Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Virus gây bệnh lở mồm long móng 1. Hình thái và cấu trúc Virus gây bệnh LMLM thuộc họ Piconarviridae, chi Aphthovirus.
Hình thái: Virus LMLM là loại virus nhỏ nhất trong các virus qua lọc. Dạng virus thành thục có đường kính là 23 nm. Dưới kính hiển vi điện tử, virus thường có hình cầu, đường kính 20 - 28 nm, gồm 20 mặt đối xứng, 30 cạnh và 12 đỉnh. Cấu trúc: Cấu trúc virus gồm phần trung tâm là axit nucleic chiếm 31%, được bao bọc bởi một capsid là protein, gồm 60 capsome, không vỏ bọc.
Hạt virus là phân tử ARN là đơn vị gây nhiễm, đóng vai trò như một ARN thông tin. Dưới ảnh hưởng của các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, hạt virus có thể phân ly thành những phần tử nhỏ ARN và những tiểu phần protein của capsome (thường gọi là tiểu phần 12S) dài 7 - 8 nm (Grubman M. Sức đề kháng của virus đối với ngoại cảnh tương đối mạnh, tùy thuộc vào chất chứa của nó, đặc biệt khi nó dính vào những chất khô hay những chất protein (Trịnh Văn Thịnh và Phan Đình Đỗ, 1958). Đặc tính di truyền, cấu trúc gen, kháng nguyên Hệ gen của virus LMLM bao gồm phần không mã hóa cho protein đầu 5’ (5’UTR) và đầu 3’ (3’UTR), phần mã hóa cho protein cấu trúc (1 ABCD) và phần mã hóa protein không cấu trúc (2 ABCD và 3 ABCD).
Chỉ thị phân tử sử dụng nhiều nhất trong định type và nghiên cứu phả hệ virus LMLM là 5’ UTR và VP1. Hệ gen của virus LMLM với chiều dài 8. Do đặc điểm của các virus ARN là sợi đơn dương nên có tính biến dị rất mạnh. Bộ gen chứa một khung đọc mở duy nhất ORF, với 2 vị trí khởi đầu giải mã cho một protein chung (polyprotein).
Polyprotein được chia thành hơn 12 polypeptide chức năng và trung gian của các phần sẽ bị cắt (Nguyễn Văn Hưng, 2011; Reid S. Hầu hết các quá trình phân cắt tạo các protein trưởng thành được xúc tác bởi 3 proteinase của virus là Lpro, 2 A và 3 Cpro. Hai đầu của bộ gen có thể được 5 thay đổi, đầu 5’ tận cùng bởi VPg (khoảng 23 axit amin), đầu 3’ bởi chuỗi Adenyl. Lpro là nhân tố quan trọng quyết định độc tính của virus.
Những protein tạo nên capsid có tính chất kháng nguyên và khả năng sinh kháng thể gồm 4 loại: VP1 , VP2, VP3, VP4 (VP: viral protein). VP1 ở ngoài cùng tham gia vào việc cố định virus trên những tế bào và là một trong những loại kháng nguyên chính kích thích tạo ra kháng thể chống lại bệnh LMLM. Do đó, có thể nói VP1 đóng vai trò quan trọng nhất trong sinh bệnh học vì nó là yếu tố sinh miễn dịch căn bản. Protein VP1 kích thích tạo ra các kháng thể trung hoà ở trâu, bò và lợn, ba vùng kháng nguyên tương ứng đã được mô tả trên bề mặt của suptype A12.
Hai trong những kháng nguyên đó đã được phát hiện trên chuỗi polypeptide của VP1 và trong các tiểu phần có hằng số sa lắng 12-S. Các vùng kháng nguyên này tham gia trong phản ứng trung hoà virus: sự kết hợp của các tiểu phần virus với kháng thể, qua đó virus mất khả năng xâm nhập (gây nhiễm), phong tỏa các vị trí hấp phụ đặc hiệu, hạn chế khả năng xâm nhập và khả năng tái tạo virus (Reid S. Về chức năng và cấu tạo của virus LMLM, các thành phần kháng nguyên của virus LMLM có thể được phân biệt như sau: hạt virus có hằng số sa lắng 140 S với 60 bản sao của 4 loại protein (VP1, VP2, VP3, VP4). Vỏ capsid trần có hằng số sa lắng 75 S với 60 bản sao của VP0 - VP3.
Các capsome có hằng số sa lắng 12 S, được cấu tạo bằng các VP1 - VP3. Kháng nguyên VIA có hằng số sa lắng 3,8 S; chuỗi RNA polymerase theo Schuel và Sadir, 1986. Ngoại trừ phân tử ARN, các đơn vị cấu trúc cũng xuất hiện trong quá trình virus nhân lên trong mô bị nhiễm và có đặc tính kháng nguyên hoặc dị ứng nguyên. Thành phần miễn dịch của một hạt virus hoàn chỉnh có khả năng kích thích con vật tạo ra các kháng thể đặc hiệu type.
Đặc tính này cũng được giữ nguyên trong quá trình bất hoạt và ức chế sự nhân lên của virus. Ngoài đặc tính kháng nguyên gây miễn dịch dịch thể đặc hiệu, hạt virus hoàn chỉnh còn có khả năng gây dị ứng là do các kháng nguyên vỏ. Phân tử ARN của virus LMLM không quan trọng về mặt kháng nguyên. Sự sai khác về bộ gen là nguyên nhân tạo ra các biến chủng, đặc biệt thông qua sự đa dạng của phân tử VP1.
Những khác biệt này dẫn đến tính kháng nguyên 6 và hệ quả là đặc tính huyết thanh học khác nhau giữa các serotype, các phân type và các biến chủng. Đặc tính kháng nguyên Trên thế giới, người ta xác định được 7 type virus LMLM là: A, O, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3 và Asia 1 (Grubman M. Về mặt kháng nguyên, virus LMLM không đồng nhất, điều này xảy ra trong các serotype, mà mỗi serotype đó có thể có dưới type và các biến chủng hoặc các biến chủng này lại khác nhau về mặt huyết thanh học. Sự sai khác về bộ gen là nguyên nhân tạo ra các biến chủng, đặc biệt thông qua sự đa dạng của phân tử VP1.
Cấu trúc VP1 cũng là điểm xuất phát của những công nghệ di truyền và công nghệ hóa hiện nay (Donalsson A. Mặc dù những protein khác như L, 2AC và 3AD không phải là phần cấu trúc capsid, nhưng chúng cũng tạo ra những đáp ứng kháng thể ở động vật nhiễm bệnh (Brocchi E. Các phương pháp huyết thanh học dùng để xác định subtype đã mang lại nhiều kết quả quan trọng trong quá trình nghiên cứu virus LMLM. Tuy nhiên, các phản ứng huyết thanh học được sử dụng đều phát hiện kháng thể kháng protein cấu trúc, protein vỏ của virus nhưng không phân biệt được đó là kháng thể của động vật đã được tiêm vaccine phòng bệnh hay do nhiễm virus (Reid S.
Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, các kỹ thuật chẩn đoán cũng có nhiều phát triển vượt bậc. Ngày nay, công nghệ phân tích gen đã được áp dụng nhiều trong công tác nghiên cứu khoa học, đặc biệt là trong sản xuất vaccine phòng bệnh. Phương pháp PCR do Millis và cộng sự phát minh năm 1985 được sử dụng rộng rãi đã đem lại cuộc cách mạng di truyền học phân tử. Đây là kỹ thuật hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích gen và hệ gen, có thể tạo ra số lượng lớn các bản sao của đoạn ADN mong muốn.
Phương pháp phân tích gen đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu về vaccine ADN phòng bệnh LMLM. Người ta đã xác định được các đoạn axit amin có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch nhanh, mạnh, tái tổ hợp vào ARN của virus dùng trong sản xuất vaccine. Khi các loại vaccine ADN này được tiêm cho gia súc thì các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu sẽ hình thành không chỉ chống lại các protein cấu trúc mà còn cả protein phi cấu trúc của virus (Reid S. Các điểm quyết định kháng nguyên Một số protein phi cấu trúc của virus LMLM gây đáp ứng miễn dịch là 3D, 3A, 3AB, 3ABC, 2C, 2B, 3C và Lpro.
Trong thời gian gần đây, một số protein phi cấu trúc 2C, 3B, 3AB, và 3ABC đã được nghiên cứu và nhiều phương pháp có độ nhạy cao đã được phát triển. Tuy nhiên có lẽ phương pháp căn bản ELISA vẫn là sự lựa chọn tốt hơn do có nhiều thuận lợi về tính khách quan, độ nhạy cao, an toàn, rẻ, dễ giải thích và sử dụng phù hợp cho số lượng mẫu lớn ở thực địa. (1998), đã tiến hành thí nghiệm dùng kháng thể đơn dòng kháng protein phi cấu trúc 3ABC với kỹ thuật ELISA ngăn trở. (1998) cũng đã tìm kiếm kháng thể kháng kháng nguyên 3D, 3AB và 3ABC bằng phương pháp ADN tái tổ hợp.
Kết quả là ở những gia súc được bảo vệ bằng vaccine đã không tạo kháng thể kháng protein phi cấu trúc đặc biệt là 3ABC. Tiến hóa của virus LMLM Thành phần hệ gen của virus LMLM luôn luôn biến đổi, ngay cả trong cùng một serotype, các chủng phân lập ở các vùng địa lý khác nhau có mức độ tương đồng về thành phần nucleotide và axit amin cũng khác nhau. Mầm bệnh của bệnh LMLM là loại virus ARN nhỏ nhất trong các virus qua lọc (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970), virus LMLM có hai đặc tính liên quan đến dịch tễ học, đó là tính đa type và tính dễ biến đổi kháng nguyên. Các type gây ra những triệu chứng bệnh tích giống nhau nhưng lại không gây ra miễn dịch chéo (Trịnh Văn Thịnh và Phan Đình Đỗ, 1958).
Virus LMLM gây những triệu chứng lâm sàng giống nhau nhưng được phân loại dựa vào kiểu gene xác định dựa trên so sánh trình tự VP1. Hiện có 7 type virus LMLM, trong đó mỗi type này lại phân chia thành nhiều type phụ (subtype) khác nhau bởi những đặc tính miễn dịch học (cấu trúc kháng nguyên, độc lực…). Hiện nay, người ta thừa nhận có hơn 70 type phụ virus LMLM. Không có sự đồng nhất rõ rệt về đặc tính kháng nguyên trong các type, không có sự miễn dịch chéo giữa các type, chỉ có miễn dịch chéo giữa một số type phụ trong phạm vi một type.
Đối với 3 type O, A, C, trong một ổ dịch có thể có sự kết hợp của các type này, nhưng thông thường chỉ một type chiếm ưu thế. Đặc tính gây nhiễm trong phòng thí nghiệm Ngay sau lần đầu tiên phát hiện virus LMLM, Loeffler và Frosch (1897) đã nghiên cứu nuôi cấy virus trong phòng thí nghiệm để tìm hiểu đặc tính của nó và tạo ra những chủng virus có tính kháng nguyên dùng để chế tạo vaccine. Kết quả gây bệnh thực nghiệm cho bê trong phòng thí nghiệm phụ thuộc vào liều tiêm và đường tiêm truyền. Kết quả gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp tiêm truyền dưới da không ổn định, tùy thuộc vào liều sử dụng và cần ít nhất 1 ml máu độc mới có kết quả.
Tiêm virus vào tĩnh mạch bê cũng cho kết quả không ổn định, bệnh có thể diễn biến trầm trọng nhưng cũng có thể chỉ ở thể nhẹ, thoáng qua. Tiêm bắp virus cho bê có thể gây bệnh trầm trọng (Trịnh Văn Thịnh và Phan Đình Đỗ, 1958). Động vật thí nghiệm: trong phòng thí nghiệm, có thể gây bệnh bằng cách tiêm phúc mạc cho chuột lang, chuột đồng, chuột trắng, chuột nhắt xám, chuột nhắt trắng sơ sinh (12 - 14 giờ), chuột đất, chuột còn bú hoặc thỏ nhà, thỏ rừng, gà, trong đó chuột lang là động vật cảm thụ nhất.