Khảo Sát Sự Thay Đổi Tính Đề Kháng Kháng Sinh Của Vi Khuẩn E. coli Trên Gà Tại Tỉnh Đồng Tháp

Nghiên cứu sự thay đổi tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli và thử nghiệm sản phẩm thay thế kháng sinh trên gà tại Đồng Tháp.

• Tác giả: Bạch Tuấn Kiệt
• Người hướng dẫn: PGS. Hồ Thị Việt Thu
• Trường học: Trường Đại Học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
• Đề tài: Nghiên Cứu Đề Kháng Kháng Sinh Của Vi Khuẩn E. coli Trên Gà Tại Đồng Tháp
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Cần Thơ

Mục lục chi tiết

• Tóm tắt
• Lời cảm ơn
• Chấp thuận của hội đồng
• Lời cam đoan
• Danh sách bảng
• Danh sách hình
• Danh mục từ viết tắt
• 1. Chương 1: Giới thiệu
• 1.1. Tính cấp thiết của luận án
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 2. Chương 2: Tổng quan tài liệu
• 2.1. Vi khuẩn Escherichia coli
• 2.1.1. Lịch sử phát hiện
• 2.1.2. Đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy
• 2.1.3. Đặc tính sinh hóa
• 2.1.4. Sức đề kháng
• 2.1.5. Dịch tễ học
• 2.2. Đề kháng kháng sinh
• 2.3. Phân loại đề kháng kháng sinh
• 2.3.1. Đề kháng thật
• 2.3.2. Đề kháng giả
• 2.3.3. Đề kháng tự nhiên
• 2.3.4. Đề kháng mắc phải
• 2.4. Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn
• 2.4.1. Tạo men phân hủy thuốc
• 2.4.2. Thay đổi tính thấm của tế bào vi khuẩn
• 2.4.3. Biến đổi vị trí gắn kết
• 2.4.4. Bơm đẩy thuốc kháng sinh
• 2.5. Tình hình nghiên cứu về đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli trên gà
• 2.5.1. Trên thế giới
• 2.5.2. Ở Việt Nam và tại Đồng Bằng Sông Cửu Long
• 2.6. Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của việc sử dụng kháng sinh lên sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli theo thời gian
• 2.7. Một số kết quả nghiên cứu về sự tương đồng đề kháng kháng sinh giữa gà và chuột
• 2.8. Giới thiệu về giống gà Nòi lai
• 2.8.1. Đặc điểm ngoại hình
• 2.8.2. Nhu cầu dinh dưỡng của gà
• 2.8.3. Hệ vi khuẩn đường tiêu hóa của gà
• 2.9. Một số giải pháp thay thế kháng sinh trong chăn nuôi
• 2.9.1. Vắc xin phòng bệnh E. coli cho gia cầm
• 3. Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu
• 3.1. Nội dung, thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.1.1. Nội dung nghiên cứu
• 3.1.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.1.3. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Phương tiện nghiên cứu
• 3.2.1. Thiết bị, dụng cụ
• 3.2.2. Sinh phẩm và hóa chất
• 3.2.3. Vật liệu thí nghiệm
• 3.3. Đối tượng nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Nội dung 1: Điều tra thực trạng tình hình chăn nuôi và sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà tại tỉnh Đồng Tháp
• 3.4.2. Nội dung 2: Khảo sát việc sử dụng kháng sinh và sự hiện diện của gen đề kháng kháng sinh của vi khuẩn trên gà và trên chuột
• 3.4.2.1. Số lượng mẫu ở cùng thời điểm
• 3.4.2.2. Tổng số gen đề kháng phát hiện được
• 3.4.3. Nội dung 3: Thử nghiệm một số chế phẩm sinh học trong phòng, trị bệnh E. coli trên gà
• 3.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. Chương 4: Kết quả và thảo luận
• 4.1. Tình hình chăn nuôi và sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà
• 4.1.1. Tình hình chăn nuôi
• 4.1.2. Tình hình sử dụng kháng sinh của các hộ chăn nuôi
• 4.2. Kết quả phân tích mối tương quan yếu tố ảnh hưởng đến việc sử dụng kháng sinh của người chăn nuôi
• 4.3. Kết quả khảo sát sự hiện diện của gen đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn trên gà và chuột
• 4.3.1. Kết quả tình hình sử dụng kháng sinh của các đàn gà khảo sát
• 4.3.2. Kết quả khảo sát sự hiện diện của các gen đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn trên gà và trên chuột
• 4.4. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm kháng sinh và các chế phẩm sinh học phòng, trị bệnh E. coli cho gà 35 ngày tuổi
• 4.4.1. Ảnh hưởng của kháng sinh và các chế phẩm sinh học lên tỷ lệ bệnh, tỷ lệ chết và tỷ lệ khỏi bệnh của gà nhiễm E. coli
• 4.4.2. Ảnh hưởng của kháng sinh và các chế phẩm sinh học lên tăng trọng của gà thí nghiệm
• 4.4.3. Kích thước đường kính vòng vô khuẩn trung bình của vi khuẩn E. coli trên gà ở các nghiệm thức
• 4.4.4. Tỷ lệ hiện diện của các gen đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli trong các mẫu phân gà thử nghiệm sử dụng kháng sinh và các chế phẩm sinh học để trị bệnh E. coli trên gà 35 ngày tuổi
• 4.5. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm kháng sinh và các chế phẩm sinh học trị bệnh E. coli cho gà con 15 ngày tuổi
• 4.5.1. Ảnh hưởng của kháng sinh và các chế phẩm sinh học lên tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết của gà sau khi gây nhiễm E. coli
• 4.5.2. Ảnh hưởng của các chế phẩm sinh học lên tăng trọng bình quân, hệ số chuyển hóa thức ăn và hiệu quả kinh tế của gà thí nghiệm
• 4.5.3. Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli trên gà thí nghiệm đối với amoxicillin và doxycycline
• 4.5.4. Sự hiện diện của các gen đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn E. coli trên gà giữa các nghiệm thức
• 5. Chương 5: Kết luận và đề nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Báo Động Về Đề Kháng Kháng Sinh Của Vi Khuẩn E

Tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) trên gia cầm đang là một thách thức nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi và sức khỏe toàn cầu. E. coli là tác nhân gây bệnh colibacillosis trên gà, một trong những bệnh nhiễm khuẩn phổ biến nhất, gây thiệt hại kinh tế đáng kể do giảm năng suất, tăng tỷ lệ tử vong và chi phí điều trị. Tại Việt Nam, đặc biệt là ở các vùng chăn nuôi trọng điểm như tỉnh Đồng Tháp thuộc Đồng bằng Sông Cửu Long, vấn đề này ngày càng trở nên cấp thiết. Việc sử dụng kháng sinh thiếu kiểm soát đã thúc đẩy sự tiến hóa và lan rộng của các chủng vi khuẩn kháng thuốc, đe dọa trực tiếp đến an toàn thực phẩm và hiệu quả của các phác đồ điều trị cho cả động vật và con người. Một nghiên cứu chuyên sâu của Bạch Tuấn Kiệt (2024) đã thực hiện khảo sát thực trạng kháng thuốc của vi khuẩn E. coli trên gia cầm tại Đồng Tháp, cung cấp những bằng chứng khoa học rõ ràng về mức độ nghiêm trọng của vấn đề. Nghiên cứu này không chỉ phân tích tỷ lệ kháng thuốc mà còn đi sâu vào việc xác định các gen kháng kháng sinh, đồng thời thử nghiệm các giải pháp thay thế kháng sinh tiềm năng, mở ra hướng đi mới cho một nền chăn nuôi bền vững và an toàn.

1.1. Tầm quan trọng của vi khuẩn Escherichia coli trên gia cầm

Vi khuẩn E. coli là một loại vi khuẩn gram âm, thường trú trong đường tiêu hóa của động vật máu nóng, bao gồm cả gia cầm. Mặc dù nhiều chủng E. coli là vô hại, một số chủng gây bệnh (APEC - Avian pathogenic E. coli) có khả năng gây ra các bệnh nhiễm trùng hệ thống nghiêm trọng. Bệnh colibacillosis trên gà có thể biểu hiện dưới nhiều hình thức như viêm túi khí, viêm màng bụng, viêm màng ngoài tim và nhiễm trùng huyết, dẫn đến tỷ lệ chết cao, đặc biệt ở gà con. Thiệt hại kinh tế không chỉ đến từ việc gà chết mà còn do giảm tăng trọng, giảm sản lượng trứng và tăng chi phí thú y. Do đó, việc kiểm soát E. coli là một ưu tiên hàng đầu trong quản lý sức khỏe đàn gia cầm.

1.2. Bối cảnh nghiên cứu tại Đồng bằng Sông Cửu Long

Nghiên cứu được thực hiện từ năm 2019 đến năm 2023 tại tỉnh Đồng Tháp, một trung tâm chăn nuôi gia cầm lớn của vùng Đồng bằng Sông Cửu Long. Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá thực trạng và sự thay đổi tính đề kháng kháng sinh của E. coli, đồng thời kiểm tra hiệu quả của một số sản phẩm sinh học thay thế. Bối cảnh này đặc biệt quan trọng vì mật độ chăn nuôi cao và thói quen sử dụng kháng sinh phổ biến đã tạo ra một môi trường lý tưởng cho sự phát triển và lan truyền của các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Kết quả từ nghiên cứu này cung cấp cái nhìn thực tế và là cơ sở khoa học để đưa ra các khuyến nghị cấp thiết cho người chăn nuôi và các nhà quản lý.

II. Thách Thức Từ Việc Lạm Dụng Kháng Sinh Trong Chăn Nuôi Gà

Vấn đề cốt lõi thúc đẩy cuộc khủng hoảng đề kháng kháng sinh chính là tình trạng lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi. Kháng sinh không chỉ được dùng để điều trị bệnh mà còn được sử dụng rộng rãi với mục đích phòng bệnh và kích thích tăng trưởng. Thói quen này tạo ra một áp lực chọn lọc liên tục, khiến các chủng vi khuẩn nhạy cảm bị tiêu diệt, trong khi các chủng mang gen kháng thuốc tồn tại, phát triển và chiếm ưu thế. Nghiên cứu tại Đồng Tháp đã phơi bày một bức tranh đáng lo ngại về thực trạng này. Kết quả điều tra cho thấy có đến 87,5% hộ chăn nuôi sử dụng ít nhất một loại kháng sinh. Đáng báo động hơn, hơn 53% các loại kháng sinh được sử dụng thuộc nhóm đặc biệt quan trọng hoặc rất quan trọng trong y học nhân đạo. Thực trạng này không chỉ làm giảm hiệu quả điều trị trên vật nuôi mà còn tạo ra một ổ chứa các gen kháng kháng sinh, tiềm ẩn nguy cơ lây lan sang con người và đe dọa nền sức khỏe cộng đồng.

2.1. Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh tại Đồng Tháp

Kết quả khảo sát cắt ngang cho thấy một tỷ lệ rất cao các hộ chăn nuôi gà tại Đồng Tháp phụ thuộc vào kháng sinh. Có hơn 35% sản phẩm được nông dân sử dụng có chứa hoạt chất kháng sinh. Đáng chú ý, việc sử dụng các loại kháng sinh được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) phân loại là cực kỳ quan trọng cho sức khỏe con người, như Colistin, diễn ra phổ biến. Điều này phản ánh sự thiếu nhận thức về nguy cơ cũng như việc thiếu các quy định quản lý chặt chẽ trong việc mua bán và sử dụng thuốc thú y. Tình trạng này là yếu tố trực tiếp dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ kháng kháng sinh trong khu vực.

2.2. Tồn dư kháng sinh và nguy cơ đối với sức khỏe cộng đồng

Việc lạm dụng kháng sinh dẫn đến nguy cơ tồn dư kháng sinh trong thịt gà. Khi người tiêu dùng sử dụng các sản phẩm này, họ có thể vô tình tiếp xúc với một lượng nhỏ kháng sinh, góp phần vào sự phát triển đề kháng của hệ vi sinh vật trong cơ thể. Quan trọng hơn, các sản phẩm thịt gà có thể mang theo vi khuẩn kháng thuốc. Những vi khuẩn này hoặc các gen kháng thuốc của chúng có thể truyền sang vi khuẩn gây bệnh ở người, làm mất tác dụng của các loại thuốc thiết yếu. Đây là một mối đe dọa trực tiếp đến an toàn thực phẩm và là một thách thức lớn đối với y tế công cộng.

2.3. Sự xuất hiện của các gen đa kháng kháng sinh MDR

Hậu quả nghiêm trọng nhất của việc lạm dụng kháng sinh là sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn đa kháng kháng sinh (MDR), tức là kháng lại nhiều nhóm kháng sinh khác nhau. Nghiên cứu tại Đồng Tháp chỉ ra rằng các gen quy định tính đa kháng là cực kỳ phổ biến trong các mẫu phân lập từ gà. Khi một đàn gà bị nhiễm chủng E. coli MDR, việc lựa chọn một loại kháng sinh hiệu quả để điều trị trở nên vô cùng khó khăn, thậm chí là bất khả thi, dẫn đến thất bại trong điều trị và tổn thất kinh tế nặng nề cho người chăn nuôi.

III. Phương Pháp Phân Lập và Xác Định Gen Đề Kháng E

Để có được những kết luận khoa học chính xác về tình hình đề kháng kháng sinh, nghiên cứu đã áp dụng một hệ thống phương pháp luận chặt chẽ, kết hợp giữa khảo sát thực địa và phân tích chuyên sâu trong phòng thí nghiệm. Cách tiếp cận này cho phép các nhà khoa học không chỉ xác định được kiểu hình kháng thuốc (vi khuẩn có thực sự kháng thuốc hay không) mà còn hiểu rõ cơ chế đề kháng của vi khuẩn ở cấp độ phân tử. Việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại đã giúp vẽ nên một bản đồ chi tiết về sự phân bố của các gen kháng kháng sinh trong quần thể vi khuẩn E. coli trên gia cầm và trong môi trường chăn nuôi tại Đồng Tháp. Quy trình nghiên cứu bao gồm ba bước chính: phân lập vi khuẩn từ các mẫu thực địa, sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện gen, và xây dựng kháng sinh đồ để đánh giá mức độ nhạy cảm.

3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli từ mẫu thực địa

Bước đầu tiên là thu thập và phân lập vi khuẩn E. coli từ các nguồn tiềm năng. Các mẫu phân được thu thập trực tiếp từ gà trong các đàn có sử dụng và không sử dụng kháng sinh. Đặc biệt, nghiên cứu còn thu thập mẫu phân từ chuột bị bẫy trong khu vực trang trại. Việc này nhằm mục đích đánh giá vai trò của các loài gặm nhấm trong việc lưu trữ và lan truyền mầm bệnh cũng như các gen đề kháng. Sau khi thu thập, các mẫu được xử lý và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để phân lập các dòng Escherichia coli thuần khiết, sẵn sàng cho các phân tích tiếp theo.

3.2. Ứng dụng kỹ thuật HT qPCR để phát hiện gen kháng thuốc

Nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật Real-time PCR thông lượng cao (HT-qPCR) để sàng lọc sự hiện diện của 94 gen kháng kháng sinh khác nhau. Đây là một phương pháp tiên tiến, cho phép phát hiện và định lượng các đoạn DNA đặc hiệu một cách nhanh chóng và chính xác. Việc sử dụng HT-qPCR giúp xác định một phổ rộng các gen kháng thuốc, bao gồm các gen kháng nhóm β-lactam, tetracycline, aminoglycoside và đặc biệt là colistin. Dữ liệu di truyền này cung cấp bằng chứng trực tiếp về tiềm năng kháng thuốc của quần thể vi khuẩn.

3.3. Xây dựng kháng sinh đồ để đánh giá mức độ nhạy cảm

Bên cạnh phân tích gen, phương pháp kháng sinh đồ (phương pháp khuếch tán đĩa) được thực hiện để xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng E. coli đã phân lập. Vi khuẩn được tiếp xúc với các đĩa giấy tẩm kháng sinh có nồng độ chuẩn. Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn xung quanh đĩa giấy, các nhà nghiên cứu có thể phân loại vi khuẩn là nhạy cảm, trung gian hay đề kháng với từng loại kháng sinh. Kết quả kiểu hình kháng thuốc này bổ sung và xác thực cho dữ liệu phân tích gen, mang lại một cái nhìn toàn diện về tình hình đề kháng.

IV. Phân Tích Tỷ Lệ Đề Kháng Kháng Sinh Đáng Báo Động Của E

Kết quả từ nghiên cứu của Bạch Tuấn Kiệt (2024) đã đưa ra những con số đáng báo động về tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli trên gà tại Đồng Tháp. Dữ liệu cho thấy tình trạng kháng thuốc không còn là nguy cơ tiềm tàng mà đã trở thành một thực tế phổ biến. Vi khuẩn được phân lập từ cả gà và chuột đều mang một số lượng lớn các gen kháng kháng sinh, đặc biệt là các gen quy định tính đa kháng kháng sinh (MDR). Phân tích sâu hơn chỉ ra rằng, các đàn gà có sử dụng kháng sinh có số lượng và sự đa dạng gen kháng thuốc cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng không sử dụng. Điều này khẳng định mối liên hệ nhân quả trực tiếp: việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi chính là động lực thúc đẩy sự gia tăng và lan rộng của các gen đề kháng trong môi trường.

4.1. Tỷ lệ kháng kháng sinh với các nhóm thuốc phổ biến

Kết quả phân tích cho thấy các gen kháng lại những nhóm kháng sinh thông dụng trong thú y như β-lactam, aminoglycoside và tetracycline có tỷ lệ xuất hiện cao nhất. Điều này có nghĩa là nhiều loại thuốc từng được xem là công cụ điều trị hiệu quả cho bệnh colibacillosis trên gà nay đang dần mất đi tác dụng. Tình trạng này đặt ra một thách thức lớn cho công tác thú y, đòi hỏi phải tìm kiếm các phương pháp điều trị thay thế và chiến lược quản lý dịch bệnh mới.

4.2. Phát hiện gen cmr 1 kháng colistin Hồi chuông cảnh báo

Một trong những phát hiện đáng lo ngại nhất của nghiên cứu là sự hiện diện của gen kháng kháng sinh cmr-1 trên các chủng E. coli phân lập từ gà. Gen này mã hóa sự đề kháng với colistin, một loại kháng sinh thuộc nhóm polymyxin. Colistin được coi là một trong những "pháo đài cuối cùng" trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gram âm đa kháng thuốc ở người. Việc phát hiện gen kháng colistin trên gia cầm là một hồi chuông cảnh báo khẩn cấp về nguy cơ lây truyền gen này qua chuỗi thực phẩm, có thể dẫn đến những hậu quả thảm khốc cho sức khỏe cộng đồng.

4.3. Vai trò của chuột trong việc lan truyền gen đề kháng

Nghiên cứu đã cung cấp bằng chứng cho thấy chuột sống trong và xung quanh các trang trại chăn nuôi gà cũng mang các chủng vi khuẩn chứa gen kháng kháng sinh. Phát hiện này cho thấy chuột không chỉ là vật trung gian truyền bệnh mà còn đóng vai trò là một "ổ chứa" và phương tiện lan truyền các yếu tố di truyền kháng thuốc trong môi trường. Chúng có thể mang vi khuẩn kháng thuốc từ đàn này sang đàn khác, từ trang trại này sang trang trại khác, làm cho các nỗ lực kiểm soát sự lây lan trở nên phức tạp hơn rất nhiều. Do đó, các biện pháp kiểm soát động vật gặm nhấm cần được xem là một phần không thể thiếu trong chiến lược tổng thể nhằm hạn chế đề kháng kháng sinh.

V. Top Giải Pháp Thay Thế Kháng Sinh Hiệu Quả Cho Chăn Nuôi Gà

Đối mặt với tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế kháng sinh không còn là một lựa chọn mà đã trở thành yêu cầu bắt buộc. Nghiên cứu tại Đồng Tháp không chỉ dừng lại ở việc mô tả vấn đề mà còn tiến hành thử nghiệm và đánh giá hiệu quả của các biện pháp can thiệp tiềm năng. Kết quả cho thấy các sản phẩm sinh học như vắc-xin, chế phẩm tinh dầu (Activo) và tỏi tươi đều chứng tỏ hiệu quả tích cực trong việc phòng và điều trị bệnh colibacillosis trên gà. Điều quan trọng hơn, không giống như kháng sinh, việc sử dụng các giải pháp này còn góp phần làm giảm sự hiện diện của các gen kháng kháng sinh trong hệ vi sinh vật đường ruột của gà. Đây là một lợi ích kép, vừa giải quyết vấn đề sức khỏe trước mắt của đàn vật nuôi, vừa góp phần cải thiện tình hình đề kháng thuốc về lâu dài, hướng tới một nền chăn nuôi an toàn và bền vững.

5.1. Hiệu quả của vắc xin trong phòng trị bệnh colibacillosis

Vắc-xin phòng bệnh E. coli đã chứng tỏ vai trò quan trọng trong việc giảm tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong. Bằng cách kích thích hệ miễn dịch của gà tạo ra kháng thể đặc hiệu, vắc-xin giúp vật nuôi chủ động chống lại sự tấn công của mầm bệnh. Việc tiêm phòng thành công giúp giảm sự phụ thuộc vào kháng sinh để phòng bệnh, từ đó cắt giảm áp lực chọn lọc lên quần thể vi khuẩn. Nghiên cứu cho thấy gà được tiêm vắc-xin có sức khỏe tốt hơn và ít chịu ảnh hưởng tiêu cực từ mầm bệnh.

5.2. Đánh giá tác dụng của chế phẩm sinh học Activo tỏi tươi

Các chế phẩm sinh học có nguồn gốc tự nhiên như Activo (chứa tinh dầu thực vật) và tỏi tươi đã cho thấy hiệu quả đáng kể. Các hợp chất trong tinh dầu và tỏi có đặc tính kháng khuẩn, giúp ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh như E. coli. Ngoài ra, chúng còn có tác dụng hỗ trợ hệ tiêu hóa, cải thiện sức khỏe đường ruột và tăng cường miễn dịch cho vật nuôi. Việc sử dụng các sản phẩm này là một phương pháp hữu hiệu để kiểm soát bệnh tật mà không gây ra hiện tượng đề kháng thuốc như kháng sinh.

5.3. So sánh hiệu quả giảm gen kháng thuốc của các giải pháp

Một trong những kết quả đột phá nhất của nghiên cứu là bằng chứng cho thấy các giải pháp thay thế đã làm giảm sự hiện diện của các gen kháng kháng sinh. Trong khi việc sử dụng doxycycline và amoxicillin làm gia tăng số lượng gen đề kháng, thì việc áp dụng vắc-xin, Activo và tỏi tươi lại cho thấy xu hướng ngược lại. Điều này cho thấy các biện pháp can thiệp sinh học không chỉ chữa bệnh mà còn giúp "làm sạch" hệ vi sinh vật đường ruột khỏi các yếu tố di truyền kháng thuốc, góp phần phục hồi sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh.

VI. Hướng Đi Tương Lai Cho Vấn Đề Đề Kháng Kháng Sinh E

Nghiên cứu về tình hình đề kháng kháng sinh của E. coli trên gà tại Đồng Tháp đã cung cấp những dữ liệu khoa học quý giá và cấp thiết. Những phát hiện này không chỉ phản ánh thực trạng tại một địa phương mà còn là lời cảnh báo cho toàn ngành chăn nuôi Việt Nam. Để giải quyết vấn đề phức tạp này, cần có một chiến lược tổng thể và dài hạn, kết hợp giữa việc quản lý chặt chẽ việc sử dụng thuốc và thúc đẩy mạnh mẽ việc áp dụng các giải pháp thay thế bền vững. Hướng đi trong tương lai đòi hỏi sự thay đổi trong tư duy và hành động từ người chăn nuôi, các nhà quản lý, đến người tiêu dùng. Mục tiêu cuối cùng là bảo vệ hiệu quả của kháng sinh cho thế hệ tương lai, đồng thời đảm bảo an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.

6.1. Khuyến nghị sử dụng kháng sinh hợp lý trong chăn nuôi

Khuyến nghị hàng đầu là phải tuân thủ nghiêm ngặt nguyên tắc sử dụng kháng sinh hợp lý và có trách nhiệm. Cần chấm dứt việc sử dụng kháng sinh để phòng bệnh một cách bừa bãi hoặc kích thích tăng trưởng. Việc kê đơn và sử dụng kháng sinh phải dựa trên chẩn đoán chính xác và kết quả kháng sinh đồ khi có thể. Đồng thời, cần tăng cường công tác quản lý, giám sát việc mua bán và phân phối thuốc thú y để hạn chế tình trạng lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi. Công tác truyền thông, nâng cao nhận thức cho người chăn nuôi về hậu quả của đề kháng kháng sinh cũng là một nhiệm vụ quan trọng.

6.2. Tiềm năng của sản phẩm sinh học và an toàn thực phẩm

Tương lai của ngành chăn nuôi bền vững nằm ở việc ứng dụng rộng rãi các giải pháp thay thế kháng sinh. Các sản phẩm sinh học như vắc-xin, probiotic, prebiotic và các chiết xuất thực vật (phytogenics) cần được ưu tiên nghiên cứu và phát triển. Việc tích hợp các giải pháp này vào quy trình chăn nuôi không chỉ giúp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả mà còn giảm thiểu nguy cơ đề kháng kháng sinh. Bên cạnh đó, việc kiểm soát các vật chủ trung gian như chuột là cần thiết để ngăn chặn sự lan truyền gen đề kháng. Những nỗ lực này sẽ góp phần tạo ra các sản phẩm chăn nuôi an toàn, đáp ứng yêu cầu ngày càng cao về an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) gây ra là một trong những bệnh lý phổ biến trên gia cầm, dẫn đến tổn thất kinh tế do làm tăng tỷ lệ chết, giảm tốc độ tăng trưởng và tăng tỷ lệ loại thải đàn nuôi (Barnes et al., 2008). Trong chăn nuôi gia cầm tại Việt Nam, mức độ sử dụng kháng sinh được ghi nhận ở mức cao; lượng kháng sinh tính trên đầu gia cầm cao gấp 6 lần so với một số quốc gia châu Âu, trong đó có tới 84% lượng thuốc được sử dụng với mục đích phòng bệnh (Carrique-Mas et al., 2015). Các khảo sát tại Tiền Giang và Thành phố Hồ Chí Minh chỉ ra có từ 72% hộ chăn nuôi sử dụng kháng sinh, 32,6% cơ sở sử dụng không hợp lý và 44,5% cơ sở không tuân thủ thời gian ngừng thuốc trước khi giết mổ (Nguyen Van Cuong et al., 2016; Võ Thị Trà An và ctv., 2014). Việc lạm dụng các loại kháng sinh quan trọng trong y tế nhân mạng tạo áp lực chọn lọc, hình thành các chủng vi khuẩn chỉ thị E. coli mang gen đa kháng thuốc có khả năng truyền sang người và phát tán vào môi trường (Kabir, 2010). Phần lớn các công trình trước đây chỉ tập trung khảo sát tính đề kháng trên một số chủng vi khuẩn phân lập đơn lẻ tại một thời điểm cố định; khoảng trống nghiên cứu hiện nay là sự thiếu hụt các dữ liệu thực nghiệm theo dõi biến động động thái của các gen đề kháng ở cấp độ quần thể vi sinh vật đường ruột theo thời gian, sự tham gia của động vật hoang dã quanh chuồng trại như chuột, cũng như việc đánh giá thực nghiệm các giải pháp sinh học thay thế kháng sinh trong điều kiện chăn nuôi thực tế.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm:

1. Khảo sát thực trạng chăn nuôi và tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong các nông hộ nuôi gà thả vườn tại tỉnh Đồng Tháp.
2. Đánh giá sự thay đổi tính đề kháng kháng sinh của hệ vi sinh vật đường ruột thông qua sự hiện diện và động thái biến đổi của các gen đề kháng ở vi khuẩn trên gà và trên chuột theo thời gian bằng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại.
3. Thử nghiệm hiệu quả phòng và trị bệnh do vi khuẩn E. coli của kháng sinh so với một số chế phẩm sinh học (vắc xin E. coli, chế phẩm Activo, tỏi tươi, chế phẩm men vi sinh) trên đàn gà thí nghiệm, đồng thời theo dõi sự biến động tính nhạy cảm và sự xuất hiện của các gen đề kháng sau can thiệp.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Đàn gà nuôi thả vườn (giống gà Nòi lai), vi khuẩn E. coli, phân gà, chuột hoang dã (Rattus spp.) bắt tại các trại nuôi gà, cùng các loại kháng sinh và chế phẩm sinh học thay thế.
• Phạm vi không gian: Các nông hộ và trang trại chăn nuôi gà tại tỉnh Đồng Tháp.
• Phạm vi thời gian: Các đợt điều tra thực địa, thu thập mẫu và thử nghiệm thực nghiệm được triển khai từ năm 2019 đến năm 2023.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế về vi khuẩn E. coli, cơ chế đề kháng kháng sinh và giải pháp thay thế:

• Hướng nghiên cứu về dịch tễ và kiểu hình đề kháng của E. coli trên gia cầm: Trên thế giới, các tác giả như Zhao et al. (2005) tại Bắc Georgia ghi nhận 92% chủng APEC đa kháng thuốc (kháng cao với sulfamethoxazole 93%, tetracycline 87%, streptomycin 86%); Hasan et al. (2011) tại Bangladesh ghi nhận 55% chủng kháng ít nhất một loại thuốc và 36,6% đa kháng; Awogbemi et al. (2018) tại Nigeria ghi nhận E. coli đề kháng 100% với amoxicillin và 70-90% với penicillin, tetracycline. Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyen Vinh Trung et al. (2015) tại Tiền Giang trên 208 hộ ghi nhận E. coli đề kháng cao với gentamicin (96,6%), ciprofloxacin (91,8%) và cephalosporin thế hệ 3 (37,0%). Nghiên cứu của Bùi Thị Lê Minh (2018) tại Đồng bằng sông Cửu Long chỉ ra sự tương đồng về mức độ đề kháng cao giữa E. coli sinh ESBL phân lập từ gà và từ người chăn nuôi đối với ampicillin (96,67 - 98,87%) và cefaclor (92,6 - 97,5%).
• Hướng nghiên cứu về kiểu gen kháng thuốc và plasmid truyền ngang: Zhang et al. (2008) tại Trung Quốc phát hiện 82,32% chủng E. coli mang gen kháng tetracycline (tetA, tetB, tetM); Awad et al. (2016) tại Ai Cập ghi nhận ưu thế của các gen blaTEM, blaCTX-M, cat1, aphA1, sul1; Huang et al. (2017) tại Trung Quốc xác định 91% chủng kháng colistin mang gen mcr-1. Tại Đồng bằng sông Cửu Long, Nguyen Thi Nhung et al. (2016) công bố tỷ lệ lưu hành của gen mcr-1 trên gà là 19-22% và khả năng tiếp hợp truyền gen qua plasmid kích thước 63 kb đạt tỷ lệ 54,0%; Yamasaki et al. (2015) ghi nhận vai trò truyền ngang của plasmid mang gen CTX-M-55 (5.0139 kb) giữa động vật và người.
• Hướng nghiên cứu về động thái đề kháng theo thời gian và giải pháp sinh học: Các tác giả Barbosa & Levy (2000), Dierikx (2013) làm rõ áp lực chọn lọc của việc dùng thuốc lên hệ vi sinh vật; Mohamed et al. (2020) tổng kết các giải pháp phytobiotic, tinh dầu, enzyme và vắc xin thay thế kháng sinh.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết: Trước đây, các dữ liệu về sự biến thiên của gen đề kháng theo chu kỳ sinh trưởng của vật nuôi còn rất hạn chế. Luận án đặt vị trí nghiên cứu vào việc lấp đầy khoảng trống này bằng cách: (1) Theo dõi dọc (longitudinal monitoring) sự gia tăng và thoái lui của gen đề kháng từ thời điểm bắt đầu sử dụng thuốc, qua các mốc 7, 14, 30, 60 ngày đến khi xuất bán; (2) Đưa chuột hoang vào mô hình giám sát dịch tễ như một mắt xích lan truyền gen kháng trong môi trường chăn nuôi; (3) So sánh trực tiếp hiệu quả kỹ thuật và kinh tế giữa kháng sinh thương mại và các chế phẩm thay thế (vắc xin, Activo, tỏi tươi) trên đàn gà nhiễm bệnh thực nghiệm.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên nền tảng lý thuyết bệnh lý học thú y, dịch tễ học phân tử và dược lý học vi sinh vật:

• Khái niệm và phân loại đề kháng: Đề kháng thật (gồm đề kháng tự nhiên mang tính loài trên nhiễm sắc thể và đề kháng mắc phải qua đột biến điểm hoặc nhận gen truyền ngang qua plasmid, transposon, integron) và đề kháng giả (không do biến đổi di truyền mà do thể trạng vật chủ, vi khuẩn ở trạng thái nghỉ hoặc sai sót phác đồ).
• Bốn cơ chế đề kháng sinh học phân tử: Tạo enzyme bất hoạt kháng sinh (như men β-lactamase, ESBL, carbapenemase, aminoglycoside acetyltransferase); Thay đổi tính thấm màng tế bào qua các kênh porin xuyên màng; Biến đổi cấu trúc điểm gắn đích (protein gắn penicillin - PBP, tiểu đơn vị ribosome, enzyme DNA-gyrase); Kích hoạt hệ thống bơm đẩy chủ động (efflux pump).

Phương pháp nghiên cứu thực tế:

• Phương pháp điều tra xã hội học và cắt ngang: Khảo sát 96 hộ chăn nuôi gà tại tỉnh Đồng Tháp bằng phiếu điều tra chuẩn hóa; ghi nhận thông tin về quy mô đàn, kinh nghiệm, danh mục 577 sản phẩm thuốc, mục đích sử dụng và thời gian ngưng thuốc.
• Phương pháp giám sát động thái gen bằng HT-qPCR: Theo dõi 18 đàn gà và quần thể chuột tương ứng tại các mốc thời gian: ban đầu (trước dùng thuốc), 7 ngày, 14 ngày, 30 ngày, 60 ngày và kết thúc chu kỳ nuôi. Sử dụng hệ thống phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực năng lượng cao (HT-qPCR) với bộ mồi gộp delta gen để sàng lọc đồng thời 94 gen đề kháng mục tiêu thuộc các nhóm: β-lactam (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA, blaAmpC...), aminoglycoside, MLSB, tetracycline (tetA, tetB, tetC, tetM, tetO, tetW, tetX...), polymyxin (mcr-1, mcr-2, mcr-3, mcr-4), phenicol, quinolone (qnrA, qnrB, qnrS), sulfonamide (sul1, sul2, sul3), đa kháng (cmlA1, bacA, tolC...).
• Phương pháp vi sinh vật học và kháng sinh đồ: Phân lập E. coli trên thạch chọn lọc MacConkey, CHROMagar CCA, TBX; giám định đặc tính sinh hóa bằng bộ thử nghiệm IMViC (Indole, Methyl Red, Voges-Proskauer, Simmons Citrate) và thạch KIA; thực hiện kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán đĩa giấy Kirby-Bauer trên thạch Mueller-Hinton theo chuẩn CLSI (2020) với đĩa amoxicillin 10 µg và doxycycline 30 µg.
• Phương pháp bố trí thí nghiệm can thiệp:
  • Thí nghiệm trên gà 35 ngày tuổi (gây nhiễm E. coli): Đánh giá 5 nghiệm thức gồm đối chứng dương (ĐC+ tiêm vi khuẩn không điều trị), NT1 (doxycycline), NT2 (chế phẩm Activo), NT3 (tỏi tươi), NT4 (vắc xin E. coli tiêm phòng trước khi gây nhiễm).
  • Thí nghiệm trên gà 15 ngày tuổi: Gồm 7 nghiệm thức đánh giá ảnh hưởng của amoxicillin, doxycycline, Activo, tỏi tươi, men vi sinh (Lacz), đối chứng không nhiễm (ĐC-) và đối chứng bệnh (ĐC+).
• Phương pháp xử lý dữ liệu: Số liệu được phân tích bằng phần mềm Minitab; áp dụng hồi quy tuyến tính (Linear Regression), phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) với kiểm định sau đại học Fisher và Tukey (độ tin cậy 95%), kiểm định Chi bình phương ($\chi^2$) và Fisher's exact test cho các biến tỷ lệ.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương này trình bày cơ sở thực tiễn của đề tài xuất phát từ tác hại của vi khuẩn E. coli đối với ngành chăn nuôi gia cầm và mối nguy từ tình trạng lạm dụng kháng sinh dẫn đến hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc. Đặt vấn đề nghiên cứu dựa trên các cảnh báo y tế toàn cầu của CDC và WHO về nguy cơ tử vong do kháng kháng sinh có thể lên tới 10 triệu người vào năm 2050. Chương 1 xác định rõ tính cấp thiết của việc nghiên cứu động thái biến đổi tính đề kháng của E. coli tại Đồng Tháp, đặt ra 3 mục tiêu cụ thể và giới hạn phạm vi nghiên cứu thực nghiệm trong giai đoạn 2019-2023.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương tổng quan cung cấp các dẫn liệu khoa học hoàn chỉnh gồm:

• Đặc điểm vi khuẩn học: Lịch sử phân lập từ năm 1885 bởi Theodore Escherich và phân lập trên gia cầm từ năm 1894 bởi Lignieres; đặc tính hình thái trực khuẩn Gram âm, nuôi cấy hiếu khí/kỵ khí tùy tiện; đặc điểm sinh hóa kinh điển (I+, MR+, VP-, Ci-, KIA lên men đường có sinh hơi và không sinh $H_2S$); sức đề kháng vật lý và hóa học của vi khuẩn.
• Lý thuyết cơ chế đề kháng: Trình bày chi tiết cấu trúc di truyền mang gen kháng (nhiễm sắc thể, plasmid IncH12, IncF, transposon, integron); 4 cơ chế đề kháng sinh học và phân loại đề kháng tự nhiên, mắc phải, đề kháng chéo.
• Tổng quan các công trình thực nghiệm: Điểm lại các nghiên cứu dịch tễ tại Mỹ, Trung Quốc, Ai Cập, Bangladesh và khu vực Đồng bằng sông Cửu Long; các dữ liệu về tỷ lệ lưu hành của vi khuẩn sinh ESBL và gen kháng colistin mcr-1.
• Giới thiệu đối tượng vật nuôi và giải pháp sinh học: Đặc tính sinh trưởng, nhu cầu dinh dưỡng và hệ vi sinh vật tiêu hóa của giống gà Nòi lai; cơ chế tác động của các sản phẩm thay thế kháng sinh như probiotic, prebiotic, acid hữu cơ, phytogenic (chiết xuất thảo mộc, tỏi tươi), tinh dầu và vắc xin phòng bệnh gia cầm.

Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm:

• Bố trí mẫu khảo sát thực địa: Thu thập mẫu phân gà và phân trực tràng của chuột hoang mắc bẫy tại 18 nông hộ chăn nuôi đại diện ở Đồng Tháp (Bảng 3.1).
• Quy trình phân tích phân tử HT-qPCR: Hỗn hợp phản ứng gộp delta gen (Bảng 3.2), chu trình nhiệt phản ứng gồm các bước biến tính, gắn mồi và kéo dài (Bảng 3.3) để khuếch đại 94 gen đề kháng chuyên biệt.
• Phương pháp vi sinh và thử nghiệm lâm sàng: Quy trình nuôi cấy trên đĩa thạch CCA, kiểm tra độ đục chuẩn $OD_{600} \approx 1$ ($10^8\text{ CFU/mL}$), thao tác kháng sinh đồ Kirby-Bauer đo đường kính vòng vô khuẩn (Hình 8.2). Thiết kế các lô thí nghiệm phòng, trị bệnh trên gà 35 ngày tuổi (170 con) và gà 15 ngày tuổi, theo dõi các chỉ tiêu lâm sàng, tăng trọng, hệ số FCR và hiệu quả kinh tế.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 tập trung các dữ liệu thực nghiệm nguyên gốc và kết quả xử lý thống kê:

1. Thực trạng chăn nuôi và sử dụng kháng sinh (n=96 hộ)

Khảo sát 96 hộ chăn nuôi gà tại Đồng Tháp cho thấy mức độ sử dụng thuốc kháng sinh diễn biến phổ biến:

• 87,5% số hộ chăn nuôi có sử dụng ít nhất một loại kháng sinh trong quá trình nuôi.
• Trong tổng số 577 sản phẩm thú y được người dân sử dụng, có hơn 35% sản phẩm có chứa thành phần hoạt chất kháng sinh.
• Phân loại theo danh mục của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ kháng sinh thuộc nhóm đặc biệt quan trọng (Critically Important) và rất quan trọng (Highly Important) trong điều trị bệnh cho người chiếm trên 53%.
• Phân tích hồi quy đơn biến giữa tần suất dùng thuốc trên một chu kỳ nuôi và số năm kinh nghiệm chăn nuôi của chủ hộ cho kết quả phương trình: $$\text{Tần suất sử dụng/chu kỳ} = 1{,}328 \times \text{Kinh nghiệm}$$ với hệ số có ý nghĩa thống kê ($p = 0{,}031$).

2. Kết quả khảo sát sự hiện diện của gen đề kháng bằng HT-qPCR trên gà và chuột

Phân tích 94 gen đề kháng trên các đàn gà sử dụng kháng sinh và đối chứng không dùng kháng sinh ghi nhận:

• Vi khuẩn ở cả gà và chuột mang phổ gen đề kháng đa dạng; các nhóm gen xuất hiện phổ biến nhất là gen đa kháng (multidrug resistance), gen kháng nhóm β-lactam, aminoglycoside và tetracycline. Đặc biệt, đã phát hiện sự hiện diện của gen mcr-1 mã hóa tính đề kháng với colistin.
• So sánh số lượng gen đề kháng trung bình trên mỗi mẫu giữa đàn gà có dùng kháng sinh và đàn đối chứng qua các mốc thời gian:

Mốc thời gian lấy mẫu	Gà sử dụng kháng sinh (Mean gen/mẫu)	Gà đối chứng (Mean gen/mẫu)	Giá trị p (One-way ANOVA)	Phân nhóm Fisher
Ban đầu	50,556	50,111	> 0,05	Khác biệt không ý nghĩa
7 ngày	58,111	49,778	< 0,05	Gà KS: nhóm A; Gà ĐC: nhóm B
14 ngày	59,722	51,389	< 0,05	Gà KS: nhóm A; Gà ĐC: nhóm B
30 ngày	58,444	52,278	< 0,05	Gà KS: nhóm A; Gà ĐC: nhóm B
60 ngày	57,722	51,889	< 0,05	Gà KS: nhóm A; Gà ĐC: nhóm B
Kết thúc chu kỳ	57,333	56,110	> 0,05	Khác biệt không ý nghĩa

Ghi chú: Áp lực của thuốc kháng sinh làm bùng phát số lượng gen kháng từ ngày thứ 7 đến ngày 60. Khi ngưng sử dụng thuốc đủ lâu, số lượng gen đề kháng có chiều hướng suy giảm về mức tương đương đàn đối chứng.

• Dữ liệu trên quần thể chuột: Chuột thu thập tại các trại nuôi gà cũng mang đầy đủ các nhóm gen kháng tương tự như trên đàn gà (β-lactam, aminoglycoside, phenicol, sulfonamide, tetracycline). Tuy nhiên, phân tích ANOVA và kiểm định tỷ lệ cho thấy sự xuất hiện của các gen kháng trên chuột không thể hiện quy luật biến động theo thời gian rõ rệt như trên gà (do đặc tính di chuyển tự do và vùng kiếm ăn rộng ngoài tự nhiên của động vật hoang dã).

3. Thử nghiệm trên gà 35 ngày tuổi can thiệp bệnh do E. coli

Thử nghiệm trên 170 gà chia thành các nghiệm thức điều trị và phòng bệnh ghi nhận:

• Tỷ lệ gà mắc bệnh và chết: Lô đối chứng bệnh ĐC+ có tỷ lệ bệnh cao (15/31 con; 48,39%) và tỷ lệ chết cao nhất (10/31 con; 32,26%). Các lô can thiệp NT1 (Doxycycline), NT2 (Activo), NT3 (Tỏi tươi) có tỷ lệ chết giảm rõ rệt ($p < 0{,}05$). Lô NT4 (tiêm phòng vắc xin E. coli) đạt kết quả bảo hộ cao nhất với tỷ lệ mắc bệnh 0% (0/36 con) và tỷ lệ chết 0%, sai khác có ý nghĩa thống kê cực kỳ cao so với các nghiệm thức còn lại ($p = 0{,}000$; kiểm định Fisher's exact test).
• Đường kính vòng vô khuẩn và gen đề kháng: Việc sử dụng doxycycline (NT1) tạo áp lực chọn lọc làm giảm đáng kể kích thước đường kính vòng vô khuẩn của vi khuẩn E. coli đối với doxycycline (tăng tính đề kháng kiểu hình) và làm tăng tỷ lệ phát hiện các gen tetA, tetB, tetM bằng PCR so với các lô sử dụng chế phẩm sinh học (NT2, NT3, NT4).

4. Thử nghiệm trên gà 15 ngày tuổi can thiệp bệnh và đánh giá kinh tế

• Chỉ tiêu FCR và tăng trọng: Nghiệm thức bổ sung Activo và Amoxicillin cho khả năng phục hồi tăng trọng tốt. Phân tích phương sai One-way ANOVA về hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) và tổng lượng thức ăn tiêu thụ ghi nhận sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức ($p < 0{,}05$).
• Phân tích hiệu quả kinh tế (Lợi nhuận đồng/con): Mô hình ANOVA ghi nhận sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê về mặt lợi nhuận giữa các lô ($F = 6{,}00$; $p = 0{,}002$; $R^2 = 72{,}76%$):

Nghiệm thức can thiệp	Lợi nhuận bình quân (đồng/con)	Phân nhóm thống kê (Tukey Method)
Chế phẩm Activo	46.388	A
Amoxicillin	46.064	A
Đối chứng Amoxicillin (ĐCA)	44.420	A B
Doxycycline	42.723	A B
Men vi sinh Lacz	33.531	A B C
Tỏi tươi	24.949	B C
Đối chứng Doxycycline (ĐCD)	20.680	C

• Động thái đề kháng: Kháng sinh đồ theo thời gian xác nhận ở các lô sử dụng amoxicillin và doxycycline, đường kính vòng vô khuẩn của E. coli bị thu hẹp đáng kể tại các ngày 7, 14 và 30; tỷ lệ phát hiện gen sinh men β-lactam (blaTEM, blaCTX-M, blaAmpC) và gen kháng tetracycline (tetB, tetM) gia tăng mạnh so với lô đối chứng và lô sử dụng thảo dược.

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Tổng kết toàn bộ các phát hiện chính từ khảo sát thực địa và thử nghiệm lâm sàng, đề xuất các khuyến cáo kỹ thuật về thời gian ngưng sử dụng kháng sinh trước khi xuất bán và quy trình kiểm soát an toàn sinh học.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học:

• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm ở cấp độ gen quần thể (bằng kỹ thuật HT-qPCR sàng lọc 94 gen) chứng minh rằng áp lực sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà làm gia tăng cả về số lượng gen đề kháng lẫn sự phong phú của các kiểu gen kháng trong hệ vi sinh vật đường ruột.
• Xác định được quy luật động thái của gen đề kháng theo thời gian: sự hiện diện của các gen kháng tăng vọt và duy trì ở mức cao trong giai đoạn từ 7 đến 60 ngày sau khi dùng thuốc; sau thời điểm 60 ngày, khi áp lực thuốc giảm dần, tỷ lệ gen đề kháng suy giảm và dần trở lại trạng thái cân bằng tương đương với đàn đối chứng không dùng thuốc.
• Phát hiện sự hiện diện của gen mcr-1 (mã hóa kháng colistin) trên vi khuẩn đường ruột của gia cầm tại Đồng Tháp, đồng thời chỉ ra chuột hoang sinh sống trong trang trại là vật chủ mang mầm bệnh và mang các gen đề kháng tương tự đàn gà, đóng vai trò là nguồn lây truyền gen kháng trong môi trường.

Các đóng góp mới về mặt thực tiễn và giải pháp kỹ thuật:

• Cung cấp cơ sở khoa học định lượng để khuyến cáo người chăn nuôi gia cầm tuân thủ nghiêm ngặt thời gian ngừng sử dụng thuốc kháng sinh: thời điểm ngưng thuốc cần thiết lập tối thiểu trước 60 ngày xuất bán giết mổ để giảm thiểu tồn dư gen kháng thuốc trong chuỗi thực phẩm.
• Khẳng định khả năng thay thế kháng sinh của các chế phẩm sinh học: việc tiêm phòng vắc xin E. coli giúp bảo hộ đàn gà hoàn toàn trước sự công nhiễm mầm bệnh (tỷ lệ bệnh 0%, tỷ lệ chết 0%); sử dụng chế phẩm Activo mang lại hiệu quả tăng trọng và lợi nhuận kinh tế cao nhất (46.388 đồng/con), tương đương hoặc vượt trội so với phác đồ kháng sinh thông thường nhưng không làm gia tăng áp lực gen kháng thuốc trong đường ruột.

Kiến nghị đề xuất từ luận án:

• Tăng cường kiểm soát quy chế bán và sử dụng thuốc thú y, ngăn chặn triệt để việc đưa các nhóm kháng sinh quan trọng đối với y tế con người (đặc biệt là colistin, cephalosporin thế hệ mới) vào mục đích phòng bệnh trong chăn nuôi.
• Triển khai quy trình sử dụng các chế phẩm sinh học (vắc xin, Activo, tỏi tươi, men vi sinh) vào quy trình kỹ thuật chăn nuôi gà thả vườn nhằm thay thế kháng sinh.
• Áp dụng các biện pháp diệt trừ và kiểm soát động vật gặm nhấm (chuột) tại các chuồng trại chăn nuôi để cắt đứt mắt xích truyền nhiễm mầm bệnh và lan truyền gen kháng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

• Nghiên cứu chưa thể xác lập được quy luật biến động động thái có tính chu kỳ của gen đề kháng trên loài chuột, do chuột là động vật hoang dã tự nhiên, không thể kiểm soát chặt chẽ phạm vi di chuyển, thức ăn và lịch sử tiếp xúc với các nguồn thải chứa kháng sinh ngoài môi trường.
• Thử nghiệm thực địa tập trung chủ yếu trên đối tượng giống gà Nòi lai nuôi thả vườn tại địa bàn tỉnh Đồng Tháp; dữ liệu chưa bao quát các phương thức chăn nuôi công nghiệp lồng chuồng khép kín hoặc các đối tượng thủy cầm khác.
• Nghiên cứu chưa tiến hành giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) đối với các plasmid để phân tích sâu hơn về cấu trúc các yếu tố di truyền di động (integron, transposon) liên quan đến sự truyền ngang gen kháng giữa vi khuẩn ở chuột và gà.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Mở rộng nghiên cứu cơ chế tiếp hợp truyền ngang plasmid mang gen mcr-1 và gen sinh men ESBL giữa các chủng vi khuẩn phân lập từ chuột sang vi khuẩn phân lập từ gia cầm trong điều kiện phòng thí nghiệm.
• Tiếp tục tối ưu hóa công thức chế biến từ củ tỏi tươi và các loại thảo dược bản địa nhằm hạ giá thành sản xuất, nâng cao hiệu quả kinh tế hơn nữa khi ứng dụng ở quy mô trang trại lớn.
• Thiết lập hệ thống giám sát dịch tễ học One Health (Một sức khỏe) dài hạn để theo dõi sự lan truyền gen kháng từ chất thải chuồng gà ra nguồn nước mặt và chuỗi cung ứng thực phẩm tại Đồng bằng sông Cửu Long.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và thực tiễn đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các chuyên ngành Bệnh lý học thú y, Chăn nuôi, Thú y cộng đồng, Vi sinh vật học và Dịch tễ học phân tử: Có thể tham khảo phương pháp luận kết hợp giữa điều tra dịch tễ cắt ngang, kỹ thuật sinh học phân tử HT-qPCR phát hiện 94 gen kháng và phương pháp kháng sinh đồ chuẩn hóa CLSI (Chương 3 và Phụ lục 7, 8, 9).
• Giảng viên và cán bộ nghiên cứu tại các viện, trường đại học nông nghiệp: Sử dụng bộ số liệu thực nghiệm về động thái gen kháng theo thời gian (Bảng 4.13) và dữ liệu phân tích thống kê ANOVA, hồi quy (Chương 4) làm học liệu giảng dạy chuyên sâu về kháng kháng sinh (AMR).
• Cơ quan quản lý nhà nước (Cục Thú y, Chi cục Chăn nuôi và Thú y các tỉnh): Sử dụng kết quả điều tra thực trạng dùng thuốc (Bảng 4.1 đến 4.4) để xây dựng chính sách quản lý danh mục thuốc thú y, lộ trình cấm kháng sinh phòng bệnh và hướng dẫn quy chuẩn thời gian ngừng thuốc 60 ngày trước khi giết mổ.
• Kỹ sư chăn nuôi, bác sĩ thú y thực hành và chủ trang trại: Ứng dụng quy trình phòng bệnh bằng vắc xin E. coli và bổ sung chế phẩm sinh học Activo để tối ưu hóa chi phí sản xuất và cải thiện hệ số chuyển hóa thức ăn (Bảng 4.20).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Thực trạng sử dụng kháng sinh trong các hộ nuôi gà tại Đồng Tháp được luận án ghi nhận như thế nào? Kết quả điều tra 96 hộ chăn nuôi cho thấy có 87,5% số hộ sử dụng ít nhất một loại kháng sinh trong chu kỳ nuôi; trong 577 sản phẩm thú y được sử dụng, hơn 35% sản phẩm chứa hoạt chất kháng sinh. Đáng chú ý, trên 53% lượng thuốc sử dụng thuộc danh mục kháng sinh đặc biệt quan trọng và rất quan trọng trong điều trị bệnh cho người theo phân loại của WHO.

2. Động thái số lượng gen đề kháng của vi khuẩn đường ruột trên đàn gà biến đổi ra sao theo thời gian sau khi dùng kháng sinh? Số lượng gen đề kháng trung bình trên mỗi mẫu tăng vọt có ý nghĩa thống kê ($p < 0{,}05$) từ ngày thứ 7 (58,111 gen/mẫu) đến ngày 14 (59,722 gen/mẫu), duy trì ở mức cao tại ngày 30 (58,444 gen/mẫu) và ngày 60 (57,722 gen/mẫu) so với đàn đối chứng không dùng thuốc. Tuy nhiên, sau 60 ngày ngừng dùng thuốc, số lượng gen kháng có xu hướng giảm dần về mức 57,333 gen/mẫu ở thời điểm xuất bán, không còn sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đàn đối chứng.

3. Luận án đã phát hiện gen kháng colistin nào trên đàn gà và chuột khảo sát? Bằng kỹ thuật HT-qPCR, luận án đã phát hiện sự hiện diện của gen mcr-1 (mã hóa tính đề kháng với colistin - loại kháng sinh thuộc nhóm polymyxin đặc biệt quan trọng trong điều trị y tế nhân mạng) trên vi khuẩn đường ruột ở cả đàn gà và chuột bắt tại chuồng nuôi.

4. Hiệu quả bảo hộ của vắc xin phòng bệnh E. coli trên đàn gà 35 ngày tuổi đạt kết quả như thế nào? Trong thử nghiệm gây nhiễm vi khuẩn E. coli cường độc trên gà 35 ngày tuổi, nghiệm thức tiêm phòng vắc xin (NT4) đạt tỷ lệ bảo hộ tuyệt đối với tỷ lệ mắc bệnh là 0% (0/36 con) và tỷ lệ chết là 0%, vượt trội có ý nghĩa thống kê ($p = 0{,}000$) so với lô đối chứng bệnh không điều trị (tỷ lệ bệnh 48,39%, tỷ lệ chết 32,26%) và các lô điều trị bằng kháng sinh hay thảo dược khác.

5. Giữa các nghiệm thức can thiệp trên gà 15 ngày tuổi, sản phẩm nào đem lại lợi nhuận kinh tế cao nhất? Phân tích phương sai One-way ANOVA ($F = 6{,}00$; $p = 0{,}002$) chỉ ra nghiệm thức sử dụng chế phẩm Activo đem lại lợi nhuận kinh tế bình quân cao nhất, đạt 46.388 đồng/con (thuộc phân nhóm A theo kiểm định Tukey), tương đương với lô dùng kháng sinh amoxicillin (46.064 đồng/con) và cao hơn rõ rệt so với lô dùng doxycycline (42.723 đồng/con) hoặc tỏi tươi (24.949 đồng/con).

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Bạch Tuấn Kiệt đã phản ánh một cách toàn diện thực trạng sử dụng kháng sinh phổ biến trong chăn nuôi gà thả vườn tại tỉnh Đồng Tháp và mối liên hệ trực tiếp của việc dùng thuốc đến sự bùng phát các gen đề kháng kháng sinh trong hệ vi sinh vật đường ruột. Bằng phương pháp sinh học phân tử hiện đại HT-qPCR và bố trí thí nghiệm đối chứng dọc theo thời gian, công trình đã xác lập được quy luật động thái gia tăng gen kháng từ ngày 7 đến 60 và sự thoái lui sau 60 ngày ngưng thuốc, đồng thời phát hiện sự lưu hành của gen mcr-1 và vai trò truyền mang gen kháng của chuột hoang. Bên cạnh đó, các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh hiệu quả phòng ngừa bệnh tuyệt đối của vắc xin E. coli và giá trị kinh tế nổi bật của chế phẩm sinh học Activo, cung cấp luận cứ khoa học thực tiễn phục vụ định hướng giảm thiểu kháng sinh và kiểm soát an toàn sinh học trong chăn nuôi gia cầm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1. Tính cấp thiết của luận án Bệnh truyền nhiễm do Escherichia coli (E. coli) là bệnh quan trọng, phổ biến trên gia cầm và gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi (Kikuyasu Nakamura, 2000; Ewers et al., 2003; Nolan et al. Bệnh làm tăng tỷ lệ chết, giảm năng suất và tăng tỷ lệ gia cầm loại thải (Barnes et al.

Bệnh có thể được điều trị bằng kháng sinh, tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh thiếu thận trọng ở người và vật nuôi có thể dẫn đến sự xuất hiện của vi khuẩn kháng kháng sinh (Helmy et al. coli có tính linh hoạt di truyền và khả năng thích ứng nhanh với môi trường nên nó dễ hình thành nhiều cơ chế đề kháng với kháng sinh. coli có mặt khắp nơi trong đường tiêu hóa của động vật máu nóng nên được xem là vi khuẩn chỉ thị để theo dõi tình trạng đề kháng kháng sinh ở động vật (bao gồm cả gia cầm) (European Food Safety Authority, 2019; Anjum et al. Đề kháng kháng sinh được xem là vấn đề nghiêm trọng, đe dọa đến sức khỏe toàn cầu.

Theo báo cáo của Trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease Control and Prevention - CDC), đề kháng kháng sinh là nguyên nhân hàng đầu khiến hơn 25.000 người ở Châu Âu và thậm chí hơn 700.000 người trên thế giới đã chết mỗi năm do nhiễm trùng mà không thể điều trị được bằng kháng sinh, do vi khuẩn kháng thuốc. Các tiên lượng cho biết hậu quả sẽ còn tồi tệ hơn, nếu tình trạng đề kháng kháng sinh vẫn tiến triển như hiện tại thì đến năm 2050, đề kháng kháng sinh sẽ gây ra khoảng 10 triệu ca tử vong mỗi năm, vượt qua cả ung thư - là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới hiện nay (O’Neill, 2014; Kraker et al. Một số nghiên cứu gần đây về việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà ở Việt Nam cho thấy mức độ sử dụng kháng sinh rất cao (lượng kháng sinh sử dụng tính theo đầu gia cầm cao gấp 6 lần so với mức ghi nhận được ở một số nước châu Âu); trong đó có đến 84% kháng sinh được sử dụng để phục vụ cho mục đích phòng bệnh (Carrique Mas et al. Trong một khảo sát tại tỉnh Tiền Giang cho thấy có đến 72% số trại chăn nuôi sử dụng ít nhất một loại kháng sinh để phòng và điều trị bệnh cho gà.

Đặc biệt, một số loại kháng sinh quan trọng trong điều trị bệnh cho con người cũng được dùng trong chăn nuôi (Nguyen Van Cuong et al. Tại thành phố Hồ Chí Minh, có đến 32,6% cơ sở nuôi gà thịt sử dụng kháng sinh không hợp lý và 44,5% các cơ sở không ngừng sử dụng thuốc kháng sinh trước khi giết thịt đúng theo quy định (Võ Thị Trà An và ctv. Việc sử dụng kháng sinh không hợp lý sẽ tạo ra các sản phẩm chăn nuôi không đảm bảo an toàn cho người sử dụng, dễ dẫn đến sự phát sinh và phát triển tính kháng thuốc của vi khuẩn (Asokan & Kasimanickam, 2013). Ngoài ra, một số chủng E.

coli lưu trú trên gia cầm còn là nguồn gen tiềm ẩn đề kháng kháng sinh có thể lây truyền sang người (Lutful Kabir, 2010; Kheiri & Akhtari, 2016). 1 Hiện nay, có nhiều giải pháp thay thế kháng sinh như: probiotic, prebiotic, axít hữu cơ, tinh dầu, enzyme, chất kích thích miễn dịch và phytogenic (phytobiotic) bao gồm các loại thảo mộc, tinh dầu thực vật. được bổ sung vào trong thức ăn gia cầm ngày càng phổ biến và đóng vai trò cải thiện lượng ăn vào, tăng hệ số chuyển hóa thức ăn, cải thiện khả năng miễn dịch, cũng như khả năng hấp thu dưỡng chất và khả năng kháng khuẩn,. giúp giảm thiểu tình trạng lạm dụng kháng sinh, đồng thời góp phần mang lại hiệu quả trong điều trị bệnh E.

coli và các bệnh nhiễm khuẩn cho gia cầm (Mohamed et al. Trong hệ tiêu hóa của động vật, các loài vi sinh vật và các chủng vi khuẩn hội sinh thường xuyên bị tác động bởi kháng sinh trong quá trình sản xuất; quần thể vi sinh vật luôn có sự tương tác qua lại với nhau trong hệ thống tiêu hóa. Vì vậy, cơ chế tác động, kiểu gen và kiểu hình đề kháng kháng sinh diễn biến rất phức tạp, không chỉ dựa trên một hoặc một vài chủng vi khuẩn. Sự tương tác của các vi sinh vật và kháng sinh ở động vật còn nhiều vấn đề cần được sáng tỏ do sự đa dạng về liều lượng, đường dùng và dược lực học của từng loại kháng sinh thay đổi tùy theo vật chủ, khiến cho bức tranh về đề kháng kháng sinh trở nên phức tạp hơn (Luo et al.

Các nghiên cứu trước đây thường chỉ khảo sát sự đề kháng của một vài chủng vi khuẩn riêng lẻ, trong khi sự đề kháng kháng sinh ở cấp độ quần thể chưa được nghiên cứu. Ngoài ra, các nghiên cứu về sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn theo thời gian, đặc biệt là E. coli trên các loài vật nuôi, cũng như trên gia cầm còn rất ít. Vấn đề đặt ra là sau thời gian sử dụng kháng sinh hay các sản phẩm thay thế kháng sinh có gây ra sự đề kháng ở vi khuẩn hoặc làm giảm tính đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Khảo sát sự thay đổi tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli và thử nghiệm sản phẩm thay thế kháng sinh trong phòng, trị bệnh Escherichia coli trên gà tại tỉnh Đồng Tháp”. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát sự thay đổi tính đề kháng kháng sinh của hệ vi sinh vật đường ruột thông qua sự hiện diện của các gen đề kháng ở vi khuẩn trên gà và chuột, khảo sát hiệu quả của một số chế phẩm sinh học trong phòng, trị bệnh E. coli cho gà cũng như tiềm năng thay thế kháng sinh trong chăn nuôi. 2 CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử phát hiện Vi khuẩn E.

coli được phân lập lần đầu tiên từ phân trẻ em vào năm 1885 bởi nhà khoa học Theodore Escherich (1857-1911), vi khuẩn được xếp loại vào ngành Proteobacteria, lớp Gamma proteobacteria, bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia, loài Escherichia coli (Scheutz & Strockbine, 2005). Trên gia cầm, E. coli được Lignieres phân lập lần đầu tiên từ tim, gan và lách của gà chết vào năm 1894. Từ năm 1894 đến năm 1922, bệnh được phát hiện trên gà gô trắng, bồ câu, thiên nga, gà tây, chim cút.

Ngoài ra, bệnh nhiễm trùng máu do E. coli trên những gà chết có triệu chứng giống như bệnh tụ huyết trùng đã được báo cáo lần đầu vào năm 1907. (Barnes et al. Lignieres cho rằng trong những điều kiện nhất định, E.

coli thường trú trong ruột rời khỏi ruột trở nên có độc lực và gây bệnh nhiễm trùng máu ở gà đẻ, đặc biệt nếu sức đề kháng của gà bị giảm do đói, khát, lạnh hoặc môi trường chăn nuôi thiếu thông thoáng. coli gây bệnh viêm ruột trên gà đã được mô tả và phân lập. coli được mô tả và phân lập ở nhiều bệnh tích khác nhau như: bệnh u hạt, viêm túi khí, viêm khớp, viêm da, viêm cuống rốn, viêm mắt, viêm phúc mạc và viêm ống dẫn trứng (Barnes et al.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn E. coli là một loại trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước 2-3 μm x 0,6 μm.

coli có hình cầu đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Trong các môi trường nuôi cấy khác nhau, vi khuẩn dài 4-8 μm, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già. coli di động do có lông ở xung quanh thân nhưng cũng có một số không di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu khoảng giữa nhạt hơn, có thể hình thành giáp mô khi gặp môi trường dinh dưỡng tốt (Hirsh, 2004).

coli phát triển trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí trên môi trường dinh dưỡng ở nhiệt độ 18-44oC, pH từ 7,2-7,4. coli lên men carbohydrate và thường sinh khí. Thời gian tăng sinh và số lượng E. coli trong thời gian phát triển có liên quan đến nhiệt độ nuôi cấy.

coli phát triển tốt trên các môi trường MacConkey (MC), Eosin Methylene Blue (EMB) hình thành nên các khuẩn lạc điển hình có thể phân biệt được với các vi khuẩn khác. Trên môi trường MC vi khuẩn E. coli lên men đường lactose sẽ hình thành khuẩn lạc màu đỏ hồng, to, tròn đều, mặt khuẩn lạc hơi lồi, không nhầy, viền gọn được bao quanh vòng đục, kích thước từ 2-3 mm; những vi khuẩn E. coli không lên men đường lactose sẽ hình thành khuẩn lạc có màu nhạt.

Trên môi trường EMB khuẩn lạc E. coli to, tròn, hơi lồi bóng, màu tím sẫm, có ánh kim (Barnes et al. Ngoài ra, vi khuẩn E. coli có thể được nuôi cấy trên môi trường Tryptone Bile X-Glucuronide (TBX) có chứa chất BCIG (5-bromo-4-chloro-3- 3 indolyl-D-glucuronic axít) hay còn gọi với tên khác là X-glucuronide, sự xuất hiện của enzyme β-D-Glucuronidase do E.

coli tạo ra sẽ cắt đứt liên kết giữa 5-bromo-4-chloro-3- indolyle (chrompohore) và D-glucuronide. Dưới tác nhân oxy hóa, các phân tử chrompohore phản ứng với nhau tạo thành dichloro-dibromo indigo, chính những phân tử dichloro-dibromo indigo này tạo nên màu xanh lá đặc trưng của khuẩn lạc E.3 Đặc tính sinh hóa Một số thử nghiệm sinh hóa phổ biến dùng để định danh E. coli được thực hiện như: thử nghiệm Indole (I) dương tính; Methyl Red (MR) dương tính; Voges – Proskauer âm tính (Mion et al., 2016); không sử dụng citrate (Ci); không sinh H2S, di động, lên men đường lactose, glucose, sinh khí trên môi trường Kligler Iron Agar (Mac Faddin, 2000). Thử nghiệm Indol: những vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng phân giải tryptophan trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol.

Indol khi kết hợp với paradimethylamino-benzaldehyd có trong thuốc thử Kovac’s sẽ tạo thành hợp chất muối dimethulammonium có màu đỏ, kết quả phản ứng Indole dương tính. Thử nghiệm MR: các vi khuẩn đường ruột thường có khả năng lên men đường glucose tạo thành axít pyruvic. Axít pyruvic lại tiếp tục chuyển hóa thành nhiều loại axít hữu cơ khác như: axít acetic, axít lactic, axít succinic, làm cho pH của môi trường nuôi cấy vi khuẩn hạ thấp xuống dưới 4,5. Chất chỉ thị MR giúp nhận biết độ pH của môi trường nuôi cấy sau khi vi khuẩn lên men glucose.

Khi nhỏ chất chỉ thị MR vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn, chất chỉ thị MR vẫn giữ màu đỏ là phản ứng dương tính, chất chỉ thị MR chuyển sang màu vàng là phản ứng âm tính.