Tổng quan luận án

Bệnh sốt rét là bệnh truyền nhiễm phổ biến do ký sinh trùng giống Plasmodium gây ra ở người, lây qua đường máu do muỗi Anopheles truyền. Bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng cũng như sự phát triển kinh tế - xã hội, đặc biệt tại các quốc gia đang phát triển. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), trên thế giới có 99 quốc gia và vùng lãnh thổ có sốt rét lưu hành với khoảng 3,3 tỷ người sống trong vùng nguy cơ. Năm 2010, toàn cầu ghi nhận khoảng 216 triệu ca mắc và 655 nghìn ca tử vong do sốt rét, tập trung chủ yếu ở trẻ em dưới 5 tuổi và phụ nữ có thai tại khu vực châu Phi.

Việt Nam nằm trong vùng sốt rét lưu hành với điều kiện tự nhiên, khí hậu và sinh cảnh thuận lợi cho sự phát triển của muỗi truyền bệnh và ký sinh trùng. Sau giai đoạn quay trở lại nghiêm trọng vào năm 1991 (với hơn 1 triệu người mắc, 4.646 ca tử vong và 144 vụ dịch), Chương trình phòng chống sốt rét Quốc gia đã triển khai quyết liệt và làm giảm mạnh tỷ lệ mắc cũng như tử vong. Đến năm 2008, tỷ lệ mắc sốt rét toàn quốc giảm còn 0,70/1.000 dân và tỷ lệ tử vong giảm còn 0,02/100.000 dân. Dù vậy, sốt rét vẫn duy trì sự lưu hành phức tạp tại vùng sâu, vùng xa và khu vực biên giới.

Khu vực Bắc Trường Sơn gồm 5 tỉnh (Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế) có đường biên giới tiếp giáp với nước bạn Lào. Cư dân sinh sống tại khu vực này đa phần là đồng bào dân tộc thiểu số như Vân Kiều, Pa Cô, Tà Ôi, Cơ Tu, đời sống kinh tế còn nhiều khó khăn, giao thông cách trở và có sự giao lưu biên giới thường xuyên. Theo phân vùng dịch tễ can thiệp năm 2009, vùng trọng điểm sốt rét của khu vực tập trung tại Quảng Bình (điển hình là huyện Lệ Thủy) và Quảng Trị (huyện Hướng Hóa), cùng với huyện A Lưới thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế.

Các phương pháp cổ điển như xét nghiệm lam máu nhuộm Giemsa và đánh giá độ nhạy/kháng thuốc bằng thử nghiệm in vivo, in vitro tại thực địa bộc lộ nhiều hạn chế: khó phát hiện ký sinh trùng ở mật độ thấp (< 1 KST/µl máu), khó nhận diện chính xác các trường hợp nhiễm phối hợp nhiều loài khi có một loài chiếm ưu thế tuyệt đối, đòi hỏi thời gian theo dõi dài ngày (7, 14, 28 ngày) và khó phân biệt giữa tái phát với nhiễm mới. Việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử (đặc biệt là kỹ thuật PCR lồng và phân tích đột biến gen) giải quyết triệt để các hạn chế này, mang lại nguồn dữ liệu chuẩn xác về dịch tễ học phân tử, cấu trúc di truyền quần thể và tình trạng kháng thuốc.

Xuất phát từ thực tiễn trên, tác giả Trương Văn Hạnh đã thực hiện luận án tiến sĩ sinh học với đề tài: "Nghiên cứu tính đa hình di truyền của ký sinh trùng sốt rét và tính kháng thuốc sốt rét của Plasmodium falciparum tại một số tỉnh biên giới thuộc khu vực Bắc Trường Sơn, Việt Nam" tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trịnh Đình Đạt và PGS. Hồ Đình Trung.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 3 mục tiêu cụ thể:

  1. Xác định được thành phần, cơ cấu loài ký sinh trùng sốt rét tại 3 tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Trường Sơn, Việt Nam.
  2. Đánh giá được tính đa hình di truyền của quần thể Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax tại khu vực Bắc Trường Sơn, Việt Nam.
  3. Xác định được tỷ lệ đột biến kháng của Plasmodium falciparum đối với thuốc sốt rét pyrimethamin, sulfadoxin và chloroquin.

Nội dung nghiên cứu

  1. Điều tra cắt ngang tại các điểm nghiên cứu ở 3 tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế để thu thập lam máu và mẫu máu trên giấy thấm Whatman 3MM, phát hiện và phân biệt ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm Giemsa và PCR.
  2. Phân tích kiểu gen của P. falciparum dựa trên 3 locus gen msp1, msp2 và glurp; kiểu gen của P. vivax dựa trên locus gen Pvcs và Pvmsp1 để đánh giá tính đa hình di truyền của các quần thể ký sinh trùng.
  3. Phân tích các vị trí đột biến điểm trên gen dhfr để xác định tỷ lệ P. falciparum mang đột biến kháng với thuốc pyrimethamin.
  4. Phân tích các vị trí đột biến điểm trên gen dhps để xác định tỷ lệ P. falciparum mang đột biến kháng với thuốc sulfadoxin.
  5. Phân tích đột biến điểm ở vị trí 76 trên gen Pfcrt để xác định tỷ lệ P. falciparum mang đột biến kháng với thuốc chloroquin.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Ký sinh trùng sốt rét (Plasmodium) ký sinh ở người được thu thập từ các bệnh nhân sốt rét và người dân tại các điểm nghiên cứu thực địa.
  • Phạm vi không gian: Các huyện biên giới thuộc 3 tỉnh khu vực Bắc Trường Sơn, gồm huyện Lệ Thủy (tỉnh Quảng Bình), huyện Hướng Hóa (tỉnh Quảng Trị) và huyện A Lưới (tỉnh Thừa Thiên Huế).
  • Phạm vi thời gian: Mẫu bệnh phẩm và dữ liệu dịch tễ được thu thập, phân tích trong giai đoạn từ năm 2008 đến năm 2012.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến sinh học ký sinh trùng, dịch tễ học, đa hình di truyền và cơ chế kháng thuốc:

Nghiên cứu về véc tơ truyền bệnh và dịch tễ học sốt rét

  • Ronald Ross (1897) tại Ấn Độ đã xác định muỗi Anopheles là thủ phạm truyền bệnh sốt rét sau khi phát hiện ký sinh trùng phát triển trong cơ thể muỗi hút máu bệnh nhân.
  • Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Trần Đức Hinh, Nguyễn Đức Mạnh, Lê Khánh Thuận đã xác định có 62 loài muỗi Anopheles, trong đó có 3 loài là véc tơ truyền bệnh chính: An. minimus (vùng đồi núi, ven rừng), An. dirus (rừng rậm, bóng râm) và An. epiroticus (vùng nước lợ ven biển Nam Bộ). Các véc tơ phụ gồm An. jeyporiensis, An. indefinitus...
  • Về địa lý tự nhiên khu vực Bắc Trường Sơn, Lê Bá Thảo (1977) mô tả đây là vùng chuyển tiếp từ phía Nam thung lũng sông Cả đến phía Bắc thung lũng sông Bung, với địa hình núi đá vôi hẹp ngang, dốc về phía biển, khí hậu phân hóa mùa đông lạnh và gió phơn khô nóng mùa hè.
Vùng/Quốc gia Nghiên cứu & Dữ liệu dịch tễ Tác giả & Thời gian Kết quả chính ghi nhận
Toàn cầu Tình hình sốt rét lưu hành tại 99 quốc gia WHO (2010, 2012) 216 triệu ca bệnh, 655 nghìn ca tử vong; châu Phi chiếm 81% ca bệnh và 91% tử vong
Tây Thái Bình Dương Tình hình sốt rét các nước trong khu vực WHO (2008) Papua New Guinea: 1.117 ca tử vong; Vanuatu: 237.811 ca mắc; Campuchia: 46.650 ca mắc
Việt Nam Diễn biến sốt rét theo vùng sinh thái Báo cáo Viện Sốt rét - KST - CTTƯ (2006, 2010) Duyên hải miền Trung và Tây Nguyên có số ca mắc và tử vong cao nhất toàn quốc
Bắc Trường Sơn Số liệu sốt rét tại 5 tỉnh miền Trung Số liệu thống kê (2008, 2011) Quảng Trị và Quảng Bình duy trì số ca KSTSR cao nhất vùng; Thừa Thiên Huế giảm dần

Ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định thành phần loài ký sinh trùng

  • Kỹ thuật PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Năm 1991, kỹ thuật này bắt đầu được ứng dụng để phát hiện ký sinh trùng sốt rét ở người.
  • Snounou G. và cộng sự (1993) sử dụng PCR lồng phân tích gen 18S-rRNA tại Thái Lan, phát hiện nhiều mẫu nhiễm phối hợp, kể cả ca nhiễm 4 loài ký sinh trùng.
  • Mehlotra R. và cộng sự (2000) tại Papua New Guinea ghi nhận kỹ thuật PCR lồng phát hiện tỷ lệ nhiễm KSTSR cao hơn 3,0 lần và tỷ lệ nhiễm phối hợp cao hơn 17,5 lần so với kính hiển vi.
  • Zakeri S. và cộng sự (2003) tại Iran phát hiện tỷ lệ nhiễm phối hợp bằng PCR là 29% (so với 0,6% qua kính hiển vi).
  • Al-Mekhlafi A.M. và cộng sự (2010) tại Yemen phát hiện tỷ lệ nhiễm KSTSR là 16,8%, trong đó nhiễm phối hợp chiếm 13,9%.
  • Tại Việt Nam, Lê Đức Đào và cộng sự (1996, 1998) áp dụng PCR lồng ghi nhận sự có mặt của 4 loài KSTSR tại Khánh Hòa (nhiễm phối hợp 81%), Lâm Đồng (41%), Đắc Lắc (40%), Bình Phước (22%). Lê Đức Đào, Trương Văn Hạnh và cộng sự (2005) tại Quảng Bình phát hiện 3 loài với tỷ lệ phối hợp 2 loài là 29,1%, 3 loài là 0,9%. Bùi Quang Phúc và cộng sự (2004) tại Quảng Trị ghi nhận tỷ lệ nhiễm phối hợp là 17,8%.

Nghiên cứu tính đa hình di truyền của P. falciparum và P. vivax

  • Đối với P. falciparum: Đa hình tập trung ở các locus gen mã hóa protein bề mặt gồm msp1 (gồm 3 họ alen K1, MAD20, RO33), msp2 (họ alen FC27 và IC1/3D7) và glurp (vùng lặp lại RII).
    • Ferreira M.U. (1998) so sánh đa hình msp1 tại Brazil (10 alen, MOI 1,42), Tanzania (13 alen, MOI 2,37) và Lâm Đồng - Việt Nam (24 alen, MOI 1,76).
    • Agnes Aubouy (2003) tại Gabon xác định 25 alen msp1, 19 alen msp2, MOI đạt 4,0.
    • Soulama I. (2009) tại Burkina Faso ghi nhận tính đa hình rất cao với 41 alen msp1, 29 alen msp2, MOI > 3,0.
    • Joshi H. và cộng sự (2006) tại Ấn Độ, Ghanchi N.K. và cộng sự (2009) tại Pakistan (25 alen msp1, 33 alen msp2), Kang J.M. và cộng sự (2010) tại Myanmar (14 alen msp1, 22 alen msp2), Khaminsou N. và cộng sự (2011) tại Lào (26 alen msp1, MOI 1,6).
    • Tại Việt Nam: Lê Đức Đào, Trương Văn Hạnh và cộng sự (2004-2005) tại Quảng Bình ghi nhận 33 alen msp1, 26 alen msp2, 13 alen glurp. Tại Bình Phước (2005-2009) ghi nhận kiểu gen MAD20 chiếm 45,04%, K1 chiếm 32,58%, RO33 chiếm 22,36% ở msp1; msp2 có FC chiếm 44,56%, IC chiếm 55,44%; glurp có 10 alen. Tại Ninh Thuận phát hiện 15 alen msp1, 14 alen msp2, 6 alen glurp.
  • Đối với P. vivax: Nghiên cứu tập trung vào locus gen Pvcs (2 kiểu gen VK210 và VK247) và Pvmsp1 (vùng F1, F2, F3).
    • Imwong M. và cộng sự (2005) tại Thái Lan ghi nhận ở Pvcs có 90 mẫu VK210, 9 mẫu VK247, 1 mẫu phối hợp (10 alen, MOI 1,2); Pvmsp1 có 5 alen F1, 2 alen F2, 4 alen F3 (MOI 1,29).
    • Kim và cộng sự tại Kolkata, Ấn Độ xác định 150 mẫu VK210 và 1 mẫu VK247.
    • Lê Đức Đào và cộng sự (2007) tại Bình Phước phát hiện 49,2% VK210, 50,8% VK247, 6 alen Pvcs (MOI 1,35); Pvmsp1 có 13 alen (3 F1, 5 F2, 5 F3).

Nghiên cứu ký sinh trùng kháng thuốc

  • Lịch sử kháng thuốc của P. falciparum: Kháng quinin xuất hiện từ 1910 (Brazil); kháng chloroquin xuất hiện năm 1960 (Colombia, Thái Lan), tại Việt Nam phát hiện đầu tiên năm 1961 tại Nha Trang; kháng sulfadoxin - pyrimethamin (Fansidar) xuất hiện năm 1968 tại biên giới Thái Lan - Campuchia, tại Việt Nam ghi nhận mức kháng cao ở Tây Nguyên (82% năm 1980 tăng lên 93% năm 1982); kháng mefloquin năm 1982 (Thái Lan); giảm đáp ứng và nghi ngờ kháng artemisinin tại Tasanh - Campuchia (2006-2007) và Bình Phước - Việt Nam (2009-2010).
  • Nghiên cứu của Tạ Thị Tĩnh, Nguyễn Mạnh Hùng và cộng sự (2008-2009) đánh giá hiệu lực artesunat viên 7 ngày tại Gia Lai, Quảng Trị, Ninh Thuận đạt tỷ lệ khỏi 96,8 - 100%, riêng xã Đắk Nhau (Bù Đăng, Bình Phước) giảm đáp ứng với tỷ lệ khỏi là 87,5%.

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết

Trước thời điểm thực hiện luận án, các nghiên cứu dịch tễ học phân tử về đa hình di truyền của P. vivax và tỷ lệ đột biến kháng thuốc của P. falciparum tại khu vực miền Trung chủ yếu thực hiện cục bộ, thiếu vắng số liệu toàn diện tại hai tỉnh Quảng Bình và Thừa Thiên Huế. Luận án đã giải quyết khoảng trống này thông qua việc phân tích đồng bộ cấu trúc di truyền và các chỉ thị đột biến phân tử kháng thuốc trên toàn bộ 3 tỉnh trọng điểm của dải biên giới Bắc Trường Sơn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Chu kỳ sinh học ký sinh trùng: Trải qua giai đoạn sinh sản vô tính trong cơ thể người (ở tế bào nhu mô gan và hồng cầu) và sinh sản hữu tính trong muỗi Anopheles. Giai đoạn thể phân liệt phá vỡ hồng cầu giải phóng merozoite gắn kết với bề mặt hồng cầu mới nhờ các protein bề mặt có tính đa hình cao.
  • Cơ sở phân tử tính đa hình: Các locus gen msp1, msp2, glurp (P. falciparum), Pvcs và Pvmsp1 (P. vivax) mang các đoạn lặp lại nucleotide có độ dài và trình tự đặc thù. Phân tích số lượng đoạn lặp và kích thước phân tử giúp nhận diện alen, tính toán tỷ lệ nhiễm đơn, nhiễm phối hợp kiểu gen và chỉ số bội nhiễm alen (Multiplicity of Infection - MOI).
  • Cơ chế kháng thuốc:
    • Nhóm antifolat (Fansidar - SP): Pyrimethamin ức chế enzym dihydrofolate reductase (DHFR mã hóa bởi gen dhfr); Sulfadoxin ức chế enzym dihydropteroate synthase (DHPS mã hóa bởi gen dhps) trong chu trình tổng hợp axit folic. Đột biến điểm tại các codon đặc hiệu làm biến đổi cấu trúc không gian của enzym, ngăn chặn sự gắn kết của thuốc.
    • Chloroquin: Thuốc đi vào lysosome có tính axit của ký sinh trùng, tích điện thành CQH+ gắn với ferriprotoporphyrin IX (Fp9), ức chế phản ứng trùng hợp hemozoin làm độc tế bào. Kháng chloroquin xảy ra do đột biến gen Pfcrt (đặc biệt tại vị trí codon 76) làm biến đổi protein vận chuyển màng lysosome, đào thải chloroquin ra ngoài và ngăn cản sự tích tụ thuốc.
Nhóm thuốc / Mục tiêu Gen đích Vị trí đột biến điểm phân tích Cơ chế phân tử
Pyrimethamin dhfr Codon 108 (và các vị trí liên quan) Giảm ái lực liên kết với enzym dihydrofolate reductase
Sulfadoxin dhps Codon 581, codon 613 Giảm ái lực liên kết với enzym dihydropteroate synthase
Chloroquin Pfcrt Codon 76 (K76T) Đào thải thuốc khỏi lysosome qua kênh vận chuyển màng
Chẩn đoán loài 18S-rRNA Vùng gen ribosome đặc hiệu loài Phân biệt 4 loài ký sinh trùng (P.f, P.v, P.m, P.o)
Đa hình P. falciparum msp1, msp2, glurp Vùng lặp lại K1, MAD20, RO33, FC, IC, RII Đánh giá độ đa hình alen và chỉ số bội nhiễm MOI
Đa hình P. vivax Pvcs, Pvmsp1 Đoạn lặp VK210, VK247 và vùng F1, F2, F3 Đánh giá cấu trúc kiểu gen và độ bội nhiễm MOI

Phương pháp nghiên cứu thực tế

  • Thiết kế nghiên cứu: Điều tra cắt ngang dịch tễ học thực địa kết hợp phân tích thực nghiệm trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử.
  • Thu thập mẫu: Lấy máu đầu ngón tay của bệnh nhân và người dân tại thực địa làm lam máu (giọt đặc và giọt mỏng), nhuộm giemsa; đồng thời thấm máu lên giấy thấm chuyên dụng Whatman 3MM để bảo quản phục vụ tách chiết ADN.
  • Kỹ thuật xét nghiệm vi thể: Soi lam máu nhuộm Giemsa dưới kính hiển vi quang học để phát hiện thể ký sinh trùng, xác định loài và mật độ ký sinh trùng.
  • Kỹ thuật sinh học phân tử:
    • Tách chiết ADN ký sinh trùng từ mẫu máu giấy thấm bằng phương pháp hóa lý phù hợp.
    • Kỹ thuật PCR lồng (Nested-PCR) khuếch đại đoạn gen 18S-rRNA với các cặp mồi đặc hiệu để xác định và phân biệt 4 loài ký sinh trùng (P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale).
    • Kỹ thuật PCR phân tích kiểu gen đa hình: sử dụng các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại các vùng biến đổi của msp1 (nhận diện K1, MAD20, RO33), msp2 (nhận diện FC, IC), glurp (vùng RII), Pvcs (nhận diện VK210, VK247) và Pvmsp1 (các phân đoạn F1, F2, F3).
    • Kỹ thuật PCR/RFLP và PCR đặc hiệu alen: khuếch đại và phân tích các đột biến điểm kháng thuốc trên gen dhfr (vị trí 108), gen dhps (vị trí 581, 613) và gen Pfcrt (vị trí 76).
    • Phân tích sản phẩm: Điện di trên gel agarose, nhuộm ethidium bromide, soi dưới ánh sáng tử ngoại, so sánh kích thước với thang chuẩn ADN (Ladder - L).
  • Xử lý số liệu: Tính toán tần suất xuất hiện của các alen, tỷ lệ nhiễm đơn loài/phối hợp loài, tỷ lệ nhiễm đơn kiểu gen/nhiễm phối hợp kiểu gen, tỷ lệ mang đột biến nhạy/kháng và chỉ số đa bội nhiễm (MOI) theo các công thức dịch tễ học phân tử.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1 - Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện 38 trang về:

  • Phân loại học, đặc điểm sinh học 4 loài ký sinh trùng sốt rét ở người (P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale) và loài lây từ khỉ sang người (P. knowlesi).
  • Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng, phân loại 62 loài muỗi Anopheles tại Việt Nam với 3 véc tơ chính (An. minimus, An. dirus, An. epiroticus).
  • Tình hình sốt rét toàn cầu (216 triệu ca năm 2010), diễn biến sốt rét tại các khu vực dịch tễ của WHO và lịch sử phòng chống sốt rét tại Việt Nam từ 1958 đến 2011.
  • Điều kiện địa lý, tự nhiên, khí hậu và kinh tế - xã hội vùng Bắc Trường Sơn (theo Lê Bá Thảo 1977); tổng hợp số liệu sốt rét năm 2008 và 2011 tại 5 tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế.
  • Đánh giá ưu nhược điểm của các kỹ thuật chẩn đoán: Lam máu nhuộm Giemsa, que thử nhanh RDT (phát hiện protein-2 giàu histidin), và kỹ thuật PCR lồng khuếch đại gen 18S-rRNA.
  • Cấu trúc các locus gen đa hình bề mặt (msp1, msp2, glurp, Pvcs, Pvmsp1) và cơ chế phân tử của tính kháng thuốc (ức chế chu trình axit folic của pyrimethamin/sulfadoxin; tích lũy hemozoin và bơm tống thuốc của gen Pfcrt đối với chloroquin).

Chương 2 - Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết trong 19 trang về:

  • Đối tượng nghiên cứu: Người bệnh và người dân tại các xã biên giới của 3 huyện: Lệ Thủy (Quảng Bình), Hướng Hóa (Quảng Trị) và A Lưới (Thừa Thiên Huế).
  • Thời gian nghiên cứu: Giai đoạn thu thập và xử lý mẫu thực địa từ 2008 đến 2012.
  • Vật liệu, thiết bị, hóa chất: Kính hiển vi, phẩm nhuộm Giemsa, giấy thấm Whatman 3MM, hóa chất ly giải và tách chiết ADN, máy luân nhiệt PCR, buồng điện di, thang phân tử ADN (Ladder), enzym Taq polymerase, dNTPs, đệm PCR và các trình tự cặp mồi oligonucleotide đặc hiệu cho chẩn đoán loài, đa hình gen và phát hiện đột biến điểm kháng thuốc (dhfr, dhps, Pfcrt).
  • Quy trình thực nghiệm: Chi tiết các chu nhiệt phản ứng PCR lồng chẩn đoán loài; quy trình khuếch đại các họ alen msp1, msp2, glurp, Pvcs, Pvmsp1; quy trình phân tích đột biến kháng thuốc.
  • Phương pháp phân tích số liệu: Tiêu chuẩn đánh giá kết quả trên ảnh điện di gel agarose; công thức toán học xác định tỷ lệ nhiễm đơn, tỷ lệ nhiễm phối hợp, tần suất alen và chỉ số bội nhiễm alen (MOI).

Chương 3 - Kết quả và thảo luận

Chương này gồm 50 trang, trình bày các phát hiện thực nghiệm và phân tích dịch tễ học phân tử:

  • Thành phần và cơ cấu loài ký sinh trùng sốt rét:
    • So sánh kết quả giữa kỹ thuật nhuộm soi lam máu Giemsa và kỹ thuật PCR lồng tại 3 tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế.
    • Kỹ thuật PCR lồng chứng minh độ nhạy cao vượt trội trong việc phát hiện các ca nhiễm mật độ thấp và các trường hợp nhiễm phối hợp 2 loài, 3 loài KSTSR (P. falciparum phối hợp P. vivax, hoặc phối hợp P. malariae) mà kính hiển vi bỏ sót hoặc chỉ nhận diện được loài chiếm ưu thế.
    • Phân tích sự thay đổi trong cơ cấu tỷ lệ giữa các loài KSTSR tại khu vực Bắc Trường Sơn khi áp dụng chẩn đoán phân tử.
  • Tính đa hình di truyền của quần thể Plasmodium falciparum:
    • Theo locus msp1: Xác định tỷ lệ phân bố các họ kiểu gen K1, MAD20 và RO33; xác định số lượng alen, kích thước phân tử và tần suất xuất hiện của các alen thuộc kiểu gen K1 và MAD20; tỷ lệ mẫu nhiễm đơn và nhiễm phối hợp kiểu gen; tính toán giá trị MOI của locus msp1.
    • Theo locus msp2: Xác định tỷ lệ phân bố hai họ kiểu gen FC và IC; xác định số lượng và tần suất các alen đặc trưng; tỷ lệ nhiễm phối hợp giữa kiểu gen FC và IC; giá trị MOI của locus msp2.
    • Theo locus glurp: Xác định số lượng, kích thước đoạn phân tử và tần suất xuất hiện của các alen tại vùng RII; xác định chỉ số đa hình quần thể.
  • Tính đa hình di truyền của quần thể Plasmodium vivax:
    • Theo locus Pvcs: Phân tích tỷ lệ mẫu mang kiểu gen VK210, VK247 và tỷ lệ nhiễm phối hợp cả 2 kiểu gen; tần suất xuất hiện của các alen tại locus Pvcs trong quần thể KSTSR Bắc Trường Sơn.
    • Theo locus Pvmsp1: Phân tích điện di và xác định các alen đặc trưng tại 3 phân đoạn F1, F2 và F3; đánh giá mức độ đa hình di truyền của P. vivax tại các tỉnh nghiên cứu.
  • Đặc điểm kháng thuốc sốt rét của Plasmodium falciparum:
    • Kháng pyrimethamin: Kết quả phân tích đột biến điểm trên gen dhfr (vị trí 108...); xác định tỷ lệ ký sinh trùng mang kiểu gen nhạy và kiểu gen đột biến kháng pyrimethamin trong quần thể; số lượng đột biến điểm liên quan đến mức độ đáp ứng thuốc.
    • Kháng sulfadoxin: Kết quả phân tích đột biến điểm trên gen dhps (vị trí 581, 613...); tỷ lệ mẫu mang kiểu gen nhạy và đột biến kháng sulfadoxin; tương quan số lượng đột biến với mức độ kháng.
    • Kháng chloroquin: Kết quả phân tích đột biến điểm tại codon 76 trên gen Pfcrt; tỷ lệ phân lập P. falciparum mang kiểu gen đột biến kháng chloroquin trong quần thể tại 3 tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế.
    • Khẳng định quần thể P. falciparum tại khu vực Bắc Trường Sơn duy trì tỷ lệ đột biến kháng rất cao đối với cả 3 loại thuốc pyrimethamin, sulfadoxin và chloroquin trong giai đoạn 2008-2012.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

  1. Lần đầu tiên cung cấp hệ thống số liệu khoa học chuẩn xác về đặc điểm kiểu gen và tính đa hình di truyền của quần thể Plasmodium vivax tại các tỉnh Quảng Bình và Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Trường Sơn.
  2. Lần đầu tiên công bố số liệu đầy đủ về tỷ lệ đột biến kháng của Plasmodium falciparum đối với 3 loại thuốc sốt rét cơ bản gồm pyrimethamin (gen dhfr), sulfadoxin (gen dhps) và chloroquin (gen Pfcrt) tại 2 tỉnh Quảng Bình và Thừa Thiên Huế.
  3. Cung cấp bức tranh toàn diện về thành phần, cơ cấu loài ký sinh trùng sốt rét, mức độ đa bội nhiễm (MOI) và cấu trúc di truyền quần thể của cả hai loài ký sinh trùng chủ yếu (P. falciparum và P. vivax) tại dải biên giới Bắc Trường Sơn giai đoạn 2008-2012.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  1. Bằng chứng sinh học phân tử khẳng định P. falciparum tại khu vực Bắc Trường Sơn có tỷ lệ đột biến kháng cao với pyrimethamin, sulfadoxin và chloroquin, là cơ sở khoa học khuyến cáo không sử dụng các đơn hóa trị liệu hoặc phác đồ phối hợp đã bị kháng trong điều trị P. falciparum.
  2. Cung cấp luận cứ thực tiễn quan trọng phục vụ Chương trình Quốc gia phòng chống và loại trừ sốt rét trong việc lựa chọn thuốc điều trị đặc hiệu thích hợp (các thuốc phối hợp dẫn xuất artemisinin - ACTs), xây dựng phác đồ can thiệp phù hợp cho các nhóm dân cư vùng sâu, vùng biên giới Việt - Lào, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Kiến nghị

  • Mở rộng ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR lồng và phân tích đột biến gen) trong hệ thống giám sát dịch tễ thường quy tại các vùng trọng điểm sốt rét biên giới.
  • Tiếp tục duy trì giám sát định kỳ biến động cấu trúc di truyền và mức độ kháng thuốc của các chủng ký sinh trùng sốt rét nhằm kịp thời cập nhật phác đồ điều trị quốc gia.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Phạm vi nghiên cứu thực địa tập trung tại 3 huyện biên giới trọng điểm thuộc 3 tỉnh Quảng Bình (Lệ Thủy), Quảng Trị (Hướng Hóa) và Thừa Thiên Huế (A Lưới), chưa bao quát toàn bộ các huyện khác trong khu vực Bắc Trường Sơn.
  • Các chỉ thị phân tử kháng thuốc trong luận án tập trung vào 3 loại thuốc sốt rét cổ điển (pyrimethamin, sulfadoxin, chloroquin) qua các gen dhfr, dhps, Pfcrt, chưa mở rộng phân tích các dấu ấn phân tử kháng mới đối với dẫn xuất artemisinin (như gen K13-propeller) trên diện rộng.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng phạm vi điều tra dịch tễ học phân tử sang các địa bàn biên giới lân cận của tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh và các tỉnh biên giới giáp Lào.
  • Tiếp tục theo dõi động thái đa hình di truyền của P. vivax trong bối cảnh tỷ lệ mắc P. vivax có xu hướng gia tăng tương đối khi P. falciparum được khống chế.
  • Nghiên cứu sâu các đột biến phân tử mới liên quan đến tính nhạy cảm và giảm đáp ứng với các thuốc sốt rét phối hợp thế hệ mới đang lưu hành.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị cao đối với nhiều nhóm đối tượng:

  • Cán bộ nghiên cứu và nghiên cứu sinh, học viên cao học: Thuộc các chuyên ngành Di truyền học, Sinh học phân tử, Ký sinh trùng học, Dịch tễ học và Y học dự phòng. Luận án cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về thiết kế mồi, phản ứng PCR lồng chẩn đoán loài, phân tích đa hình alen các locus gen (msp1, msp2, glurp, Pvcs, Pvmsp1) và kỹ thuật phát hiện đột biến điểm kháng thuốc (dhfr, dhps, Pfcrt).
  • Cán bộ y tế và các viện nghiên cứu chuyên ngành: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương, các Viện khu vực Quy Nhơn, TP. Hồ Chí Minh và Trung tâm phòng chống sốt rét các tỉnh miền Trung. Số liệu của luận án là nguồn dữ liệu nền chuẩn xác để so sánh, đối chiếu biến động dịch tễ học phân tử qua các thời kỳ.
  • Các nhà quản lý y tế và hoạch định chính sách: Cung cấp căn cứ khoa học trực tiếp phục vụ việc điều chỉnh phác đồ điều trị, định hướng chiến lược quốc gia về phòng chống và tiến tới loại trừ bệnh sốt rét tại các vùng biên giới đặc thù.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án sử dụng những locus gen nào để đánh giá tính đa hình di truyền của P. falciparum và P. vivax?

Luận án sử dụng 3 locus gen mã hóa protein bề mặt có tính đa hình cao đối với P. falciparum gồm: msp1 (phân tích 3 họ kiểu gen K1, MAD20, RO33), msp2 (phân tích 2 họ kiểu gen FC và IC) và glurp (phân tích vùng lặp lại RII). Đối với P. vivax, tác giả sử dụng 2 locus gen gồm Pvcs (phân tích 2 kiểu gen VK210, VK247) và Pvmsp1 (phân tích 3 vùng đa hình F1, F2, F3).

2. Tác giả phân tích các đột biến gen nào để xác định tính kháng thuốc của P. falciparum?

Tác giả phân tích các đột biến điểm trên 3 gen đích của P. falciparum:

  • Gen dhfr (phân tích đột biến tại codon 108...) liên quan đến tính kháng pyrimethamin.
  • Gen dhps (phân tích đột biến tại codon 581, 613...) liên quan đến tính kháng sulfadoxin.
  • Gen Pfcrt (phân tích đột biến điểm tại codon 76) liên quan đến tính kháng chloroquin.

3. Tại sao phương pháp PCR lồng lại ưu việt hơn phương pháp soi lam máu nhuộm Giemsa trong nghiên cứu này?

Phương pháp nhuộm soi lam máu Giemsa truyền thống khó phát hiện ký sinh trùng ở mật độ thấp (< 1 KST/µl máu) và dễ bỏ sót các ca nhiễm phối hợp nhiều loài khi có một loài chiếm ưu thế số lượng lớn. Kỹ thuật PCR lồng nhân bản đoạn gen 18S-rRNA đặc hiệu loài có độ nhạy cao gấp nhiều lần, cho phép phân biệt chính xác cả 4 loài KSTSR ở người và phát hiện đầy đủ các trường hợp nhiễm phối hợp ẩn.

4. Đóng góp khoa học mới lần đầu tiên được công bố trong luận án này là gì?

Luận án lần đầu tiên cung cấp hệ thống số liệu về đặc điểm kiểu gen, tính đa hình di truyền của quần thể P. vivax và tỷ lệ đột biến kháng của P. falciparum đối với 3 loại thuốc sốt rét (pyrimethamin, sulfadoxin, chloroquin) tại hai tỉnh Quảng Bình và Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Trường Sơn.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Trương Văn Hạnh đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu nghiên cứu thông qua việc kết hợp chặt chẽ giữa điều tra dịch tễ thực địa tại 3 tỉnh biên giới Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế và kỹ thuật sinh học phân tử chuyên sâu. Công trình đã làm rõ thành phần loài, chứng minh tính đa hình di truyền cao của các quần thể P. falciparum và P. vivax, đồng thời xác định tỷ lệ đột biến kháng rất cao của P. falciparum đối với pyrimethamin, sulfadoxin và chloroquin giai đoạn 2008-2012. Kết quả của luận án cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn vững chắc, đóng góp quan trọng cho công tác giám sát dịch tễ và lựa chọn phác đồ điều trị hiệu quả trong Chiến lược quốc gia phòng chống và loại trừ bệnh sốt rét tại Việt Nam.