếp ra môi trường tự nhiên, gây thất thoát tài nguyên hữu cơ và phát thải khí nhà kính nghiêm trọng. Rào cản lớn nhất trong việc tái chế phụ phẩm nhãn thành phân bón hữu cơ sinh học nằm ở cấu trúc phức tạp của lignocellulose. Lignin là một polymer thơm dị vòng có cấu trúc 3D vô định hình, liên kết chặt chẽ với cellulose và hemicellulose thông qua các liên kết este và ether, tạo nên lớp "áo giáp" sinh học kháng cự sự phân giải của vi sinh vật thông thường.

Nhằm giải quyết triệt để bài toán xử lý sinh khối thực vật sau thu hoạch, đề tài tập trung vào 3 mục tiêu cụ thể:

  1. Đánh giá đặc tính sinh hóa, hoạt tính enzyme phân giải lignin (laccase, peroxidase) và enzyme cellulase của 2 chủng vi khuẩn bản địa DN2 và D3.6 (phân lập từ đất trồng nhãn Bắc Giang).
  2. Khảo sát động thái sinh trưởng, tối ưu hóa thành phần cơ chất (thay thế D-glucose bằng nguồn carbon giá rẻ), xác định dải pH và nhiệt độ tối thích phục vụ nhân sinh khối quy mô lớn.
  3. Thử nghiệm tiền xử lý và ủ phân giải phụ phẩm nhãn (cành, lá, vỏ, hạt) ở quy mô pilot 1kg, định lượng mức độ suy giảm lignin, cellulose và hemicellulose sau 28 ngày.

Phạm vi nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học Phân tử & CNSH Ứng dụng – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tập trung vào điều kiện nuôi cấy hiếu khí ở nhiệt độ 30–60°C và dải pH từ 3.0 đến 8.0.

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Quá trình phân hủy phụ phẩm cây thân gỗ và cây ăn quả hiện nay chủ yếu dựa vào các phương pháp truyền thống hoặc sử dụng hệ vi sinh vật tự nhiên, bộc lộ nhiều điểm hạn chế về thời gian và độ an toàn sinh thái:

Tiêu chí Đốt truyền thống Xử lý bằng Nấm mục trắng (White-rot fungi) Chế phẩm thương mại (Sumitri/EMIC) Giải pháp Chủng vi khuẩn DN2 & D3.6
Cơ chế tác động Oxy hóa nhiệt Tiết enzyme Laccase, LiP, MnP qua sợi nấm Hỗn hợp đa chủng vi sinh vật hoại sinh Tiết Laccase vi khuẩn chọn lọc, hoạt động ở pH acid
Thời gian sinh khối Tức thời Dài (7 – 14 ngày tạo quả thể/hệ sợi) Trung bình (24 – 48 giờ) Cực ngắn (đạt cực đại sau 24 giờ)
Hiệu suất giảm Lignin 100% (mất chất) 24.36% – 35.00% (sau 30 ngày) 32.94% – 35.00% (sau 28 ngày) 19.27% – 22.16% (đơn chủng sau 28 ngày)
Rủi ro sinh thái Ô nhiễm khói bụi, CO2 Khó kiểm soát bào tử nấm lây lan vườn cây Chi phí thương phẩm cao Chủng vi khuẩn bản địa an toàn, không phát tán bào tử nấm
Tác động lên Cellulose Tiêu hủy hoàn toàn Thủy phân mạnh cả Cellulose Thủy phân mạnh Cellulose (67–70%) Bảo tồn khung Cellulose (hoạt tính Cellulase rất yếu)

Theo mô hình MoSCoW trong chuẩn hóa kỹ thuật:

  • Must have: Hoạt tính oxy hóa cơ chất phenolic của lignin, tốc độ tăng sinh khối nhanh dưới 24h, khả năng thích ứng môi trường đống ủ acid.
  • Should have: Sử dụng nguồn carbon công nghiệp giá rẻ (đường mía thương phẩm, rỉ đường) thay thế D-glucose phân tích để tối ưu chi phí.
  • Could have: Giữ lại tối đa hàm lượng cellulose để định hướng sản xuất phân bón cải tạo đất hoặc sản xuất bioethanol.
  • Won't have: Sử dụng các chủng nấm sợi ngoại lai tiềm ẩn nguy cơ phát sinh nấm bệnh ký sinh trên thân cây nhãn.

Thiết kế hệ thống

Quy trình công nghệ sinh học xử lý phụ phẩm nhãn được thiết kế khép kín theo chu trình từ nuôi cấy đến phối trộn đống ủ:

Thành phần môi trường lên men tối ưu hóa:

  • Môi trường cơ sở Hansen cải tiến (g/L): Saccarose (50,0 g), $\text{KH}_2\text{PO}_4$ (5,0 g), $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$ (5,0 g), Peptone (10,0 g), nước cất vừa đủ 1000 mL.
  • Dung dịch đệm phản ứng: Sodium acetate 10 mM điều chỉnh pH 5.0 phục vụ phản ứng enzyme.
  • Cơ chất định tính/định lượng: Acid tannic 0,2%, Guaiacol 99%, Carboxymethyl Cellulose (CMC) 1%, Congo Red 1%.

Methodology

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm tuân thủ quy trình nghiêm ngặt:

  • Khảo sát sinh trưởng & động học enzyme: Theo dõi quang phổ kế ở bước sóng $\lambda = 600\text{ nm}$ ($\text{OD}_{600}$) và $\lambda = 450\text{ nm}$ định kỳ mỗi 2–6 giờ trong 48 giờ.
  • Đánh giá nhiệt độ & pH: Khảo sát dải nhiệt từ 30°C đến 60°C; dải pH từ 3.0 đến 8.0.
  • Phân tích hàm lượng xơ sợi: Xác định lignin theo tiêu chuẩn hòa tan acid sulfuric TAPPI T222/T236 và chuẩn độ permanganate; xác định cellulose/hemicellulose theo phương pháp hòa tan liên hoàn acid-kiềm.

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình triển khai kỹ thuật tập trung vào giải mã hoạt tính xúc tác sinh học và động thái phát triển sinh khối của hai chủng vi khuẩn.

# Thuật toán mô phỏng tính toán Hoạt độ Enzyme Laccase (U/L)
# và Chỉ số Kappa xác định hàm lượng Lignin theo chuẩn TAPPI T222/T236

def calculate_laccase_activity(abs_450: float, total_vol_ml: float, 
                               enz_vol_ml: float, time_min: float, 
                               extinction_coef: float = 0.6740) -> float:
    """
    E.A = (A * V) / (t * epsilon * v)
    epsilon = 0.6740 mM^-1 cm^-1 cho Guaiacol
    Đơn vị trả về: U/mL, quy đổi U/L = U/mL * 1000
    """
    activity_u_ml = (abs_450 * total_vol_ml) / (time_min * extinction_coef * enz_vol_ml)
    return activity_u_ml * 1000.0  # Chuyển đổi sang U/L

def calculate_lignin_percentage(vol_thio_blank: float, vol_thio_sample: float, 
                                norm_thio: float, sample_dry_weight_g: float, 
                                d_factor: float) -> float:
    """
    Tính hàm lượng % Lignin qua chuẩn độ Permanganate (KMnO4) và Thiosulfate (Na2S2O3)
    Va: Thể tích Na2S2O3 tiêu tốn hiệu chỉnh
    """
    va = vol_thio_blank - vol_thio_sample
    kappa_index = (va * norm_thio * 0.1 * 100.0 * d_factor) / sample_dry_weight_g
    lignin_percent = kappa_index * 0.15  # Tỉ lệ quy đổi tiêu chuẩn thực vật
    return lignin_percent

===========================================================================
QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG LIGNOCELLULOSE TRONG PHỤ PHẨM NHÃN
===========================================================================

===========================================================================

Testing và validation

1. Hoạt hóa & Định tính Enzyme Phân giải Lignin / Cellulose

  • Khả năng phân giải Lignin: Cấy chấm điểm trên thạch LB bổ sung 0,2% acid tannic ở 37°C. Sau 24h, cả hai chủng DN2 và D3.6 đều tạo quầng oxy hóa sẫm màu nâu đậm rõ rệt xung quanh khuẩn lạc, khẳng định khả năng sinh enzyme ligninolytic ngoại bào mạnh mẽ.
  • Hoạt tính Cellulase: Thử nghiệm khuếch tán giếng thạch trên đĩa CMC 1%, nhuộm Congo Red 1% và rửa bằng NaCl 1M. Kết quả đường kính vòng phân giải $r = D - d$ chỉ đạt 2,0 mm ở chủng DN2 và 3,0 mm ở chủng D3.6. Điều này chứng minh hai chủng vi khuẩn tiết cellulase rất yếu, mang ý nghĩa quan trọng trong việc bảo toàn chuỗi polysaccharide có ích.
                  VÒNG PHÂN GIẢI CƠ CHẤT SAU 24 GIỜ NUÔI CẤY

2. Động thái Sinh trưởng và Sinh tổng hợp Laccase

Khảo sát nuôi lắc lỏng (150 rpm, 37°C) với mật độ tiếp giống ban đầu $\text{OD}_{600} = 0,05$:

  • Pha tiềm phát (Lag phase): Rất ngắn (0 – 2 giờ đối với DN2; 0 – 4 giờ đối với D3.6).
  • Pha log sinh trưởng: Diễn ra từ 2h đến 18h (DN2) và 4h đến 24h (D3.6).
  • Pha cân bằng & Cực đại:
    • Chủng DN2: Mật độ tế bào đạt cực đại tại 24 giờ với $\text{OD}_{600} = 2,24 \pm 0,02$, hoạt độ Laccase đạt $33,8\text{ U/L}$.
    • Chủng D3.6: Mật độ tế bào đạt cực đại tại 24 giờ với $\text{OD}_{600} = 2,19 \pm 0,03$ (duy trì đến 30h ở mức 2,20), hoạt độ Laccase đạt $28,04\text{ U/L}$.
    OD600 (Sinh khối) vs Hoạt độ Laccase (U/L) của Chủng DN2 theo Thời gian
        0     4     8    12    16    20    24    28    32    36    40

3. Tối ưu hóa Môi trường & Thông số Vật lý

  • Nguồn Carbon: Trong 6 nguồn thử nghiệm (rỉ đường, bột gạo, bột cám, bột đậu tương, saccarose, maltose so với đối chứng D-glucose), môi trường bổ sung $50\text{ g/L}$ Saccarose (đường mía thương phẩm) cho mật độ sinh khối cao nhất ($\text{OD}{600} > 2,20$), vượt trội so với bột cám/bột gạo ($\text{OD}{600} < 0,50$).
  • Ảnh hưởng của pH: Cả 2 chủng phát triển mạnh trong dải pH acid từ 3.5 đến 5.0. Tại pH 4.0, mật độ sinh khối đạt giá trị cao nhất: $\text{OD}{600} = 2,20 \pm 0,02$ (DN2) và $\text{OD}{600} = 2,22 \pm 0,04$ (D3.6). Tại pH $\ge 7.0$, sinh trưởng giảm mạnh ($\text{OD}_{600} < 0,46$).
  • Ảnh hưởng của Nhiệt độ: Dải nhiệt thích hợp nhất là 30°C – 40°C (tại 40°C, DN2 đạt $\text{OD}{600} = 2,11$ và D3.6 đạt $\text{OD}{600} = 2,13$). Khi nhiệt độ vượt quá 45°C, sinh khối suy giảm rõ rệt.
Thông số nuôi cấy Chủng DN2 ($\text{OD}_{600}$) Chủng D3.6 ($\text{OD}_{600}$) Nhận xét đánh giá
pH 3.0 $1.82 \pm 0.05$ $1.83 \pm 0.03$ Sinh trưởng tốt trong môi trường acid cao
pH 4.0 (Tối ưu) $\mathbf{2.20 \pm 0.02}$ $\mathbf{2.22 \pm 0.04}$ Mật độ tế bào đạt ngưỡng cực đại
pH 5.0 $1.84 \pm 0.03$ $1.52 \pm 0.01$ Bắt đầu suy giảm nhẹ
pH 7.0 $0.46 \pm 0.01$ $0.32 \pm 0.02$ Sinh trưởng bị ức chế đáng kể
Nhiệt độ 37°C $2.14 \pm 0.02$ $2.15 \pm 0.02$ Tăng sinh tế bào ổn định
Nhiệt độ 40°C (Tối ưu) $\mathbf{2.11 \pm 0.01}$ $\mathbf{2.13 \pm 0.03}$ Thích ứng hoàn hảo với nhiệt tâm đống ủ
Nhiệt độ 50°C $0.85 \pm 0.04$ $0.88 \pm 0.02$ Vi khuẩn bước vào pha ức chế nhiệt

Kết quả đạt được

Đặc tính thành phần cơ chất nguyên liệu nhãn trước khi ủ: Cành chứa $25,14%$ lignin; Vỏ chứa $24,43%$ lignin; Lá chứa $20,77%$ lignin; Hạt chứa $18,68%$ lignin. Tổng cellulose & hemicellulose dao động từ $65,35%$ đến $72,04%$.

Thử nghiệm ủ 1kg phụ phẩm (duy trì ẩm độ 60%, nhiệt độ tâm đống ủ đạt 37–40°C) theo 2 công thức:

  • Mix 1: Cành : Lá (tỉ lệ 1 : 1) — Hàm lượng Lignin ban đầu: $23,19%$.
  • Mix 2: Cành : Lá : Vỏ : Hạt (tỉ lệ 1 : 1 : 1 : 1) — Hàm lượng Lignin ban đầu: $21,25%$.
               HIỆU QUẢ SUY GIẢM LIGNIN SAU 28 NGÀY Ủ (% GIẢM)
       Đối chứng Nước (1.85%)

Hiệu quả phân hủy lignin sau 28 ngày ủ thực nghiệm:

  • Chủng DN2: Phân giải lượng lignin trong mẫu Mix 1 còn $18,50%$ (giảm $20,22%$ so với ban đầu); trong mẫu Mix 2 còn $16,54%$ (giảm $22,16%$). Hiệu quả phân giải lignin gấp hơn 10 lần so với mẫu đối chứng ủ bằng nước ($1,85%$).
  • Chủng D3.6: Phân giải lượng lignin trong mẫu Mix 1 còn $18,72%$ (giảm $19,27%$); trong mẫu Mix 2 còn $16,67%$ (giảm $21,55%$).
  • So sánh với chế phẩm đa chủng thương phẩm Sumitri: Sumitri đạt mức giảm lignin $35,00%$ (Mix 1) và $32,94%$ (Mix 2). Hai đơn chủng vi khuẩn DN2 và D3.6 đạt hiệu suất tương đương $57,7% – 67,3%$ so với tổ hợp chế phẩm thương mại, khẳng định tiềm năng ứng dụng độc lập hoặc phối chế sinh học.

Đổi mới và đóng góp

  1. Ứng dụng hệ enzyme Laccase từ nguồn vi khuẩn bản địa thích nghi acid: Khác với phần lớn các công trình sử dụng nấm mục trắng (Trametes hirsuta, Pleurotus ostreatus theo Reddy & Yang, 2005) vốn đòi hỏi thời gian nuôi cấy kéo dài từ 10–20 ngày và tiềm ẩn rủi ro phát tán bào tử gây hại cho cây trồng, nghiên cứu này chứng minh vi khuẩn DN2 và D3.6 có khả năng tiết Laccase mạnh mẽ ngay trong 24 giờ đầu ở điều kiện pH 4.0.
  2. Đặc tính phân giải có chọn lọc (Selective Lignin Degradation): Trong khi các dòng xạ khuẩn (Streptomyces viridosporus T7A theo Zeng et al., 2012) hoặc nấm sợi phân hủy đồng thời cả lignin và cellulose (làm hao hụt sinh khối carbon hữu ích), hai chủng DN2 và D3.6 có hoạt tính cellulase cực thấp ($r \le 3\text{ mm}$), giúp loại bỏ liên kết bọc lignin mà vẫn giữ nguyên khung cấu trúc cellulose phục vụ các quá trình chuyển hóa thứ cấp.
  3. Tối ưu hóa kinh tế cơ chất bằng Đường mía (Saccarose): Nghiên cứu mở ra giải pháp thay thế hoàn toàn D-glucose tinh khiết bằng đường mía thương phẩm ($50\text{ g/L}$), giúp giảm $65% – 75%$ chi phí môi trường nuôi cấy sinh khối lớn mà vẫn duy trì mật độ tế bào đạt $\text{OD}_{600} > 2,20$.

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng & Quy trình triển khai đống ủ thực địa

  • Mô hình triển khai: Áp dụng trực tiếp tại các hợp tác xã, nhà vườn chuyên canh nhãn tại Hưng Yên, Sơn La, Bắc Giang và Đồng bằng Sông Cửu Long.
  • Phân tích Hiệu quả Kinh tế (ROI):
    • Chi phí ủ 1 tấn phụ phẩm bằng phương pháp sinh học (công băm, men đường mía, bạt ủ): ~450.000 – 600.000 VNĐ.
    • Giá trị phân bón hữu cơ vi sinh thu hồi: ~600 kg phân hữu cơ chất lượng cao trị giá 1.500.000 – 1.800.000 VNĐ (giá thị trường ~2.500 – 3.000 VNĐ/kg).
    • Tỷ suất sinh lời (ROI) đạt trên $150%$, đồng thời cắt giảm hoàn toàn chi phí xử lý tiêu hủy và rủi ro phạt môi trường do đốt rơm rác.

Hạn chế và hướng phát triển

  • Hạn chế kỹ thuật: Chủng vi khuẩn DN2 và D3.6 có ngưỡng nhiệt sinh trưởng tối ưu từ 30°C đến 40°C và bị ức chế khi nhiệt độ vượt quá 45°C. Trong các đống ủ quy mô công nghiệp (hàng chục tấn), giai đoạn nhiệt cao (thermophilic stage) có thể lên tới 55–65°C, gây suy giảm mật độ vi khuẩn nếu không kiểm soát thông khí và đảo trộn.
  • Rào cản nguồn lực: Nghiên cứu hiện dừng lại ở quy mô pilot thùng xốp 1kg và bình tam giác trong phòng thí nghiệm; cần mở rộng thử nghiệm ở quy mô đống ủ luống dài (windrow composting) từ 500kg đến 5 tấn.
  • Hướng phát triển:
    1. Tuyển chọn hoặc phối trộn DN2, D3.6 với các chủng xạ khuẩn hiếu nhiệt (Thermoactinomyces, Bacillus licheniformis) để tạo chế phẩm đa chủng thích ứng mọi dải nhiệt độ đống ủ.
    2. Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA để định danh chính xác loài vi khuẩn và đăng ký ngân hàng gen quốc tế.

Đối tượng hưởng lợi

  • Sinh viên & Học viên Cao học CNSH: Cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn về assay enzyme Laccase, phương pháp TAPPI T222 phân tích Lignocellulose và tối ưu hóa môi trường lên men.
  • Kỹ sư & Nhà phát triển Chế phẩm Sinh học: Dữ liệu kỹ thuật cụ thể về động học sinh trưởng 24h, khả năng dùng Saccarose $50\text{ g/L}$ và cơ chế bảo tồn cellulose để phát triển các dòng men tiền xử lý sinh khối.
  • Doanh nghiệp Nông nghiệp & Nhà vườn trồng cây ăn trái: Giải pháp kỹ thuật biến 156 triệu tấn phụ phẩm nông nghiệp thành phân bón sinh học tại chỗ, tiết kiệm chi phí phân bón hóa học từ 30–40%.
  • Nhà nghiên cứu Khoa học Đất & Môi trường: Dữ liệu cơ sở về chu trình chuyển hóa carbon tự nhiên, giảm phát thải methane ($CH_4$) và khói bụi từ hoạt động đốt phế phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật tối thiểu để nhân sinh khối chủng DN2 và D3.6 tại quy mô trang trại là gì?

Cần trang bị bồn khuấy hiếu khí hoặc hệ thống sục khí liên tục, duy trì nhiệt độ 30–37°C, pH ban đầu 4.0–4.5, sử dụng môi trường nước đường mía $5%$ (50 g/L đường cát vàng hoặc rỉ đường đã xử lý) bổ sung dịch chiết đậu nành/peptone $1%$, thời gian sục khí 24 giờ để đạt mật độ $\text{OD}_{600} \ge 2,0$.

2. Giới hạn nhiệt độ của hai chủng vi khuẩn này là bao nhiêu và cách xử lý khi đống ủ quá nóng?

Hai chủng vi khuẩn hoạt động tối ưu ở 30–40°C và suy giảm sinh khối ở nhiệt độ trên 45°C. Khi ủ thực tế, nhiệt độ đống ủ có thể tăng cao do hoạt động của vi sinh vật khác; cần tiến hành đảo trộn đống ủ định kỳ (3–5 ngày/lần) hoặc mở rộng bề mặt tiếp xúc để duy trì nhiệt độ lõi ổn định dưới 45°C.

3. Có thể phối hợp dịch nuôi DN2/D3.6 với các chế phẩm Trichoderma thương mại không?

Hoàn toàn có thể. Do hai chủng vi khuẩn này chỉ phân giải lignin mà không làm suy giảm mạnh cellulose, việc phối hợp bổ sung nấm Trichoderma ở giai đoạn ủ hoai thứ cấp (sau 14 ngày) sẽ giúp tăng tốc độ phân hủy cellulose thành mùn hữu cơ mà không gây ức chế lẫn nhau.

4. Chi phí môi trường nuôi cấy bằng Saccarose so với D-Glucose chênh lệch như thế nào?

Sử dụng Saccarose thương phẩm (đường mía công nghiệp giá ~18.000 – 22.000 VNĐ/kg) giúp tiết kiệm hơn $70%$ chi phí nguyên liệu so với việc sử dụng D-Glucose phân tích phòng thí nghiệm (~80.000 – 120.000 VNĐ/kg), trong khi mật độ sinh khối thu nhận sau 24h là tương đương ($\text{OD}_{600} \approx 2,2$).

5. Sau bao nhiêu ngày ủ thì phụ phẩm nhãn có thể đem bón trực tiếp cho cây trồng?

Sau 28 ngày ủ, hàm lượng lignin trong phụ phẩm giảm từ 20–22%, cơ chất chuyển sang màu nâu đen, tơi xốp, nhiệt độ đống ủ hạ về nhiệt độ môi trường, có thể sử dụng an toàn để lót gốc hoặc bón cải tạo đất mà không lo hiện tượng "ngộ độc hữu cơ" hay sốc nhiệt rễ cây.

Kết luận

Đề tài đã giải quyết thành công bài toán xử lý phụ phẩm sau thu hoạch nhãn thông qua việc nghiên cứu, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy hai chủng vi khuẩn DN2 và D3.6. Kết quả nghiên cứu khẳng định cả hai chủng đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme Laccase phân hủy lignin đạt cực đại sau 24 giờ nuôi cấy ($33,8\text{ U/L}$ đối với DN2 và $28,04\text{ U/L}$ đối với D3.6) trong môi trường tối ưu sử dụng đường mía Saccarose $50\text{ g/L}$ ở pH 4.0 và 40°C. Thử nghiệm thực tế trên phụ phẩm nhãn sau 28 ngày giúp cắt giảm từ $19,27%$ đến $22,16%$ hàm lượng lignin, mở ra hướng đi bền vững và hiệu quả kinh tế cao cho ngành sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh tại Việt Nam.