Luận án tiến sĩ nghiên cứu hệ gen ty thể đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi họ paragonimidae tại việt nam và một số khu vực châu á

Luận án tiến sĩ nghiên cứu hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và một số khu vực châu Á.

• Tác giả: Nguyễn Thị Khuê
• Người hướng dẫn: Đoàn Thị Thanh Hương
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi Paragonimidae tại Việt Nam và châu Á
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cảm ơn
• Lời cam đoan
• Danh mục các chữ viết tắt
• Danh mục các bảng
• Danh mục các hình
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae
• 1.1.1. Phân loại sán lá phổi họ Paragonimidae
• 1.1.2. Phân bố địa lý sán lá phổi họ Paragonimidae
• 1.1.3. Đặc điểm sinh học sán lá phổi họ Paragonimidae
• 1.1.4. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae trên thế giới
• 1.1.5. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae ở Việt Nam
• 1.2. Giới thiệu ty thể, ribosome của ty thể và hệ gen ty thể
• 1.2.1. Giới thiệu ty thể, nguồn gốc, cấu tạo và chức năng
• 1.2.2. Cấu trúc và sắp xếp gen ở hệ gen ty thể
• 1.2.3. Mitoribosome của ty thể và thành phần cấu tạo
• 1.2.4. Đặc điểm gen học hệ gen ty thể
• 1.3. Cấu trúc đơn vị mã hóa ribosome của hệ gen nhân
• 1.3.1. Cấu trúc ribosome của tế bào
• 1.3.2. Đơn vị mã hóa ribosome của hệ gen nhân tế bào
• 1.3.3. Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử của đơn vị mã hóa ribosome
• 1.3.4. Sự cần thiết nghiên cứu đặc điểm gen hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi Paragonimus
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, mục tiêu, nội dung và địa điểm nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 2.1.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2.1. Nguồn vật liệu là mẫu sán lá phổi nghiên cứu
• 2.2.2. Vật liệu khuôn DNA và các loại mồi sử dụng
• 2.2.3. Hóa chất, sinh phẩm, dụng cụ
• 2.2.4. Trang thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu gen và hệ gen ty thể (mtDNA)
• 2.3.1. Phương pháp xác định cấu trúc và sắp xếp gen ở hệ gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và P.
• 2.3.2. Phương pháp phân tích đặc điểm gen RNA ribosome ty thể (MRG)
• 2.3.3. Phương pháp phân tích đặc điểm gen RNA vận chuyển ty thể (tRNA)
• 2.3.4. Phương pháp phân tích vùng không mã hóa ở hệ gen ty thể
• 2.3.5. Phân tích phương thức sử dụng nucleotide và tính toán giá trị độ lệch (skew/skewness) trong hệ gen ty thể
• 2.3.6. Phương pháp tính khoảng cách di truyền giữa các loài sán lá phổi dựa trên chuỗi nucleotide của hệ gen ty thể
• 2.3.7. Phương pháp phân tích đặc điểm gen mã hóa protein và sự “thiên vị” sử dụng bộ mã
• 2.3.8. Phương pháp phân tích phả hệ dựa trên chỉ thị cộng hợp toàn bộ 12 PCG của mtDNA
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu gen học đơn vị mã hóa ribosome (rTU)
• 2.4.1. Phương pháp xác định cấu trúc và sắp xếp gen ở đơn vị mã hóa ribosome của Paragonimus heterotremus và sán lá phổi châu Á
• 2.4.2. Phương pháp xác định độ dài, đặc điểm gen/vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome
• 2.4.3. Phương pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai gen 18S và 28S rRNA của Paragonimus heterotremus và P.
• 2.4.4. Phương pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai vùng giao gen (ITS-1 và ITS-2) của Paragonimus heterotremus và sán lá phổi châu Á
• 2.4.5. Phương pháp phân tích phương thức sử dụng nucleotide và giá trị độ lệch (“skew”) trong đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á
• 2.4.6. Phương pháp phân tích tương đồng nucleotide của gen 18S+28S rRNA và phần mã hóa ribosome (rTU*) của sán lá phổi họ Paragonimidae
• 2.4.7. Phương pháp xác lập phả hệ dựa trên phân tích chuỗi gen 28S rRNA toàn phần
• 2.4.8. Phương pháp xác lập phả hệ dựa trên phân tích cộng hợp chuỗi gen 18S+28S rRNA toàn phần
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể của sán lá phổi châu Á Paragonimus heterotremus và P. ohirai họ Paragonimidae
• 3.1.1. Cấu trúc và sắp xếp hệ gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus (mẫu Việt Nam) và P.
• 3.1.2. Phân tích đặc điểm và cấu trúc gen RNA ribosome của ty thể (MRG)
• 3.1.3. Phân tích đặc điểm và cấu trúc gen RNA vận chuyển ty thể (tRNA)
• 3.1.4. Phân tích vùng không mã hóa (NCR) ở hệ gen ty thể của P.
• 3.1.5. Phương thức sử dụng nucleotide và giá trị “độ lệch” (skew) trong hệ gen ty thể của P. ohirai và sán lá phổi khác
• 3.1.6. Phân tích đặc điểm gen mã hóa protein và sự “thiên vị” sử dụng bộ mã ở hệ gen ty thể của P. ohirai và sán lá phổi châu Á
• 3.1.7. Khoảng cách di truyền giữa P. heterotremus và các loài sán lá phổi châu Á dựa trên chuỗi nucleotide phần mã hóa của hệ gen ty thể
• 3.1.8. Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu amino acid cộng hợp của 12 PCG
• 3.2. Kết quả nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae
• 3.2.1. Cấu trúc và sắp xếp gen ở đơn vị mã hóa ribosome của các loài sán lá phổi Paragonimus châu Á (P.
• 3.2.2. Độ dài gen rRNA và vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome của các loài sán lá phổi Paragonimus châu Á
• 3.2.3. Đặc điểm cấu trúc gen rRNA (18S và 28S rRNA) của loài P.
• 3.2.4. Đặc điểm cấu trúc vùng giao gen (ITS-1 và ITS-2) của loài P.
• 3.2.5. Kết quả phân tích phương thức sử dụng nucleotide và giá trị “độ lệch” (skew) ở đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á
• 3.2.6. Kết quả phân tích tương đồng nucleotide của các gen rRNA và phần mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae
• 3.2.7. Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu đơn gen 28S rRNA toàn phần
• 3.2.8. Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu cộng hợp gen 18S+28S rRNA toàn phần
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Về nghiên cứu gen/hệ gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai
• 4.1.1. Về thu nhận dữ liệu gen/hệ gen ty thể của Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai
• 4.1.2. Về đặc điểm cấu trúc của gen và hệ gen ty thể sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai
• 4.1.3. Về đặc điểm thành phần gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai
• 4.1.4. Về ứng dụng mtDNA trong nghiên cứu phân loại và phả hệ tiến hóa của sán lá phổi châu Á
• 4.1.5. Về xây dựng cơ sở dữ liệu mtDNA của họ Paragonimidae
• 4.2. Về nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á
• 4.2.1. Về thu nhận dữ liệu gen/vùng giao gen của đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á
• 4.2.2. Về đặc điểm cấu trúc của gen rRNA và vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á
• 4.2.3. Về đặc điểm thành phần gen của đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á
• 4.2.4. Về ứng dụng đơn vị mã hóa ribosome trong nghiên cứu phân tích phả hệ
• 4.2.5. Về xây dựng cơ sở dữ liệu đơn vị mã hóa ribosome của họ Paragonimidae
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH SÁCH CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Hệ gen ty thể và ribosome của sán lá phổi Paragonimidae

Nghiên cứu tập trung vào hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của các loài sán lá phổi thuộc họ Paragonimidae tại Việt Nam và châu Á. Hệ gen ty thể (mtDNA) được phân tích để hiểu rõ cấu trúc, sắp xếp gen và đặc điểm di truyền. Ribosome, đặc biệt là các gen mã hóa ribosome (rRNA), được nghiên cứu để xác định cấu trúc và chức năng trong quá trình tổng hợp protein. Các kết quả từ nghiên cứu này cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho việc phân loại và hiểu biết sâu hơn về bệnh sán lá phổi.

1.1. Đặc điểm hệ gen ty thể

Hệ gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và P. ohirai được phân tích chi tiết. Cấu trúc vòng tròn của mtDNA bao gồm 13 gen mã hóa protein (PCG), 2 gen RNA ribosome (MRG) và 22 gen RNA vận chuyển (tRNA). Các vùng không mã hóa (NCR) cũng được nghiên cứu để hiểu rõ vai trò của chúng trong quá trình sao chép và phiên mã. Phân tích phương thức sử dụng nucleotide và giá trị độ lệch (skew) cung cấp thông tin về sự thiên vị trong sử dụng bộ mã.

1.2. Đơn vị mã hóa ribosome

Đơn vị mã hóa ribosome (rTU) của các loài sán lá phổi được nghiên cứu để xác định cấu trúc và sắp xếp gen. Các gen 18S và 28S rRNA được phân tích để hiểu rõ cấu trúc bậc hai và chức năng của chúng. Vùng giao gen (ITS) cũng được nghiên cứu để xác định sự đa dạng di truyền giữa các loài. Kết quả phân tích tương đồng nucleotide giữa các gen rRNA cung cấp thông tin quan trọng cho việc xây dựng cây phả hệ.

II. Phân tích dịch tễ học và phân loại sán lá phổi

Nghiên cứu cung cấp cái nhìn tổng quan về dịch tễ học sán lá phổi tại Việt Nam và châu Á. Các loài Paragonimus được phân bố rộng rãi tại các khu vực này, gây ra bệnh sán lá phổi ở người và động vật. Phân tích phân loại học dựa trên dữ liệu gen ty thể và ribosome giúp xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra sự đa dạng di truyền giữa các chủng sán lá phổi tại các khu vực khác nhau.

2.1. Dịch tễ học sán lá phổi

Bệnh sán lá phổi là một vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng tại châu Á, đặc biệt là ở các vùng nông thôn và miền núi. Nghiên cứu chỉ ra rằng khoảng 23 triệu người mắc bệnh và 292 triệu người có nguy cơ nhiễm. Các loài Paragonimus phân bố rộng rãi từ Nhật Bản, Hàn Quốc đến Đông Nam Á. Việc hiểu rõ dịch tễ học của bệnh giúp đưa ra các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát hiệu quả.

2.2. Phân loại học dựa trên dữ liệu gen

Phân tích phân loại học dựa trên dữ liệu hệ gen ty thể và ribosome giúp xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài Paragonimus. Kết quả phân tích khoảng cách di truyền và cây phả hệ cho thấy sự đa dạng di truyền giữa các chủng sán lá phổi tại các khu vực khác nhau. Điều này cung cấp cơ sở khoa học cho việc phân loại và nghiên cứu tiến hóa của các loài sán lá phổi.

III. Ứng dụng thực tiễn và giá trị nghiên cứu

Nghiên cứu này có giá trị thực tiễn cao trong việc phòng ngừa và kiểm soát bệnh sán lá phổi. Dữ liệu về hệ gen ty thể và ribosome cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả. Ngoài ra, nghiên cứu cũng góp phần vào việc xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền của các loài Paragonimus, hỗ trợ cho các nghiên cứu trong tương lai về dịch tễ học và phân loại học.

3.1. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Dữ liệu về hệ gen ty thể và ribosome của sán lá phổi có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác. Các chỉ thị phân tử từ nghiên cứu này có thể giúp xác định loài sán lá phổi gây bệnh, từ đó đưa ra các phương pháp điều trị phù hợp. Điều này đặc biệt quan trọng trong việc kiểm soát bệnh sán lá phổi tại các vùng dịch tễ.

3.2. Xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền

Nghiên cứu góp phần vào việc xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền của các loài Paragonimus. Dữ liệu này không chỉ hỗ trợ cho các nghiên cứu hiện tại mà còn là nền tảng cho các nghiên cứu trong tương lai về dịch tễ học, phân loại học và tiến hóa của sán lá phổi. Điều này giúp nâng cao hiểu biết về sự đa dạng và phân bố của các loài sán lá phổi tại Việt Nam và châu Á.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bệnh sán lá phổi (paragonimiasis) do các loài sán lá thuộc họ Paragonimidae (phân bộ Troglotremata, lớp Trematoda, ngành Platyhelminthes) gây ra là một trong những bệnh truyền lây từ động vật sang người (zoonosis) bị lãng quên nghiêm trọng nhất. Theo ước tính dịch tễ học toàn cầu, hiện có khoảng "23 triệu người mắc bệnh, 292 triệu ở nguy cơ nhiễm", tập trung chủ yếu tại các khu vực miền núi, vùng sâu vùng xa thuộc châu Á, châu Phi và châu Mỹ. Tại châu Á, sự đa dạng chủng loài tạo nên các phức hệ loài (species complex) vô cùng phức tạp như phức hệ Paragonimus westermani, P. heterotremus, P. ohirai, P. miyazakii và P. skrjabini. Rào cản học thuật lớn nhất tồn tại nhiều thập kỷ qua là hiện tượng đồng hình thái (morphological cryptic species) ở giai đoạn ấu trùng nang (metacercariae) và trứng, cùng với sự giao thoa di truyền (introgressive hybridization) và biến dị mức bội thể (2n, 3n, 4n), khiến các phương pháp phân loại hình thái học cổ điển hoàn toàn bất khả thi trong việc định danh chính xác tác nhân gây bệnh.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi xuất phát từ sự thiếu hụt trầm trọng cơ sở dữ liệu hệ gen hoàn chỉnh: trước thời điểm nghiên cứu, dữ liệu hệ gen ty thể (mitochondrial genome - mtDNA) và đặc biệt là toàn bộ đơn vị mã hóa ribosome (ribosomal transcription unit - rTU) của lớp Sán lá (Trematoda) chỉ mới thu nhận được ở số lượng rất hạn chế (khoảng 80–90 chủng của 60–70 loài sán lá trong GOBASE/GenBank), hầu như vắng bóng các đại diện hoàn chỉnh thuộc họ Paragonimidae tại Việt Nam và Đông Nam Á.

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Khuê (2022) tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã thiết lập các câu hỏi và giả thuyết khoa học trọng tâm:

1. Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Cấu trúc phân tử, trật tự sắp xếp gen và đặc điểm tiến hóa hệ gen ty thể hoàn chỉnh của loài gây bệnh chủ đạo Paragonimus heterotremus (Việt Nam) và loài mô hình Paragonimus ohirai (Nhật Bản) có đặc trưng phân tử nào khác biệt so với các họ sán lá khác?
2. Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Cấu trúc rTU toàn phần (~7,2–8,6 kb) và cơ chế hình thành các đơn vị lặp liền kề (tandem repeat units - TRU) trong vùng giao gen ITS-1/ITS-2 chi phối như thế nào đến độ dài rTU và giá trị phân loại học của các loài sán lá phổi châu Á?
3. Giả thuyết khoa học 1 (H1): Hệ gen ty thể sán lá phổi họ Paragonimidae tuân thủ cấu trúc bảo tồn 12 gen mã hóa protein (PCG) mất gen atp8, mang các cấu trúc biến dị tRNA cụ thể (mất nhánh DHU hoặc TΨC) và sở hữu vùng không mã hóa (NCR) giàu cấu trúc lặp TRU.
4. Giả thuyết khoa học 2 (H2): Phân tích phát sinh loài đa gen đồng hợp (concatenated dataset) từ 12 PCG ty thể và rTU toàn phần (18S + 28S rRNA) sẽ giải quyết triệt để các xung đột phân loại, tái khẳng định vị trí phân loại độc lập của họ Paragonimidae thuộc phân bộ Troglotremata.

Khung lý thuyết của nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng Thuyết Nội cộng sinh (Endosymbiotic Theory) của Lynn Margulis (1970), Thuyết Tiến hóa phân tử trung tính (Neutral Theory of Molecular Evolution) của Motoo Kimura (1968), và Nguyên lý Phân loại học nhánh học (Phylogenetic Systematics / Cladistics) của Willi Hennig (1966). Quy mô nghiên cứu bao quát các mẫu phân lập thực địa tại các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam (chủng P. heterotremus Lai Châu - LC) và các chủng chuẩn quốc tế tại châu Á (P. ohirai Kino, P. iloktsuenensis Amami, P. miyazakii OkuST1 từ Nhật Bản; P. westermani lưỡng bội 2n Megha từ Ấn Độ; P. westermani tam bội 3n Bogil từ Hàn Quốc). Nghiên cứu mang ý nghĩa đột phá khi cung cấp dữ liệu rTU toàn phần đầu tiên cho 5 loài sán lá phổi châu Á, đóng góp trực tiếp vào ngân hàng gen quốc tế phục vụ chẩn đoán dịch tễ và y học can thiệp.

Literature Review và Positioning

Lịch sử nghiên cứu phân loại họ Paragonimidae ghi nhận sự chuyển dịch sâu sắc từ hình thái học sang sinh học phân tử. Giai đoạn đầu thế kỷ 20, các nhà giun sán học chủ yếu dựa vào cấu trúc phân nhánh tinh hoàn, buồng trứng và tỷ lệ kích thước giác miệng/giác bụng của sán trưởng thành theo phân loại học cổ điển (Miyazaki, 1974; Chen, 1962). Tuy nhiên, các tranh luận học thuật gay gắt liên tục nổ ra:

• Tranh luận 1 (Vị trí phân loại họ và phân bộ): Một trường phái phân loại duy trì quan điểm xếp giống Paragonimus nằm trong họ Troglotrematidae thuộc phân bộ Xiphidiata (La Rue, 1957). Ngược lại, trường phái hiện đại (Schell, 1980; Blair et al., 1999) đề xuất tách biệt thành họ độc lập Paragonimidae Dollfus, 1939 thuộc phân bộ Troglotremata Schell, 1980 cùng với các họ Collyriclidae, Nanophyetidae và Troglotrematidae.
• Tranh luận 2 (Định vị loài và tính hợp lệ của phân loài): Tranh cãi giữa việc công nhận P. sadoensis hay P. microrchis là các loài độc lập hay chỉ là đồng danh (synonyms) của P. ohirai; hay vị trí phân loại của P. miyazakii là loài riêng biệt hay chỉ là phân loài P. skrjabini miyazakii (Blair et al., 2005; Cui et al., 2003).

So sánh với các công trình quốc tế tiêu biểu:

1. Nghiên cứu của Blair et al. (1997, 1999) và Agatsuma et al. (2005) đã sử dụng các đoạn gen ngắn như cox1, nad1 hoặc một phần đoạn cắt ITS-2 để nghiên cứu phát sinh chủng loại. Tuy nhiên, các chỉ thị đoạn ngắn bộc lộ hạn chế lớn do thiếu độ phân giải phân tử đối với các nhánh tiến hóa sâu và không thể hiện được biến dị cấu trúc bậc hai của toàn bộ cụm rTU.
2. Công trình giải trình tự hệ gen ty thể Paragonimus kellicotti tại Bắc Mỹ (GenBank: HQ900670) của Mitreva et al. chỉ dừng lại ở phạm vi một loài đơn lẻ vùng Tân nhiệt đới/Tân Bắc cực, chưa phản ánh được tính đa dạng và bức xạ thích nghi phong phú của các phức hệ sán lá phổi châu Á.

Luận án này định vị chính xác vào khoảng trống phân tử đó bằng việc tích hợp giải trình tự hệ gen ty thể hoàn chỉnh kết hợp giải mã toàn phần đơn vị rTU đa gen (18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S). Đây là bước tiến nhảy vọt giúp chuẩn hóa cây phả hệ phân tử của họ Paragonimidae trên bình diện quốc tế.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và kiểm chứng thực nghiệm Thuyết Tiến hóa Đồng bộ (Concerted Evolution Theory) của Dover (1982) và Zimmer et al. (1980) trên hệ thống gen nhân đa bản sao rDNA của ký sinh trùng. Nghiên cứu chứng minh rằng dù các đơn vị rTU tồn tại hàng trăm bản sao trong operon nhân, các đột biến điểm trong gen chức năng (18S, 28S, 5.8S rRNA) được đồng nhất hóa thông qua cơ chế sửa đổi gen không tương hỗ (unequal crossing-over và gene conversion), trong khi vùng giao gen ITS-1 chịu áp lực chọn lọc lỏng lẻo, tạo điều kiện cho các đơn vị lặp TRU tích lũy biến dị chiều dài.

Đồng thời, nghiên cứu củng cố Thuyết Tiến hóa Hệ gen Ty thể Động vật (Avise, 2000), khẳng định quy luật rút gọn hệ gen (genomic compaction) đặc trưng của ngành Platyhelminthes: hoàn toàn tiêu biến gen atp8, các gen mã hóa protein có hiện tượng gối chồng nucleotide (overlapping) lên nhau từ vài base đến 40 nucleotide (như giữa cặp gen nad4L và nad4), loại bỏ hoàn toàn các đoạn intron và hình thành các bộ mã kết thúc không hoàn chỉnh (T/TA) được bổ sung đuôi poly(A) sau phiên mã.

Mô hình Đơn vị rTU Hoàn chỉnh của Họ Paragonimidae:
5'- [IGS] - [ETS] - [18S (~2,0 kb)] - [ITS-1 (chứa 4,7-15,7 TRU)] - [5.8S (158 bp)] - [ITS-2] - [28S (~3,8 kb)] - [IGS] -3'

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp đa tầng dữ liệu phân tử sinh hóa (Multi-layer Biochemical Framework):

1. Phân tích Cấu trúc bậc một (Sequence-level Analysis): Xác định thành phần nucleotide, tính toán độ lệch AT-skew [(A-T)/(A+T)] và GC-skew [(G-C)/(G+C)], tần suất sử dụng bộ mã (Relative Synonymous Codon Usage - RSCU).
2. Phân tích Cấu trúc bậc hai (Secondary Structure Modeling): Dựa trên nguyên lý nhiệt động lực học năng lượng tự do tối thiểu (Minimum Free Energy - MFE) của Tinoco và Zuker, mô phỏng cấu trúc lá sồi biến đổi của 22 tRNA ty thể (phát hiện cơ chế bù trừ DHU-replacement loop hoặc TV-replacement loop) và mô hình cuộn gập các nhánh kẹp tóc (stem-loop) của rRNA 18S, 28S, ITS-1, ITS-2.
3. Phân tích Phát sinh loài Tích hợp (Phylogenomic Integration): Phân tích ma trận cộng hợp 12 protein ty thể (PCG dataset) và ma trận cộng hợp 18S + 28S rRNA (~5,8 kb) để loại bỏ các sai số hệ thống do hiện tượng hút nhánh dài (long-branch attraction).

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu vận dụng triết lý thực chứng khoa học (positivism paradigm) với quy trình định lượng sinh học phân tử chặt chẽ. Thiết kế nghiên cứu đa cấp độ (multi-level design) kết hợp giải phẫu hình thái học giun sán (helminthology) với công nghệ gen thế hệ cao.

Đối tượng nghiên cứu chính xác:

• Chủng P. heterotremus phân lập từ ấu trùng metacercariae trên cua suối đá thuộc giống Potamiscus tại tỉnh Lai Châu (Việt Nam) và nuôi gây nhiễm thực nghiệm trên động vật để thu sán trưởng thành.
• Chủng P. ohirai Kino phân lập từ cua Chiromantes dehaani tại Nhật Bản.
• Các mẫu so sánh chuẩn độ dài rTU: P. iloktsuenensis (Amami, Nhật Bản), P. miyazakii (OkuST1, Nhật Bản), P. westermani 2n (Meghalaya, Ấn Độ), P. westermani 3n (Bogil, Hàn Quốc).

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình kỹ thuật được chuẩn hóa cao độ nhằm đảm bảo tính lặp lại (replicability):

1. Tách chiết và tinh sạch DNA: Sử dụng kit tách chiết mô mô hạt DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ bằng quang phổ kế NanoDrop và điện di gel agarose 1%.
2. Kỹ thuật PCR khuếch đại phân đoạn lớn (Long-PCR / LPCR): Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa trên các vùng bảo tồn và enzyme chịu nhiệt có hoạt tính đọc sửa cao (High-Fidelity DNA Polymerase: LA Taq / Phusion Polymerase) để nhân bản các đoạn DNA ty thể dài từ 3–5 kb và toàn bộ cụm rTU dài từ 7,5–9,0 kb.
3. Giải trình tự và đối chiếu chéo (Sequencing Protocols): Thực hiện giải trình tự Sanger hai chiều trên hệ thống máy đọc tự động ABI 3500/3730xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) sử dụng hóa chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Đối với các vùng khó đọc như cụm lặp TRU, sử dụng chiến lược giải trình tự bước bộ (primer walking) kết hợp nhân dòng phân tử (cloning) vào vector pGEM-T Easy để kiểm chứng chính xác từng nucleotide.
4. Chuẩn hóa độ tin cậy và kiểm định hợp lý: Phân tích độ lệch chuẩn, kiểm soát âm tính (negative controls) trong mọi phản ứng PCR, kiểm tra sự đồng nhất chuỗi qua các lần giải lặp lại độc lập.

Data và phân tích

• Phân tích chuỗi và chỉnh tổ hợp: Sử dụng các phần mềm chuyên dụng CLUSTAL X v2.0, BioEdit v7.2, Geneious Pro để căn chỉnh đa chuỗi (multiple sequence alignment).
• Phân tích sinh hóa bộ mã: Phần mềm MEGA X và DnaSP v6.0 dùng để tính toán thành phần nucleotide, độ sai khác di truyền (p-distance, Kimura 2-parameter), chỉ số RSCU và độ lệch AT/GC skew.
• Mô hình hóa cấu trúc thứ cấp: Sử dụng phần mềm RNAstructure v6.2 và thuật toán mfold để xác lập mô hình năng lượng tự do cực tiểu ($\Delta G$, kcal/mol) cho 22 phân tử tRNA, 12S/16S rRNA và các vùng ITS.
• Tái dựng cây phát sinh loài (Phylogenetic Inference):
  • Phương pháp Xác suất Cực đại (Maximum Likelihood - ML) trên phần mềm IQ-TREE / RAxML với chuẩn kiểm định bootstrap 1.000 lần lặp.
  • Phương pháp Suy luận Bayes (Bayesian Inference - BI) trên phần mềm MrBayes v3.2, chạy 4 chuỗi Markov Chain Monte Carlo (MCMC) qua 5.000.000 thế hệ, lấy mẫu mỗi 100 thế hệ, loại bỏ 25% giá trị burn-in ban đầu để tính giá trị xác suất hậu định (posterior probabilities - PP).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Giải mã hoàn chỉnh hệ gen ty thể P. heterotremus (15.244 bp) và P. ohirai (14.818 bp): Hệ gen ty thể của P. heterotremus (mẫu Việt Nam) và P. ohirai (KX756277) đều có cấu trúc vòng khép kín điển hình, bao gồm 12 PCG (cox1-3, nad1-6, nad4L, cob, atp6), 2 gen RNA ribosome (rrnS và rrnL), 22 gen tRNA và 1 vùng không mã hóa chính (NCR). Tỷ lệ A+T trong toàn bộ hệ gen dao động mạnh từ 61,5% đến 68,2%, mang giá trị AT-skew âm sâu trên chuỗi mã hóa, phản ánh áp lực đột biến nghiêng về Thymine (T) đặc trưng cho giun sán ký sinh.

2. Khám phá cơ chế biến dị độ dài rTU do đơn vị lặp TRU: Lần đầu tiên trên thế giới, cấu trúc toàn phần của rTU ở 5 loài sán lá phổi châu Á được giải mã chi tiết, chỉ ra sự biến thiên kích thước tổng chiều dài rTU từ 6.419 bp đến 8.616 bp:

   • Paragonimus heterotremus (Lai Châu, VN): 7.661 bp (vùng ITS-1 chứa 7,7 đơn vị lặp TRU).
   • Paragonimus ohirai (Kino, JP): 7.422 bp (vùng ITS-1 chứa 5,7 đơn vị lặp TRU).
   • Paragonimus iloktsuenensis (Amami, JP): 7.543 bp (vùng ITS-1 chứa 6,7 đơn vị lặp TRU).
   • Paragonimus miyazakii (OkuST1, JP): 6.419 bp.
   • Paragonimus westermani 2n (Meghalaya, Ấn Độ): 8.616 bp (vùng ITS-1 chứa tới 15,7 đơn vị lặp TRU - kích thước dài nhất được ghi nhận ở họ Paragonimidae).
   • Paragonimus westermani 3n (Bogil, Hàn Quốc): 7.292 bp (vùng ITS-1 chứa 4,7 đơn vị lặp TRU).

3. Tính bảo tồn nghiêm ngặt của gen 18S rRNA và 28S rRNA toàn phần: Độ dài gen 18S rRNA của họ Paragonimidae đạt mức bảo tồn tuyệt đối ở 1.989 bp; gen 28S rRNA đạt chiều dài từ 3.826–3.834 bp; gen 5.8S rRNA ổn định ở 158 bp. Sự tương đồng nucleotide giữa các loài trong họ đạt >98,5% ở 18S rRNA và >94,2% ở 28S rRNA, chứng minh đây là các mốc phân tử tối ưu cho phân loại cấp họ/bộ, trong khi vùng ITS-1 đóng vai trò chỉ thị phân biệt chủng/loài và mức bội thể.

4. Đặc điểm bất thường của hệ thống tRNA ty thể: Trong số 22 gen tRNA của P. heterotremus và P. ohirai, hầu hết các tRNA mất cấu trúc cánh tay DHU (thay thế bằng DHU-replacement loop) hoặc mất cánh tay TΨC (như ở tRNASer), tạo nên cấu trúc bậc hai nhỏ gọn chỉ từ 55–68 nucleotide mà vẫn duy trì chức năng bắt cặp codon-anticodon chính xác.

5. Giải quyết phân loại phát sinh chủng loại bằng phân tích cộng hợp đa gen: Cây phả hệ dựa trên 12 PCG ty thể và ma trận cộng hợp 18S + 28S rRNA (~5,8 kb) với giá trị ủng hộ tuyệt đối (Bootstrap = 100%, PP = 1.0) đã bác bỏ triệt để quan điểm sáp nhập họ Paragonimidae vào Troglotrematidae, khẳng định họ Paragonimidae là một nhánh đơn phát sinh (monophyletic clade) độc lập thuộc phân bộ Troglotremata.

Loài / Chủng sán lá phổi	Độ dài rTU toàn phần (bp)	Số lượng đơn vị lặp (TRU) tại ITS-1	Độ dài gen 18S rRNA (bp)	Độ dài gen 28S rRNA (bp)	Tỷ lệ A+T rTU* (%)
P. heterotremus (LC-VN)	7.661	7,7 TRU	1.989	3.828	49,82
P. ohirai (Kino-JP)	7.422	5,7 TRU	1.989	3.826	49,45
P. iloktsuenensis (Amami-JP)	7.543	6,7 TRU	1.989	3.830	49,60
P. miyazakii (OkuST1-JP)	6.419	Biến dị	1.989	3.832	49,15
P. westermani 2n (Megha-IN)	8.616	15,7 TRU	1.989	3.834	50,12
P. westermani 3n (Bogil-KR)	7.292	4,7 TRU	1.989	3.829	49,78

Implications đa chiều

• Ý nghĩa lý thuyết: Cung cấp bằng chứng phân tử vững chắc cho mô hình tiến hóa cytonuclear (tương tác nhân - ty thể) ở động vật ký sinh bậc thấp; làm sáng tỏ quy luật tích lũy cấu trúc lặp TRU trong quá trình hình thành loài.
• Đổi mới phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình Long-PCR kết hợp giải trình tự trực tiếp (direct amplicon sequencing) cho các đoạn gen giàu cấu trúc lặp bậc cao, mở ra hướng ứng dụng cho các họ ký sinh trùng khác (Fasciolidae, Opisthorchiidae, Schistosomatidae).
• Ứng dụng thực tiễn y tế: Thiết kế các mồi chẩn đoán phân tử chuyên biệt (Species-specific Diagnostic PCR kits) nhắm trúng vùng TRU của ITS-1 hoặc cox1, cho phép phát hiện sớm trứng sán trong đờm, phân hoặc dịch màng phổi mà không bị nhầm lẫn với bệnh lao phổi (tuberculosis) hoặc u phổi.
• Chính sách y tế công cộng: Định hình bản đồ dịch tễ phân tử tại vùng Tây Bắc và Bắc Trung Bộ Việt Nam, cung cấp cơ sở khoa học để Cục Y tế Dự phòng triển khai chương trình can thiệp hành vi ăn uống (chống ăn gỏi cua, cua đá nướng chưa chín) tại các cộng đồng thiểu số.

Limitations và Future Research

1. Giới hạn mẫu địa lý: Dù bao quát các chủng đại diện châu Á, nghiên cứu chưa thu thập được các mẫu sán lá phổi từ châu Phi (P. africanus, P. uterobilateralis) và Nam Mỹ (P. mexicanus) để phân tích toàn cầu hóa hệ gen họ Paragonimidae.
2. Độ phân giải biến dị cá thể trong quần thể: Nghiên cứu tập trung giải mã hệ gen chuẩn của các chủng đại diện mà chưa mở rộng phân tích sâu về tính đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) ở quy mô hàng nghìn cá thể trong cùng ổ dịch.
3. Dữ liệu phiên mã chức năng (Transcriptomics): Chưa tích hợp dữ liệu RNA-Seq để định lượng mức độ biểu hiện gen của các enzyme chuyển hóa năng lượng ty thể trong các giai đoạn phát triển khác nhau (metacercariae vs. sán trưởng thành).

Hướng nghiên cứu ưu tiên:

• Ứng dụng giải trình tự thế hệ mới (NGS - Illumina/PacBio) để giải mã toàn bộ hệ gen nhân (nuclear genome) kích thước lớn của P. heterotremus.
• Thiết lập công nghệ mito-metagenomics và mito-barcoding môi trường (eDNA) từ mẫu nước suối nhằm tầm soát tự động vật chủ trung gian (ốc và cua) nhiễm ấu trùng tại thực địa.
• Nghiên cứu cơ chế phân tử điều hòa miễn dịch của các protein bài tiết/tiết (Excretory/Secretory Products - ESPs) từ sán lá phổi nhằm phát triển vắc-xin phòng ngừa.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Dữ liệu trình tự nucleotide hoàn chỉnh đăng ký trên NCBI GenBank (điển hình như P. ohirai KX756277 và rTU của P. heterotremus) trở thành chuỗi quy chiếu chuẩn quốc tế, dự kiến thu hút trích dẫn cao trong các nghiên cứu phân loại học, tiến hóa học và y sinh học nhiệt đới.
• Chuyển đổi y tế dự phòng: Cung cấp công cụ vàng cho các Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng (NIMPE) trên toàn quốc thực hiện giám định loài nhanh chóng, chính xác trong các vụ bùng phát dịch cục bộ.
• Lợi ích kinh tế - xã hội: Giảm thiểu chi phí chẩn đoán sai và điều trị nhầm lẫn cho hàng nghìn bệnh nhân nghèo vùng cao bị chẩn đoán nhầm lao phổi kháng thuốc; giảm thiểu tổn thất ngày công lao động do biến chứng áp xe phổi và ký sinh lạc chỗ ở não.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Giới học thuật: Tiếp cận bộ dữ liệu hệ gen và quy trình phân tích tin sinh học chuẩn mực để kế thừa, mở rộng nghiên cứu sang các lớp ký sinh trùng khác.
• Ngành R&D Dược & Thiết bị Y tế: Sử dụng các trình tự đặc hiệu (TRU, cox1) để thương mại hóa các bộ kit Real-time PCR, LAMP-PCR chẩn đoán tại điểm chăm sóc (Point-of-Care Testing - POCT).
• Nhà hoạch định chính sách & Bác sĩ lâm sàng: Có được phác đồ dịch tễ và hướng dẫn chẩn đoán phân biệt chính xác giữa bệnh paragonimiasis và các bệnh lý hô hấp mãn tính khác.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Đó là việc mở rộng Thuyết Tiến hóa Đồng bộ (Concerted Evolution Theory) trên hệ thống rTU nhân của ký sinh trùng, chứng minh tính phân hóa chức năng rõ rệt: sự bảo tồn tuyệt đối của các gen cấu trúc 18S (1.989 bp) và 28S (~3,8 kb) đối lập hoàn toàn với tính đa hình cấu trúc bậc cao của vùng ITS-1 do tích lũy các đơn vị lặp TRU (từ 4,7 đến 15,7 TRU).

2. Đột phá phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây thế nào? Khác biệt với nghiên cứu của Blair et al. (1999) và Iwagami et al. (2000) vốn chỉ dùng các đoạn PCR ngắn rời rạc (<1 kb), luận án đã thiết lập quy trình Long-PCR nhân bản và giải trình tự trọn vẹn toàn bộ đơn vị rTU (~7,2–8,6 kb) và mtDNA hoàn chỉnh (~15 kb), kết hợp mô phỏng cấu trúc bậc hai MFE để chuẩn hóa phát sinh loài.

3. Phát hiện bất ngờ nhất với bằng chứng dữ liệu là gì? Phát hiện chủng P. westermani 2n tại Ấn Độ sở hữu rTU dài tới 8.616 bp chứa tới 15,7 đơn vị lặp TRU ở ITS-1, trong khi chủng tam bội 3n tại Hàn Quốc chỉ dài 7.292 bp với 4,7 TRU. Điều này chứng minh số lượng TRU ở ITS-1 không tương quan thuận với mức bội thể (ploidy) mà phản ánh sự phân kỳ địa lý và lịch sử tiến hóa độc lập của từng chủng.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập (replication protocol) đầy đủ không? Có. Luận án mô tả chi tiết danh mục mồi khuếch đại, chu trình nhiệt PCR cho từng đoạn phân tử lớn, nồng độ hóa chất, vector tạo dòng (pGEM-T Easy) và các tham số chạy mô hình phân tích Bayes/ML trong MrBayes và IQ-TREE.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình như thế nào? Tập trung vào 3 trụ cột: (i) Giải mã toàn bộ hệ gen nhân (Nuclear Whole Genome) của P. heterotremus; (ii) Ứng dụng chip sinh học eDNA tầm soát ổ dịch tự nhiên; (iii) Phát triển kháng thể đơn dòng và thuốc ức chế chọn lọc chuỗi chuyển điện tử ty thể của sán lá phổi.

Kết luận

1. Hoàn thành giải mã và phân tích cấu trúc hệ gen ty thể hoàn chỉnh của P. heterotremus (15.244 bp) tại Việt Nam và P. ohirai (14.818 bp) tại Nhật Bản, làm sáng tỏ cơ chế sắp xếp 12 PCG, 2 gen rRNA và 22 gen tRNA khuyết thiếu nhánh.
2. Thiết lập cơ sở dữ liệu rTU toàn phần đầu tiên trên thế giới cho 5 loài sán lá phổi châu Á (P. heterotremus, P. ohirai, P. iloktsuenensis, P. miyazakii, P. westermani), phát hiện cơ chế biến động kích thước rTU (6.419–8.616 bp) do các đơn vị lặp TRU tại vùng giao gen ITS-1.
3. Chứng minh tính bảo tồn cấu trúc tuyệt đối của gen 18S rRNA (1.989 bp) và 28S rRNA (~3,8 kb), cung cấp thước đo phân tử chuẩn mực cho nghiên cứu tiến hóa giun sán.
4. Xây dựng cây phát sinh loài hoàn chỉnh bằng dữ liệu cộng hợp 12 PCG ty thể và 18S + 28S rRNA, giải quyết dứt điểm các tranh cãi phân loại, khẳng định vị trí độc lập của họ Paragonimidae thuộc phân bộ Troglotremata.
5. Cung cấp bộ công cụ chỉ thị phân tử đặc hiệu phục vụ chẩn đoán phân biệt chính xác bệnh sán lá phổi tại Việt Nam và các nước lưu hành dịch, đóng góp nền tảng thiết yếu cho công tác bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae 1. Phân loại sán lá phổi họ Paragonimidae Giống Paragonimus, họ Paragonimidae, thuộc phân bộ Troglotremata (Platyhelminthes: Trematoda), bao gồm nhiều loài SLP có vai trò dịch tễ quan trọng tạo nên vòng lây nhiễm và bệnh lý đặc trưng ở người và động vật [1]. Cho đến gần đây, xác định phân bộ (suborder) và họ (family) của sán lá phổi mới có được sự nhất trí dùng tên phân bộ là Troglotremata đang được thống nhất hiện nay thay vì tên phân bộ là Xiphidiata trước đây.

Tương tự, trước đây Paragonimus chỉ là một giống trong họ Troglotrematidae, nay được tách riêng khỏi họ này trở thành một họ Paragonimidae độc lập (http://ddbj.jp/tx_search/27871?depth=4) [2, 3]. Phân bộ Troglotremata chính thức hiện nay gồm các họ Collyriclidae, họ Nanophyetidae, họ Troglotrematidae và họ Paragonimidae. Giống Paragonimus (trước đây) và nay là họ Paragonimidae bao gồm các loài: Paragonimus africanus; P. Phân bộ Troglotremata có đến 93 đăng ký loài tại cơ sở dữ liệu UniProt, trong đó ngoài loài chủ yếu, còn có một số loài đồng danh (synonym) và một số loài chưa được phân định cấp loài một cách chính xác (https://www.

Phân loại SLP gặp phải một số khó khăn do có sự đa dạng rất cao các chủng của cùng một loài trong một phức hệ, giữa các quần thể và cả về hình thái ấu trùng metacercaria, về di truyền, sinh học và khả năng gây bệnh [1, 4]. Phân tích SHPT đã khẳng định một số loài là đồng danh, ví dụ, P. sadoensis là đồng danh của loài P. microrchis là đồng danh của P.

Một số loài trở thành phân loài, như P. miyazakii được xếp là phân loài P. skrjabini miyazakii, nhưng chưa chính thức. Theo Tóm tắt phân loại có trong Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia ở Mỹ (NCBI) thì hệ thống phân loại của họ Paragonimidae và các giống 4 của chúng (NCBI: Taxonomy: http://www.gov/Taxonomy/) được sắp xếp phân cấp theo Dòng phân loại (lineage), như sau: Tóm tắt Dòng phân loại (lineage): cellular organisms; Eukaryota; Opisthokonta; Metazoa; Eumetazoa; Bilateria; Protostomia; Spiralia; Lophotrochozoa; Platyhelminthes; Trematoda; Digenea; Plagiorchiida; Troglotremata; Paragonimidae; (Paragonimus) (Hình 1.

Sắp xếp dòng phân loại của họ Paragonimidae và các giống trong họ này theo Hệ thống thông tin phân loại tích hợp (ITIS). Nguồn: (https://www. Phân Bộ Troglotremata Schell, 1980 bao gồm họ Collyriclidae Ward, 1917, họ Nanophyetidae (Dollfus, 1939), họ Paragonimidae Dollfus, 1939 và họ Troglotrematidae, Odhner, 1914; trong đó họ Paragonimidae gồm các loài chủ yếu gây bệnh sán lá phổi (paragonimiasis) do các loài Paragonimus spp. Theo Hệ thống thông tin phân loại tích hợp (ITIS, Integrated Taxonomic Information System)/ https://www.gov/), cấp bậc phân loại, vị trí các loài và các giống trong họ Paragonimidae, cũng như sắp xếp của họ Paragonimidae với các họ khác trong ngành Sán dẹt được phân cấp như sau: Giới (Kingdom): Động vật (Animalia) Phân Giới: Bilateria Hạ Giới (Infrakingdom): Protostomia Trên Ngành (Superphylum): Platyzoa Ngành Phylum): Sán dẹt (Platyhelminthes Minot, 1876) Dưới Ngành (Subphylum): Neodermata Ehlers, 1985 Lớp (Class): Sán lá (Trematoda, Rudolphi, 1808) Dưới Lớp (Subclass): Digenea, Carus, 1863 Bộ (Order): Plagiorchiida La Rue, 1957 5 Phân Bộ (Suborder): Troglotremata Schell, 1980 Họ (Family): Paragonimidae Dollfus, 1939 Giống (Genus): Paragonimus, Braun, 1899 Loài (Species): Paragonimus heterotremus Chen et Hsia, 1964 Loài (Species): Paragonimus ohirai Miyazaki, 1939 Loài (Species): Paragonimus iloktsuenensis Chen, 1940 Loài: Paragonimus miyazakii Kamo, Nishida, Hatsushika, et Tomimura, 1961 Loài: Paragonimus westermani Kerbert, 1878 Loài: Paragonimus kellicotti Ward, 1908 Loài: Paragonimus mexicanus Miyazaki et Ishii, 1968 … 1.

Phân bố địa lý sán lá phổi họ Paragonimidae Các loài SLP gây bệnh ở người được phân vào các phức hệ chính, gồm: i) Phức hệ P. westermani; ii) Phức hệ P. heterotremus; iii) Phức hệ P. ohirai; iv) Phức hệ P.

miyazakii; v) Phức hệ P. skrjabini và một số phức hệ nhỏ khác; và mỗi một phức hệ có nhiều genotype và có thể còn có nhiều biến chủng khác nhau ở mỗi loài đang được khám phá [5–9]. Sán lá phối cũng đã được chia làm các nhóm theo phân bố địa lý và do mỗi nhóm địa lý có các loài có đặc điểm dịch tễ và tiến triển gây bệnh tương đối giống nhau, nên SLP cũng được phân vào các nhóm là: nhóm SLP châu Á; nhóm SLP châu Phi và nhóm SLP châu Mỹ [6, 8, 10, 11]. Phân bố các loài sán lá phổi ở các nước châu Á Loài Đồng danh Phân bố địa lý 1 P.

bangkokensis (Miyazaki and Thái Lan, Trung Quốc, Lào, Vajrasthira, 1967) Việt Nam 2 P. cheni (Hu, 1963) Trung Quốc 3 P. compactus (Cobbold, 1859) Ấn Độ, Sri Lanka 4 P. harinasutai (Miyazaki and Thái Lan, Trung Quốc, Lào, Vajrasthira, 1968) Việt Nam 6 P.

heterorchis (Zhou et al. heterotremus (Chen and Hsia, P. tuanshanensis (Chung et al., 1964) Trung Quốc, Thái Lan, Lào, 1964) Việt Nam 8 P. jiangsuensis (Cao et al.

macrorchis (Chen, 1962) Trung Quốc, Sri Lanka, Thái Lan 10 P. microchis (Hsia et al. mungoi (Mishra et al. sadoensis (Miyazaki et al., 1968), Nhật, Trung Quốc, Hàn P.

iloktsuenensis (Chen, 1940) Quốc, Đài Loan 14 P. paishuihoensis (Tsao and P. divergens (Liu et al., 1980) Trung Quốc, Lào, Thái Lan Chung, 1965) 15 P. proliferus (Hsia and Chen, P.

menglaensis (Chung et al., 1964), Trung Quốc, Việt Nam 1964) P. hokuoensis (Ho et al. hueitungensis (Chung et al., 1975), Trung Quốc, Nhật Bản, P. miyazakii (Kamo et al.

Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam szechuanensis (Chung and Tsao, 1962), P. taipingini (Kurochkin, 1987) Trung Quốc 20 P. Ấn Độ, Pakistan, Nepal, edwardsi (Gulati, 1926), P. filipinus Thái Lan, Philippin, (Miyazaki, 1978), Indonesia, Papua New P.

Guinea, Myanmar, Việt philippinensis (Ito et al. Nam, Campuchia, Lào, Hàn pulmonalis (Baelz, 1880), P. ringeri Quốc, Trung Quốc, Nhật (Cobbold, 1880) Bản, Đài Loan, Vùng viễn đông nước Nga 21 P. xiangshanensis (He et al.

yunnanensis (Ho et al. vietnamensis (Doanh et al. pseudoheterotremus Thái Lan (Waikagul, 2007) 25 P. sheni (Shan, Lin et al.) Trung Quốc Ghi chú: Theo tài liệu [4] và [12].

Phân bố các loài sán lá phổi ghi nhận gây nhiễm trên người ở châu Á Quốc gia ghi nhận gây Loài Phân bố địa lý nhiễm trên người 1 P. westermani Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Loan, Trung Quốc, Thái Myanmar, Lào, Campuchia, Lan, Philippin, Ấn Độ Indonesia, Nepal, Pakistan, Papua New Guinea, Malaysia, Philippin, Sri Lanka, Ấn Độ 2 P. heterotremus Ấn Độ, Thái Lan, Việt Nam, Lào, Ấn Độ, Thái Lan, Việt Myanmar, Nam Trung Quốc Nam, Lào, Trung Quốc (phía Nam) 3 P. Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Trung Quốc miyazakii Việt Nam, Ấn Độ Ghi chú: Theo [12].

Các loài Paragonimus spp. của châu Á có nhiều biến chủng khác nhau nằm trong các quần thể có đa dạng di truyền phức tạp, phân bố từ Nhật Bản, Hàn Quốc, dọc theo Bắc và Đông-Nam Trung Quốc, vùng Tây-Bắc và miền Trung Việt Nam, 7 Myanmar, Lào, Thái Lan, Philippin, Bangladesh, Ấn Độ, Sri Lanka và chủ yếu tập trung trong một số phức hệ chính nói trên (Bảng 1. Các loài Paragonimus spp. của châu Mỹ (P.

mexicanus) phân bố chủ yếu ở Canada, Mỹ và Mexico; các loài SLP châu Phi ở các vùng hạ sa mạc Sahara [10, 21]. Đặc điểm sinh học sán lá phổi họ Paragonimidae 1. Hình thái, cấu tạo của sán lá phổi Giống như sán lá nói chung, SLP họ Paragonimidae có cấu tạo mặt dẹt, dạng hình lá, lỗ sinh dục mở ở mặt bụng. Metacercaria (ấu trùng nang) sán lá phổi (Hình 1.2A) Metacercaria là giai đoạn ấu trùng ở VCTG thứ hai.

Đặc điểm metacercaria SLP là ruột uốn lượn và túi bài tiết lớn chứa đầy hạt glycogen (Hình 1. Metacercaria có hình bầu dục, màu vàng nâu sẫm. Về kích thước, metacercaria chia thành 3 nhóm: kích thước lớn (như P. harinasutai…), kích thước trung bình (P.

bangkokensis…) và kích thước nhỏ (P. Metacercaria của cùng một loài SLP dao động đáng kể, điển hình là sự đa dạng của loài P. Cercaria (ấu trùng đuôi) sán lá phổi (Hình 1.2B) Cercaria là giai đoạn ấu trùng ở VCTG thứ nhất. Cercaria của các loài SLP thuộc nhóm microcercaria, với đặc trưng có stylet ở phần đầu và đuôi ngắn [22].

Cercaria của các loài trong giống Paragonimus rất giống nhau về hình thái và kích thước, nên khó có thể phân biệt chúng ở cấp độ loài. Hiện nay chưa có nhiều số liệu về ấu trùng cercaria của các loài SLP [1]. Các dạnh trưởng thành của sán lá phổi Paragonimus. Hình dạng metacercaria [22]; B.

Hình dạng cercaria [23]; C. Hình dạng trứng [22]. 8 Trứng sán lá phổi (Hình 1.2C) Trứng SLP có hình dạng không đối xứng, một đầu to và một đầu nhỏ, đầu to có nắp, kích thước trung bình dài 80–120 µm, rộng 50–70 µm (Hình 1. Mặc dù có sự khác nhau về kích thước trứng giữa các loài, nhưng rất khó để phân biệt trứng giữa các loài SLP bằng kiểm tra hình thái học [4, 22].

Hiện nay, trứng SLP cũng được định loại bằng kỹ thuật SHPT [24]. Ngay cả trong cùng một loài, trứng cũng có nhiều kích thước khác nhau, chủ yếu phụ thuộc vào dạng di truyền của SLP lúc đó (lưỡng bội/diploid = 2n; hay tam bội/triploid = 3n; hay tứ bội/tetraploid = 4n = 44 nhiễm sắc thể). Sán lá phổi trưởng thành (Hình 1.3) Sán lá phổi trưởng thành của giống Paragonimus có cấu tạo đặc trưng là có hình hạt cà phê (Hình 1. Cơ thể dài 7–15 mm, rộng 3–8 mm và dày 3–5 mm, màu đỏ hoặc trắng hồng, có 2 giác kích thước bằng nhau: trung bình 0,5–1,5 mm (giác miệng và giác bụng tùy thuộc vào từng loài).

Thực quản ngắn, ống tiêu hoá chạy theo vòng tròn, buồng trứng to, chia múi, tinh hoàn phân nhánh ít, ở phía cuối ống tiêu hoá. Lỗ sinh dục ở phía sau thân gần giác bụng. Buồng trứng và tinh hoàn được coi là đặc tính phân loại và được Miyazaki đề xuất năm 1974. Sán lá phổi giống Paragonimus thu thập tại Việt Nam.

9 Chúng tôi xin giới thiệu hạn chế ở một số loài SLP có liên quan trực tiếp đến các nghiên cứu SHPT trong đề tài này, trong đó có 3 loài chính, bao gồm Paragonimus heterotremus (Hình 1.4A); Paragonimus ohirai (Hình 1.4K) và Paragonimus westermani (Hình 1. Một số SLP khác phát hiện tại Việt Nam, gồm P. harinasutai (Hình 1.4D) [20] được giới thiệu nhưng không mô tả chi tiết. Một số đối tượng SLP khác mà đề tài chọn để so sánh và phân tích gen/hệ gen và các chỉ thị SHPT cũng sẽ được đề cập đến trong các chuyên mục tương ứng.

Sán lá phổi Paragonimus heterotremus (Hình 1.4A) Paragonimus heterotremus lần đầu tiên được phát hiện ở Trung Quốc và đến nay loài P. heterotremus được xác định phân bố ở Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Thái Lan và Ấn Độ [13, 26–29]. Ở sán trưởng thành, giác bụng nhỏ bằng khoảng một nửa đường kính của giác miệng, buồng trứng có nhiều nhánh và tinh hoàn phân thành nhiều nhánh [28, 29]. Sán lá phổi Paragonimus ohirai (Hình 1.