Phân Lập Và Xác Định Đặc Tính Sinh Học Của Virus PEDV Ở Lợn Tại Thái Nguyên Và Hưng Yên

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của chủng pedv porcine epidemic diarrhea virus ở lợn, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Trần Thị Nhàn
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Văn Phan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Virus PEDV Ở Lợn Tại Thái Nguyên Và Hưng Yên
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG BIỂU
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. THESIS ABSTRACT
• 7. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 8. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 9. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 10. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC HOẶC THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 11. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 11.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY DỊCH TIÊU CHẢY CẤP TRÊN LỢN (PEDV)
• 11.2. Hình thái cấu trúc và bộ gen virus
• 11.3. Các loại protein cấu trúc của PEDV
• 12. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 12.1. Địa điểm nghiên cứu
• 12.2. Thời gian nghiên cứu
• 12.3. Đối tượng - Vật liệu nghiên cứu
• 12.4. Đối tượng - Nguyên liệu nghiên cứu
• 12.5. Môi trường, hóa chất
• 12.6. Thiết bị, dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm
• 12.7. Nội dung nghiên cứu
• 12.8. Phương pháp nghiên cứu
• 12.8.1. Phương pháp thu thập và xử lí mẫu
• 12.8.2. Phương pháp phân lập virus PED trên tế bào Vero
• 12.8.3. Phương pháp kiểm tra vô trùng và thuần khiết
• 12.8.4. Phương pháp RT – PCR
• 12.8.5. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá virus (TCID50/ml)
• 12.8.6. Phương pháp kiểm tra tính độc
• 12.8.7. Phương pháp chẩn đoán nhanh PEDV bằng PED-Ag test kit
• 12.8.8. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của virus
• 12.8.9. Phương pháp giải trình tự gen
• 12.8.10. Phương pháp xây dựng cây sinh học phân tử
• 13. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 13.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm dương tính với PEDV trên lợn
• 13.2. Kết quả phân lập virus từ các mẫu bệnh phẩm trên tế bào vero
• 13.3. Kết quả phân lập PEDV
• 13.4. Kết quả kiểm tra vô trùng và thuần khiết của hai chủng virus phân lập
• 13.5. Kết quả xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV phân lập
• 13.5.1. Khả năng thích nghi và gây bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập
• 13.5.2. Hiệu giá 2 chủng virus PED phân lập
• 13.5.3. Đường cong sinh trưởng của 2 chủng virus PED
• 13.6. Kết quả xác định độc lực của 2 chủng PEDV
• 13.7. Kết quả phân tích giải trình tự gen S của 2 chủng PEDV
• 13.8. Kết quả so sánh tương đồng về nucleotide và axit amin
• 14. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Virus PEDV Gây Bệnh Tiêu Chảy Cấp Ở Lợn

Bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (PED) do virus PEDV gây ra là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan nhanh chóng qua đường tiêu hóa. Bệnh đặc trưng bởi tiêu chảy nặng, nôn mửa, mất nước và tỷ lệ tử vong cao, đặc biệt ở lợn con dưới 7 ngày tuổi (90-100%). PEDV cũng có thể gây ra các vấn đề sinh sản ở lợn nái. Dịch bệnh lần đầu tiên được ghi nhận ở châu Âu vào những năm 1970, sau đó lan rộng sang châu Á và trở thành bệnh lưu hành ở nhiều nước chăn nuôi lợn, gây thiệt hại kinh tế lớn. Tại Việt Nam, dịch bệnh được phát hiện lần đầu vào năm 2008 và nhanh chóng lan rộng, ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi lợn. Việc nghiên cứu và kiểm soát dịch bệnh PEDV là vô cùng quan trọng để bảo vệ ngành chăn nuôi lợn.

1.1. Lịch Sử Phát Hiện Và Lây Lan Của Virus PEDV

Virus PEDV lần đầu tiên được xác định ở châu Âu vào năm 1971 và lan rộng khắp châu lục này. Tuy nhiên, số vụ dịch giảm đáng kể trong những năm 1980 và 1990. Sau đó, bệnh trở thành lưu hành ở các nước chăn nuôi lợn ở Châu Á như Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Philippines, Đài Loan và Thái Lan. Tỷ lệ chết ở lợn con theo mẹ có thể lên đến 100% (Carvajal et al., 1995, Kim et al., 2001, Penseart and Yeo, 2006, Puranaveja et al., 2009) dẫn đến tổn thất kinh tế đáng kể trong ngành chăn nuôi lợn toàn cầu.

1.2. Tác Động Kinh Tế Của Dịch Bệnh PEDV Trong Chăn Nuôi Lợn

Dịch bệnh PEDV gây ra những tổn thất kinh tế đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn. Tỷ lệ tử vong cao ở lợn con, đặc biệt là lợn con sơ sinh, dẫn đến giảm số lượng lợn thịt và ảnh hưởng đến năng suất chăn nuôi. Ngoài ra, chi phí phòng ngừa và điều trị bệnh cũng làm tăng chi phí sản xuất. Do đó, việc kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh PEDV là vô cùng quan trọng để bảo vệ lợi nhuận của người chăn nuôi.

II. Thách Thức Trong Kiểm Soát Dịch Bệnh PEDV Tại Việt Nam

Mặc dù đã có nhiều nỗ lực trong việc kiểm soát dịch bệnh PEDV, Việt Nam vẫn đối mặt với nhiều thách thức. Các loại vắc-xin nhập khẩu đôi khi không mang lại hiệu quả cao do sự khác biệt về chủng virus giữa vắc-xin và chủng virus lưu hành tại địa phương. Bên cạnh đó, quy mô chăn nuôi nhỏ lẻ, phân tán và việc áp dụng các biện pháp an toàn sinh học chưa triệt để cũng tạo điều kiện cho virus PEDV lây lan và tái phát. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển vắc-xin phù hợp với chủng virus địa phương là vô cùng cần thiết.

2.1. Hiệu Quả Vắc Xin PEDV Nhập Khẩu Còn Hạn Chế

Một trong những thách thức lớn nhất trong kiểm soát dịch bệnh PEDV tại Việt Nam là hiệu quả không cao của các loại vắc-xin nhập khẩu. Nguyên nhân chính là do sự khác biệt về kháng nguyên giữa chủng virus trong vắc-xin và chủng virus đang lưu hành ngoài thực địa. Điều này dẫn đến việc vắc-xin không thể tạo ra miễn dịch bảo vệ hiệu quả cho đàn lợn.

2.2. Quy Mô Chăn Nuôi Nhỏ Lẻ Gây Khó Khăn Cho Kiểm Soát PEDV

Quy mô chăn nuôi nhỏ lẻ, phân tán và việc áp dụng các biện pháp an toàn sinh học chưa triệt để cũng là một yếu tố quan trọng gây khó khăn cho việc kiểm soát dịch bệnh PEDV. Việc quản lý và kiểm soát dịch bệnh trở nên khó khăn hơn khi các hộ chăn nuôi không tuân thủ nghiêm ngặt các quy trình phòng bệnh và an toàn sinh học.

2.3. Quản Lý Vận Chuyển Lợn Chưa Tốt Làm Lây Lan Mầm Bệnh PEDV

Việc quản lý vận chuyển, buôn bán lợn chưa tốt cũng là một trong những nguyên nhân khiến mầm bệnh PEDV dễ dàng lây lan từ vùng này sang vùng khác. Lợn bệnh hoặc lợn mang virus có thể được vận chuyển đến các vùng chưa có dịch, gây ra các đợt bùng phát mới.

III. Phân Lập Và Xác Định Đặc Tính Sinh Học Virus PEDV

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV ở lợn nuôi tại Thái Nguyên và Hưng Yên. Mục tiêu là phân lập thành công virus PEDV từ thực địa và xác định các đặc tính sinh học của chủng virus phân lập được. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển vắc-xin phòng bệnh hiệu quả hơn trong tương lai. Các mẫu bệnh phẩm được thu thập từ lợn con bị tiêu chảy cấp và được chẩn đoán dương tính với PEDV bằng kỹ thuật RT-PCR.

3.1. Phương Pháp Thu Thập Và Xử Lý Mẫu Bệnh Phẩm PEDV

Các mẫu bệnh phẩm được thu thập từ lợn con bị tiêu chảy cấp (phân, ruột) được chẩn đoán dương tính bằng kỹ thuật RT – PCR từ năm 2015-2017 tại hai tỉnh Hưng Yên và Thái Nguyên đang được lưu trữ tại Phòng thí nghiệm Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam.

3.2. Quy Trình Phân Lập Virus PEDV Trên Tế Bào Vero

Phương pháp phân lập PEDV trên tế bào Vero được thực hiện theo quy trình chuẩn. Tế bào Vero được sử dụng để nuôi cấy virus và theo dõi sự phát triển của virus thông qua các dấu hiệu bệnh tích tế bào. Quá trình phân lập được thực hiện nhiều lần để đảm bảo thu được chủng virus thuần khiết.

3.3. Kiểm Tra Vô Trùng Và Thuần Khiết Của Virus PEDV Phân Lập

Sau khi phân lập, virus PEDV được kiểm tra vô trùng và thuần khiết để đảm bảo không có sự nhiễm tạp của các vi sinh vật khác. Các phương pháp kiểm tra bao gồm kiểm tra bằng mắt thường, kiểm tra bằng kính hiển vi và kiểm tra bằng kỹ thuật RT-PCR.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của PEDV Phân Lập

Nghiên cứu đã phân lập thành công hai chủng virus PEDV (PEDV/TN8/2016 và PEDV/HY3/2015) từ các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Thái Nguyên và Hưng Yên. Các chủng virus này đã được xác định các đặc tính sinh học như khả năng gây bệnh tích tế bào, hiệu giá virus, đường cong sinh trưởng và độc lực. Kết quả cho thấy cả hai chủng virus đều có khả năng gây bệnh cho lợn thí nghiệm với các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng của PED.

4.1. Khả Năng Gây Bệnh Tích Tế Bào Của PEDV Phân Lập

Các chủng PEDV phân lập được có khả năng gây bệnh tích tế bào trên tế bào Vero. Bệnh tích tế bào được quan sát thấy dưới kính hiển vi và được đánh giá dựa trên mức độ tổn thương của tế bào. Kết quả cho thấy cả hai chủng virus đều có khả năng gây bệnh tích tế bào rõ rệt.

4.2. Xác Định Hiệu Giá Virus PEDV Phân Lập TCID50 ml

Hiệu giá virus của các chủng PEDV phân lập được xác định bằng phương pháp TCID50/ml. Hiệu giá virus cho biết số lượng virus có khả năng gây nhiễm trên tế bào. Kết quả cho thấy hiệu giá virus của cả hai chủng virus đều đạt mức cao, cho thấy khả năng lây nhiễm mạnh.

4.3. Đường Cong Sinh Trưởng Của Virus PEDV Trên Tế Bào

Đường cong sinh trưởng của virus PEDV được xác định bằng cách theo dõi sự gia tăng số lượng virus theo thời gian trên tế bào Vero. Kết quả cho thấy virus phát triển nhanh chóng trên tế bào và đạt hiệu giá cao nhất sau 36-48 giờ gây nhiễm.

V. Phân Tích Di Truyền Và So Sánh Chủng Virus PEDV Phân Lập

Kết quả phân tích di truyền cho thấy cả hai chủng PEDV phân lập được đều thuộc nhóm G2b và có mối quan hệ gần gũi với các chủng PEDV đã được công bố tại Việt Nam trong những năm gần đây. Tuy nhiên, khi so sánh với các chủng PEDV trên thế giới, mức độ tương đồng về nucleotide và axit amin khá thấp. Điều này cho thấy sự khác biệt về di truyền giữa các chủng PEDV lưu hành tại Việt Nam và các chủng PEDV trên thế giới.

5.1. Phân Tích Phả Hệ Phylogenetic Tree Của Virus PEDV

Phân tích phả hệ được thực hiện để xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng PEDV phân lập được và các chủng PEDV tham chiếu khác. Kết quả cho thấy cả hai chủng virus đều thuộc nhóm G2b và có mối quan hệ gần gũi với các chủng PEDV đã được công bố tại Việt Nam.

5.2. So Sánh Trình Tự Nucleotide Và Axit Amin Của PEDV

Trình tự nucleotide và axit amin của các chủng PEDV phân lập được so sánh với các chủng PEDV tham chiếu khác để xác định mức độ tương đồng và khác biệt về di truyền. Kết quả cho thấy có sự khác biệt đáng kể về trình tự nucleotide và axit amin giữa các chủng PEDV lưu hành tại Việt Nam và các chủng PEDV trên thế giới.

VI. Ứng Dụng Nghiên Cứu PEDV Cho Phát Triển Vắc Xin Tương Lai

Nghiên cứu này đã phân lập thành công hai chủng PEDV từ thực địa và xác định các đặc tính sinh học và di truyền của chúng. Hai chủng virus này sẽ là nguồn nguyên liệu quan trọng cho các nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh tiêu chảy cấp trên lợn (PED) trong tương lai. Việc sử dụng chủng virus địa phương để sản xuất vắc-xin có thể mang lại hiệu quả bảo vệ cao hơn so với việc sử dụng các chủng virus nhập khẩu.

6.1. Tiềm Năng Sử Dụng Chủng PEDV Phân Lập Để Sản Xuất Vắc Xin

Các chủng PEDV phân lập được trong nghiên cứu này có tiềm năng lớn để sử dụng trong sản xuất vắc-xin phòng bệnh tiêu chảy cấp trên lợn. Việc sử dụng chủng virus địa phương có thể giúp tạo ra vắc-xin có khả năng bảo vệ tốt hơn cho đàn lợn.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Vắc Xin PEDV Hiệu Quả Hơn

Nghiên cứu này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển vắc-xin PEDV hiệu quả hơn. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc cải tiến quy trình sản xuất vắc-xin, tăng cường khả năng tạo miễn dịch của vắc-xin và đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc-xin trên đàn lợn thực địa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ NHÀN PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG PEDV (PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) Ở LỢN NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN VÀ HƯNG YÊN Chuyên ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Lê Văn Phan NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 c LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ thực hiện luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày.

năm 2018 Tác giả luận văn Trần Thị Nhàn i c LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. Lê Văn Phan đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiêm, Khoa Thú y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày. năm 2018 Tác giả luận văn Trần Thị Nhàn ii c MỤC LỤC Lời cam đoan.

ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt.v Danh mục bảng biểu. vi Danh mục hình. vii Trích yếu luận văn.

viii Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. Phạm vi nghiên cứu.

Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học hoặc thực tiễn của đề tài. Tổng quan tài liệu. Giới thiệu chung về virus gây dịch tiêu chảy cấp trên lợn (PEDV). Hình thái cấu trúc và bộ gen virus.

Các loại protein cấu trúc của PEDV. Đặc tính nuôi cấy của virus PED trên tế bào. Tính không đồng nhất. Tình hình nghiên cứu trong nước và nước ngoài.

Nghiên cứu trong nước. Nghiên cứu nước ngoài. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng PED trên thế giới và việt nam. Trên thế giới.

Tại Việt Nam. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.

Đối tượng -Vật liệu nghiên cứu. Đối tượng - Nguyên liệu nghiên cứu. Môi trường, hóa chất. Thiết bị, dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm.

Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp thu thập và xử lí mẫu. Phương pháp phân lập virus PED trên tế bào Vero.

Phương pháp kiểm tra vô trùng và thuần khiết. Phương pháp RT – PCR. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá virus (TCID50/ml). Phương pháp kiểm tra tính độc.

Phương pháp chẩn đoán nhanh PEDV bằng PED-Ag test kit. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của virus. Phương pháp giải trình tự gen. Phương pháp xây dựng cây sinh học phân tử.

Kết quả và thảo luận. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm dương tính với PEDV trên lợn. Kết quả phân lập virus từ các mẫu bệnh phẩm trên tế bào vero. Kết quả phân lập PEDV.

Kết quả kiểm tra vô trùng và thuần khiết của hai chủng virus phân lập. Kết quả xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV phân lập. Khả năng thích nghi và gây bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập. Hiệu giá 2 chủng virus PED phân lập.

Đường cong sinh trưởng của 2 chủng virus PED. Kết quả xác định độc lực của 2 chủng PEDV. Kết quả phân tích giải trình tự gen S của 2 chủng PEDV. Kết quả so sánh tương đồng về nucleotide và axit amin.

Kết luận và kiến nghị .51 Tài liệu tham khảo .61 iv c DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt cDNA Complementary deoxyribonucleic acid DEPC Diethyl pyrocarbonate DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium DTT Dithiothreitol ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay HY Hưng Yên MTV Một thành viên MOI Multiplicity of infection ORF Open reading frame PBS Phosphate buffered saline PDCoV Porcine deltacoronavirus PED Porcine Epidemic Diarrhea PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus RNA Ribonucleic acid RT - PCR Reverse transcription polymerase chain reaction TCID50 Tissue culture infective dose 50 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TGEV Transmissible gastroenteritis virus TN Thái Nguyên TNHH Trách nhiệm hữu hạn TSB Trypto-casein soy broth v c DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2. Chức năng của các loại protein cấu tạo PEDV. Danh mục các loại vắc - xin phòng bệnh PED đang lưu hành tại Việt Nam hiện nay. Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA.

Trình tự mồi dùng trong nghiên cứu. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chuẩn độ hiệu giá virus PED. Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra tính độc các chủng PEDV phân lập.

Trình tự mồi sử dụng giải trình tự gen S. Chu trình nhiệt của phản ứng RT - PCR nhân gen S. Danh sách mẫu bệnh phẩm dương tính với PEDV thuộc hai tỉnh Hưng Yên và Thái Nguyên. Kết quả phân lập PEDV trên tế bào Vero.

Kết quả kiểm tra tạp khuẩn và tạp nấm của 2 chủng PEDV. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm virus ngoại lai. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của lợn con sau khi uống PEDV với các liều khác nhau.

Mức độ tương đồng (dưới) và số nucleotide khác nhau giữa 2 chủng phân lập được và các chủng tham chiếu. Mức độ tương đồng (dưới) và số amino acid khác nhau giữa 2 chủng phân lập được và các chủng tham chiếu .48 vi c DANH MỤC HÌNH Hình 2. Sơ đồ tổ chức và cấu trúc hệ gen virus PED. Kỹ thuật kiểm tra PEDV bằng kít test nhanh.

Kết quả chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR. Biểu hiện bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập được và kết quả giám định bằng kỹ thuật RT –PCR. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra tạp nhiễm của 2 chủng PEDV phân lập với một số loại virus gây tiêu chảy trên lợn khác. Bệnh tích tế bào của PEDV qua các đời cấy truyền ở 24 giờ sau gây nhiễm.

Biểu đồ biểu thị hiệu giá chủng PEDV phân lập qua các đời cấy truyền. Đường biểu diễn tốc độ sinh trưởng của hai chủng virus PED phân lập theo thời gian. Bệnh tích tế bào theo thời gian. Một số dấu hiệu lâm sàng ghi nhận được trên lợn thí nghiệm.

Hình ảnh mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể ở lợn thí nghiệm sau khi gây nhiễm PEDV. Mối quan hệ di truyền giữa chủng PEDV/TN8/2016 và chủng PEDV/HY3/2015 với các chủng ham chiếu khác. Kết quả căn trình tự vùng COE. Kết quả căn trình tự các vùng quyết định kháng nguyên.

49 vii c TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Nhàn Tên luận văn: Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) tại Thái Nguyên và Hưng Yên Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam (VNUA) Mục đích nghiên cứu - Phân lập được virus PED để khẳng định chắc chắn sự lưu hành của loại virus này tại Thái Nguyên và Hưng Yên. - Xác định một số đặc tính sinh học của chủng virus PED phân lập được. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp thu thập và xử lí mẫu. Các mẫu bệnh phẩm được thu thập theo phương pháp hồi cứu.

Tức là chỉ sử dụng những mẫu đã được chẩn đoán dương tính với PEDV tại hai tỉnh Hưng Yên và Thái Nguyên từ năm 2015 -2017 bằng kỹ thuật RT – PCR và hiện đang còn lưu trữ tại Phòng thí nghiệm của Công ty TNHHMTV Avac Việt Nam. Mẫu được chọn, trước khi sử dụng cho phân lập virus đều được kiểm tra lại tình trạng mẫu bằng kỹ thuật RT –PCR để giám định lại sự có mặt của PEDV trong mẫu bệnh phẩm. Sau đó mẫu được nghiền hoặc đồng nhất thành huyễn dịch 10%, ly tâm và lọc qua màng lọc 0,45µm và sử dụng cho phân lập PEDV. - Phương pháp phân lập PEDV trên tế bào Vero - Phương pháp kiểm tra vô trùng thuần khiết + Phuơng pháp kiểm tra vô trùng theo TCVN 8684:2011 + Phương pháp kiểm tra sự thuần khiết sử dụng kỹ thuật RT – PCR - Phương pháp chuẩn độ virus (TCID50/ml) - Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của virus - Phương pháp xác định tính độc của virus - Phương pháp giải trình tự gene - Phương pháp dựng cây sinh phát sinh chủng loại.

Kết quả chính và kết luận - Sau 5 đời cấy truyền mù trên môi trường tế bào vero, đã phân lập thành công 2 chủng virus PED (PEDV/TN8/2016 và PEDV/HY3/2015) trong tổng số 22 mẫu bệnh viii c phẩm thực địa. Hiệu giá virus thu được dao động từ 106 - 106,5 TCID50/ml. Cả 2 chủng virus đều đạt tiêu chuẩn vô trùng và thuần khiết không tạp nhiễm bất cứ vi sinh vật ngoại lai nào. - Kết quả nghiên cứu về đường cong sinh trưởng của hai chủng PEDV phân lập được trên môi trường tế bào cho thấy, với liều gây nhiễm MOI = 0,01, hiệu giá virus thu được đạt cao nhất sau 36 – 48 giờ gây nhiễm.

- Kết quả nghiên cứu về độc lực của virus trên động vật thí nghiệm cho thấy cả 2 chủng PEDV phân lập được đều có khả năng gây bệnh cho lợn thí nghiệm với những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng của PED. - Kết quả phân tích về phả hệ (phylogenetic tree) cho thấy cả hai chủng PEDV phân lập được đều nằm trong nhóm G2b, có mối quan hệ gần gũi với các chủng PEDV tham chiếu khác đã được công bố ở Việt Nam trong những năm gần đây.