Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học và Ứng Dụng Virus Viêm Gan Vịt Cường Độc

Tài liệu nghiên cứu Luận văn nghiên cứu một số đặc tính sinh học sinh học phân tử của virus viêm gan vịt cường độc và, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Lê Thu Hương
• Người hướng dẫn: TS. Trịnh Đình Thâu
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Một Số Đặc Tính Sinh Học, Sinh Học Phân Tử Của Virus Viêm Gan Vịt Cường Độc Và Ứng Dụng Trong Kiểm Nghiệm Vắc Xin
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• THESIS EXTRACT
• MỞ ĐẦU. MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan vịt
• 1.1.1. Lịch sử và phân bố bệnh
• 1.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Viêm gan vịt trên thế giới

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Virus Viêm Gan Vịt Cường Độc Hiện Nay

Bệnh viêm gan vịt (DVH) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi vịt, đặc biệt là ở vịt con từ 1-6 tuần tuổi. Bệnh lây lan nhanh chóng và có tỷ lệ chết cao, có thể lên đến 95-100%. Virus gây bệnh đã được phân loại thành nhiều genotype khác nhau, trong đó phổ biến nhất là DHAV-1. Tuy nhiên, các genotype khác như DHAV-2 và DHAV-3 cũng đang ngày càng được quan tâm. Việc nghiên cứu sâu về đặc tính sinh học virus và sinh học phân tử của các chủng virus viêm gan vịt là rất quan trọng để phát triển các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh hiệu quả. Các phương pháp chẩn đoán và kiểm nghiệm vắc xin hiện đại, dựa trên nền tảng sinh học phân tử, đóng vai trò then chốt trong việc bảo vệ đàn vịt khỏi bệnh viêm gan vịt.

1.1. Lịch Sử Phát Hiện và Phân Bố Bệnh Viêm Gan Vịt

Bệnh viêm gan vịt được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1945 tại Mỹ. Sau đó, bệnh lan rộng ra nhiều quốc gia trên thế giới. Virus gây bệnh được xác định thuộc họ Picornaviridae và được chia thành nhiều serotype, sau này được gọi là genotype. Các genotype khác nhau có sự khác biệt về độc lực virus và khả năng gây bệnh. Việc theo dõi sự phân bố và biến đổi của các genotype virus DHAV là cần thiết để cập nhật các biện pháp phòng bệnh.

1.2. Tình Hình Nghiên Cứu Bệnh Viêm Gan Vịt Trên Thế Giới

Nghiên cứu về virus viêm gan vịt trên thế giới đã đạt được nhiều tiến bộ, đặc biệt trong lĩnh vực sinh học phân tử. Các phương pháp như RT-PCR và giải trình tự gen cho phép xác định chính xác các chủng virus và nghiên cứu sâu về cơ chế gây bệnh. Các nghiên cứu về miễn dịch học cũng giúp hiểu rõ hơn về phản ứng của vịt đối với virus và phát triển các loại vắc xin viêm gan vịt hiệu quả hơn.

II. Thách Thức Trong Kiểm Soát Virus Viêm Gan Vịt Cường Độc

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu và phòng chống bệnh viêm gan vịt, vẫn còn nhiều thách thức cần giải quyết. Sự xuất hiện của các chủng virus cường độc và sự biến đổi gen của virus gây khó khăn cho việc phát triển vắc xin hiệu quả. Bên cạnh đó, việc chẩn đoán sớm và chính xác bệnh viêm gan vịt cũng là một vấn đề quan trọng. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống có thể không đủ nhạy để phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm, khi virus mới bắt đầu nhân lên trong cơ thể vịt. Do đó, cần có các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác hơn, dựa trên nền tảng sinh học phân tử.

2.1. Sự Biến Đổi Gen và Xuất Hiện Chủng Virus Cường Độc

Virus viêm gan vịt có khả năng biến đổi gen cao, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng virus cường độc mới. Các chủng virus này có thể vượt qua khả năng bảo vệ của vắc xin hiện tại, gây ra các vụ dịch nghiêm trọng. Việc theo dõi sự biến đổi gen của virus và cập nhật các chủng virus trong vắc xin là rất quan trọng để duy trì hiệu quả phòng bệnh.

2.2. Khó Khăn Trong Chẩn Đoán Sớm Bệnh Viêm Gan Vịt

Chẩn đoán sớm bệnh viêm gan vịt là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây lan của bệnh. Tuy nhiên, các phương pháp chẩn đoán truyền thống có thể không đủ nhạy để phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm. Các phương pháp PCR và ELISA có thể giúp phát hiện virus ở giai đoạn sớm, nhưng cần có trang thiết bị và kỹ thuật viên có trình độ cao.

2.3. Tình Hình Dịch Bệnh Viêm Gan Vịt Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, bệnh viêm gan vịt vẫn là một vấn đề đáng lo ngại trong chăn nuôi vịt. Các vụ dịch bệnh thường xuyên xảy ra, gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi. Việc nghiên cứu và ứng dụng các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh hiệu quả là rất cần thiết để bảo vệ ngành kinh tế chăn nuôi vịt.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Virus DHAV Cường Độc

Nghiên cứu đặc tính sinh học virus là bước quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh và phát triển các biện pháp phòng chống hiệu quả. Các phương pháp nghiên cứu bao gồm nuôi cấy virus trên tế bào, xác định độc lực virus, nghiên cứu cấu trúc virus, và phân tích sự nhân lên của virus. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng để đánh giá hiệu quả vắc xin và phát triển các loại vắc xin mới.

3.1. Nuôi Cấy và Phân Lập Virus Viêm Gan Vịt Cường Độc

Việc nuôi cấy và phân lập virus viêm gan vịt là bước đầu tiên trong nghiên cứu đặc tính sinh học virus. Virus được nuôi cấy trên tế bào phôi gà hoặc tế bào vịt. Sau khi virus nhân lên, nó được phân lập và tinh sạch để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.2. Xác Định Độc Lực Virus Viêm Gan Vịt Bằng LD50

Độc lực của virus viêm gan vịt được xác định bằng phương pháp LD50 (liều gây chết 50%). Phương pháp này xác định lượng virus cần thiết để gây chết 50% số vịt thí nghiệm. LD50 là một chỉ số quan trọng để đánh giá khả năng gây bệnh của virus.

3.3. Giải Trình Tự Gen Virus Viêm Gan Vịt Cường Độc

Giải trình tự gen của virus viêm gan vịt cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc virus và các gen quan trọng. Thông tin này có thể được sử dụng để so sánh các chủng virus khác nhau và xác định các đột biến gen có thể ảnh hưởng đến độc lực virus hoặc khả năng đáp ứng với vắc xin.

IV. Ứng Dụng Kiểm Nghiệm Vắc Xin Viêm Gan Vịt Bằng Virus Cường Độc

Việc kiểm nghiệm vắc xin là bước quan trọng để đảm bảo an toàn vắc xin và hiệu quả vắc xin. Phương pháp công cường độc sử dụng virus cường độc để đánh giá khả năng bảo vệ của vắc xin. Vịt được tiêm vắc xin và sau đó được gây nhiễm bằng virus cường độc. Nếu vắc xin có hiệu quả, vịt sẽ được bảo vệ khỏi bệnh.

4.1. Quy Trình Kiểm Nghiệm Vắc Xin Viêm Gan Vịt Nhược Độc

Quy trình kiểm nghiệm vắc xin bao gồm nhiều bước, từ kiểm tra tính an toàn của vắc xin đến đánh giá hiệu quả vắc xin. Các bước kiểm tra bao gồm kiểm tra vô trùng, kiểm tra độ thuần khiết, và kiểm tra tính an toàn trên động vật thí nghiệm.

4.2. Đánh Giá Hiệu Quả Vắc Xin Bằng Phương Pháp Công Cường Độc

Phương pháp công cường độc là một phương pháp quan trọng để đánh giá hiệu quả vắc xin. Vịt được tiêm vắc xin và sau đó được gây nhiễm bằng virus cường độc. Tỷ lệ vịt được bảo vệ khỏi bệnh là một chỉ số quan trọng để đánh giá hiệu quả vắc xin.

4.3. Phân Tích Kết Quả Kiểm Nghiệm và Đề Xuất Cải Tiến Vắc Xin

Kết quả kiểm nghiệm vắc xin được phân tích để đánh giá hiệu quả vắc xin và xác định các vấn đề cần cải tiến. Các cải tiến có thể bao gồm thay đổi chủng virus trong vắc xin, điều chỉnh liều lượng vắc xin, hoặc cải thiện quy trình sản xuất vắc xin.

V. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Vắc Xin Mới

Nghiên cứu về virus viêm gan vịt đã đạt được nhiều tiến bộ, nhưng vẫn còn nhiều vấn đề cần giải quyết. Việc nghiên cứu sâu về đặc tính sinh học virus và sinh học phân tử của các chủng virus cường độc là rất quan trọng để phát triển các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh hiệu quả. Các nghiên cứu về miễn dịch học và công nghệ sinh học có thể giúp phát triển các loại vắc xin mới, có khả năng bảo vệ tốt hơn và an toàn hơn.

5.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu Về Virus Viêm Gan Vịt Cường Độc

Nghiên cứu đã xác định được đặc tính sinh học virus của một chủng virus viêm gan vịt cường độc và ứng dụng chủng virus này trong kiểm nghiệm vắc xin. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng để phát triển các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh hiệu quả.

5.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Vắc Xin Viêm Gan Vịt Mới

Các hướng nghiên cứu phát triển vắc xin viêm gan vịt mới bao gồm sử dụng công nghệ tái tổ hợp, phát triển vắc xin sống giảm độc lực, và nghiên cứu các tác nhân kích thích miễn dịch mới. Các nghiên cứu này có thể giúp phát triển các loại vắc xin có khả năng bảo vệ tốt hơn và an toàn hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh viêm gan virus ở vịt (Duck Virus Hepatitis - DVH) là một trong những bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm hàng đầu trong ngành chăn nuôi thủy cầm, đặc biệt mẫn cảm ở vịt con dưới 3 tuần tuổi với tỷ lệ tử vong toàn đàn có thể lên tới 95% - 100%. Tại Việt Nam, các khảo sát dịch tễ tại các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ từng ghi nhận 20 ổ dịch với tỷ lệ nhiễm bệnh đạt 100% và tỷ lệ chết dao động từ 48,57% đến 90%, gây ra thiệt hại kinh tế đặc biệt nghiêm trọng.

Vấn đề nghiên cứu trọng tâm xuất phát từ thực tiễn nguồn giống vi sinh vật thú y lưu giữ tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I. Trong đó, chủng virus viêm gan vịt cường độc được phân lập từ năm 1989 và bảo quản đông khô gần 30 năm vẫn chưa được giám định hệ thống về độc lực, cấu trúc di truyền và phân loại sinh học phân tử theo các tiêu chuẩn quốc tế mới nhất. Hơn nữa, hầu hết các vắc xin thương mại lưu hành trong nước đều sản xuất từ genotype I (DHAV-1), trong khi các biến chủng mới trên thế giới đã phát triển phức tạp thành genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3).

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Thú y của tác giả Lê Thu Hương, dưới sự hướng dẫn của TS. Trịnh Đình Thâu tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu khoa học cụ thể:

1. Đánh giá toàn diện đặc tính sinh học, độ vô trùng, độ thuần khiết và xác định liều gây chết 50% (LD50) của giống virus cường độc.
2. Giải mã trật tự gen kháng nguyên vỏ VP1 và toàn bộ hệ gen 7.777 nucleotide để xác lập dữ liệu phân tử chuẩn quốc gia.
3. Ứng dụng chủng virus cường độc chuẩn hóa này vào quy trình kiểm nghiệm hiệu lực vắc xin nhược độc theo tiêu chuẩn TCVN 8685-2:2011.

Nghiên cứu được triển khai tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I, mang ý nghĩa nền tảng trong việc thiết lập chuẩn quốc gia, nâng cao độ chính xác trong kiểm định chất lượng 100% các lô vắc xin lưu hành và định hướng công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phòng chống dịch bệnh hiệu quả tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết phân loại virus học hiện đại của Ủy ban Quốc tế về Phân loại Virus (ICTV) đối với họ Picornaviridae, giống Avihepatovirus, bao gồm 3 genotype chính: DHAV-1 (chiếm hơn 60 chủng toàn cầu), DHAV-2 (đặc trưng tại Đài Loan) và DHAV-3 (phổ biến tại Hàn Quốc, Trung Quốc và Việt Nam). Đồng thời, đề tài tích hợp lý thuyết miễn dịch học thú y về cơ chế kích hoạt đáp ứng miễn dịch dịch thể, trong đó việc sinh kháng thể trung hòa đặc hiệu kháng nguyên bề mặt đóng vai trò quyết định khả năng bảo vệ tế bào gan của gia cầm trước sự tấn công của mầm bệnh.

Hệ thống khái niệm chuyên ngành then chốt bao gồm:

• Hệ gen RNA sợi đơn dương (ssRNA+): Hệ gen virus có chiều dài xấp xỉ 7.690 đến 7.777 nucleotide, không có cấu trúc mũ đầu 5' mà liên kết đồng hóa trị với protein VPg (khoảng 23 axit amin) và tận cùng bằng đuôi poly(A) dài khoảng 18 nucleotide.
• Gen kháng nguyên VP1 (1D): Đoạn gen dài 720 base pair (bp), mã hóa protein cấu trúc nằm ngoài cùng của capsid virus, quyết định tính sinh miễn dịch và độc lực gây bệnh.
• Điểm vào ribosome nội phân tử (IRES): Cấu trúc không gian bậc hai tại vùng không dịch mã 5'UTR (dài khoảng 625 nucleotide), cho phép ribosome tế bào chủ gắn kết và khởi động dịch mã không phụ thuộc mũ.
• Liều gây chết 50% (LD50): Chỉ số định lượng độc lực sinh học thể hiện nồng độ virus tối thiểu đủ khả năng làm chết 50% cá thể động vật cảm nhiễm trong điều kiện thí nghiệm tiêu chuẩn.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập thông qua quy trình bố trí thí nghiệm nghiêm ngặt trên mô hình động vật và kỹ thuật sinh học phân tử:

• Cỡ mẫu và chọn mẫu động vật: Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu 100 vịt xiêm khỏe mạnh từ 1 đến 3 ngày tuổi, chia đều làm 2 đợt thí nghiệm độc lập (50 con/đợt). Mỗi đợt gồm 10 lô (9 lô thí nghiệm tiêm các nồng độ pha loãng virus từ 10^-1 đến 10^-9 và 1 lô đối chứng sinh lý, mỗi lô 5 con). Động vật thí nghiệm được chọn mẫu ngẫu nhiên có chủ đích từ đàn bố mẹ an toàn dịch bệnh, đảm bảo 100% chưa qua tiêm phòng và không có kháng thể mẹ truyền đối với virus viêm gan vịt.
• Kiểm tra độ vô trùng và thuần khiết: Giống virus được cấy kiểm tra trên 5 môi trường cơ bản (thạch máu, thạch nấm, thạch thường, nước thịt, nước thịt gan yếm khí) theo dõi trong 7 ngày ở 37°C. Độ thuần khiết được thẩm định theo tiêu chuẩn TCVN 8684:2011, kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn Salmonella trên môi trường MacConkey (48-72 giờ) và Mycoplasma trên canh thang PPLO/thạch PPLO (theo dõi 28 ngày trong tủ ấm 5% CO2).
• Phương pháp phân tích sinh học phân tử: Lý do lựa chọn bộ kit QIAamp Viral RNA Mini Kit và kỹ thuật RT-PCR một bước là nhằm hạn chế tối đa nguy cơ nhiễm chéo và đảm bảo độ tinh sạch của RNA tổng số. Cặp mồi đặc hiệu DHAV3F/DHAV3R được thiết kế để nhân đoạn gen VP1 kích thước 0,8 kb. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng MinElute Gel Extraction Kit, giải trình tự tự động trên hệ thống ABI 3730XL Model và xử lý cây phả hệ bằng phần mềm MEGA4 với thuật toán Neighbor-Joining (1.000 lần lặp bootstrap).
• Quy trình kiểm nghiệm vắc xin: Thực hiện theo TCVN 8685-2:2011 với 40 vịt thí nghiệm (20 con tiêm 1 liều vắc xin nhược độc và 20 con đối chứng không tiêm). Sau 72 giờ, toàn bộ 40 cá thể được thử thách bằng cách tiêm dưới da chủng virus cường độc với liều 10^3,0 LD50/con và theo dõi liên tục trong 10 ngày.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân tích thực nghiệm đã ghi nhận 4 kết quả mang tính đột phá về đặc tính sinh học và cấu trúc phân tử của chủng virus nghiên cứu:

Thứ nhất, chủng virus viêm gan vịt cường độc lưu giữ quốc gia đạt độ vô trùng và thuần khiết 100%. Sau 7 ngày theo dõi trên cả 5 hệ môi trường dinh dưỡng, hoàn toàn không phát hiện sự phát triển của tạp khuẩn hay nấm mốc. Quá trình kiểm tra độ thuần khiết theo TCVN 8684:2011 cho kết quả âm tính hoàn toàn với Salmonella sau 72 giờ và không xuất hiện khuẩn lạc Mycoplasma sau 28 ngày nuôi cấy.

Thứ hai, độc lực của giống virus được chuẩn hóa chính xác với giá trị LD50 trung bình đạt 10^6,31 LD50/ml trên vịt con 1-3 ngày tuổi. Kết quả qua 2 đợt thử nghiệm cho thấy sự ổn định cao: đợt 1 đạt 10^6,25 LD50/ml và đợt 2 đạt 10^6,37 LD50/ml. Ở các nồng độ pha loãng 10^-1 và 10^-2, tỷ lệ vịt chết thực tế đạt 100% chỉ sau 24 đến 48 giờ gây nhiễm với các triệu chứng co giật, đầu ngoẹo đặc trưng.

Thứ ba, nghiên cứu đã giải mã thành công toàn bộ hệ gen của chủng virus với chiều dài chính xác 7.777 nucleotide và đoạn gen kháng nguyên VP1 có kích thước 720 bp. Phân tích so sánh dữ liệu với Ngân hàng gen quốc tế khẳng định chủng virus cường độc của Việt Nam thuộc nhóm Duck Hepatitis A Virus genotype III (DHAV-3), thuộc giống Avihepatovirus, họ Picornaviridae.

Thứ tư, thử nghiệm kiểm định hiệu lực vắc xin theo TCVN 8685-2:2011 đạt độ an toàn và hiệu quả tuyệt đối: 100% vịt thuộc lô gây miễn dịch (20/20 con) sống khỏe mạnh sau khi công cường độc liều cao 10^3,0 LD50. Ngược lại, 100% vịt ở lô đối chứng (20/20 con) phát bệnh cấp tính và tử vong trong vòng 48 đến 72 giờ với bệnh tích gan xuất huyết hoại tử điển hình.

Thảo luận kết quả

Kết quả xác định độc lực LD50 đạt 10^6,31 LD50/ml chứng minh rằng sau gần 30 năm bảo tồn đông khô, chủng virus vẫn duy trì trọn vẹn hoạt tính sinh học và độc lực nguyên bản. Cơ chế gây bệnh được làm sáng tỏ qua giải phẫu bệnh lý: virus tấn công ồ ạt vào tế bào nội mô huyết quản và hệ thống tế bào Kupffer tại gan chỉ sau 1 đến 2 giờ xâm nhập, làm suy kiệt hàm lượng glycogen và gây ứ đọng lipid nghiêm trọng, khiến vịt con tử vong do rối loạn chuyển hóa và ngộ độc cấp.

Về mặt dịch tễ học phân tử, việc giải mã gen VP1 (720 bp) và toàn bộ hệ gen 7.777 nucleotide có ý nghĩa bước ngoặt. Trước đây, các tài liệu trong nước chủ yếu ghi nhận virus viêm gan vịt thuộc genotype I (DHAV-1). Dữ liệu phân tích phả hệ khi biểu diễn qua biểu đồ hình cây di truyền (Phylogenetic Tree) và ma trận tương đồng nucleotide cho thấy chủng cường độc nghiên cứu có độ tương đồng di truyền trên 95% với chủng DN2 phân lập tại Việt Nam và các chủng DHAV-3 tại Hàn Quốc, Trung Quốc, nhưng có sự phân nhánh khác biệt rõ rệt so với các chủng DHAV-1 cổ điển.

Điều này giải thích hiện tượng trong thực tế tại một số địa phương, nhiều đàn vịt dù đã được tiêm phòng vắc xin nhược độc thương mại (vốn sản xuất từ DHAV-1) vẫn xuất hiện các ca nhiễm bệnh với tỷ lệ chết từ 15% đến 30%. Biểu đồ so sánh tỷ lệ bảo hộ chéo giữa các serotype cho thấy nhu cầu cấp thiết phải đưa chủng DHAV-3 chuẩn hóa này vào hệ thống kiểm nghiệm quốc gia nhằm đánh giá chính xác phổ bảo vệ của vắc xin lưu hành.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả khoa học đã được kiểm chứng, nghiên cứu đưa ra 4 nhóm khuyến nghị hành động cụ thể:

1. Chuẩn hóa quy trình bảo tồn nguồn gen vi sinh vật quốc gia: Giao Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I áp dụng quy trình kiểm tra vô trùng 5 môi trường và thử nghiệm độ thuần khiết theo TCVN 8684:2011 định kỳ 2 đến 3 năm một lần. Mục tiêu duy trì ổn định hiệu giá virus gốc đạt ngưỡng tối thiểu 10^6,0 LD50/ml, hoàn thiện hồ sơ dữ liệu sinh học phân tử cho 100% các chủng lưu trữ.
2. Cập nhật quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về kiểm nghiệm vắc xin: Đề xuất Cục Thú y trong giai đoạn 12 đến 18 tháng tới tiến hành sửa đổi, bổ sung tiêu chuẩn TCVN 8685-2:2011. Bắt buộc đưa chủng virus cường độc DHAV-3 (hiệu giá 10^3,0 LD50/liều thử thách) vào quy trình kiểm tra hiệu lực đối kháng song song với chủng DHAV-1 đối với toàn bộ vắc xin viêm gan vịt đăng ký lưu hành.
3. Nghiên cứu phát triển vắc xin đa giá thế hệ mới: Khuyến khích các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất thuốc thú y trong nước phối hợp triển khai dự án nghiên cứu vắc xin nhược độc hoặc vô hoạt nhũ dầu đa giá (kết hợp cả 2 phân type DHAV-1 và DHAV-3) trong thời gian 24 đến 36 tháng, hướng tới mục tiêu nâng tỷ lệ bảo hộ thực địa lên trên 95% cho đàn thủy cầm.
4. Xây dựng hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử chuyên sâu: Cơ quan thú y vùng phối hợp các địa phương thiết lập mạng lưới tầm soát biến chủng virus định kỳ 6 tháng/lần tại các vùng chăn nuôi trọng điểm ở đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long, sử dụng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu DHAV3F/DHAV3R để khống chế tỷ lệ bùng phát ổ dịch dưới 2% mỗi năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị thực tiễn và học thuật cao, là tài liệu tham khảo hữu ích cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Cán bộ kiểm nghiệm và chuyên viên quản lý chất lượng thuốc thú y: Cung cấp hướng dẫn chi tiết về phương pháp đánh giá vô trùng, kiểm tra Mycoplasma trong 28 ngày và quy trình công cường độc chuẩn hóa với liều 10^3,0 LD50 theo TCVN 8685-2:2011 để đánh giá chính xác các lô vắc xin nhập khẩu và sản xuất nội địa.
2. Các nhà khoa học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Thú y - Công nghệ sinh học: Cung cấp bộ dữ liệu giải mã toàn bộ hệ gen 7.777 nucleotide, trình tự 720 bp gen VP1 và sơ đồ thiết kế mồi RT-PCR làm cơ sở dữ liệu đối chiếu trong các nghiên cứu phân tích phả hệ và biến đổi kháng nguyên của Picornavirus.
3. Các doanh nghiệp sản xuất vắc xin và chế phẩm sinh học thú y: Cung cấp cơ sở khoa học về đặc tính gây bệnh và tính sinh miễn dịch của phân type DHAV-3 để nghiên cứu quy trình nuôi cấy trên phôi gà 9-10 ngày tuổi, chế tạo kháng thể lòng đỏ trứng gà đạt hiệu lực điều trị trên 95%.
4. Giảng viên và sinh viên các trường đại học khối Nông - Lâm - Ngư nghiệp: Làm giáo trình thực hành mẫu mực về phương pháp tính toán LD50 theo thuật toán Reed-Muench trên 10 lô thí nghiệm và kỹ thuật nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng virus cường độc trong nghiên cứu thuộc phân nhóm di truyền nào và có ý nghĩa gì đối với dịch tễ học tại Việt Nam? Kết quả giải mã hoàn chỉnh hệ gen 7.777 nucleotide và gen VP1 (720 bp) chứng minh chủng virus thuộc genotype DHAV-3, chi Avihepatovirus. Đây là bằng chứng khoa học khẳng định sự lưu hành thực tế của phân type DHAV-3 tại Việt Nam bên cạnh chủng DHAV-1 truyền thống, tạo cơ sở điều chỉnh cơ cấu sản xuất vắc xin phòng bệnh.

2. Hiệu giá độc lực LD50 của chủng virus giống gốc được xác định chính xác là bao nhiêu? Hiệu giá độc lực trung bình của giống virus qua 2 đợt thử nghiệm độc lập trên 100 vịt con đạt 10^6,31 LD50/ml (đợt 1 đạt 10^6,25 LD50/ml và đợt 2 đạt 10^6,37 LD50/ml). Giá trị này khẳng định giống virus đạt chuẩn độc lực cao, hoàn toàn đáp ứng các điều kiện làm chủng thử thách kiểm nghiệm sinh phẩm.

3. Quy trình thử nghiệm độ thuần khiết của giống virus được thực hiện qua các bước nào? Theo tiêu chuẩn TCVN 8684:2011, giống virus được kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn Salmonella trên môi trường MacConkey và canh thang Selenit trong 48 đến 72 giờ ở 37°C; đồng thời kiểm tra Mycoplasma trên môi trường canh thang và thạch PPLO chuyên biệt theo dõi suốt 28 ngày trong tủ ấm 5% CO2, đảm bảo 100% không có tạp nhiễm vi sinh vật ngoại lai.

4. Kết quả công cường độc đánh giá hiệu lực vắc xin theo TCVN 8685-2:2011 đạt tiêu chí ra sao? Thử nghiệm trên 40 vịt thí nghiệm cho kết quả vượt tiêu chuẩn quy định: 100% vịt lô gây miễn dịch (20/20 con) được bảo hộ sống khỏe mạnh sau 10 ngày theo dõi thử thách với liều 10^3,0 LD50, trong khi 100% vịt lô đối chứng (20/20 con) bị tiêu diệt hoàn toàn trong 72 giờ, vượt mức yêu cầu tối thiểu 80% của tiêu chuẩn quốc gia.

5. Virus viêm gan vịt có sức đề kháng với các yếu tố lý hóa và môi trường như thế nào? Virus có sức đề kháng cao, tồn tại được từ 15 đến 40 ngày trong chất độn chuồng và thức ăn, sống được 21 ngày ở nhiệt độ 37°C và duy trì khả năng gây nhiễm từ 2 đến 9 năm ở nhiệt độ âm sâu từ -4°C đến -20°C. Tuy nhiên, mầm bệnh bị tiêu diệt hoàn toàn bởi dung dịch NaOH 5% trong 6 giờ hoặc dung dịch Formol 1% trong 3 giờ.

Kết luận

Luận văn thạc sĩ của tác giả Lê Thu Hương đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu với 5 đóng góp học thuật và thực tiễn nổi bật:

• Chứng minh giống virus viêm gan vịt cường độc quốc gia lưu giữ gần 30 năm vẫn duy trì độ vô trùng tuyệt đối trên 5 môi trường nuôi cấy và thuần khiết 100% trước Salmonella và Mycoplasma.
• Xác lập chính xác chỉ số độc lực sinh học của giống đạt mức 10^6,31 LD50/ml trên mô hình vịt con 1-3 ngày tuổi bằng phương pháp Reed-Muench.
• Giải mã thành công toàn bộ hệ gen 7.777 nucleotide và đoạn gen kháng nguyên VP1 dài 720 bp, định danh chính xác chủng virus thuộc phân nhóm di truyền DHAV-3.
• Chuẩn hóa quy trình kiểm nghiệm hiệu lực vắc xin nhược độc theo TCVN 8685-2:2011, ghi nhận tỷ lệ bảo hộ tuyệt đối 100% trước liều công cường độc 10^3,0 LD50.
• Hoàn thiện bộ dữ liệu sinh học phân tử nguồn gen chuẩn quốc gia phục vụ công tác kiểm định thuốc thú y và nghiên cứu dịch tễ học chuyên sâu.

Trong kế hoạch 12 đến 24 tháng tới, các cơ quan quản lý cần mở rộng ứng dụng bộ chỉ thị phân tử này vào việc giám sát thực địa trên quy mô toàn quốc. Các đơn vị nghiên cứu và sản xuất thuốc thú y hãy chủ động khai thác nguồn gen DHAV-3 đã được giải mã để nhanh chóng phát triển các dòng vắc xin đa giá thế hệ mới, góp phần bảo vệ bền vững ngành chăn nuôi gia cầm Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TWI được thành lập năm 1984 theo quyết định số 58 NN-TCCB/QĐ ngày 28 tháng 3 năm 1984 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp nay là Bộ Nông nghiệp và PTNT. Ngoài nhiệm vụ kiểm nghiệm thuốc và nguyên liệu làm thuốc, các chế phẩm sinh học thú y, Trung tâm là nơi lưu giữ giống vi sinh vật thú y để phục vụ cho kiểm nghiệm, chẩn đoán cũng như chế tạo vắc xin và các chế phẩm sinh học cho ngành thú y trong cả nước và được nhập từ nước ngoài. Hiện nay, Trung tâm lưu trữ và bảo tồn 48 chủng giống vi sinh vật thú y. Phần lớn các giống vi sinh vật thú y này có xuất xứ từ Trung Quốc, một số khác do cán bộ thú y mang từ nước ngoài về theo con đường không chính thức (hoặc chính thức) và một số do Viện Thú y, Trung tâm Chẩn đoán thú y quốc gia cung cấp.

Do sự eo hẹp về kinh phí, hàng năm Trung tâm chỉ có thể bảo tồn giống vi sinh vật bằng các phương pháp truyền thống rồi đông khô, lưu giữ. Gần như tất cả các giống vi sinh vật hiện có chưa được giám định đầy đủ về kháng nguyên tính, độc lực, tính ổn định và cấu trúc gen một cách có hệ thống. Những năm gần đây, do sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học phân tử. Các chủng vi sinh vật được lưu giữ tại Trung tâm đã và đang được tiêu chuẩn hoá, dần dần tiệm cận với chuẩn hoá của quốc tế.

Trước đây, nhưng nghiên cứu virus viêm gan vịt chỉ dừng ở mức độ lâm sàng, bệnh tích, chẩn đoán virus học và sản xuất vắc xin truyền thống để phòng chống (OIE, 2008). Tuy nhiên, trong vòng 5 năm nay, virus viêm gan vịt được nghiên cứu sâu sắc ở mức độ sinh học phân tử gen và hệ gen, đặc biệt về ứng dụng sinh học phân tử trong giám định, nghiên cứu hệ gen, phân loại và tìm hiểu quan hệ sinh học trong họ Picornaviridae. Theo quan điểm phân loại hiện nay, virus viêm gan vịt trên thế giới gồm ba genotype khác nhau: Genotype I (DHAV- 1), genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3). Tại Việt Nam, chủng virus viêm gan vịt đang lưu giữ từ trước tới nay mới chỉ xác định được virus gây bệnh viêm gan vịt thuộc genotype I (DHAV-1).

Việc xác định chủng virus thuộc genotype I như đã công bố hay đã biến đổi hoặc có những khác biệt so với các chủng trên thế giới? 1 Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của virus Viêm gan vịt cường độc và ứng dụng trong kiểm nghiệm vắc xin". Đề tài được thực hiện với những mục tiêu và nội dung sau: Mục tiêu nghiên cứu: Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc Giải mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống. Ứng dụng chủng cường độc trong kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt. Nội dung nghiên cứu: 1.

Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc (gồm các bước cấy truyền, khả năng gây nhiễm trên tế bào, độc lực, tính ổn định, tính kháng nguyên của giống); Giải mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống. Giải mã toàn bộ hệ gen của chủng virus cường độc đang lưu giữ. Kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt bằng phương pháp công cường độc bằng chủng cường độc viêm gan vịt. Những đóng góp mới của luận văn: Là nghiên cứu về sinh học phân tử và giải mã hệ gen virus đầy đủ và chi tiết nhất của chủng virus cường độc viêm gan vịt thuộc nguồn gen quốc gia.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM GAN VỊT 2. Lịch sử và phân bố bệnh Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Virus Hepatitis - DVH) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở vịt con 1- 6 tuần tuổi, mẫn cảm nhất là vịt con dưới 3 tuần tuổi. Bệnh lây lan rất nhanh với tỷ lệ chết cao, có khi lên đến 95 – 100% toàn đàn.

Cách đây hơn chục năm, virus viêm gan vịt được xếp vào chi Enterovirus trong họ Picornaviridae và việc xếp loại được dựa mối quan hệ về huyết thanh học, bao gồm 3 serotype khác nhau là DHV-1, DHV-2 và DHV-3. Trong đó, phổ biến hơn cả là virus viêm gan vịt serotype 1 (DHV-1) (Fabricant, Levine, 1957 ; Levine et al., 1950; Asplin, 1965; 1970 ; Toth, 1969; Haider, Calnek, 1979). Virus viêm gan vịt serotype 2 và serotype 3 mới được tìm thấy ở Anh và Mỹ, gây tỷ lệ chết không đáng kể (Woolcock, 2003). Virus viêm gan vịt serotype 1 còn được gọi chung là virus viêm gan vịt.

Ngày nay, nhờ công nghệ sinh học phân tử, đã xác định virus gây bệnh viêm gan vịt trên thế giới gồm có 3 genotype khác nhau, bao gồm genotype I (DHAV-1), genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3). Phổ biến nhất là virus viêm gan vịt genotype I bao gồm khoảng 60 chủng đã được phân lập từ năm 1950 đến nay, virus viêm gan vịt genotype II chỉ gồm có 2 chủng mới phân lập ở Đài Loan và virus viêm gan vịt genotype III gồm 15 chủng vừa phân lập ở Trung Quốc và Hàn Quốc. Bệnh có biểu hiện đặc trưng: Vịt chết nhanh với tỷ lệ chết rất cao và chết ở trạng thái đặc biệt đầu ngoẹo về một bên, 2 chân duỗi thẳng. Mổ khám thấy gan sưng to, xuất huyết lốm đốm trên gan, có điểm hoại tử.

Bệnh viêm gan do virus ở vịt (Duck Hepatitis Virus) được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1945 tại Mỹ trên đàn vịt con một tuần tuổi (Levine, Hofstad, 1945), nhưng chưa phân lập được mầm bệnh. Mùa xuân năm 1949, Levine và Fabricant theo dõi một bệnh tương tự trên đàn vịt Bắc Kinh trắng tại Long Island (Mỹ) và có tới 70 trại vịt lớn mắc bệnh gây thiệt hại nặng nề. Ban đầu ở những trại mắc bệnh nặng tỷ lệ chết lên tới 95%, thời điểm cuối ổ dịch ở một số trại còn sót lại khi vịt mắc bệnh tỷ lệ chết giảm dần chỉ còn 15%. Tổng số vịt chết trong ổ dịch lên tới 75.

Hình ảnh vịt chết khi Hình 2. Gan vịt xuất huyết khi nhiễm virus viêm gan vịt mắc bệnh (Nguồn: Nanovet) (Nguồn:www.vn) Năm 1950, bằng phương pháp nuôi cấy trên phôi gà, Levine và Fabricant đã phân lập được virus viêm gan vịt type I (Nguyễn Đức Lưu và Vũ Như Quán, 2002). Năm 1953, bệnh xảy ra trên các ñàn vịt xảy ra ở các vùng khác của nước Mỹ. Sau đó bệnh cũng được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới: Anh, Canada, Niderland, Ai Cập và Tây Ban Nha, ở Bỉ.

Ở Liên Xô cũ bệnh được xác định trên lãnh thổ Ucraina và nước cộng hoà Nga. Ở Mỹ, Canada, Anh bệnh viêm gan vịt con thuộc bệnh truyền nhiễm bắt buộc phải đăng ký như bệnh Newcastle (Nguyễn Xuân Bình, 1995). Năm 1956, bệnh tiếp tục được phát hiện ở bang Massachuset, Illinois và Michigan; sau đó bệnh xảy ra trên khắp cả nước Mỹ. Năm 1965, ở Norfolk (Anh) hiện tượng bệnh viêm gan vịt vẫn xảy ra trên những đàn vịt con đã được tiêm phòng vắc xin nhược độc viêm gan vịt serotype 1.

Bệnh xảy ra nhẹ hơn so với bệnh viêm gan vịt của virus typ I, tỉ lệ chết của vịt con hiếm khi vượt quá 30%. Haider và Calnek đã đặt tên virus này là virus viêm gan vịt typ III và cho đến nay virus viêm gan vịt typ III mới chỉ được công bố ở Mỹ (Haider và Calnek, 1979). Ở Trung Quốc, virus viêm gan vịt lần đầu tiên được phân lập và xác nhận năm 1982 (Guo, Pan, 1984). Theo các báo cáo gần đây nhất, bệnh viêm gan vịt xảy ra ở khắp nơi trên thế giới, trong đó có cả Trung Quốc và Triều Tiên (OIE, 2003).

Tình hình nghiên cứu bệnh Viêm gan vịt trên thế giới Có nhiều phương pháp được áp dụng trong nghiên cứu xác định virus viêm gan vịt (Toth, 1969; Rispens, 1969), đặc biệt là sử dụng phản ứng ngưng kết hồng cầu (hemagglutination test, HA), phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch và phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme (Enzyme Linked Immunosorbent Assay – ELISA). Gần đây, khoa học ngày càng phát triển với nhiều phương pháp mới hiện đại hơn, chính xác hơn trong nghiên cứu sâu về sinh học phân tử virus Viêm gan vịt. Phổ biến hơn cả là phương pháp RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction) và PCR cho phép xác định chính xác virus gây bệnh cũng như nghiên cứu sâu về sinh học phân tử của virus. Đến nay, bệnh Viêm gan vịt do virus serotype 1 (còn được gọi là virus Viêm gan vịt) đã phân bố rộng rãi trên khắp thế giới trong đó có Việt Nam.1 Đường xâm nhập và cách lây lan Virus Viêm gan vịt lây lan rất nhanh từ con bệnh sang con lành, tỷ lệ nhiễm bệnh rất cao (100%).

Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá, hô hấp hoặc qua vết thương (Levine, Fabricant, 1950). Đường lây nhiễm qua không khí của bệnh Viêm gan vịt giống với bệnh dịch tả vịt và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà con; có sự xâm nhập của virus qua vùng da bị tổn thương, nhưng ít gặp. Những vịt chưa bị nhiễm virus, nếu cho chúng sống cùng đàn vịt bệnh, chúng sẽ mắc bệnh và chết sau đó ít ngày. Bệnh Viêm gan vịt không lây truyền qua đường trứng, vịt con nở ra từ trứng của vịt mẹ bị nhiễm bệnh vẫn phát triển tốt (Asplin, 1958).

Ở những vịt khỏi bệnh, virus được bài xuất ra ngoài theo phân trong 8 tuần. Các loài chim hoang dã mang virus viêm gan vịt từ vùng này sang vùng khác theo phương thức cơ học, đây chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch mới ở nơi xa (Asplin, 1961). Chuột cống nâu có thể là vật chủ dự trữ virus viêm gan vịt type I. Ở loại động vật này virus được thu nhận vào cơ thể, tồn tại 35 ngày, sau ñó ñược bài tiết ra bênh ngoài trong khoảng thời gian 18 – 22 ngày sau khi nhiễm.

Trong huyết thanh của chuột có kháng thể và kháng thể tồn tại 12 – 24 ngày. Priz, 1973 đã gây bệnh cho vịt con bằng đường gây nhiễm qua không khí. Trong các trường hợp này, virus xâm nhập vào cơ thể qua thanh quản và đường hô hấp trên (Priz, 1973). Có thể gây bệnh cho vịt bằng cách cho uống (Asplin, 1958).

Virus viêm gan vịt type II xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá và 5 đường lỗ huyệt. Ở những vịt khỏi bệnh, virus được bài xuất theo phân ít nhất 1 tuần sau khi nhiễm bệnh.