HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN LÂM NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A/H5 BIẾN CHỦNG MỚI Ở ĐÀN GIA CẦM LÀM CƠ SỞ CHO PHÒNG CHỐNG DỊCH BỆNH TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN LÂM NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A/H5 BIẾN CHỦNG MỚI Ở ĐÀN GIA CẦM LÀM CƠ SỞ CHO PHÒNG CHỐNG DỊCH BỆNH TẠI VIỆT NAM Ngành : Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số : 9 64 01 02 Người hướng dẫn khoa học: 1. Tô Long Thành 2. Chu Đức Thắng HÀ NỘI - 2021 LỜI CAM ĐOAN Dữ liệu trong luận án là một phần của đề tài độc lập cấp quốc gia "Nghiên cứu sự phân bố các biến chủng (clade) mới của virus cúm A/H5N1 trên đàn gia cầm ở Việt Nam làm cơ sở cho việc phòng chống dịch bệnh đạt hiệu quả cao", mã số ĐTĐL.CN- 10/15, giai đoạn 2015-2018, do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương làm đơn vị chủ trì đề tài. Tôi xin cam đoan: (1) tất cả các kết quả thu được trong luận án này do tôi và nhóm nghiên cứu thực hiện, kết quả được công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài và các thành viên tham gia thực hiện; (2) các kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và không trùng lặp với bất kỳ một luận án tiến sĩ nào đã công bố trước đây; (3) mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Nguyễn Văn Lâm i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý Đào tạo, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình học tập, trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS. Tô Long Thành, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương; PGS.
Chu Đức Thắng, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, là những người thầy hướng dẫn khoa học, trực tiếp giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn tập thể các thầy cô và kỹ thuật viên thuộc Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo và các cán bộ của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình. Nghiên cứu này có sử dụng kinh phí của đề tài độc lập cấp quốc gia mã số ĐTĐL.CN-10/15 "Nghiên cứu sự phân bố các biến chủng (clade) mới của virus cúm A/H5N1 trên đàn gia cầm ở Việt Nam làm cơ sở cho việc phòng chống dịch bệnh đạt hiệu quả cao", do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương làm đơn vị chủ trì đề tài.
Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn các thành viên trong cùng nhóm nghiên cứu, các đồng tác giả Nguyễn Thị Thúy Mận, Nguyễn Hoàng Đăng, Nguyễn Đăng Thọ và Tô Long Thành đã cho phép tôi sử dụng kết quả nghiên cứu đã công bố vào một phần nội dung của luận án. Nhân dịp hoàn thành luận án, tôi luôn biết ơn gia đình, đặc biệt là vợ tôi, đã luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu và bản luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh Nguyễn Văn Lâm ii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục.
iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng. viii Danh mục hình. ix Trích yếu luận án.
xi Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu.
Đối tượng nghiên cứu. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.
Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. Tổng quan tài liệu. Đại cương về bệnh cúm gia cầm.
Lịch sử bệnh cúm gia cầm. Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới. Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 ở Việt Nam. Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm.
Triệu chứng bệnh cúm gia cầm. Bệnh tích bệnh cúm gia cầm. Chẩn đoán bệnh cúm gia cầm. Virus học cúm gia cầm.
Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm type A. Đặc tính kháng nguyên của virus cúm type A. Thành phần hóa học của virus. Sự nhân lên và tác động gây bệnh của virus.
Độc lực của virus. Đặc tính các protein và khả năng biến chủng của virus. Sức đề kháng của virus. Nuôi cấy và lưu giữ virus.
Phòng chống bệnh cúm gia cầm. Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vacxin phòng bệnh cúm gia cầm. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.
Nội dung nghiên cứu. Giám sát để tìm virus cúm A/H5 biến chủng mới. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới. Nghiên cứu khả năng bảo hộ đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới của các loại vacxin.
Nguyên liệu nghiên cứu. Dụng cụ lấy mẫu. Hóa chất lấy mẫu. Vacxin và động vật thí nghiệm.
Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp lấy mẫu. Phản ứng Realtime RT-PCR để sàng lọc, phát hiện virus cúm A/H5Nx. Giám định virus phân lập bằng phương pháp HI.
Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của virus A/H5 biến chủng mới. Phương pháp xác định chỉ số độc lực của virus A/H5 biến chủng mới. Phương pháp đánh giá triệu chứng lâm sàng. Phương pháp mổ khám toàn diện.
Chuẩn bị tiêu bản vi thể bằng phương pháp paraffin. Phương pháp công cường độc kiểm tra hiệu lực phòng bệnh của vacxin với virus cúm A/H5 biến chủng mới. Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả nghiên cứu và thảo luận.
Giám sát để tìm virus cúm A/H5 biến chủng mới. Kết quả thu thập mẫu và sàng lọc virus cúm A. Kết quả xác định subtype H5 từ các mẫu dương tính với virus cúm A. Kết quả xác định subtype H5N1 từ mẫu dương tính với virus cúm A/H5.
Kết quả xác định subtype H5N6 từ mẫu dương tính với virus cúm A/H5. Kết quả xét nghiệm virus cúm A/H5 biến chủng mới theo loài. Nghiên cứu phân loại virus cúm A/H5 biến chủng mới thu thập được từ gà, vịt và chim cút. Kết quả nghiên cứu nguồn gốc phát sinh của virus cúm A/H5 biến chủng mới qua phân tích phả hệ dựa trên gen HA.
Sự xuất hiện của virus cúm A/H5 biến chủng mới theo thời gian và không gian. Một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới. Đặc tính sinh học phân tử tiểu phần HA1 của các biến chủng. Đặc tính gây bệnh của virus cúm A/H5 biến chủng mới.
Triệu chứng bệnh tích do virus cúm A/H5 biến chủng mới gây ra trên gia cầm. Khả năng bảo hộ đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới của các loại vacxin. Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của virus clade 2. Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của virus clade 2.
Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của virus clade 2. Biến đổi bệnh lý ở gà có miễn dịch dị chủng sau công cường độc bằng virus clade 2. Thảo luận về khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của biến thể virus cúm A/H5Nx. Kết luận và đề nghị .109 Danh mục công trình đã công bố liên quan đến luận án .110 Tài liệu tham khảo .128 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải ADN Axit deoxyribonucleic AI Avian influenza ARN Axit ribonucleic ATSH An toàn sinh học Bộ NN&PTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Bp Base pair CEF Chicken Embryo Fibroblast CGC Cúm gia cầm CK Chicken CS Cộng sự CT Cycle of threshold CTCPTTYTW1 Công ty Cổ phần thuốc Thú y Trung ương 1 DK Duck ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FAO Food and Agriculture Organization GMT Geometic Mean Titer Gs Goose HA Hemagglutination HSD Hạn sử dụng HGKT Hiệu giá kháng thể HI Hemagglutination Inhibition HPAI Highly Pathgenic Avian Influenza IVPI Intravenous Pathogenicity Index Kb Kilo base LPAI Low Pathogenic Avian Influenza M Matrix protein MDCK Madin-Darby-Canine-Kidney MDK Muscovy duck MDT Mediocris Downtime vi MEGA Molecular Evolution Genetic Analysis NA Neuraminidae NCVD National Centre for Veterinary Diagnostics NEP Nuclear export protein NP Nucleoprotein NS Non-strutural protein NSX Ngày sản xuất OIE Office International des Épizooties PA Polymerase acidic PB1 Polymerase basic protein 1 PB2 Polymerase basic protein 2 PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction SPF Specific pathogen free RT-PCR Reverse transcriptase- Polymerase Chain Reaction RNP Ribonucleoprotein TCID50 Tissue Culture Infective Dosage TCN Tiêu chuẩn ngành TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TW Trung ương VN Việt Nam WHO World Health Organization vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.
Sự xuất hiện của virus cúm A/H5 biến chủng mới giai đoạn 2003-2014. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới giai đoạn 2004 - 2017. Bệnh tích điển hình của gà mắc cúm gia cầm. Cơ cấu thu thập mẫu của đề tài.
Danh mục các cặp mồi phát hiện gen M, H5, N1 và N6. Danh mục trình tự mồi giải trình tự gen HA1 và HA2. Bố trí thí nghiệm công cường độc. Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực phòng bệnh của vacxin với virus H5N1 clade 2.
Bệnh tích đại thể trên gà ở các lô thí nghiệm sau công cường độc.93 viii DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 2. Sơ đồ mô tả các cơ chế sinh bệnh chủ yếu, các gen và sản phẩm của gen tham ra vào sự gây nhiễm của virus cúm A/H5N1. Sơ đồ quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm. Cấu trúc virus cúm H5N1.
Quá trình nhân lên của virus cúm. Cấu trúc bậc 3 của HA virus cúm. Vị trí của 5 epitope kháng nguyên chính. Kết quả sàng lọc virus cúm A tại các tỉnh giám sát.
Tỷ lệ nhiễm virus cúm A theo giai đoạn và khu vực giám sát. Kết quả sàng lọc virus cúm A/H5 tại các tỉnh giám sát. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 theo giai đoạn và khu vực giám sát .
