MỞ ĐẦU. Lý do chọn đề tài. Mục đích nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.
Cơ sở khoa học và tính thực tiễn. Những đóng góp của luận văn. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới. Lịch sử loài người qua các nghiên cứu di truyền khảo cổ học.
Loài người tại khu vực Đông Nam Á và Việt Nam qua nghiên cứu di truyền khảo cổ. Các chỉ thị di truyền sử dụng trong nghiên cứu mẫu xương khảo cổ. Ứng dụng công nghệ giải trình tự gen trong nghiên cứu các mẫu khảo cổ. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. Người Việt cổ sinh sống trong giai đoạn hậu thời kỳ đồ đá mới. Người Việt hiện đại. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
Tách chiết DNA ty thể và giải trình tự bằng hệ thống máy Ion S5™ (Thermo Fisher Scientific). Phân tích đánh giá chất lượng giải trình tự của hệ thống Ion S5™ bằng phần mềm FastQC. Map các đoạn đọc (reads) với hệ gen tham chiếu và lọc chất lượng bằng phần mềm bwa, samtools. Ước tính các mẫu bị tổn thương (deamination) và chỉnh lại các file BAM bằng phần mềm mapDamage.
Gọi các biến thể (variants) và tạo ra VCF (Variant Call Format) 22 2. Tạo file consensus và kiểm tra nhiễm với Schmutzi. Xác định nhóm haplogroup bằng HaploGrep2. Dựng cây phát sinh chủng loại thông qua phần mềm MEGA.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Kết quả tách chiết DNA ty thể và giải trình tự bằng hệ thống máy Ion S5™ (Thermo Fisher Scientific). Kết quả tách chiết DNA ty thể. Phân tích đánh giá chất lượng giải trình tự của hệ thống Ion S5™ bằng phần mềm FastQC.
Map các đoạn đọc (reads) với hệ gen tham chiếu và lọc chất lượng bằng phần mềm bwa, samtools. Ước tính các mẫu bị tổn thương (deamination) và chỉnh lại các file BAM bằng phần mềm mapDamage. Gọi các biến thể (variants) và tạo ra VCF (Variant Call Format). Tạo file consensus và kiểm tra nhiễm với Schmutzi.
Xác định nhóm haplogroup bằng HaploGrep2. Dựng cây phát sinh chủng loại thông qua phần mềm MEGA. 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 58 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ.
59 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO. 60 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT STT Tên viết tắt Tên đầy đủ 1 DNA Deoxyribonucleic acid 2 mtDNA Mitochondiral DNA 3 H. sapiens Homo sapiens 4 H. erectus Homo erectus 5 H.
floresiensis Homo floresiensis 6 NST Nhiễm sắc thể 7 NRY Non-recombining portion of the Y chromosome 8 Autosomal STRs Autosomal short tandem repeats 9 SNPs Single nucleotide polymorphisms 10 PCR Polymerase chain reaction 11 GWAS Genome-wide association study 12 AMHs Anatomically modern Homo sapiens 13 TCN Trước công nguyên 14 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 15 AFDIL Armed Forces DNA Identification Laboratory 16 rCRS revised Cambridge Reference Sequence 17 USA United States of America 18 HV1 Hypervariable segment 1 19 VCF Variant Call Format 20 BCF Binary variant call format 21 RSRS Reconstructed Sapiens Reference Sequence vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Một số loại chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu lịch sử loài người .1: Kết quả kiểm tra nồng độ DNA đầu vào sử dụng bộ Quantifiler Trio kit (ThermoFisher, USA) .2: Kết quả định lượng thư viện sau chuẩn bị bằng Ion Library Taqman Quantification kit (ThermoFisher, USA) .3: Chất lượng mỗi trình tự thu được của CCNM24WG và CCNM55WG .4: Thông tin các mẫu được lựa chọn để xây dựng cây phát sinh loài 45 Bảng 3.5: Thông tin các mẫu thuộc hai nhánh xanh dương và đỏ. 53 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mô hình mtDNA ở người.1: Quy trình làm việc của Schmutzi ( Renaud G et al.1: Mẫu xương đùi – K1A06 .3: Mẫu 6 xương dài - K1B05 .4: Mẫu xương dài và các mảnh xương nhỏ K1B10A .7: Các mẫu xương sau khi nghiền mịn.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi miniset PS1 và PS2 trên gel agarose 2%.9: Các thông số của quá trình giải trình tự .10: Chất lượng trình tự của mẫu xương cổ thứ nhất (CCNM24WG) .11: Chất lượng trình tự của mẫu xương cổ thứ hai (CCNM55WG) .12: File đầu ra thu được từ samtools .13: Thông tin tổn thương DNA cổ đại của mẫu CCNM24WG được tạo ra bởi mapDamage 2.14: Thông tin tổn thương DNA cổ đại của mẫu CCNM55WG được tạo ra bởi mapDamage 2.15: Một phần file vcf đầu ra .16: Kết quả chạy schmutzi .17: Cây phát sinh chủng loại của người Việt cổ và người cổ thuộc một số nước trong cùng giai đoạn .18: Cây phát sinh chủng loại của người Việt cổ, người cổ thuộc một số nước trong cùng giai đoạn và người Việt hiện đại. Lý do chọn đề tài Cho đến thời điểm hiện tại, các mẫu xương người khảo cổ chỉ được nghiên cứu về mặt khảo cổ học mà chưa có một nghiên cứu di truyền nào được tiến hành tại Việt Nam.
Con người đã đến định cư tại vùng đất Việt Nam từ lâu đời, dựa trên một số dấu vết của những Homo sp. thì dấu vết của những con người đầu tiên tại Việt Nam đã có từ khoảng nửa triệu năm trước – nửa cuối giai đoạn Pleistocene. Tuy nhiên, sự hạn chế của các bằng chứng khảo cổ học và đặc biệt là các nghiên cứu di truyền chứng minh lịch sử của con người sinh sống tại Việt Nam chưa thể đưa ra những kết luận chắc chắn. Nghiên cứu về quá trình tiến hóa của loài người cần tiến hành dựa trên cả các bằng chứng lịch sử và nghiên cứu về mã di truyền.
Thông tin di truyền thu thập được từ những bộ hài cốt có thể cung cấp bằng chứng về chủng người, nguồn gốc, sự pha trộn của các nền văn hóa trong quá khứ đến hiện đại, từ lối sống của một quần thế, hay là xác định nguyên nhân dẫn đến cái chết của người đó [1, 2]. Mục đích nghiên cứu Phân lập và tách chiết được DNA ty thể (mtDNA) từ mẫu người Việt cổ. Ước đoán được mối liên hệ di truyền giữa người Việt cổ hậu thời kỳ đồ đá mới với người Việt hiện đại cũng như người Việt cổ và một số người cổ thuộc một số nước trong khu vực Đông Nam Á. Nội dung nghiên cứu Tách chiết mtDNA từ mẫu xương cổ đại Giải trình tự mẫu mtDNA thu được Đánh giá chất lượng của trình tự mtDNA thu được Xây dựng cây phân loại theo haplogoup để sa sánh các mẫu của người Việt cổ với người Việt hiện đại cũng như người Việt cổ và một số người cổ khác trong cùng thời đại trong một số nước khu vực Đông Nam Á.
Cơ sở khoa học và tính thực tiễn DNA cổ đại (aDNA) là vật liệu di truyền thu được từ các mẫu vật cổ đại và không giống như DNA hiện đại, trải qua quá trình phân mảnh và các 2 tổn thương sau khi chết chủ yếu do các yếu tố môi trường gây ra [3]. Các nghiên cứu DNA cổ đại, được thực hiện trong 30 năm qua, đã xác nhận rằng trong khi duy trì các quy trình thích hợp, chúng ta có thể khôi phục vật liệu di truyền từ các mẫu vật cổ đại. Cho đến gần đây, phần lớn các nghiên cứu về aDNA của con người chủ yếu tập trung vào DNA ti thể (mtDNA) nhờ thực tế là mtDNA hiện diện trong tế bào với số lượng bản sao cao hơn bộ gen nhân, và do đó nó thường là dấu hiệu di truyền duy nhất có thể thu hồi từ các mẫu bảo quản kém. Do di truyền từ mẹ, tỷ lệ đột biến cao, không có sự tái tổ hợp và sự biến động ở cấp độ quần thể, nó là một công cụ hữu ích để tái tạo lại các sự kiện nhân khẩu học trong quá khứ [4].
Những đóng góp của luận văn Bước đầu tối ưu quy trình tách chiết mtDNA từ mẫu xương có tuổi vài nghìn năm cũng như những mẫu vật có chất lượng rất kém. Bước đầu cung cấp thêm các bằng chứng phân tử về sự tồn tại của người Việt cổ đại cũng như mối quan hệ di truyền của người Việt cổ và người Việt hiện đại cũng như người Việt cổ với người cổ thuộc một số nước Đông Nam Á trong cùng thời đại, nền văn hoá. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1. Lịch sử loài người qua các nghiên cứu di truyền khảo cổ học Homo sapiens là loài duy nhất còn tồn tại thuộc chi Homo, có kiểu hình như người hiện đại đang sinh sống trên Trái Đất hiện nay.
Tuy nhiên, trước khi sự có mặt của tổ tiên gần nhất của loài người hiện đại đơn độc thì trên Trái Đất đã từng tồn tại những người anh em của H. sapiens khác cùng sinh sống. Những người anh em này có hình thái giải phẫu về tỉ lệ kích thước bộ não trên kích thước cơ thể gần tương tự với loài người và sự xuất hiện của công cụ lao động [5]. Dựa trên bằng chứng khảo cổ thì loài người hiện đại đã tiến hóa từ loài người tối cổ từ khoảng hai triệu năm trở về trước.
Trọng tâm của các cuộc tranh luận về nguồn gốc của loài người hiện đại Homo sapiens đó là mô hình, vị trí và thời điểm mà loài người biến đổi từ loài người có hộp sọ lớn thành cấu trúc giải phẫu của người hiện đại. Một số ý kiến đưa ra dựa trên mô hình sự thay thế của người Châu Phi từ thời điểm những tổ tiên Homo sapiens đầu tiên hình thành như một loài mới ở Châu Phi từ khoảng 150 đến 200 nghìn năm về trước, sau đó dần chiếm lĩnh các vùng đất trong thế giới cổ đại, và thay thế các nhóm người khác, trong đó có người Neanderthals. Một số ý kiến khác thì chấp nhận mô hình tiến hóa đa vùng miền – multiregion evolution, sự dịch chuyển từ người cổ đại sang hình thái người hiện đại đã diễn ra trong một làn sóng bành trướng của loài người hiện đại khoảng hai triệu năm trở về trước. Cũng dựa trên mô hình đó nhưng quá trình diễn biến có các dạng khác nhau như sự biến chuyển về hình thái diễn ra đầu tiên ở Châu Phi và sau đó lan rộng ra toàn bộ thế giới cổ đại thông qua hình thức di nhập gen; trong khi đó, một số ý kiến khác thì cho rằng hình thái người hiện đại xuất hiện từ nhiều thời điểm khác nhau, tại nhiều địa điểm khác nhau.
Cho đến năm 1997, việc tách chiết thành công mtDNA từ một mẫu vật Neanderthals thu thập được trong hang Feldhofer tại Đức đã đánh dấu bước ngoặt trong nghiên cứu nguồn gốc loài người, khi mà có thể khai thác thông tin di truyền của các mẫu người khảo cổ chứ không chỉ dựa trên các bằng chứng truyền thống.