Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học và Phân Tử của Virus PRRS Gây Rối Loạn Hô Hấp và Sinh Sản ở Lợn

Tài liệu nghiên cứu Luận văn nghiên cứu đặc tính sinh học và phân tử của chủng virus nhược độc kty prrs 04 gây hội, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu

• Tác giả: Hà Văn Thịnh
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Lan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Virus PRRS Gây Rối Loạn Hô Hấp và Sinh Sản ở Lợn
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục các từ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận văn
• 1.7. Thesis abstract
• 2. MỞ ĐẦU
• 2.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 2.2. Mục tiêu đề tài
• 2.3. Tổng quan tài liệu
• 2.3.1. Tình hình nghiên cứu về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
• 2.3.1.1. Tình hình dịch PRRS trên thế giới
• 2.3.1.2. Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam
• 2.3.1.3. Những nghiên cứu về dịch PRRS ở nước ngoài
• 2.3.1.4. Những nghiên cứu về dịch PRRS ở Việt Nam
• 2.3.2. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)
• 2.3.2.1. Hình thái, cấu tạo
• 2.3.2.2. Phân loại virus PRRS
• 2.3.2.3. Khả năng gây bệnh của virus PRRS
• 2.3.2.4. Sức đề kháng của virus PRRS
• 2.3.2.5. Đặc tính nuôi cấy virus PRRS
• 2.3.3. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản
• 2.3.3.1. Đặc điểm chung
• 2.3.3.2. Động vật cảm nhiễm
• 2.3.3.3. Chất chứa mầm bệnh. Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây
• 2.3.3.4. Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS
• 2.3.3.5. Bệnh tích của lợn mắc PRRS
• 2.3.3.6. Các phương pháp chẩn đoán PRRS
• 2.3.3.7. Biện pháp phòng và trị bệnh
• 2.4. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.4.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.4.1.2. Nguyên liệu nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu
• 2.4.1.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.4.2.1. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc -145
• 2.4.2.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc -145
• 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.3.1. Nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 trên môi trường tế bào Marc - 145. Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50. Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển
• 2.4.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS
• 2.4.3.3. Phương pháp giải trình tự Gen
• 2.4.3.4. Phương pháp đọc kết quả
• 2.5. Kết quả và thảo luận
• 2.5.1. Kết quả nghiên cứu chủng virus PRRS nghiên cứu
• 2.5.2. Kết quả lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu
• 2.5.3. Kiểm tra khả năng tạp nhiễm với các loại virus khác
• 2.5.4. Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus kty - PRRS - 04
• 2.5.5. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển. Kết quả xác định hiệu giá virus qua các đời cấy chuyển
• 2.5.6. Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS - 04
• 2.5.7. Kết quả tách chiết RNA tổng số của chủng virus KTY – PRRS - 04
• 2.5.8. Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của chủng virus KTY - PRRS - 04
• 2.5.9. Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua các đời cấy chuyển
• 2.5.10. Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự axit amin của virus KTY - PRRS - 04 qua các đời cấy chuyển
• 2.5.11. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử
• 2.6. Kết luận và kiến nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Virus PRRS Tác Nhân Gây Bệnh Tai Xanh Ở Lợn

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS), hay còn gọi là bệnh Tai Xanh, là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Tác nhân gây bệnh là Virus PRRS, một loại virus RNA có ái lực cao với tế bào đại thực bào phổi, gây suy giảm miễn dịch và tạo điều kiện cho các bệnh nhiễm trùng thứ phát. Bệnh lây lan nhanh chóng và gây ra các vấn đề nghiêm trọng như sảy thai, lợn con yếu, chậm lớn, và tăng tỷ lệ tử vong. Việc nghiên cứu sâu về đặc tính sinh học virus PRRS là vô cùng quan trọng để phát triển các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh hiệu quả.

1.1. Lịch Sử Phát Hiện và Tình Hình Dịch Tễ Bệnh PRRS

Bệnh PRRS lần đầu tiên được ghi nhận tại Mỹ vào năm 1987 và nhanh chóng lan rộng ra toàn thế giới. Đến nay, bệnh đã trở thành dịch địa phương ở nhiều quốc gia, gây tổn thất kinh tế hàng trăm triệu đô la. Tại Việt Nam, PRRS xuất hiện lần đầu vào năm 1997 và gây ra nhiều đợt dịch lớn, ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi lợn. Theo Cục Thú y (2008), từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới đều có dịch PRRS lưu hành (trừ Châu Úc và Newzeland).

1.2. Tác Động Kinh Tế Của Bệnh PRRS Đến Ngành Chăn Nuôi Lợn

Bệnh PRRS gây ra những tổn thất kinh tế to lớn cho ngành chăn nuôi lợn do giảm năng suất sinh sản, tăng chi phí điều trị và phòng bệnh, và tăng tỷ lệ tử vong. Các nước trong khu vực có tỷ lệ PRRS lưu hành rất cao như: Trung Quốc 80%, Đài Loan 94,7 – 76,4%, Philippin 90%, Thái Lan 97%, Malaysia 94%, Hàn Quốc 67,4 – 73,1%. Việc kiểm soát và phòng ngừa bệnh PRRS là một thách thức lớn đối với ngành chăn nuôi lợn trên toàn thế giới.

II. Thách Thức Trong Kiểm Soát Virus PRRS Đột Biến và Biến Chủng

Một trong những thách thức lớn nhất trong việc kiểm soát bệnh PRRS là khả năng đột biến virus PRRS cao, dẫn đến sự xuất hiện của nhiều biến chủng với độc lực khác nhau. Điều này gây khó khăn cho việc phát triển vaccine hiệu quả và kiểm soát dịch bệnh. Các nghiên cứu gần đây cho thấy virus PRRS có sự thay đổi liên tục về mặt di truyền, đòi hỏi các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh phải được cập nhật và điều chỉnh thường xuyên. Bên cạnh đó đã có nhiều nghiên cứu cho thấy virus PRRS có sự đột biến cao, tạo ra nhiều chủng có độc lực khác nhau, rất khó để kiểm soát dịch bệnh.

2.1. Cơ Chế Đột Biến và Sự Tiến Hóa Của Virus PRRS

Virus PRRS có bộ gen RNA, vốn dễ bị đột biến hơn so với bộ gen DNA. Quá trình nhân lên của virus cũng có tỷ lệ lỗi cao, dẫn đến sự tích lũy các đột biến theo thời gian. Các đột biến này có thể ảnh hưởng đến độc lực, khả năng lây lan, và khả năng đáp ứng miễn dịch của virus. Sự tiến hóa liên tục của virus PRRS đòi hỏi các nhà khoa học phải liên tục theo dõi và nghiên cứu để hiểu rõ hơn về các biến chủng mới.

2.2. Ảnh Hưởng Của Đột Biến Đến Hiệu Quả Vaccine PRRS

Sự xuất hiện của các biến chủng virus PRRS có thể làm giảm hiệu quả của vaccine hiện có. Vaccine thường được thiết kế dựa trên các chủng virus cũ, và có thể không bảo vệ được chống lại các biến chủng mới. Do đó, việc phát triển vaccine đa giá hoặc vaccine có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch rộng rãi là rất quan trọng để đối phó với sự đa dạng di truyền của virus PRRS.

2.3. Giải Trình Tự Gen Virus PRRS Công Cụ Theo Dõi Biến Động Di Truyền

Giải trình tự gen là một công cụ quan trọng để theo dõi sự biến động di truyền của virus PRRS. Bằng cách so sánh trình tự gen của các chủng virus khác nhau, các nhà khoa học có thể xác định các đột biến quan trọng và đánh giá mức độ liên quan giữa các chủng. Thông tin này có thể được sử dụng để phát triển các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh hiệu quả hơn. Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của chủng virus sau các đời cấy chuyển liên tục.

III. Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Virus PRRS Phương Pháp Tiếp Cận

Nghiên cứu đặc tính sinh học virus PRRS là một bước quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh và phát triển các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh hiệu quả. Các nghiên cứu thường tập trung vào việc xác định khả năng gây bệnh, khả năng nhân lên, và khả năng đáp ứng miễn dịch của virus. Các phương pháp nghiên cứu bao gồm nuôi cấy virus trên tế bào, xác định hiệu giá virus, và phân tích di truyền của virus. Để hiểu rõ về các chủng virus PRRS, để tìm ra được các chủng virus có đủ tiêu chuẩn để sản xuất vacxin thì việc nghiên cứu một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus PRRS qua các đời cấy chuyển trên tế bào Marc-145.

3.1. Nuôi Cấy Virus PRRS Trên Tế Bào Marc 145 Quy Trình và Ứng Dụng

Tế bào Marc-145 là một dòng tế bào thường được sử dụng để nuôi cấy virus PRRS trong phòng thí nghiệm. Việc nuôi cấy virus cho phép các nhà khoa học nghiên cứu các đặc tính sinh học của virus, sản xuất virus để sử dụng trong các thí nghiệm khác, và phát triển vaccine. Phương pháp nghiên cứu: nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 trên môi trường tế bào Marc-145; xác định hiệu giá virus TCID50; xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy truyền.

3.2. Xác Định Hiệu Giá Virus PRRS TCID50 Đánh Giá Khả Năng Lây Nhiễm

Hiệu giá virus (TCID50) là một chỉ số quan trọng để đánh giá khả năng lây nhiễm của virus PRRS. TCID50 là nồng độ virus cần thiết để gây nhiễm cho 50% số tế bào được nuôi cấy. Việc xác định TCID50 cho phép các nhà khoa học so sánh khả năng lây nhiễm của các chủng virus khác nhau và đánh giá hiệu quả của các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh. Kết quả xác định hiệu giá virus qua các đời cấy chuyển.

3.3. Phân Tích Di Truyền Virus PRRS Xác Định Đột Biến và Biến Chủng

Phân tích di truyền là một công cụ quan trọng để xác định các đột biến và biến chủng của virus PRRS. Bằng cách so sánh trình tự gen của các chủng virus khác nhau, các nhà khoa học có thể xác định các đột biến quan trọng và đánh giá mức độ liên quan giữa các chủng. Thông tin này có thể được sử dụng để phát triển các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh hiệu quả hơn. Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS; RT-PCR; phương pháp giải trình tự Gen.

IV. Ứng Dụng Nghiên Cứu Virus PRRS Phát Triển Vaccine và Kiểm Soát

Các nghiên cứu về đặc tính sinh học virus PRRS có ứng dụng quan trọng trong việc phát triển vaccine và các biện pháp kiểm soát bệnh. Việc hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh, khả năng lây lan, và khả năng đáp ứng miễn dịch của virus cho phép các nhà khoa học thiết kế vaccine hiệu quả hơn và phát triển các chiến lược kiểm soát bệnh phù hợp. Để chủ động đạt hiệu quả cao trong công tác phòng chống dịch PRRS, Việt Nam cần có vacxin chế từ các chủng phân lập được.

4.1. Phát Triển Vaccine PRRS Các Loại Vaccine Hiện Có và Hạn Chế

Hiện nay, có nhiều loại vaccine PRRS khác nhau trên thị trường, bao gồm vaccine sống giảm độc lực và vaccine bất hoạt. Tuy nhiên, hiệu quả của các loại vaccine này có thể khác nhau tùy thuộc vào chủng virus và tình trạng miễn dịch của lợn. Một số vaccine có thể gây ra các tác dụng phụ không mong muốn, và một số vaccine có thể không bảo vệ được chống lại các biến chủng mới. Hiện nay đã có vacxin, tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng bảo hộ cho đàn lợn của các sản phẩm vacxin PRRS thương mại.

4.2. Các Biện Pháp Kiểm Soát Bệnh PRRS An Toàn Sinh Học và Quản Lý Dịch Bệnh

Ngoài vaccine, các biện pháp kiểm soát bệnh PRRS bao gồm tăng cường an toàn sinh học, quản lý dịch bệnh, và kiểm soát sự lây lan của virus. An toàn sinh học bao gồm các biện pháp như vệ sinh chuồng trại, kiểm soát sự ra vào của người và động vật, và sử dụng các sản phẩm khử trùng. Quản lý dịch bệnh bao gồm việc phát hiện sớm các trường hợp bệnh, cách ly và điều trị lợn bệnh, và tiêu hủy lợn chết. Các biện pháp kiểm soát sự lây lan của virus bao gồm kiểm soát vận chuyển lợn, sử dụng các sản phẩm khử trùng, và kiểm soát côn trùng và động vật gặm nhấm.

4.3. Tình Hình Bệnh PRRS Tại Việt Nam Thách Thức và Giải Pháp

Tình hình bệnh PRRS tại Việt Nam vẫn còn phức tạp, với các đợt dịch tái phát thường xuyên. Các thách thức bao gồm sự đa dạng di truyền của virus, việc sử dụng vaccine không hiệu quả, và việc thiếu các biện pháp kiểm soát bệnh hiệu quả. Các giải pháp bao gồm tăng cường nghiên cứu về virus PRRS, phát triển vaccine hiệu quả hơn, và tăng cường các biện pháp kiểm soát bệnh. Lần đầu tiên PRRS xuất hiện ở Việt Nam vào năm 1997, PRRS được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam.

V. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Virus PRRS Trong Tương Lai Gần

Nghiên cứu về virus PRRS vẫn là một lĩnh vực quan trọng và đầy thách thức. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh, khả năng lây lan, và khả năng đáp ứng miễn dịch của virus. Việc phát triển vaccine hiệu quả hơn và các biện pháp kiểm soát bệnh phù hợp là rất quan trọng để giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh PRRS gây ra. Do đó, để hiểu rõ về các chủng virus PRRS, để tìm ra được các chủng virus có đủ tiêu chuẩn để sản xuất vacxin thì việc nghiên cứu một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus PRRS qua các đời cấy chuyển trên tế bào Marc-145.

5.1. Nghiên Cứu Về Miễn Dịch Học Virus PRRS Phát Triển Vaccine Thế Hệ Mới

Nghiên cứu về miễn dịch học virus PRRS là rất quan trọng để phát triển vaccine thế hệ mới. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các kháng nguyên quan trọng của virus, cơ chế đáp ứng miễn dịch của lợn, và các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả vaccine. Việc phát triển vaccine đa giá hoặc vaccine có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch rộng rãi là rất quan trọng để đối phó với sự đa dạng di truyền của virus PRRS.

5.2. Phát Triển Các Phương Pháp Chẩn Đoán Nhanh và Chính Xác Bệnh PRRS

Việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh PRRS là rất quan trọng để phát hiện sớm các trường hợp bệnh và ngăn chặn sự lây lan của virus. Các phương pháp chẩn đoán hiện có bao gồm PCR, ELISA, và giải trình tự gen. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của các phương pháp chẩn đoán, và phát triển các phương pháp chẩn đoán tại chỗ để sử dụng trong điều kiện thực địa. Kết quả phản ứng RT-PCR với mồi ORF5.

5.3. Nghiên Cứu Về Tác Động Của Virus PRRS Đến Sức Khỏe Tổng Thể Của Lợn

Nghiên cứu về tác động của virus PRRS đến sức khỏe tổng thể của lợn là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh và phát triển các biện pháp điều trị hiệu quả. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các yếu tố nguy cơ, các bệnh nhiễm trùng thứ phát, và các tác động lâu dài của bệnh PRRS đến sức khỏe và năng suất của lợn. PRRS gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn, đặc biệt là lợn nái.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch sốt lợn Tai xanh (Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn - PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi toàn cầu. Tại Việt Nam, dịch bệnh từng bùng phát trên diện rộng với hơn 621.000 con lợn mắc bệnh và trên 336.000 con bị tiêu hủy trong năm 2010, sau khi đã lây lan qua 28 tỉnh thành vào năm 2008. Tác nhân gây bệnh là virus PRRS, một loại virus RNA có tỷ lệ biến dị di truyền cao. Thực tế cho thấy các chế phẩm vaccine ngoại nhập chưa mang lại hiệu quả bảo hộ toàn diện trước các chủng thực địa, đòi hỏi ngành thú y phải chủ động nghiên cứu và phát triển nguồn giống vaccine nhược độc từ chính các ổ dịch trong nước.

Đề tài tập trung giải quyết vấn đề cốt lõi: Đánh giá sự ổn định về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển liên tục trên dòng tế bào Marc-145. Mục tiêu cụ thể là xác định khả năng thích ứng tế bào, động thái nhân lên, độc lực gây bệnh tích tế bào và mức độ biến đổi của đoạn gen ORF5 mã hóa kháng nguyên GP5. Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 6 năm 2016 tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trên mẫu bệnh phẩm phân lập từ ổ dịch tại tỉnh Bắc Giang năm 2014.

Kết quả nghiên cứu cung cấp hệ thống dữ liệu định lượng chuẩn xác, khẳng định chủng virus đạt hiệu giá đỉnh 10^6,74 TCID50/25µl và duy trì độ tương đồng nucleotide từ 98,15% đến 100% qua 40 thế hệ cấy chuyển. Công trình tạo tiền đề khoa học vững chắc cho việc lựa chọn chủng giống phục vụ sản xuất vaccine phòng bệnh PRRS nội địa an toàn và hiệu quả cao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết virus học phân tử và cơ chế sinh bệnh học của Arterivirus. Virus PRRS thuộc bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, có cấu trúc hạt hình cầu vỏ bọc kích thước 45-80 nm với hệ gen RNA chuỗi đơn dương dài khoảng 13-15 kb gồm 7 khung đọc mở (ORF1 đến ORF7). Về mặt sinh bệnh học, virus có ái lực đặc hiệu với đại thực bào phế nang (PAM), phá hủy trực tiếp tới 40% quần thể đại thực bào, làm tê liệt hệ thống miễn dịch tự nhiên và mở đường cho các mầm bệnh kế phát nguy hiểm.

Ba khái niệm học thuật then chốt được vận dụng xuyên suốt đề tài gồm:

1. Đoạn gen ORF5 và glycoprotein GP5: Khung đọc mở ORF5 có kích thước 603 bp mã hóa protein kháng nguyên GP5 gồm 200 axit amin. Đây là glycoprotein màng liên kết vỏ bọc có tính đa dạng kháng nguyên cao nhất và giữ vai trò trung tâm trong quá trình kích thích cơ thể sinh kháng thể trung hòa.
2. Hiệu giá gây nhiễm mô tế bào (TCID50): Chỉ số định lượng thể hiện liều lượng virus cần thiết để phá hủy 50% số giếng nuôi cấy tế bào thử nghiệm, phản ánh chính xác khả năng nhân lên của mầm bệnh.
3. Hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE): Hiện tượng thoái hóa, co cụm, tròn lại và bong tróc của thảm tế bào nuôi cấy dưới tác động hủy hoại của virus.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn dữ liệu thực nghiệm thu thập từ 30 mẫu bệnh phẩm lợn nghi mắc PRRS tại ổ dịch Bắc Giang (gồm 10 lợn con theo mẹ, 7 lợn sau cai sữa, 6 lợn choai, 4 lợn nái mang thai và 3 lợn nái nuôi con). Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng dựa trên các biểu hiện lâm sàng đặc trưng như sốt cao, khó thở, tím tai, sảy thai và mất sữa. Sau khi sàng lọc bằng kỹ thuật RT-PCR và kiểm định độ thuần khiết (không tạp nhiễm với các virus CSF, FMD, PED và TGE), chủng KTY - PRRS - 04 phân lập từ mô phổi lợn nái được chọn làm đối tượng nghiên cứu chính.

Phương pháp phân tích bao gồm:

• Nuôi cấy và cấy chuyển liên tục qua 40 đời trên dòng tế bào thận khỉ Marc-145 trong môi trường DMEM bổ sung 5% FBS ở 37°C và 5% CO2. Lựa chọn dòng tế bào Marc-145 vì đây là hệ thống nuôi cấy chuẩn cho phép virus thích ứng tốt và biểu hiện rõ bệnh tích tế bào.
• Đánh giá động thái sinh trưởng và xác định hiệu giá virus theo phương pháp Behrens-Karber tại các mốc thời gian từ 24 đến 120 giờ sau gây nhiễm.
• Tách chiết RNA tổng số bằng bộ kít QIAamp, khuếch đại đoạn gen ORF5 kích thước 603 bp bằng RT-PCR chuyên biệt và giải trình tự gen tự động trên hệ thống Beckman Coulter CEQ 8000.
• Xử lý dữ liệu trình tự nucleotide và chuỗi axit amin bằng phần mềm chuyên dụng MEGA5 để đối chiếu mức độ tương đồng di truyền qua các thế hệ cấy chuyển P0, P10, P20, P30 và P40 trong suốt giai đoạn nghiên cứu từ tháng 9/2015 đến tháng 6/2016.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu ghi nhận 4 phát hiện quan trọng có ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc:

Thứ nhất, tỷ lệ lưu hành virus PRRS tại ổ dịch thực địa ở mức rất cao. Phân tích RT-PCR trên 30 mẫu bệnh phẩm cho thấy có 25 mẫu dương tính, đạt tỷ lệ 83,33%. Trong đó, nhóm lợn nái mang thai và nái nuôi con đạt tỷ lệ nhiễm tuyệt đối 100%, nhóm lợn choai đạt 83,33%, lợn con theo mẹ đạt 80% và lợn sau cai sữa đạt 71,43%. Chủng KTY - PRRS - 04 thể hiện tính thuần khiết tuyệt đối khi âm tính hoàn toàn với 4 loại virus tạp nhiễm thường gặp.

Thứ hai, khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của chủng KTY - PRRS - 04 trên tế bào Marc-145 có tính ổn định rất cao qua các đời cấy chuyển P0, P10, P20, P30 và P40. Bệnh tích xuất hiện sớm sau 36 giờ gây nhiễm với tỷ lệ tổn thương 5-10%, tăng mạnh lên 40-45% sau 48 giờ, đạt 70-80% sau 60 giờ và hủy hoại hoàn toàn 100% thảm tế bào sau 72 giờ trước khi các tế bào bong tróc hoàn toàn ở mốc 84 giờ.

Thứ ba, xác lập đường cong sinh trưởng điển hình của virus. Hiệu giá virus khởi điểm ở mức 10^4,23 TCID50/25µl sau 24 giờ gây nhiễm, tăng dần và đạt đỉnh cực đại 10^6,74 TCID50/25µl ở thời điểm 72 giờ, sau đó suy giảm nhanh chóng xuống còn 10^3,63 TCID50/25µl sau 120 giờ.

Thứ tư, xác định độ bền vững sinh học phân tử của đoạn gen ORF5 dài 603 bp mã hóa 200 axit amin. Mức độ tương đồng về chuỗi nucleotide giữa các thế hệ cấy chuyển dao động từ 98,15% đến 100%, và mức tương đồng về chuỗi axit amin đạt từ 96,88% đến 100%.

Thảo luận kết quả

Kết quả xác định đỉnh sinh trưởng tại mốc 72 giờ với hiệu giá 10^6,74 TCID50/25µl phản ánh chu kỳ nhân lên hoàn chỉnh của virus PRRS trước khi cơ chất tế bào bị phá hủy hoàn toàn. Dữ liệu này được thể hiện rõ qua biểu đồ đường cong sinh trưởng dạng hình chuông lệch phải và bảng ma trận đối chiếu mức độ tương đồng nucleotide/axit amin giữa các đời cấy chuyển đại diện. Sự sụt giảm hiệu giá sau 72 giờ được giải thích là do thảm tế bào Marc-145 đã thoái hóa toàn bộ, không còn giá thể sống để virus tiếp tục nhân lên, dẫn đến sự bất hoạt tự nhiên của các hạt virion tự do trong môi trường nuôi cấy.

So sánh với các công trình công bố trước đây, tốc độ phát triển bệnh tích tế bào và hiệu giá của chủng KTY - PRRS - 04 cao hơn so với chủng nhược độc Hanvet1.VN (chủng này đạt đỉnh sinh trưởng muộn hơn ở mốc 80-96 giờ) và các chủng phân lập tại vùng phụ cận Hà Nội trong một nghiên cứu gần đây. Điều này chứng minh chủng KTY - PRRS - 04 duy trì độc lực và khả năng nhân lên mạnh mẽ, đồng thời kết quả này hoàn toàn tương đồng với nghiên cứu của các nhà khoa học trong nước năm 2016 về các chủng virus phân lập tại Việt Nam.

Đặc biệt, sự bảo tồn gần như nguyên vẹn của đoạn gen ORF5 với độ tương đồng axit amin trên 96,88% qua 40 đời cấy chuyển khẳng định chủng KTY - PRRS - 04 không bị đột biến sai lệch kháng nguyên lớn trong điều kiện in vitro. Đây là tiêu chí kỹ thuật mang tính quyết định để lựa chọn chủng virus này làm ứng viên sản xuất vaccine nhược độc phòng chống dịch tai xanh.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả thực nghiệm đạt được, luận văn đưa ra 4 giải pháp cụ thể nhằm thúc đẩy ứng dụng vào thực tiễn chăn nuôi và thú y:

1. Chuẩn hóa quy trình thu hoạch sinh khối virus giống: Ban hành quy chuẩn kỹ thuật thu hoạch dịch nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 trên tế bào Marc-145 tại đúng thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm để đạt hiệu giá tối ưu 10^6,74 TCID50/25µl, áp dụng ngay trong quý tới tại các cơ sở nghiên cứu và sản xuất sinh phẩm thú y.
2. Thực hiện thử nghiệm đánh giá an toàn và hiệu lực bảo hộ in vivo: Triển khai thử nghiệm tiêm phòng và công độc thực nghiệm trên đàn lợn sạch bệnh với quy mô 30-50 cá thể trong khung thời gian 6-12 tháng tới, do các Viện nghiên cứu và Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y chủ trì thực hiện nhằm đo lường tỷ lệ bảo hộ thực tế.
3. Xây dựng ngân hàng lưu trữ chủng giống vaccine quốc gia: Lưu giữ chủng giống KTY - PRRS - 04 ở điều kiện nhiệt độ chuẩn -80°C hoặc trong môi trường nitơ lỏng, định kỳ 6 tháng kiểm định lại độ tinh sạch và khả năng nhân lên trên tế bào Marc-145 để đảm bảo không tạp nhiễm với các tác nhân gây bệnh nguy hiểm khác.
4. Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR gen ORF5 vào giám sát dịch tễ: Thiết lập mạng lưới chẩn đoán phân tử định kỳ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại đoạn gen 603 bp tại các vùng chăn nuôi trọng điểm, nhằm phát hiện sớm ổ dịch với độ chính xác trên 95%, do Chi cục Chăn nuôi và Thú y các địa phương phối hợp với các trang trại thực hiện trong giai đoạn từ nay đến năm 2030.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Các nhà khoa học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Vi sinh vật học - Thú y: Cung cấp phương pháp luận thực nghiệm chuẩn mực về quy trình thuần hóa virus qua 40 thế hệ cấy chuyển, cùng các kỹ thuật sinh học phân tử phân tích đoạn gen ORF5 dài 603 bp.
2. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và vaccine thú y: Tiếp cận dữ liệu kỹ thuật về đường cong sinh trưởng và mốc thu hoạch vàng 72 giờ đạt hiệu giá 10^6,74 TCID50/25µl, giúp tối ưu hóa hiệu suất và giảm chi phí sản xuất vaccine quy mô công nghiệp.
3. Bác sĩ thú y và cán bộ dịch tễ học động vật: Vận dụng số liệu lâm sàng thực tế với tỷ lệ phát hiện 83,33% trên 30 mẫu khảo sát và đặc trưng triệu chứng (nái mất sữa 80%, lợn sảy thai, khó thở) để chẩn đoán phân biệt chính xác dịch PRRS ngoài thực địa.
4. Chủ trang trại chăn nuôi lợn quy mô trang trại và gia trại: Hiểu rõ cơ chế virus phá hủy 40% đại thực bào phế nang gây suy giảm miễn dịch, từ đó xây dựng kế hoạch tiêm phòng chủ động và thiết lập rào cản an toàn sinh học nghiêm ngặt cho đàn vật nuôi.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao chủng virus KTY - PRRS - 04 lại được lựa chọn để nghiên cứu cấy chuyển qua 40 đời?
Chủng KTY - PRRS - 04 được phân lập từ mô phổi lợn nái có biểu hiện lâm sàng điển hình trong ổ dịch Bắc Giang năm 2014, sở hữu hiệu giá virus ban đầu cao vượt trội đạt 10^6,74 TCID50/25µl và hoàn toàn âm tính với các loại virus tạp nhiễm nguy hiểm như CSF, FMD, PED và TGE.

Thời điểm nào là tối ưu nhất để thu hoạch virus KTY - PRRS - 04 trên môi trường tế bào Marc-145?
Thời điểm tối ưu nhất là 72 giờ sau khi gây nhiễm tế bào. Tại thời điểm này, hiệu giá virus đạt đỉnh cực đại 10^6,74 TCID50/25µl và tỷ lệ bệnh tích tế bào đạt 100%. Sau 72 giờ, hàm lượng virus giảm rất nhanh xuống còn 10^3,63 TCID50/25µl ở mốc 120 giờ do tế bào chủ đã bị hủy hoại hoàn toàn.

Vì sao đoạn gen ORF5 lại được chọn để đánh giá đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS?
Đoạn gen ORF5 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 axit amin của protein kháng nguyên bề mặt GP5. Đây là vùng gen có tính biến dị cao nhất trong bộ gen của virus PRRS, đóng vai trò quyết định trong việc nhận diện thụ thể tế bào và kích thích sản sinh kháng thể trung hòa.

Mức độ ổn định di truyền của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển được đánh giá như thế nào?
Chủng virus thể hiện sự ổn định di truyền xuất sắc qua 40 thế hệ cấy chuyển liên tục trên tế bào Marc-145, với độ tương đồng nucleotide duy trì từ 98,15% đến 100% và độ tương đồng chuỗi axit amin đạt từ 96,88% đến 100%, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn về độ bền vững di truyền của giống sản xuất vaccine.

Kỹ thuật RT-PCR trong nghiên cứu cho tỷ lệ chẩn đoán dương tính trên đàn lợn nghi nhiễm thực tế là bao nhiêu?
Phương pháp RT-PCR đã xác định chính xác 25 mẫu dương tính trên tổng số 30 lợn nghi mắc bệnh tại ổ dịch, đạt tỷ lệ 83,33%. Trong đó, nhóm lợn nái mang thai và nái nuôi con cho kết quả dương tính 100%, khẳng định độ nhạy và độ tin cậy tuyệt đối của phương pháp chẩn đoán phân tử này.

Kết luận

• Chủng virus KTY - PRRS - 04 phân lập từ ổ dịch Bắc Giang có độ thuần khiết cao, không tạp nhiễm với 4 mầm bệnh đường ruột và dịch tả lợn phổ biến.
• Khả năng nhân lên và gây bệnh tích tế bào (CPE) trên dòng tế bào Marc-145 rất mạnh mẽ và ổn định qua 40 đời cấy chuyển, đạt mức phá hủy 100% thảm tế bào tại thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm.
• Xác lập thời điểm thu hoạch virus tối ưu tại mốc 72 giờ sau khi gây nhiễm, đạt hiệu giá đỉnh cao nhất 10^6,74 TCID50/25µl.
• Cấu trúc đoạn gen ORF5 (603 bp mã hóa 200 axit amin) có tính ổn định di truyền vượt trội, với mức độ tương đồng nucleotide từ 98,15% - 100% và axit amin từ 96,88% - 100% qua các thế hệ cấy chuyển P0 đến P40.
• Tỷ lệ chẩn đoán dương tính đạt 83,33% trên 30 mẫu bệnh phẩm thực địa, minh chứng cho tính hiệu quả của quy trình giám sát dịch tễ bằng kỹ thuật RT-PCR.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là chứng minh đầy đủ các luận cứ khoa học và thực nghiệm khẳng định chủng KTY - PRRS - 04 có đặc tính sinh học, động thái nhân lên và tính ổn định di truyền đáp ứng hoàn hảo các tiêu chuẩn của chủng giống gốc dùng để chế tạo vaccine nhược độc phòng bệnh Tai xanh tại Việt Nam. Kế hoạch tiếp theo là hoàn thiện các thử nghiệm in vivo đánh giá khả năng bảo hộ của vaccine trên đàn lợn trong giai đoạn 2026-2027. Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm thú y hãy tham khảo toàn văn luận văn để tiếp cận chi tiết quy trình công nghệ và ứng dụng hiệu quả vào sản xuất thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HÀ VĂN THỊNH NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS NHƯỢC ĐỘC KTY - PRRS - 04 GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các kết quả, số liệu nêu trong bản luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa được bảo vệ ở một học vị nào khác. Tôi cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày.năm 2016 Tác giả luận văn Hà Văn Thịnh i LỜI CẢM ƠN Quá trình học tập và rèn luyện dưới mái trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp tôi hòa thiện hơn về nhân cách và trình độ chuyên môn.

Tôi đã nhận được sự quan tâm, dạy dỗ tận tình của các Thầy, Cô giáo đặc biệt là các Thầy, Cô giáo công tác tại Khoa Thú y. Nhân dịp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cao học chuyên ngành Thạc sỹ thú y cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến các Thầy, Cô giáo – những người đã tận tình dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập tại Trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam cũng như trong suốt quá trình tôi thực hiện khóa luận này. Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô PGS. Nguyễn Thị Lan, Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Hà Nội, cô đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.

Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn đến các Thầy, Cô trong bộ môn Bệnh lý – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, các anh chị phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH – khoa Thú Y (B213 – B214) nơi tôi thực hiện đề tài, đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài tốt nhất. Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè những người đã luôn động viên, tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này. Trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày.năm 2016 Tác giả luận văn Hà Văn Thịnh ii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục.

iii Danh mục các từ viết tắt. vi Danh mục bảng. vii Danh mục hình. viii Trích yếu luận văn.

ix Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài:. Mục tiêu đề tài. Tổng quan tài liệu.

Tình hình nghiên cứu về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn. Tình hình dịch PRRS trên thế giới. Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam. Những nghiên cứu về dịch PRRS ở nước ngoài.

Những nghiên cứu về dịch PRRS ở Việt Nam. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV). Hình thái, cấu tạo. Phân loại virus PRRS.

Khả năng gây bệnh của virus PRRS. Sức đề kháng của virus PRRS. Đặc tính nuôi cấy virus PRRS. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản.

Đặc điểm chung. Động vật cảm nhiễm. Chất chứa mầm bệnh. Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây.

Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS. Bệnh tích của lợn mắc PRRS. Các phương pháp chẩn đoán PRRS. Biện pháp phòng và trị bệnh.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Nguyên liệu nghiên cứu.

Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc -145.

Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc -145. Phương pháp nghiên cứu. Nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 trên môi trường tế bào Marc - 145. Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50.

Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển. Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS. Phương pháp giải trình tự Gen. Phương pháp đọc kết quả.

Kết quả và thảo luận. Kết quả nghiên cứu chủng virus PRRS nghiên cứu. Kết quả lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu. Kiểm tra khả năng tạp nhiễm với các loại virus khác.

Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus kty - PRRS - 04. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển. Kết quả xác định hiệu giá virus qua các đời cấy chuyển. Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS - 04.

Kết quả tách chiết RNA tổng số của chủng virus KTY – PRRS - 04. Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của chủng virus KTY - PRRS - 04. Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua các đời cấy chuyển. Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự axit amin của virus KTY - PRRS - 04 qua các đời cấy chuyển.

Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử. Kết luận và kiến nghị. 53 Tài liệu tham khảo. 55 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Aa : acid amin BED : Blue Ear disease CNSH : Công nghệ sinh học CPE : Cyto Pathogenic Effect Cs : Cộng sự DMEM : Dulbecco,s Modified Eagle Medium ELISA : Enzyme Immunosortbent Linking Assay EVA : Equine virus FCS : Fetal Calf Serum IFA : Indirect Immunofluoresence Assay kDa : Kilodalton LDHV : Lactate Dehydlogenase – elevating virus MK : Monkey kidney cell MSD : Mistery Swine Disease OIE : Tổ chức thú y thế giới ORF : Open reading frame (khung đọc mở) PAM : Pulmnary alveolar macrophage PEARS : Porcine Endemic abortion and Respiratory syndrome PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus RNA : Ribonucleic acid SHFV : Simian hemorrhaghic fever virus L1 : Lần 1 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.

Protein cấu trúc của PRRSV. Sức đề kháng của virus với điều kiện ngoại cảnh. Thành phần và thể tích cho phản ứng RT-PCR. Các cặp mồi cho phản ứng RT-PCR.

Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT-PCR. Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được. Kết quả chẩn đoán RT-PCR các lợn nghi mắc PRRS. Hồ sơ giống virus PRRS lựa chọn nghiên cứu.

Kết quả xác định sự có mặt của virus PRRS, CSF, FMD, PED và TGE. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua các đời. Hiệu giá của chủng virus KTY – PRRS – 04 tại các thời điểm thu hoạch. Hiệu giá của chủng virus KTY - PRRS – 04 qua các đời cấy chuyển.

Sai khác về vị trí nucleotide ở các đời của chủng PRRS nghiên cứu. So sánh sự tương đồng về nucleotide của virus KTY - PRRS – 04 các đời cấy chuyển. Sai khác về vị trí axit amin ở các đời của chủng KTY - PRRS - 04. So sánh sự tương đồng về axit amin của virus PRRS – 04 các đời cấy chuyển.

50 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2. Bản đồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới. Cấu trúc hạt của PRRS virus. Cấu trúc bộ gen của PRRS virus.4: Bộ gen của virus PRRS.

Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào. Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus. Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm. Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm.

Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm. Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây gây nhiễm. Đường cong sinh trưởng của virus KTY – PRRS - 04. Log10 hiệu giá của chủng virus KTY - PRRS – 04 qua các đời cấy chuyển.

Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số. Kết quả phản ứng RT-PCR với mồi ORF5. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng KTY-PRRS-04 ở đời cấy chuyển thứ 10. So sánh trình tự nucleotide của chủng KYT-PRRS-04 ở các đời cấy chuyển.

So sánh trình tự axit amin của chủng KTY-PRRS-04 ở các đời cấy chuyển. Cây sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS -. 52 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN 1. Tên tác giả: Hà Văn Thịnh 2.

Tên luận văn: “Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus nhược độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn” 3. Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 4. Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đề tài nhằm mục đích đánh giá được sự ổn định một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 Phương pháp nghiên cứu Bằng các phương pháp nghiên cứu: nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 trên môi trường tế bào Marc-145; xác định hiệu giá virus TCID50; xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy truyền; tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS; RT-PCR; phương pháp giải trình tự Gen. Kết quả chính và kết luận 1.

Đặc tính sinh học của chủng virus KTY - PRRS - 04: Khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus nghiên cứu có tính ổn định cao qua các đời cấy chuyển trên môi trường Marc-145. Chủng virus PRRS có hiệu giá cao và ổn định, có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trường tế bào Marc-145. Hiệu giá virus thu được cao nhất tại thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm. Đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS - 04: Xác định được trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng virus sau các đời cấy chuyển liên tục.

Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 của chủng virus KTY - PRRS - 04 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 axit amin của protein kháng nguyên GP5. Trình tự nucleotide và axit amin của trong đoạn gen ORF5 của chủng nghiên cứu qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 tương đối ổn định, mức độ tương đồng về nucleotide từ 98,15% đến 100%; về axit amin từ 96,88% đến 100%. ix THESIS ABSTRACT 1.