Luận văn thạc sĩ nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía bắc việt nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu đặc tính virus Marek ở gà công nghiệp phía Bắc Việt Nam, đề xuất giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh.

• Tác giả: Hà Văn Quyết
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Quang Tuyên
• Trường học: Đại học Thái Nguyên - Trường Đại học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Ký sinh trùng và Vi sinh vật học thú y
• Đề tài: Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình lưu hành bệnh Marek ở trong nước và trên thế giới
• 1.2. Tình hình lưu hành bệnh Marek ở Việt Nam
• 1.3. Cơ sở khoa học của đề tài
• 1.4. Đặc tính sinh học cơ bản của virus gây bệnh Marek
• 1.5. Triệu chứng lâm sàng bệnh Marek
• 1.6. Bệnh tích của bệnh Marek
• 1.7. Chẩn đoán bệnh Marek
• 1.8. Dịch tễ học bệnh Marek
• 1.9. Miễn dịch chống lại MDV
• 1.10. Vắc xin với việc kiểm soát và phòng ngừa bệnh Marek
• 1.11. Các giải pháp phòng và trị bệnh Marek
• 2. NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nội dung nghiên cứu
• 2.2. Phân lập virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam
• 2.3. Nghiên cứu xác định độc lực và gây bệnh thực nghiệm virus Marek phân lập được trên các giống và lứa tuổi gà
• 2.4. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý đặc trưng do virus Marek phân lập được đối với gà thí nghiệm
• 2.5. Nghiên cứu thử nghiệm phối hợp chất bổ trợ với vắc xin để tăng cường hiệu quả miễn dịch của vắc xin phòng bệnh Marek
• 2.6. Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu
• 2.6.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.6.2. Hóa chất, sinh phẩm và môi trường nuôi cấy
• 2.6.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.6.3.1. Địa điểm nghiên cứu
• 2.6.3.2. Thời gian nghiên cứu
• 2.7. Phương pháp nghiên cứu
• 2.7.1. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu
• 2.7.2. Phương pháp phân lập MDV và nhuộm Plaque
• 2.7.3. Phương pháp hóa mô
• 2.7.4. Phương pháp xác định độc lực của virus trên phôi trứng gà
• 2.7.5. Phương pháp PCR và xác định trình tự gen Meq
• 2.7.6. Phương pháp Real-Time PCR định lượng số copy genome của virus MDV
• 2.7.7. Bố trí thí nghiệm xác định khả năng gây bệnh của MDV trên các giống gà và lứa tuổi gà
• 2.7.8. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các chất tăng cường miễn dịch đến hiệu quả của vắc xin HVT/Rispens
• 2.7.9. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập virus Marek
• 3.2. Kết quả mổ khám gà nghi mắc bệnh Marek ở một số địa phương
• 3.3. Phân lập virus Marek
• 3.4. Đặc tính gene của virus Marek chủng MDV 6
• 3.5. Khả năng gây bệnh của chủng MDV phân lập được
• 3.6. Khả năng gây bệnh của MDV 6.13 trên các giống gà thí nghiệm
• 3.7. Khả năng gây bệnh của MDV phân lập được trên các giống gà thí nghiệm ở các độ tuổi khác nhau
• 3.8. Nghiên cứu sự bài thải của virus từ gà thí nghiệm gây nhiễm virus gây bệnh MDV
• 3.9. Biểu hiện bệnh tích ở gà thí nghiệm do chủng MDV phân lập được gây nên
• 3.10. Biểu hiện tổn thương đại thể ở các tổ chức của gà thí nghiệm
• 3.11. Biểu hiện tổn thương vi thể ở các tổ chức của gà thí nghiệm
• 3.12. Kết quả xác định khả năng gây bệnh trên phôi gà của MDV phân lập
• 3.13. Kết quả xác định khả năng gây bệnh trên môi trường tế bào xơ phôi vịt một lớp của MDV phân lập
• 3.14. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất tăng cường miễn dịch đến hiệu quả bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek
• 3.15. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch sự hình thành đáp ứng miễn dịch của gà thí nghiệm với vắc xin phòng bệnh Marek
• 3.16. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự hình thành khối u trong các tổ chức của gà thí nghiệm công cường độc
• 3.17. Tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong các cơ quan có chức năng miễn dịch của gà thí nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng cường miễn dịch
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus Marek và bệnh Marek

Virus Marek (MDV) là tác nhân gây bệnh Marek ở gà, một bệnh lý nguy hiểm trong ngành chăn nuôi gia cầm. Bệnh đặc trưng bởi sự tăng sinh tế bào lympho, hình thành khối u ở các cơ quan nội tạng và tổn thương thần kinh, dẫn đến bại liệt. Bệnh Marek được phát hiện lần đầu vào năm 1907 và đến năm 1967, virus mới được phân lập tại Anh và Mỹ. Ở Việt Nam, bệnh bùng phát mạnh vào những năm 1980 và vẫn tiếp tục gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngành chăn nuôi gà công nghiệp, đặc biệt là ở miền Bắc.

1.1. Tình hình lưu hành bệnh Marek tại Việt Nam

Theo nghiên cứu của Phan Văn Lục và cộng sự (2008), bệnh Marek đã xuất hiện ở nhiều địa phương như Châu Thành (1982) và Cầu Diễn (1984), buộc phải hủy toàn bộ đàn gà. Mặc dù đã áp dụng vắc xin và các biện pháp vệ sinh, bệnh vẫn xuất hiện với tỷ lệ 3-5% ở các đàn gà giống. Các tỉnh như Đồng Nai, Bình Dương, Long An và Tiền Giang cũng ghi nhận nhiều trường hợp bùng phát dịch. Dịch bệnh gia cầm này không chỉ gây thiệt hại kinh tế mà còn ảnh hưởng đến môi trường và xã hội.

1.2. Đặc tính sinh học của virus Marek

Virus Marek thuộc nhóm Herpesvirus, có khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường và lây lan nhanh qua đường hô hấp. Virus này gây hai dạng bệnh chính: tăng sinh lympho và suy giảm miễn dịch. Đặc tính virus này khiến việc kiểm soát và phòng ngừa bệnh trở nên phức tạp, đặc biệt là trong điều kiện chăn nuôi công nghiệp tập trung.

II. Nghiên cứu đặc tính virus Marek ở gà công nghiệp miền Bắc

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và xác định đặc tính virus của chủng MDV 6.13, một chủng virus Marek lưu hành tại miền Bắc Việt Nam. Chủng này được phân lập từ các đàn gà công nghiệp đã tiêm vắc xin nhưng vẫn mắc bệnh. Nghiên cứu virus này cung cấp cơ sở khoa học quan trọng để đánh giá diễn biến dịch bệnh và phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

2.1. Phân lập và xác định độc lực của virus

Chủng MDV 6.13 được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của gà mắc bệnh tại các tỉnh phía Bắc. Độc lực virus được đánh giá thông qua các thí nghiệm gây bệnh trên gà thí nghiệm, cho thấy khả năng gây bệnh mạnh và tỷ lệ tử vong cao. Kiểm soát virus này đòi hỏi các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả hơn.

2.2. Đặc điểm bệnh lý và tổn thương do virus gây ra

Các tổn thương đại thể và vi thể do chủng MDV 6.13 gây ra được ghi nhận ở các cơ quan như lách, thận, tim và dây thần kinh ngoại biên. Bệnh tích này phản ánh mức độ nghiêm trọng của bệnh và cung cấp thông tin quan trọng cho việc chẩn đoán và điều trị.

III. Giải pháp tăng hiệu quả vắc xin phòng bệnh Marek

Một trong những mục tiêu chính của nghiên cứu là tìm ra giải pháp tăng hiệu quả của vắc xin phòng bệnh Marek. Các thí nghiệm được tiến hành để đánh giá hiệu quả của việc phối hợp vắc xin với các chất tăng cường miễn dịch, nhằm nâng cao khả năng bảo hộ của vắc xin.

3.1. Thử nghiệm phối hợp chất bổ trợ với vắc xin

Các chất bổ trợ như Poly I:C và CPG-ODN được sử dụng để tăng cường đáp ứng miễn dịch của vắc xin. Kết quả cho thấy, việc phối hợp này làm tăng đáng kể hiệu quả vắc xin, giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong ở gà thí nghiệm. Công nghệ vắc xin này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc nâng cao hiệu quả phòng bệnh.

3.2. Ứng dụng thực tiễn và ý nghĩa kinh tế

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn lớn, giúp giảm thiệt hại do bệnh Marek gây ra và tăng thu nhập cho người chăn nuôi. Giải pháp tăng hiệu quả này cũng góp phần thúc đẩy ngành chăn nuôi gia cầm phát triển bền vững, đặc biệt là trong bối cảnh dịch bệnh gia cầm ngày càng phức tạp.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghiên cứu của nghiên cứu sinh Hà Văn Quyết (2017) với đề tài "Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía Bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh" (chuyên ngành Ký sinh trùng và Vi sinh vật học thú y, Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên) giải quyết một trong những thách thức kinh tế - kỹ thuật nghiêm trọng nhất của ngành chăn nuôi gia cầm công nghiệp. Tại Việt Nam, ngành chăn nuôi gà đạt quy mô 252 triệu con với sản lượng trên 500 ngàn tấn thịt và 8,5 tỷ quả trứng vào năm 2016 (chiếm 3,15% GDP cả nước). Tuy nhiên, dịch bệnh do virus Marek (Gallid herpesvirus 2 - GaHV-2, thuộc phân họ Alphaherpesvirinae, chi Mardivirus) bùng phát liên tục tại các trang trại gà nuôi công nghiệp và gà đẻ thương phẩm tại các tỉnh phía Bắc như Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Nội dù đàn gà đã được tiêm phòng đầy đủ các dòng vắc xin thương mại như HVT hoặc CVI988/Rispens lúc 1 ngày tuổi, với tỷ lệ chết và loại thải ghi nhận từ 25% đến 30%.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi được xác định là: sự thiếu vắng dữ liệu hoàn chỉnh về đặc tính sinh học phân tử, độc lực thực địa và biến dị của gen sinh ung thư Meq của các chủng virus Marek lưu hành tại Việt Nam; đồng thời thiếu các giải pháp can thiệp miễn dịch bổ trợ (immunoadjuvants) nhằm vượt qua hiện tượng suy giảm hiệu lực bảo hộ chéo của vắc xin cổ điển trước các biến chủng độc lực cao (very virulent - vvMDV hoặc very virulent plus - vv+MDV). Đúng như tác giả trích dẫn: "Các loại vắc xin hiện đang sử dụng được tạo ra từ những chủng kinh điển, sử dụng lâu dài trên toàn thế giới không hoàn toàn phù hợp với các biến chủng mới, độc lực cao xuất hiện thường xuyên ở các vùng địa lý khác nhau" (Hà Văn Quyết, 2017).

Luận án thiết lập 4 câu hỏi nghiên cứu (RQ) và giả thuyết khoa học (H) cốt lõi:

1. RQ1 & H1: Virus Marek đang lưu hành tại các trang trại phía Bắc có mang các đột biến gen chỉ thị độc lực cao và duy trì khả năng gây bệnh ác tính trên gà công nghiệp hay không? Giả thuyết cho rằng chủng thực địa mang đột biến gen sinh ung thư Meq đặc trưng cho các biến chủng cường độc.
2. RQ2 & H2: Mức độ mẫn cảm và sinh bệnh học của virus Marek biến thiên như thế nào theo nguồn gốc di truyền giống gà (Gà Ri, Lương Phượng, Ross 308) và lứa tuổi gây nhiễm (1 ngày, 1 tuần, 1 tháng, 3 tháng tuổi)? Giả thuyết cho rằng giống gà hướng thịt cao sản và độ tuổi sơ sinh có độ mẫn cảm cao nhất với liều gây nhiễm chuẩn 2.000 PFU.
3. RQ3 & H3: Bệnh tích đại thể, vi thể và động học bài thải virus qua nang lông biểu hiện như thế nào trong điều kiện thực nghiệm? Giả thuyết cho rằng virus gây teo cơ quan lympho sơ cấp kết hợp tăng sinh lympho ác tính đa cơ quan và bài thải mạnh qua biểu mô nang lông.
4. RQ4 & H4: Sự kết hợp giữa vắc xin đa giá thương mại (HVT/Rispens) với các phân tử điều hòa miễn dịch (CpG-ODN, Poly I:C, cytokine tái tổ hợp IFN-α, IFN-β, IFN-γ) có kích hoạt đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và thu được, ức chế sự nhân lên của virus cường độc hay không? Giả thuyết khẳng định các chất kích hoạt TLRs và cytokine giúp giảm thiểu đáng kể số bản sao gen Meq và ức chế hình thành khối u lympho.

Về quy mô và phạm vi nghiên cứu: Đề tài thu thập 126 mẫu bệnh phẩm từ các trang trại gà 60–100 ngày tuổi tại Hà Nội, Vĩnh Phúc, Phú Thọ; tiến hành thử nghiệm in vivo trên 480 cá thể gà (360 gà thí nghiệm và 120 gà đối chứng thuộc 3 giống qua 4 lứa tuổi), phân lập thành công chủng MDV 6.13, giải trình tự đoạn gen Meq 1.081 bp, và định lượng tải lượng virus bằng Real-time PCR huỳnh quang (Meq 73 bp amplicon).

Literature Review và Positioning

Bệnh Marek được József Marek mô tả lần đầu vào năm 1907 và virus GaHV-2 được Churchill và Biggs phân lập thành công vào năm 1967 (Churchill et al., 1967; Biggs et al., 1965). Tổng quan tài liệu quốc tế chỉ ra sự tiến hóa liên tục về độc lực của virus Marek dưới áp lực chọn lọc của vắc xin: từ các chủng độc lực cổ điển (mild/virulent - mMDV/vMDV) trong thập niên 1960–1970 sang các chủng rất độc (very virulent - vvMDV) trong thập niên 1980 và cực độc (very virulent plus - vv+MDV) từ thập niên 1990 đến nay (Witter et al., 1997; Baigent et al., 2004).

Trong y văn tồn tại hai luồng quan điểm và tranh luận khoa học lớn:

• Trường phái chọn lọc vắc xin (Vaccine-driven virulence evolution): Đứng đầu bởi Gimeno (2008) và Osterrieder et al. (2006), cho rằng vắc xin Marek là "vắc xin rò rỉ" (leaky vaccine) – giúp gia cầm không bị chết hoặc hình thành khối u nhưng không ngăn chặn được sự nhân lên và bài thải của virus thực địa qua nang lông. Điều này tạo áp lực tiến hóa bắt buộc virus phải đột biến tăng độc lực để tồn tại.
• Trường phái quản trị miễn dịch và di truyền (Host genetics & Immunomodulation): Đứng đầu bởi Calnek (2001), Bacon et al. (2001) và Burgess et al. (2002), nhấn mạnh rằng sự thất bại vắc xin bắt nguồn từ tính mẫn cảm di truyền của các dòng gà cao sản hướng thịt/trứng thương mại, sự can thiệp của kháng thể mẹ truyền làm trung hòa virus vắc xin, và hiện tượng ức chế miễn dịch đa pha (biphasic immunosuppression) do các yếu tố môi trường và stress nuôi nhốt gây ra.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế đương đại:

• Tại Romania, Ionica et al. (2009) ghi nhận ổ dịch trên đàn gà giống hướng thịt gây chết 12.000 con trong 6 tuần, với tỷ lệ chết 12,06% (trong đó 9,0% do MDV).
• Tại Ấn Độ, Arulmozhi et al. (2011) xác định các ổ dịch Marek trên đàn gà Leghorn trắng đã tiêm phòng tại Tamil Nadu với tỷ lệ chết dao động từ 10% đến 40%.
• Tại Trung Quốc, Xinyu et al. (2015) báo cáo dịch Marek trên gà Broiler 24–30 tuần tuổi tại An Huy với tỷ lệ chết lên tới 80% trên số gà phát bệnh; trong khi Zhenhua Gong et al. (2013) phân lập chủng cực độc SD2012-1 tại Sơn Đông có khả năng vượt qua hoàn toàn hàng rào bảo vệ của vắc xin HVT kết hợp SB-1.

Tại Việt Nam, các công trình trước đây của Hồ Đình Chúc (1984, 1987), Lê Văn Năm (2003) và Phan Văn Lục (2008) chủ yếu dừng lại ở điều tra dịch tễ học lâm sàng, giải phẫu bệnh lý và chẩn đoán huyết thanh học thô (AGID). Luận án của Hà Văn Quyết định vị bước tiến đột phá bằng việc lần đầu tiên phân lập, giải mã phân tử gen sinh ung thư Meq của chủng virus Marek bản địa (MDV 6.13) và thiết lập mô hình thử nghiệm phối hợp chất bổ trợ điều hòa miễn dịch sinh học để tối ưu hóa vắc xin thương mại.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc thêm các lý thuyết nền tảng trong vi sinh vật học và miễn dịch học thú y:

1. Mở rộng lý thuyết biến đổi ung thư do gen Meq (Meq Oncoprotein Transformation Theory): Luận án củng cố mô hình của Parcells et al. (2003) và Lupiani et al. (2001) về vai trò của oncoprotein Meq (Marek's EcoRI-Q-encoded protein) – một yếu tố phiên mã chứa cấu trúc bZIP (basic leucine zipper). Gen Meq biểu hiện liên tục trong pha tiềm ẩn, dimer hóa với c-Jun để ức chế quá trình tự chết (apoptosis) của tế bào lympho T CD4+, thúc đẩy chuyển dạng khối u lympho ác tính và duy trì mức độ tiềm tan (latency-lytic switch).
2. Bổ sung lý thuyết ức chế miễn dịch đa pha (Biphasic Immunosuppression Model): Xác thực luận điểm của Faiz et al. (2016) và Schat et al. (1982), chứng minh pha 1 xảy ra sớm (2–7 ngày sau nhiễm) do sự phá hủy tiêu bào lympho B và lympho T tại lách, tuyến ức, túi Fabricius; pha 2 liên quan đến việc virus giải phóng viral Interleukin-8 (vIL-8) thu hút tế bào T hoạt hóa, đồng thời tế bào u biểu hiện thụ thể CD30 và cytokine ức chế IL-10 làm tê liệt hoàn toàn hệ miễn dịch tế bào vật chủ.
3. Phát triển lý thuyết kích hoạt thụ thể nhận diện mẫu (Pattern Recognition Receptor / TLR Activation Paradigm): Cung cấp bằng chứng thực nghiệm rằng việc kích hoạt nhân tạo các thụ thể nội bào TLR3 (bằng Poly I:C) và TLR21 ở gia cầm (bằng CpG-ODN) kết hợp bổ sung cytokine ngoại sinh (IFN-γ, IL-12p40) có thể bù đắp khiếm khuyết miễn dịch bẩm sinh, thúc đẩy biệt hóa tế bào T helper-1 (Th1) và tế bào lympho T độc (CTLs CD8+), tái thiết lập khả năng kiểm soát sự sao chép của virus.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của đề tài tích hợp liên ngành giữa:

• Dịch tễ học phân tử (Molecular Epidemiology): Nhắm mục tiêu vào hệ gen ADN mạch đôi ~174 kb của MDV-1 (GaHV-2), tập trung vào trình tự gen Meq (1.081 bp).
• Sinh bệnh học thực nghiệm (Experimental Pathogenesis): Đánh giá độc lực in vivo trên phôi gà (nốt đậu CAM/Foxes) và trên 3 giống gà đại diện cho các mức độ đề kháng di truyền khác nhau qua 4 mốc thời gian phát triển cá thể.
• Dược lý miễn dịch vắc xin (Vaccine Immunopharmacology): Đánh giá tương tác hiệp đồng giữa kháng nguyên vắc xin sống giảm độc (HVT serotype 3 và Rispens CVI988 serotype 1) với các chất bổ trợ miễn dịch sinh học.

Khung phân tích thiết lập điều kiện biên (boundary conditions): Áp dụng cho các giống gà nuôi công nghiệp và bán công nghiệp trong điều kiện chuồng nuôi kín có kiểm soát, phân tích đáp ứng miễn dịch trong giới hạn liều công cường độc 2.000 PFU/cá thể qua đường tiêm bắp cánh.

       [Virus Marek Thực địa (MDV 6.13)]
[Gen sinh ung thư Meq]       [Độc lực & Sinh bệnh học in vivo]
 (Giải trình tự 1.081 bp)     (Gây nhiễm 3 giống gà x 4 lứa tuổi)
        [Cơ chế bệnh học lympho & ức chế MD]
        - Teo túi Fabricius, tuyến ức, lách
        - U hạt / lan tỏa tại nội tạng & thần kinh
        - Động học bài thải virus qua nang lông
[Can thiệp Miễn dịch: Vắc xin HVT/Rispens + Chất bổ trợ]
 (CpG-ODN, Poly I:C, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-12p40)
       [Đánh giá Hiệu lực Bảo hộ Đột phá]
       - Định lượng Real-time PCR gen Meq
       - Nồng độ kháng thể MDV IgG & Cytokines
       - Tỷ lệ bảo hộ lâm sàng & triệt tiêu khối u

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu vận hành theo hệ hình thực chứng (positivism) với thiết kế thực nghiệm định lượng nghiêm ngặt. Hệ thống thí nghiệm được chia thành các hợp phần đa tầng (multi-level design):

1. Phân lập và định danh virus vi mô: Sử dụng tế bào xơ phôi vịt một lớp (Duck Embryo Fibroblast - DEF) nuôi cấy trong môi trường Leibovitz's L-15 bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS), ủ tại 37°C và 5% CO2.
2. Thí nghiệm sinh bệnh học đa yếu tố: Ma trận thực nghiệm 3 x 4 gồm 3 giống gà (Gà Ri bản địa, Gà Lương Phượng thả vườn cải tiến, Gà siêu thịt thương phẩm Ross 308) x 4 lứa tuổi gây nhiễm (1 ngày tuổi, 1 tuần tuổi, 1 tháng tuổi, 3 tháng tuổi). Mỗi lô thí nghiệm gồm $n = 30$ con (tổng cộng 12 lô gây nhiễm = 360 con) và lô đối chứng tương ứng $n = 10$ con (tổng cộng 12 lô đối chứng = 120 con).
3. Thí nghiệm thử nghiệm chất bổ trợ miễn dịch: Đánh giá hiệu lực của vắc xin đa giá MD-Vac CFL (chủng Rispens CVI988 và HVT FC-126 do Zoetis Inc., Hoa Kỳ sản xuất) khi kết hợp đơn lẻ hoặc phối hợp với các chất tăng cường miễn dịch (CpG-ODN, Poly I:C, IFN-α, IFN-β, IFN-γ).

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu thập và xử lý bệnh phẩm tuân thủ tiêu chuẩn vô trùng nghiêm ngặt:

• Tách tế bào lympho từ máu toàn phần chống đông qua dung dịch phân tầng Ficoll-Paque.
• Nghiền mẫu mô lách, thận, gan trong dung dịch đệm Hank's, ly tâm 1.500 vòng/phút trong 3 phút, xử lý kháng sinh hoạt phổ rộng (10³ µg/ml Streptomycin, 10³ µg/ml Benzyl Penicillin, 25 U/ml Fungizone) và lọc qua màng lọc sinh học 0,45 µm.
• Mẫu nang lông vũ ngâm chiết trong dung dịch đệm SPGA/EDTA (0,0% Bovine albumin, 0,2% EDTA, pH 6,5).
• Nuôi cấy phôi trứng gà 9–11 ngày tuổi: Tiêm dịch huyền phù virus 0,2 ml vào xoang niệu mô màng CAM (Chorioallantoic Membrane). Độc lực virus được chuẩn hóa thông qua đếm số nốt sần trắng (pock lesions/Foxes). Màng CAM có $> 20$ Fox được khẳng định dương tính.
• Nhuộm Plaque: Nuôi cấy virus trên đĩa 6 giếng DEF với mật độ $0,5 - 1 \times 10^5$ tế bào/giếng, phủ lớp thạch Agarose 0,5% trong môi trường DMEM + 5% FBS + HEPES. Sau 5–6 ngày, nhuộm Trypan Blue để xác định các đám hoại tử tế bào không bắt màu dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400x–1.600x).
• Phương pháp hóa mô kinh điển: Cố định mẫu bệnh phẩm trong formol đệm trung tính 10%, đúc khối parafin, cắt lát siêu mỏng 0,3 µm, nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE) để quan sát sự thâm nhiễm tế bào lympho đa hình thái, đa nhân ác tính.

[Mẫu bệnh phẩm: Máu, Lách, Thận, Lông]
[Tách Ficoll / Xử lý SPGA-EDTA / Lọc 0,45 µm]
[Nuôi cấy tế bào DEF]                  [Tiêm phôi gà CAM 9-11 ngày]
 - Theo dõi CPE đa nhân khổng lồ        - Đếm nốt sần Fox (>20 nốt: (+))
 - Nhuộm Plaque (Trypan Blue)           - Thu hoạch màng CAM bệnh lý
       [Phân lập thành công chủng MDV 6.13]
[Phân tích Phân tử]                   [Gây nhiễm In Vivo & Bổ trợ]
 - PCR nhân đoạn gen Meq 1.081 bp       - 480 gà (Ri, Lương Phượng, Ross 308)
 - Giải trình tự ABI 3100               - Liều 2.000 PFU tiêm bắp cánh
 - Real-time PCR Meq định lượng (73 bp) - Phối hợp vắc xin + CpG/Poly I:C/IFNs
 - Khảo sát Cytokine & IgG bằng ELISA   - Mổ khám bệnh tích đại thể & vi thể

Data và phân tích

Luận án áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và phân tích dữ liệu tiên tiến:

• Kỹ thuật PCR gen Meq: Sử dụng cặp mồi xuôi 5'-GGCACGGTACAGGTGTAAAGAG-3' và mồi ngược 5'-GCATAGACGATGTGCTGCTGAG-3' để khuếch đại đoạn gen đích 1.081 bp. Chu trình nhiệt gồm biến tính 94°C/5 phút; 31 chu kỳ (94°C/1 phút, 55°C/30 giây, 72°C/1 phút); kéo dài 72°C/10 phút. Điện di trên thạch Agarose 1,2% nhuộm Ethidium Bromide, soi dưới đèn UV.
• Giải trình tự gen tự động: Sử dụng hệ thống máy giải trình tự mao quản ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) với hóa chất BigDye Terminator v3. Xử lý và gióng hàng trình tự nucleotide bằng phần mềm BioEdit và công cụ BLAST (NCBI).
• Kỹ thuật Real-time PCR định lượng (TaqMan Probe): Sử dụng hệ thống máy MxPro - Mx3005P (Stratagene) và kit Platinum Quantitative PCR System - UDG (Invitrogen). Thiết kế đoạn mồi khuếch đại 73 bp của gen Meq:
  • Mồi xuôi: 5'-GGTCTGGTGGTTTCCAGGTGA-3' (vị trí 1341–1361)
  • Mồi ngược: 5'-GCATAGACGATGTGCTGCTGA-3' (vị trí 1413–1393)
  • Mẫu dò (TaqMan Probe): 5'-AGACCCTGATGATCCGCATTGCGACT-3' (vị trí 1366–1391), gắn huỳnh quang đầu 5' FAM và chất dập tắt đầu 3' TAMRA.
• Kỹ thuật ELISA định lượng miễn dịch: Sử dụng các bộ kit ELISA chuyên biệt cho gia cầm để đo lường nồng độ kháng thể MDV IgG (MyBioSource, MBS269960) và các cytokine điều hòa: IFN-γ (CAC 1233), α-IFN (CSB-E10071Ch), β-IFN, IL-4, IL-10, IL-12p40 (BlueGene, ABIN1563394).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Phân lập thành công và giải mã chủng MDV 6.13: Lần đầu tiên tại Việt Nam, một chủng virus Marek thực địa cường độc phân lập từ đàn gà công nghiệp tiêm phòng thất bại được giải mã trình tự gen Meq. Đúng như tác giả khẳng định: "Chủng virus MDV 6.13 là chủng virus gây bệnh Marek lần đầu tiên được phân lập và xác định đặc tính gene học, độc lực, gây bệnh cho gà ở Việt Nam" (Hà Văn Quyết, 2017). Phân tích tương đồng chuỗi gen Meq cho thấy MDV 6.13 mang các đột biến axit amin đặc trưng của nhóm virus Marek rất độc (vvMDV/vv+MDV), giải thích nguyên nhân gây thất bại bảo hộ của vắc xin Rispens đơn giá tại thực địa.
2. Quy luật mẫn cảm theo giống và lứa tuổi: Kết quả gây nhiễm thực nghiệm với liều 2.000 PFU chứng minh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết:
   • Gà Ross 308 (hướng thịt cao sản) có tỷ lệ mắc bệnh (lên tới 83,33%) và tỷ lệ chết cao nhất, tiếp theo là gà Lương Phượng (66,67%), và thấp nhất là gà Ri (43,33%).
   • Gà con 1 ngày tuổi mẫn cảm cao nhất với tỷ lệ chết 100% sau 7–28 ngày gây nhiễm; tỷ lệ mẫn cảm giảm mạnh theo độ tuổi: gà 1 tuần tuổi mẫn cảm cao gấp nhiều lần so với gà 1 tháng tuổi và 3 tháng tuổi. Điều này tái khẳng định phát hiện kinh điển: "Gà con 1 ngày tuổi mẫn cảm hơn từ 1.000 lần so với gà 14 - 16 ngày tuổi" (Calnek et al., 1970; Hà Văn Quyết, 2017).
3. Phổ bệnh tích đại thể và vi thể ác tính:
   • Tổn thương gan chiếm tỷ lệ cao nhất (83,33% – 100%) dưới 3 dạng: thể u kết hạt (kích thước 0,5–4 cm), thể u lan tỏa làm gan phì đại mất màu, và thể hỗn hợp.
   • Tổn thương lách ghi nhận ở 85,50% – 98,63% cá thể, lách sưng to gấp 3–6 lần (thậm chí 10–12 lần), mặt cắt lốm đốm đá granito.
   • Dạ dày tuyến tổn thương chiếm 44,66% – 64,20% với hiện tượng loét đỉnh tuyến và xuất huyết hoại tử.
   • Biến đổi thần kinh: Dây thần kinh đùi và cánh phình to mất vân ngang, chuyển màu xám tro, liên quan trực tiếp đến triệu chứng bại liệt "chân trước chân sau" điển hình.
   • Tổn thương tim chiếm 4,76% – 26,51%, tuyến ức 4,38% – 8,88%, và túi Fabricius teo rỗng chứa chất bã đậu khô.
4. Động học bài thải virus qua nang lông: Định lượng bằng Real-time PCR ghi nhận mật độ bản sao gen Meq trong chất độn chuồng và nang lông đạt đỉnh ($\log_{10}$ bản sao rất cao) từ tuần thứ 3 đến tuần thứ 6 sau gây nhiễm, chứng minh nang lông là cơ quan duy nhất bài thải virus hoàn chỉnh có vỏ bọc ra môi trường, tồn tại dai dẳng từ 4 đến 8 tháng trong điều kiện tự nhiên.
5. Hiệu quả đột phá của chất bổ trợ miễn dịch (Immunoadjuvants): Phối hợp vắc xin HVT/Rispens với các chất tăng cường miễn dịch tạo ra bước nhảy vọt về hiệu lực bảo hộ:
   • Nhóm bổ trợ CpG-ODN và Poly I:C kích hoạt mạnh mẽ sự tổng hợp IFN-γ, IFN-α và IL-12p40, đồng thời ức chế cytokine ức chế IL-10.
   • Tỷ lệ giảm số bản sao gen Meq đạt trên 85–92% trong lách, túi Fabricius và tuyến ức của gà sau khi công cường độc so với nhóm chỉ tiêm vắc xin đơn thuần.
   • Triệt tiêu gần như hoàn toàn sự hình thành khối u đại thể tại gan, lách, thận và phục hồi đáp ứng kháng thể trung hòa dịch thể MDV IgG.

Chỉ số Khảo sát / Cơ quan	Nhóm ĐC Cường độc (Không Vắc xin)	Nhóm Vắc xin Đơn thuần (HVT/Rispens)	Nhóm Vắc xin + CpG-ODN / Poly I:C
Tỷ lệ hình thành khối u gan/lách	85,50% – 100%	20,00% – 30,00%	< 5,00% (p < 0,01)
Mức độ giảm bản sao gen Meq (Lách)	0% (Baseline cao)	45,20% – 52,40%	88,50% – 93,20%
Nồng độ IFN-γ huyết thanh	Thấp / Suy giảm	Tăng trung bình	Tăng mạnh (đỉnh sau 72h)
Tổn thương thần kinh đùi & bại liệt	Điển hình (> 75%)	Xuất hiện rải rác (10–15%)	Triệt tiêu hoàn toàn

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Cung cấp bằng chứng thuyết phục chứng minh cơ chế bảo hộ chống virus Marek đòi hỏi sự hiệp đồng bắt buộc giữa miễn dịch dịch thể (ADCC, kháng thể trung hòa) và miễn dịch qua trung gian tế bào (tế bào NK, CTLs CD8+, IFN-γ). Cytokine IFN-γ đóng vai trò ức chế sao chép virus trực tiếp và gián tiếp thông qua kích thích đại thực bào sản sinh Nitric Oxide (NO).
• Về mặt phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình PCR – Real-time PCR định lượng gen Meq và quy trình phân lập virus Marek trên tế bào DEF kết hợp kỹ thuật nhuộm Plaque vô trùng, tạo công cụ chẩn đoán phân tử có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho các phòng thí nghiệm thú y tại Việt Nam.
• Về mặt thực tiễn và chính sách: Khẳng định việc phụ thuộc hoàn toàn vào vắc xin đơn giá nhập khẩu mà không có chất bổ trợ sinh học là nguyên nhân chính gây thủng lưới miễn dịch tại các trại gà công nghiệp. Đề xuất quy trình tiêm phòng phối hợp chất kích thích miễn dịch CpG-ODN/Poly I:C ngay tại lò ấp lúc gà 1 ngày tuổi, kết hợp các biện pháp an toàn sinh học "cùng nhập - cùng xuất" (all-in, all-out) và cách ly tối thiểu 2–3 km giữa các phân khu nuôi.

Limitations và Future Research

Nghiên cứu có các giới hạn khoa học cần được thừa nhận khách quan:

1. Phạm vi địa lý mẫu: Mẫu bệnh phẩm mới chỉ tập trung tại 3 tỉnh, thành phố đại diện phía Bắc (Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Nội), chưa bao quát toàn diện các vùng sinh thái chăn nuôi trọng điểm tại miền Trung và Nam Bộ.
2. Giới hạn giải trình tự hệ gen: Nghiên cứu chỉ tập trung giải trình tự đoạn gen sinh ung thư Meq (1.081 bp) mà chưa giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - 174 kb) của chủng MDV 6.13 để phát hiện thêm các đột biến trên các gen độc lực khác như pp38, gB, ICP4, hoặc vIL-8.
3. Quy mô thử nghiệm chất bổ trợ: Các thử nghiệm phối hợp CpG-ODN, Poly I:C và cytokine mới thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm và chuồng nuôi thực nghiệm có kiểm soát, chưa triển khai thử nghiệm diện rộng (field trials) trên quy mô công nghiệp hàng trăm ngàn con để đánh giá đầy đủ tính khả thi về mặt chi phí - hiệu quả (cost-benefit analysis).

Chương trình nghiên cứu tiếp theo (4–5 hướng cụ thể):

• Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) của chủng MDV 6.13 bằng công nghệ Next-Generation Sequencing (NGS) để xây dựng bản đồ đột biến hoàn chỉnh.
• Thiết lập hệ thống di truyền ngược (Reverse Genetics System) dựa trên Bacterial Artificial Chromosome (BAC) chứa bộ gen MDV 6.13 nhằm tạo đột biến xóa gen Meq để phát triển chủng vắc xin nhược tiểu nội địa thế hệ mới.
• Nghiên cứu công thức hóa nano (nano-encapsulation) các chất bổ trợ CpG-ODN và Poly I:C nhằm kéo dài thời gian giải phóng chậm và tối ưu hóa quy trình tiêm in ovo (tiêm vào phôi trứng 18 ngày tuổi tại lò ấp tự động).
• Mở rộng giám sát dịch tễ học phân tử trên phạm vi toàn quốc để theo dõi sự trôi dạt kháng nguyên (antigenic drift) của các chủng GaHV-2.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Luận án là công trình tiên phong tại Việt Nam công bố trình tự phân tử gen Meq của chủng Marek thực địa; đóng góp nguồn gen virus tham chiếu quý giá cho Ngân hàng Gen Quốc tế (GenBank/NCBI), tạo tiền đề cho hàng loạt công trình nghiên cứu sau đại học về vi sinh vật và miễn dịch học gia cầm.
• Tác động ngành chăn nuôi gia cầm: Cung cấp cơ sở khoa học giúp các tập đoàn chăn nuôi (CP, Japfa Comfeed, Dabaco...) và các trang trại quy mô lớn điều chỉnh quy trình phòng bệnh, giảm thiểu tỷ lệ chết từ 25–30% xuống dưới mức rủi ro kiểm soát được, bảo vệ chuỗi cung ứng thực phẩm thịt và trứng gà.
• Tác động chính sách thú y: Cung cấp luận cứ khoa học để Cục Thú y và Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn hoàn thiện quy chuẩn quốc gia về kiểm soát chất lượng vắc xin Marek nhập khẩu, đưa tiêu chí kiểm tra độc lực chéo với chủng thực địa vào quy trình cấp phép lưu hành sinh phẩm thú y.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học thuật: Tiếp cận cơ sở dữ liệu phân tử, quy trình phân lập trên tế bào DEF, thiết kế mồi/probe Real-time PCR TaqMan định lượng gen Meq, và mô hình nghiên cứu sinh bệnh học in vivo đa yếu tố.
• Các Viện nghiên cứu và Doanh nghiệp sản xuất vắc xin thú y: Nắm bắt công nghệ phối hợp chất bổ trợ phân tử (CpG-ODN, Poly I:C, recombinant cytokines) để nâng cấp các dòng vắc xin hiện hữu hoặc định hướng nghiên cứu sản xuất vắc xin Marek "Made in Vietnam" từ nguồn gen MDV 6.13.
• Bác sĩ thú y và Chủ trang trại chăn nuôi công nghiệp: Hiểu rõ bản chất dịch tễ học và sinh lý bệnh, loại bỏ các sai lầm trong quy trình tiêm phòng, ứng dụng giải pháp bổ trợ miễn dịch để nâng cao tỷ lệ sống và năng suất đàn gà đẻ thương phẩm.
• Nhà quản lý dịch tễ thú y: Có cơ sở dữ liệu dịch tễ chính xác để hoạch định vùng an toàn sinh học và kiểm soát nhập khẩu giống gia cầm an toàn.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?
   Đó là việc mở rộng Lý thuyết biến đổi ung thư do gen Meq (Meq Oncoprotein Transformation Theory) trên chủng virus thực địa Việt Nam (MDV 6.13). Luận án chứng minh đột biến trên gen Meq trực tiếp điều khiển kiểu hình cường độc ác tính, đồng thời chứng minh bằng thực nghiệm rằng đáp ứng miễn dịch kháng khối u đòi hỏi sự kích hoạt trục cytokine Th1 (IFN-γ, IL-12) qua trung gian TLRs chứ không thể chỉ dựa vào kháng thể dịch thể trung hòa thông thường.

2. Cải tiến phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây?
   So với nghiên cứu của Hồ Đình Chúc (1984) và Lê Văn Năm (2003) vốn chỉ sử dụng phản ứng khuếch tán trên thạch (AGID) và quan sát triệu chứng lâm sàng/bệnh tích thô, luận án này đã chuẩn hóa phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi vịt (DEF), nhuộm mảng hoại tử Plaque, giải trình tự mao quản ABI 3100 đoạn gen 1.081 bp và thiết lập phản ứng Real-time PCR TaqMan Probe định lượng chính xác số bản sao bộ gen virus trong mô bào và nang lông với độ nhạy tuyệt đối.

3. Phát hiện bất ngờ nhất (counter-intuitive result) thu được là gì?
   Gà đã được tiêm phòng đầy đủ vắc xin Rispens CVI988 đúng quy trình chuẩn lúc 1 ngày tuổi vẫn có thể bị ức chế miễn dịch nặng và chết do khối u khi tiếp xúc với chủng MDV 6.13 ở liều 2.000 PFU nếu không có chất kích hoạt miễn dịch bẩm sinh. Hiện tượng này khẳng định rằng sự hiện diện của vắc xin sống kinh điển không tự động đồng nghĩa với việc ngăn chặn được sự nhân lên của virus thực địa nếu virus đã tích lũy đột biến trên gen Meq.

4. Nghiên cứu có cung cấp quy trình nhân bản (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?
   Có. Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ thông số kỹ thuật: nồng độ tế bào DEF ($0,5 - 1 \times 10^5$ tế bào/giếng), nồng độ trypsin/EDTA 0,25%, công thức môi trường nuôi cấy Leibovitz's L-15, trình tự các cặp mồi PCR và TaqMan Probe, chu trình nhiệt Real-time PCR, liều công cường độc 2.000 PFU/con và phác đồ phối hợp liều lượng CpG-ODN/Poly I:C.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm được phác thảo như thế nào?
   Lộ trình 10 năm tập trung vào: (i) Giải mã toàn bộ hệ gen (WGS) các chủng Marek tại 3 miền Bắc - Trung - Nam; (ii) Ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược BAC-MDV để tạo chủng vắc xin tái tổ hợp biến đổi gen; (iii) Sản xuất thử nghiệm vắc xin thế hệ mới gắn hạt nano tá dược CpG-ODN; (iv) Thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm trên hệ thống trang trại quy mô triệu con; (v) Thương mại hóa vắc xin nội địa phục vụ thị trường Đông Nam Á.

Kết luận

1. Phân lập, định danh và bảo tồn thành công chủng virus Marek cường độc thực địa đầu tiên tại Việt Nam mang tên MDV 6.13 trên tế bào xơ phôi vịt (DEF) và phôi gà 11 ngày tuổi.
2. Giải mã thành công trình tự đoạn gen sinh ung thư Meq (1.081 bp) của chủng MDV 6.13, phát hiện các chỉ thị đột biến phân tử khẳng định chủng thuộc nhóm virus Marek độc lực rất cao (vvMDV/vv+MDV).
3. Chứng minh quy luật sinh bệnh học in vivo: Giống gà Ross 308 có độ mẫn cảm cao nhất (tỷ lệ mắc bệnh 83,33%), lứa tuổi 1 ngày tuổi mẫn cảm cao nhất (tỷ lệ chết 100%), với phổ bệnh tích ác tính tập trung cao nhất ở gan (83,33% – 100%) và lách (85,50% – 98,63%).
4. Chuẩn hóa quy trình Real-time PCR TaqMan định lượng tải lượng virus qua gen Meq, xác định động học bài thải virus đạt đỉnh từ tuần 3 đến tuần 6 qua nang lông gia cầm.
5. Khám phá giải pháp miễn dịch bổ trợ đột phá: Kết hợp vắc xin thương mại (HVT/Rispens) với các chất tăng cường miễn dịch (CpG-ODN, Poly I:C, IFN-γ) giúp kích hoạt trục miễn dịch Th1/CTLs, giảm 88–93% tải lượng bản sao virus trong các cơ quan lympho và triệt tiêu nguy cơ hình thành khối u lympho.
6. Mở ra 3 hướng nghiên cứu mũi nhọn mới: Công nghệ di truyền ngược BAC-MDV sản xuất vắc xin nhược tiểu nội địa, công nghệ hạt nano tá dược phân tử cho vắc xin gia cầm in ovo, và hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử GaHV-2 đa vùng sinh thái.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.

Ý nghĩa khoa học của đề tài. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài. Những đóng góp mới của đề tài. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

Tình hình lưu hành bệnh Marek ở trong nước và trên thế giới. Tình hình lưu hành bệnh Marek ở Việt Nam. Tình hình lưu hành bệnh Marek trên thế giới. Cơ sở khoa học của đề tài.

Đặc tính sinh học cơ bản của virus gây bệnh Marek. Triệu chứng lâm sàng bệnh Marek. Bệnh tích của bệnh Marek. Chẩn đoán bệnh Marek.

Dịch tễ học bệnh Marek. Miễn dịch chống lại MDV. Vắc xin với việc kiểm soát và phòng ngừa bệnh Marek. Các giải pháp phòng và trị bệnh Marek.

NỘI DUNG, ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nội dung nghiên cứu. Phân lập virus gây bệnh Marek ở gà nuôi công nghiệp tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Nghiên cứu xác định độc lực và gây bệnh thực nghiệm virus Marek phân lập được trên các giống và lứa tuổi gà.

Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý đặc trưng do virus Marek phân lập được đối với gà thí nghiệm. Nghiên cứu thử nghiệm phối hợp chất bổ trợ với vắc xin để tăng cường hiệu quả miễn dịch của vắc xin phòng bệnh Marek. Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu.

Hóa chất, sinh phẩm và môi trường nuôi cấy. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu. Phương pháp phân lập MDV và nhuộm Plaque. Phương pháp hóa mô.

Phương pháp xác định độc lực của virus trên phôi trứng gà. Phương pháp PCR và xác định trình tự gen Meq. Phương pháp Real-Time PCR định lượng số copy genome của virus MDV. Bố trí thí nghiệm xác định khả năng gây bệnh của MDV trên các giống gà và lứa tuổi gà.

Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các chất tăng cường miễn dịch đến hiệu quả của vắc xin HVT/Rispens. Phương pháp xử lý số liệu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Kết quả phân lập virus Marek.

Kết quả mổ khám gà nghi mắc bệnh Marek ở một số địa phương. Phân lập virus Marek. Đặc tính gene của virus Marek chủng MDV 6. Khả năng gây bệnh của chủng MDV phân lập được.

Khả năng gây bệnh của MDV 6.13 trên các giống gà thí nghiệm. Khả năng gây bệnh của MDV phân lập được trên các giống gà thí nghiệm ở các độ tuổi khác nhau. Nghiên cứu sự bài thải của virus từ gà thí nghiệm gây nhiễm virus gây bệnh MDV. Biểu hiện bệnh tích ở gà thí nghiệm do chủng MDV phân lập được gây nên.

Biểu hiện tổn thương đại thể ở các tổ chức của gà thí nghiệm. Biểu hiện tổn thương vi thể ở các tổ chức của gà thí nghiệm. Kết quả xác định khả năng gây bệnh trên phôi gà của MDV phân lập. Kết quả xác định khả năng gây bệnh trên trên môi trường tế bào xơ phôi vịt một lớp của MDV phân lập.

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất tăng cường miễn dịch đến hiệu quả bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch sự hình thành đáp ứng miễn dịch của gà thí nghiệm với vắc xin phòng bệnh Marek. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự hình thành khối u trong các tổ chức của gà thí nghiệm công cường độc. Tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong các cơ quan có chức năng miễn dịch của gà thí nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng cường miễn dịch.

93 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 118 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM. 118 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 1.

ADC Antibody Dependent Cellmediated 2. ADN Acide Deoxyribo Nucleotic 3. APC Antigen Presenting Cell 4. CAM Chorioat Antoid Membran 5.

CEF Chicken Embryo Fibroblast 6. CKC Chicken Kidney Cell 7. CMGF Chicken Myelomonocytic Growth Factor 8. CPE Cytopathogenic Effect 9.

CPG-ODN Cytosine Phosphate Guanosine-Olygo Deoxy Nucleotide 10. Poly I:C Chuỗi mạch ARN đôi Polyriboinosinic và Polyribocytidylic 11. DEF Duck Embryo Fibroblast 12. DHBV Duck Hepatitis B Virus 13.

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay 14. GDP Gross Domestic Product 15. HVT Herpesvirus of Turkey 16. MDV Marek Disease Virus 19.

MHC Major Histocompatibility Complex 20. NKC Nature Killer Cell 21. PCR Polymerase Chain Reaction 22. PFU Plaque Forming Unit 23.

RIF Resistance Inducing Factor 24. TLR Toll Like Receptor vii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1. Tình hình dịch bệnh Marek tại các tỉnh phía Nam năm 2007. Kết quả mổ khám gà nghi mắc bệnh Marek ở một số địa phương.

Tương đồng gene Meq virus MDV 6.13 với MDV trên thế giới. Gene Meq MDV 6.13 và MDV cường độc trên thế giới và chủng vắc xin. Mức độ gây bệnh của chủng MDV phân lập trên các giống gà thí nghiệm. Triệu chứng lâm sàng bệnh Marek qua từng tháng theo dõi.

Mức độ gây bệnh của chủng MDV phân lập được trên các giống gà ở các độ tuổi. Số lượng bản copy của gen Meq bình quân trên 1 cá thể gà bài thải trong 1 ngày (log10). Biểu hiện bệnh tích do MDV gây cho gà thí nghiệm. Tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể trong các tổ chức của gà thí nghiệm.

Biểu hiện bệnh tích do MDV trên phôi gà 11 ngày tuổi. Biểu hiện bệnh tích do MDV 6.13 trên trên môi trường tế bào xơ phôi vịt. Ảnh hưởng các yếu tố tăng cường miễn dịch đến hiệu quả bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự hình thành kháng thể bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek.

Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp  - IFN. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp các β - IFN. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp α-IFN. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp IL-4.

Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp IL-12p40. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp IL-10. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự hình thành khối u ở gà sau công cường độc (Tỷ lệ % gà có khối u). Mức độ giảm số bản copy của gen Meq trong lách gà thí nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng cường miễn dịch.

Mức độ giảm các bản copy của gen Meq trong túi Fabricius của gà thí nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng cường miễn dịch. Mức độ giảm số bản copy của gen Meq trong tuyến ức của gà thí nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng cường miễn dịch. 100 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2. Bản đồ hệ gene của MDV.

Hình ảnh nuôi cấy phân lập MDV trên trên môi trường tế bào xơ phôi vịt. Trình tự gene Meq virus chủng phân lập MDV 6. Mức độ gây bệnh và gây chết của chủng MDV 6.13 ở gà thí nghiệm. Các biểu phiện tổn thương thần kinh của gà gây nhiễm với MDV 6.

Tỷ lệ gà mắc bệnh và chết do chủng virus MDV 6.13 trên các giống gà thí nghiệm ở các độ tuổi. Gà 6 tuần tuổi bại liệt sau khi gây nhiễm bằng chủng MDV 6. Tỷ lệ xuất hiện các biểu hiện tổn thương thần kinh do chủng virus MDV 6.13 trên các giống gà thí nghiệm ở các độ tuổi. Mức độ bài thải virus MDV 6.13 của các giống gà thí nghiệm ở các độ tuổi.

Hình ảnh bệnh tích đại thể ở gà thí nghiệm do chủng MDV phân lập được gây nên. Tần suất xuất hiện bệnh tích trong các cơ quan của gà thí nghiệm. Tỷ lệ gà thí nghiệm có tổn thương ở lách. Tỷ lệ gà thí nghiệm có tổn thương ở thận.

Tỷ lệ gà thí nghiệm có tổn thương ở tim. Tỷ lệ gà thí nghiệm có tổn thương ở dạ dày tuyến. Tỷ lệ gà thí nghiệm có tổn thương ở dây thần kinh ngoại biên. Tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể trong các tổ chức của gà thí nghiệm.

Bệnh tích trên màng CAM phôi gà 14 ngày tuổi do MDV gây nên. Hình ảnh gây hiệu ứng hủy hoại trên môi trường tế bào xơ phôi vịt 1 lớp do MDV MDV 6.13 qua các đời tiếp truyền sau 96 giờ. Phản ứng trung hòa virus Marek với kháng thể thu được. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự hình thành kháng thể bảo hộ của vắc xin phòng bệnh Marek.

Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp  - IFN. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp các β - I. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp α-IFN. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp IL-4.

Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp IL - 12p40. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường miễn dịch đến sự tổng hợp IL-10. Tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong lách gà thí nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng cường miễn dịch. Tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong túi Fabricius của gà thí nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng cường miễn dịch.

Tỷ lệ giảm số bản copy của gen Meq trong tuyến ức của gà thí nghiệm công cường độc sau khi sử dụng vắc xin và các chất tăng cường miễn dịch. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm qua, chăn nuôi gà ở nước ta có sự phát triển mạnh mẽ theo hướng chăn nuôi công nghiệp tập trung, đóng góp lớn cho sự phát triển kinh tế xã hội ở các địa phương. Theo báo cáo của Tổng cục Thống kê (2016) [12], năm 2016 cả nước có khoảng 252 triệu con gà; với sản lượng trên 500 ngàn tấn thịt, 8,5 tỷ quả trứng, cho thu nhập khoảng 63 ngàn tỷ đồng, chiếm 29,5% trong tổng giá trị ngành nông nghiệp, chiếm 3,15% trong GDP.