Luận văn phân lập và xác định đặc tính sinh học của virus PEDV ở lợn tại Thái Nguyên và Hưng Yên

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của chủng pedv porcine epidemic diarrhea virus ở lợn, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Trần Thị Nhàn
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Văn Phan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Virus PEDV Ở Lợn Tại Thái Nguyên Và Hưng Yên
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG BIỂU
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. THESIS ABSTRACT
• 7. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 8. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 9. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 10. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC HOẶC THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 11. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 11.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY DỊCH TIÊU CHẢY CẤP TRÊN LỢN (PEDV)
• 11.2. Hình thái cấu trúc và bộ gen virus
• 11.3. Các loại protein cấu trúc của PEDV
• 12. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 12.1. Địa điểm nghiên cứu
• 12.2. Thời gian nghiên cứu
• 12.3. Đối tượng - Vật liệu nghiên cứu
• 12.4. Đối tượng - Nguyên liệu nghiên cứu
• 12.5. Môi trường, hóa chất
• 12.6. Thiết bị, dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm
• 12.7. Nội dung nghiên cứu
• 12.8. Phương pháp nghiên cứu
• 12.8.1. Phương pháp thu thập và xử lí mẫu
• 12.8.2. Phương pháp phân lập virus PED trên tế bào Vero
• 12.8.3. Phương pháp kiểm tra vô trùng và thuần khiết
• 12.8.4. Phương pháp RT – PCR
• 12.8.5. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá virus (TCID50/ml)
• 12.8.6. Phương pháp kiểm tra tính độc
• 12.8.7. Phương pháp chẩn đoán nhanh PEDV bằng PED-Ag test kit
• 12.8.8. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của virus
• 12.8.9. Phương pháp giải trình tự gen
• 12.8.10. Phương pháp xây dựng cây sinh học phân tử
• 13. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 13.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm dương tính với PEDV trên lợn
• 13.2. Kết quả phân lập virus từ các mẫu bệnh phẩm trên tế bào vero
• 13.3. Kết quả phân lập PEDV
• 13.4. Kết quả kiểm tra vô trùng và thuần khiết của hai chủng virus phân lập
• 13.5. Kết quả xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV phân lập
• 13.5.1. Khả năng thích nghi và gây bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập
• 13.5.2. Hiệu giá 2 chủng virus PED phân lập
• 13.5.3. Đường cong sinh trưởng của 2 chủng virus PED
• 13.6. Kết quả xác định độc lực của 2 chủng PEDV
• 13.7. Kết quả phân tích giải trình tự gen S của 2 chủng PEDV
• 13.8. Kết quả so sánh tương đồng về nucleotide và axit amin
• 14. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Virus PEDV Gây Bệnh Tiêu Chảy Cấp Ở Lợn

Bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (PED) do virus PEDV gây ra là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan nhanh chóng qua đường tiêu hóa. Bệnh đặc trưng bởi tiêu chảy nặng, nôn mửa, mất nước và tỷ lệ tử vong cao, đặc biệt ở lợn con dưới 7 ngày tuổi (90-100%). PEDV cũng có thể gây ra các vấn đề sinh sản ở lợn nái. Dịch bệnh lần đầu tiên được ghi nhận ở châu Âu vào những năm 1970, sau đó lan rộng sang châu Á và trở thành bệnh lưu hành ở nhiều nước chăn nuôi lợn, gây thiệt hại kinh tế lớn. Tại Việt Nam, dịch bệnh được phát hiện lần đầu vào năm 2008 và nhanh chóng lan rộng, ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi lợn. Việc nghiên cứu và kiểm soát dịch bệnh PEDV là vô cùng quan trọng để bảo vệ ngành chăn nuôi lợn.

1.1. Lịch Sử Phát Hiện Và Lây Lan Của Virus PEDV

Virus PEDV lần đầu tiên được xác định ở châu Âu vào năm 1971 và lan rộng khắp châu lục này. Tuy nhiên, số vụ dịch giảm đáng kể trong những năm 1980 và 1990. Sau đó, bệnh trở thành lưu hành ở các nước chăn nuôi lợn ở Châu Á như Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Philippines, Đài Loan và Thái Lan. Tỷ lệ chết ở lợn con theo mẹ có thể lên đến 100% (Carvajal et al., 1995, Kim et al., 2001, Penseart and Yeo, 2006, Puranaveja et al., 2009) dẫn đến tổn thất kinh tế đáng kể trong ngành chăn nuôi lợn toàn cầu.

1.2. Tác Động Kinh Tế Của Dịch Bệnh PEDV Trong Chăn Nuôi Lợn

Dịch bệnh PEDV gây ra những tổn thất kinh tế đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn. Tỷ lệ tử vong cao ở lợn con, đặc biệt là lợn con sơ sinh, dẫn đến giảm số lượng lợn thịt và ảnh hưởng đến năng suất chăn nuôi. Ngoài ra, chi phí phòng ngừa và điều trị bệnh cũng làm tăng chi phí sản xuất. Do đó, việc kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh PEDV là vô cùng quan trọng để bảo vệ lợi nhuận của người chăn nuôi.

II. Thách Thức Trong Kiểm Soát Dịch Bệnh PEDV Tại Việt Nam

Mặc dù đã có nhiều nỗ lực trong việc kiểm soát dịch bệnh PEDV, Việt Nam vẫn đối mặt với nhiều thách thức. Các loại vắc-xin nhập khẩu đôi khi không mang lại hiệu quả cao do sự khác biệt về chủng virus giữa vắc-xin và chủng virus lưu hành tại địa phương. Bên cạnh đó, quy mô chăn nuôi nhỏ lẻ, phân tán và việc áp dụng các biện pháp an toàn sinh học chưa triệt để cũng tạo điều kiện cho virus PEDV lây lan và tái phát. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển vắc-xin phù hợp với chủng virus địa phương là vô cùng cần thiết.

2.1. Hiệu Quả Vắc Xin PEDV Nhập Khẩu Còn Hạn Chế

Một trong những thách thức lớn nhất trong kiểm soát dịch bệnh PEDV tại Việt Nam là hiệu quả không cao của các loại vắc-xin nhập khẩu. Nguyên nhân chính là do sự khác biệt về kháng nguyên giữa chủng virus trong vắc-xin và chủng virus đang lưu hành ngoài thực địa. Điều này dẫn đến việc vắc-xin không thể tạo ra miễn dịch bảo vệ hiệu quả cho đàn lợn.

2.2. Quy Mô Chăn Nuôi Nhỏ Lẻ Gây Khó Khăn Cho Kiểm Soát PEDV

Quy mô chăn nuôi nhỏ lẻ, phân tán và việc áp dụng các biện pháp an toàn sinh học chưa triệt để cũng là một yếu tố quan trọng gây khó khăn cho việc kiểm soát dịch bệnh PEDV. Việc quản lý và kiểm soát dịch bệnh trở nên khó khăn hơn khi các hộ chăn nuôi không tuân thủ nghiêm ngặt các quy trình phòng bệnh và an toàn sinh học.

2.3. Quản Lý Vận Chuyển Lợn Chưa Tốt Làm Lây Lan Mầm Bệnh PEDV

Việc quản lý vận chuyển, buôn bán lợn chưa tốt cũng là một trong những nguyên nhân khiến mầm bệnh PEDV dễ dàng lây lan từ vùng này sang vùng khác. Lợn bệnh hoặc lợn mang virus có thể được vận chuyển đến các vùng chưa có dịch, gây ra các đợt bùng phát mới.

III. Phân Lập Và Xác Định Đặc Tính Sinh Học Virus PEDV

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV ở lợn nuôi tại Thái Nguyên và Hưng Yên. Mục tiêu là phân lập thành công virus PEDV từ thực địa và xác định các đặc tính sinh học của chủng virus phân lập được. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển vắc-xin phòng bệnh hiệu quả hơn trong tương lai. Các mẫu bệnh phẩm được thu thập từ lợn con bị tiêu chảy cấp và được chẩn đoán dương tính với PEDV bằng kỹ thuật RT-PCR.

3.1. Phương Pháp Thu Thập Và Xử Lý Mẫu Bệnh Phẩm PEDV

Các mẫu bệnh phẩm được thu thập từ lợn con bị tiêu chảy cấp (phân, ruột) được chẩn đoán dương tính bằng kỹ thuật RT – PCR từ năm 2015-2017 tại hai tỉnh Hưng Yên và Thái Nguyên đang được lưu trữ tại Phòng thí nghiệm Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam.

3.2. Quy Trình Phân Lập Virus PEDV Trên Tế Bào Vero

Phương pháp phân lập PEDV trên tế bào Vero được thực hiện theo quy trình chuẩn. Tế bào Vero được sử dụng để nuôi cấy virus và theo dõi sự phát triển của virus thông qua các dấu hiệu bệnh tích tế bào. Quá trình phân lập được thực hiện nhiều lần để đảm bảo thu được chủng virus thuần khiết.

3.3. Kiểm Tra Vô Trùng Và Thuần Khiết Của Virus PEDV Phân Lập

Sau khi phân lập, virus PEDV được kiểm tra vô trùng và thuần khiết để đảm bảo không có sự nhiễm tạp của các vi sinh vật khác. Các phương pháp kiểm tra bao gồm kiểm tra bằng mắt thường, kiểm tra bằng kính hiển vi và kiểm tra bằng kỹ thuật RT-PCR.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của PEDV Phân Lập

Nghiên cứu đã phân lập thành công hai chủng virus PEDV (PEDV/TN8/2016 và PEDV/HY3/2015) từ các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Thái Nguyên và Hưng Yên. Các chủng virus này đã được xác định các đặc tính sinh học như khả năng gây bệnh tích tế bào, hiệu giá virus, đường cong sinh trưởng và độc lực. Kết quả cho thấy cả hai chủng virus đều có khả năng gây bệnh cho lợn thí nghiệm với các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng của PED.

4.1. Khả Năng Gây Bệnh Tích Tế Bào Của PEDV Phân Lập

Các chủng PEDV phân lập được có khả năng gây bệnh tích tế bào trên tế bào Vero. Bệnh tích tế bào được quan sát thấy dưới kính hiển vi và được đánh giá dựa trên mức độ tổn thương của tế bào. Kết quả cho thấy cả hai chủng virus đều có khả năng gây bệnh tích tế bào rõ rệt.

4.2. Xác Định Hiệu Giá Virus PEDV Phân Lập TCID50 ml

Hiệu giá virus của các chủng PEDV phân lập được xác định bằng phương pháp TCID50/ml. Hiệu giá virus cho biết số lượng virus có khả năng gây nhiễm trên tế bào. Kết quả cho thấy hiệu giá virus của cả hai chủng virus đều đạt mức cao, cho thấy khả năng lây nhiễm mạnh.

4.3. Đường Cong Sinh Trưởng Của Virus PEDV Trên Tế Bào

Đường cong sinh trưởng của virus PEDV được xác định bằng cách theo dõi sự gia tăng số lượng virus theo thời gian trên tế bào Vero. Kết quả cho thấy virus phát triển nhanh chóng trên tế bào và đạt hiệu giá cao nhất sau 36-48 giờ gây nhiễm.

V. Phân Tích Di Truyền Và So Sánh Chủng Virus PEDV Phân Lập

Kết quả phân tích di truyền cho thấy cả hai chủng PEDV phân lập được đều thuộc nhóm G2b và có mối quan hệ gần gũi với các chủng PEDV đã được công bố tại Việt Nam trong những năm gần đây. Tuy nhiên, khi so sánh với các chủng PEDV trên thế giới, mức độ tương đồng về nucleotide và axit amin khá thấp. Điều này cho thấy sự khác biệt về di truyền giữa các chủng PEDV lưu hành tại Việt Nam và các chủng PEDV trên thế giới.

5.1. Phân Tích Phả Hệ Phylogenetic Tree Của Virus PEDV

Phân tích phả hệ được thực hiện để xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng PEDV phân lập được và các chủng PEDV tham chiếu khác. Kết quả cho thấy cả hai chủng virus đều thuộc nhóm G2b và có mối quan hệ gần gũi với các chủng PEDV đã được công bố tại Việt Nam.

5.2. So Sánh Trình Tự Nucleotide Và Axit Amin Của PEDV

Trình tự nucleotide và axit amin của các chủng PEDV phân lập được so sánh với các chủng PEDV tham chiếu khác để xác định mức độ tương đồng và khác biệt về di truyền. Kết quả cho thấy có sự khác biệt đáng kể về trình tự nucleotide và axit amin giữa các chủng PEDV lưu hành tại Việt Nam và các chủng PEDV trên thế giới.

VI. Ứng Dụng Nghiên Cứu PEDV Cho Phát Triển Vắc Xin Tương Lai

Nghiên cứu này đã phân lập thành công hai chủng PEDV từ thực địa và xác định các đặc tính sinh học và di truyền của chúng. Hai chủng virus này sẽ là nguồn nguyên liệu quan trọng cho các nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh tiêu chảy cấp trên lợn (PED) trong tương lai. Việc sử dụng chủng virus địa phương để sản xuất vắc-xin có thể mang lại hiệu quả bảo vệ cao hơn so với việc sử dụng các chủng virus nhập khẩu.

6.1. Tiềm Năng Sử Dụng Chủng PEDV Phân Lập Để Sản Xuất Vắc Xin

Các chủng PEDV phân lập được trong nghiên cứu này có tiềm năng lớn để sử dụng trong sản xuất vắc-xin phòng bệnh tiêu chảy cấp trên lợn. Việc sử dụng chủng virus địa phương có thể giúp tạo ra vắc-xin có khả năng bảo vệ tốt hơn cho đàn lợn.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Vắc Xin PEDV Hiệu Quả Hơn

Nghiên cứu này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển vắc-xin PEDV hiệu quả hơn. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc cải tiến quy trình sản xuất vắc-xin, tăng cường khả năng tạo miễn dịch của vắc-xin và đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc-xin trên đàn lợn thực địa.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch tiêu chảy cấp trên lợn (Porcine Epidemic Diarrhea - PED) do virus PEDV gây ra là một trong những bệnh truyền nhiễm đường tiêu hóa nguy hiểm nhất trong ngành chăn nuôi lợn toàn cầu. Bệnh đặc trưng bởi tình trạng nôn mửa, tiêu chảy cấp tính, mất nước nghiêm trọng và gây tỷ lệ tử vong từ 90% đến 100% ở lợn con sơ sinh dưới 7 ngày tuổi. Tại Việt Nam, dịch PED được ghi nhận lần đầu tiên vào cuối năm 2008 tại tỉnh Đồng Nai, sau đó nhanh chóng lây lan ra diện rộng, gây thiệt hại kinh tế ước tính hàng trăm tỷ đồng cho các trang trại chăn nuôi. Mặc dù nhiều loại vắc-xin thương mại nhập khẩu từ Hàn Quốc và Mỹ đã được cấp phép lưu hành, hiệu quả bảo hộ trên thực địa vẫn chưa đạt kỳ vọng do sự khác biệt về kháng nguyên giữa chủng vắc-xin cổ điển và các biến chủng dã sinh đang lưu hành.

Xuất phát từ thực tiễn cấp bách đó, đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Thú y của tác giả Trần Thị Nhàn, dưới sự hướng dẫn của PGS. Lê Văn Phan tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam phối hợp cùng Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam, đã được thực hiện từ tháng 10/2017 đến tháng 09/2018. Nghiên cứu tập trung giải quyết hai mục tiêu trọng tâm: phân lập thành công các chủng virus PEDV thực địa từ 22 mẫu bệnh phẩm thu thập tại hai vùng chăn nuôi trọng điểm là Hưng Yên và Thái Nguyên trong giai đoạn 2015 - 2017, đồng thời xác định các đặc tính sinh học, động học nhân lên và đặc điểm sinh học phân tử của các chủng phân lập được. Kết quả nghiên cứu đã tạo ra nguồn giống virus thuần khiết với hiệu giá cao từ 10^6,0 đến 10^6,5 TCID50/ml, đạt độ tương đồng di truyền trên 98% so với các chủng gây bệnh tại Việt Nam, đặt nền móng cốt lõi cho việc nghiên cứu và sản xuất vắc-xin PED nội địa trong tương lai gần.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết phân loại học virus hiện đại của họ Coronaviridae, phân họ Coronavirinae và chi Alphacoronavirus. Cấu trúc hệ gen của PEDV là sợi đơn RNA dương có kích thước xấp xỉ 28 kb với 7 khung đọc mở (ORF), mã hóa cho 4 protein cấu trúc bao gồm protein gai (S), protein màng (M), protein vỏ (E), protein nucleocapsid (N) cùng 3 protein không cấu trúc liên quan đến quá trình sao chép (ORF1a, ORF1b và ORF3).

Bốn khái niệm khoa học trọng tâm được áp dụng xuyên suốt nghiên cứu gồm:

1. Glycoprotein gai (Protein S): Protein bề mặt có trọng lượng phân tử khoảng 180 - 200 kDa gồm 1.386 axit amin, chịu trách nhiệm gắn kết thụ thể tế bào chủ và kích thích sản sinh kháng thể trung hòa.
2. Hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE): Hiện tượng tế bào Vero bị dung giải màng, hình thành hợp bào nhiều nhân và bong tróc khỏi giá thể dưới tác động của virus.
3. Phân nhóm di truyền (Genogroup G1 và G2): Cơ chế phân loại dựa trên gen S để phân biệt nhóm cổ điển G1 (chủng chuẩn CV777) và nhóm biến chủng đại dịch G2 (đặc trưng bởi các đột biến chèn - xóa S-INDEL).
4. Liều gây nhiễm mô nuôi cấy 50% (TCID50): Đơn vị chuẩn độ sinh học định lượng mật độ hạt virus có khả năng cảm nhiễm trên thảm tế bào nuôi cấy in vitro.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và cỡ mẫu: Đề tài tiến hành khảo sát và chọn lọc trên tổng số 22 mẫu bệnh phẩm (gồm 16 mẫu phân và 6 mẫu ruột non) thu thập từ các ổ dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Hưng Yên và Thái Nguyên trong giai đoạn từ năm 2015 đến năm 2017.

Phương pháp chọn mẫu: Áp dụng phương pháp hồi cứu có định hướng từ nguồn mẫu lưu trữ tại Phòng R&D của Công ty Avac Việt Nam ở nhiệt độ -40°C. Toàn bộ mẫu được tái kiểm tra và khẳng định dương tính với PEDV bằng phản ứng RT-PCR trước khi tiến hành xử lý dịch lọc 0,45 µm để nuôi cấy.

Phương pháp phân tích và lý do lựa chọn:

1. Nuôi cấy phân lập trên dòng tế bào Vero (ATCC CCL-81): Sử dụng môi trường DMEM bổ sung chính xác 10 µg/ml Trypsin. Lý do chọn phương pháp này là vì tế bào Vero có tính cảm nhiễm cao nhất với PEDV, và enzyme Trypsin giữ vai trò bắt buộc trong việc cắt tiểu đơn vị S1/S2 nhằm kích hoạt quá trình xâm nhập của virus.
2. Kiểm tra độ vô trùng và thuần khiết: Đánh giá tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc theo tiêu chuẩn TCVN 8684:2011 trên môi trường TSB, TSA, SDA trong 7 - 14 ngày; đồng thời dùng RT-PCR để loại trừ tạp nhiễm các virus tiêu chảy ngoại lai gồm TGEV, Rotavirus và PDCoV.
3. Chuẩn độ hiệu giá và xác định đường cong sinh trưởng: Sử dụng phương pháp Spearman - Kärber trên đĩa 96 giếng và đánh giá động học sinh trưởng tại các mốc từ 6 đến 96 giờ với liều gây nhiễm MOI = 0,01.
4. Đánh giá độc lực in vivo: Thử nghiệm công độc đường uống trên lợn con dưới 7 ngày tuổi ở 3 mức liều 10^2, 10^3, 10^4 TCID50/ml để theo dõi triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể.
5. Giải trình tự gen S và phân tích phả hệ: Khuếch đại toàn bộ 4.161 nucleotide của gen S bằng 4 cặp mồi đặc hiệu W20, W21, W22, W23, sau đó phân tích căn chỉnh bằng BioEdit 7.1 và dựng cây phả hệ bằng phần mềm MEGA 7 theo thuật toán Neighbor-Joining.

Thời gian thực hiện: Nghiên cứu được triển khai liên tục trong vòng 12 tháng, từ ngày 01/10/2017 đến ngày 30/09/2018 tại tỉnh Hưng Yên.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập thành công 2 chủng thực địa đạt tỷ lệ 9,09%: Từ 22 mẫu bệnh phẩm ban đầu, qua 5 đời cấy truyền liên tiếp trên tế bào Vero, nghiên cứu đã phân lập và thích nghi thành công 2 chủng virus thực địa gồm PEDV/TN8/2016 (nguồn gốc từ ruột non tại Thái Nguyên) và PEDV/HY3/2015 (nguồn gốc từ phân tại Hưng Yên). Bệnh tích tế bào đặc trưng được ghi nhận rõ từ đời cấy truyền thứ 2 đối với chủng TN8 và đời thứ 3 đối với chủng HY3.

2. Hiệu giá virus tăng trưởng mạnh qua các đời cấy truyền: Hiệu giá của chủng PEDV/HY3/2015 tăng từ 10^2,25 TCID50/ml ở đời P1 lên 10^5,88 TCID50/ml ở đời P4. Chủng PEDV/TN8/2016 có khả năng thích ứng vượt trội hơn, đạt hiệu giá từ 10^3,00 TCID50/ml ở đời P1 tăng lên 10^6,25 TCID50/ml ở đời P4 và duy trì 10^6,50 TCID50/ml ở đời P5. Thời gian xuất hiện bệnh tích tế bào rút ngắn từ 24 - 36 giờ (ở P1 - P2) xuống chỉ còn 12 giờ sau gây nhiễm (ở P3 - P5).

3. Đạt tiêu chuẩn tuyệt đối về độ vô trùng và thuần khiết: Sau 7 - 14 ngày kiểm nghiệm, cả hai chủng virus đều không phát hiện tạp nhiễm vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí hay nấm mốc. Phản ứng RT-PCR khẳng định sản phẩm phân lập âm tính 100% với các virus gây tiêu chảy khác gồm TGEV (đoạn gen 859 bp), Rotavirus (đoạn gen 309 bp) và Deltacoronavirus (đoạn gen 493 bp).

4. Gây bệnh tích điển hình trên động vật thực nghiệm: Cả hai chủng PEDV phân lập ở các liều từ 10^2 đến 10^4 TCID50/ml đều gây tiêu chảy cấp phân lỏng màu vàng, nôn mửa và mất nước trên 100% lợn con dưới 7 ngày tuổi trong vòng 24 - 48 giờ. Mổ khám ghi nhận bệnh tích đại thể đặc trưng với dạ dày ứ đọng sữa vón cục và thành ruột non mỏng manh trong suốt.

Thảo luận kết quả

Khả năng thích ứng và nhân lên của hai chủng virus trên tế bào Vero phụ thuộc chặt chẽ vào nồng độ Trypsin và mật độ thảm tế bào. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng nồng độ 10 µg/ml Trypsin cùng mật độ tế bào đạt 90% - 100% đáy chai là điều kiện tối ưu để virus nhân lên mà không làm bong sớm tế bào chủ. Động học sinh trưởng của hai chủng virus có thể được minh họa trực quan qua biểu đồ đường biểu diễn sự biến thiên của log10 TCID50 theo thời gian, trong đó đường cong sinh trưởng thể hiện rõ hiệu giá đạt đỉnh cực đại sau 36 - 48 giờ gây nhiễm với liều MOI = 0,01 trước khi suy giảm dần ở mốc 72 - 96 giờ.

Phân tích phả hệ phân tử gen S dài 4.161 nucleotide (mã hóa 1.386 amino acid) cho thấy cả hai chủng phân lập đều thuộc phân nhóm biến chủng G2b. Khi so sánh mức độ tương đồng di truyền, hai chủng này tương đồng tới 99% về nucleotide và 98% về amino acid với hai chủng tham chiếu nổi bật tại Việt Nam là HUA/PED114 và HUA/PED118. Ngược lại, mức độ tương đồng khi so sánh với chủng vắc-xin cổ điển thế giới CV777 (nhóm G1a) chỉ đạt 92,6% - 93,2% về nucleotide và 91,2% - 92,9% về amino acid. Sự khác biệt này nên được trình bày thông qua bảng ma trận khoảng cách di truyền và cây sinh học phân tử dựng bằng MEGA 7, làm sáng tỏ nguyên nhân tại sao các loại vắc-xin nhập khẩu dựa trên chủng cổ điển lại có tỷ lệ bảo hộ thực địa suy giảm tại các ổ dịch ở Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Đẩy mạnh nghiên cứu suy giảm độc lực để sản xuất vắc-xin nhược độc: Các doanh nghiệp sản xuất thuốc thú y và viện nghiên cứu chuyên ngành cần tiếp tục cấy truyền liên tục chủng PEDV/TN8/2016 qua 80 - 100 đời trên tế bào Vero nhằm làm suy giảm hoàn toàn độc lực, hướng tới sản xuất vắc-xin nhược độc nội địa đạt tỷ lệ bảo hộ trên 85% cho đàn lợn con trong giai đoạn 2024 - 2026.

2. Chuẩn hóa quy trình chẩn đoán RT-PCR tại các phòng xét nghiệm: Cục Thú y và hệ thống Chi cục Thú y vùng triển khai ứng dụng thống nhất cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen S kích thước 651 bp, bảo đảm thời gian chẩn đoán ca bệnh dưới 6 giờ với độ chính xác đạt 100% để khoanh vùng ổ dịch kịp thời.

3. Tăng cường kiểm soát an toàn sinh học tại các trang trại: Người chăn nuôi lợn tại các địa phương trọng điểm như Hưng Yên, Thái Nguyên cần duy trì lịch sát trùng chuồng đẻ 2 lần/tuần bằng hóa chất chuyên dụng, kết hợp tiêm phòng vắc-xin cho lợn nái mang thai trước khi sinh 2 - 4 tuần để giảm tỷ lệ chết ở lợn con sơ sinh xuống dưới 5% trong vòng 12 tháng tới.

4. Xây dựng ngân hàng dữ liệu dịch tễ phân tử virus PEDV: Các trường đại học và cơ quan quản lý dịch tễ cần thiết lập chương trình giải trình tự gen S định kỳ tối thiểu 50 mẫu thực địa mỗi năm, hoàn thành việc xây dựng bản đồ dịch tễ học bộ gen PEDV quốc gia trước quý 4/2025 nhằm chủ động cảnh báo các biến chủng mới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Doanh nghiệp sản xuất vắc-xin và sinh phẩm thú y: Tiếp cận chi tiết quy trình phân lập, công thức bổ sung 10 µg/ml Trypsin và phương pháp tối ưu hóa hiệu giá virus trên tế bào Vero đạt mức 10^6,5 TCID50/ml để ứng dụng trực tiếp vào quy mô sản xuất công nghiệp.

2. Cán bộ nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Vi sinh vật - Thú y: Sử dụng dữ liệu giải trình tự 4.161 nucleotide của gen S và cây phả hệ phân nhóm G2b làm tài liệu giảng dạy, đối sánh dữ liệu di truyền trong các đề tài dịch tễ học phân tử chuyên sâu.

3. Kỹ thuật viên xét nghiệm và bác sĩ thú y chẩn đoán: Nắm vững quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm phân, ruột non và chu trình nhiệt 40 chu kỳ của phản ứng RT-PCR để phát hiện nhanh PEDV với độ nhạy cao, loại trừ chính xác các tác nhân gây tiêu chảy phân lỏng khác như TGEV và Rotavirus.

4. Chủ trang trại và kỹ sư quản lý chăn nuôi lợn công nghiệp: Hiểu rõ cơ chế lây truyền, động học sao chép của virus và mức độ nguy hiểm của PEDV trên lợn con dưới 7 ngày tuổi để xây dựng quy trình cách ly chuồng đẻ và chiến lược tiêm phòng vắc-xin bảo hộ đàn hiệu quả.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tỷ lệ phân lập thành công virus PEDV trên tế bào Vero thường ở mức thấp? Quá trình phân lập PEDV gặp nhiều rào cản do virus đòi hỏi điều kiện nuôi cấy khắt khe, đặc biệt là nồng độ Trypsin 10 µg/ml để kích hoạt bám dính tế bào. Ngoài ra, độc tính từ chất chứa đường ruột và chất lượng bảo quản mẫu ở nhiệt độ -40°C ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ phân lập, vốn chỉ đạt 9,09% trong nghiên cứu này và dao động dưới 14,3% theo các y văn quốc tế.

2. Vì sao gen S luôn được lựa chọn làm đối tượng chính để giải trình tự và phân tích di truyền? Gen S dài 4.161 nucleotide mã hóa glycoprotein gai gồm 1.386 amino acid, chứa các epitope trung hòa quan trọng nhất kích thích miễn dịch bảo hộ của vật chủ. Các biến đổi chèn - xóa trên gen S phản ánh trực tiếp quá trình tiến hóa kháng nguyên, giúp định danh chính xác các phân nhóm dịch tễ G1a, G1b, G2a và G2b trên toàn cầu.

3. Vắc-xin PEDV nhập khẩu từ nước ngoài có bảo hộ hoàn toàn đàn lợn nuôi tại Việt Nam không? Các vắc-xin nhập khẩu thương mại phần lớn phát triển từ chủng cổ điển nhóm G1a (như CV777 hoặc DR13), chỉ đạt độ tương đồng amino acid 91,2% - 92,9% so với các chủng dã sinh G2b tại Việt Nam. Sự khác biệt kháng nguyên lớn này làm suy giảm hiệu lực bảo hộ chéo, khiến dịch bệnh vẫn có nguy cơ tái bùng phát trên đàn đã tiêm phòng.

4. Chủng PEDV/TN8/2016 phân lập được có những ưu thế gì nổi bật để phát triển thành vắc-xin? Chủng PEDV/TN8/2016 có khả năng thích ứng cao trên tế bào Vero, rút ngắn thời gian gây bệnh tích xuống 12 giờ ở đời P5 và đạt hiệu giá virus cao 10^6,25 TCID50/ml. Chủng giống đạt tiêu chuẩn vô trùng 100% và có độ tương đồng di truyền lên đến 98% - 99% với các biến chủng PEDV đang lưu hành phổ biến tại miền Bắc.

5. Triệu chứng và bệnh tích mổ khám đặc trưng nhất của bệnh tiêu chảy cấp PED là gì? Lợn con dưới 7 ngày tuổi mắc bệnh biểu hiện tiêu chảy dữ dội phân nhiều nước màu vàng, nôn mửa liên tục và mất nước cấp tính dẫn đến tử vong nhanh. Bệnh tích đại thể điển hình khi mổ khám gồm dạ dày căng phồng chứa sữa đông vón không tiêu và thành ruột non bị bào mỏng trong suốt do teo nhung mao niêm mạc ruột.

Kết luận

• Phân lập thành công 2 chủng virus PEDV thực địa (PEDV/TN8/2016 và PEDV/HY3/2015) từ 22 mẫu bệnh phẩm với tỷ lệ đạt 9,09% qua 5 đời cấy truyền trên tế bào Vero. • Tối ưu hóa hiệu giá nhân giống virus đạt đỉnh từ 10^6,0 đến 10^6,5 TCID50/ml sau 36 - 48 giờ gây nhiễm trong môi trường bổ sung 10 µg/ml Trypsin. • Xác nhận độ vô trùng và thuần khiết đạt 100%, không tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc cũng như các virus tiêu chảy nguy hiểm khác như TGEV, Rotavirus và Deltacoronavirus. • Chứng minh độc lực mạnh mẽ của 2 chủng phân lập trên lợn con dưới 7 ngày tuổi với tỷ lệ biểu hiện bệnh tích teo nhung mao ruột đạt 100%. • Giải mã toàn bộ 4.161 nucleotide gen S, xác định hai chủng thuộc phân nhóm G2b có độ tương đồng di truyền cao 98% - 99% so với các chủng lưu hành tại Việt Nam.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là cung cấp nguồn chủng giống PEDV thực địa chuẩn hóa, có hoạt lực cao và đặc tính kháng nguyên tương đồng tuyệt đối với dịch tễ nội địa, giải quyết nút thắt về nguồn nguyên liệu sản xuất sinh phẩm. Bước tiếp theo cần triển khai cấy truyền liên tục qua 90 đời trong 18 - 24 tháng tới để làm giảm độc lực hoàn toàn, phục vụ thương mại hóa vắc-xin nhược độc. Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất vắc-xin thú y cần khẩn trương đẩy mạnh hợp tác ứng dụng kết quả này nhằm chủ động bảo vệ an toàn sinh học cho ngành chăn nuôi lợn Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ NHÀN PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG PEDV (PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) Ở LỢN NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN VÀ HƯNG YÊN Chuyên ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Lê Văn Phan NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 c LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ thực hiện luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày.

năm 2018 Tác giả luận văn Trần Thị Nhàn i c LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. Lê Văn Phan đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiêm, Khoa Thú y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày. năm 2018 Tác giả luận văn Trần Thị Nhàn ii c MỤC LỤC Lời cam đoan.

ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt.v Danh mục bảng biểu. vi Danh mục hình. vii Trích yếu luận văn.

viii Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. Phạm vi nghiên cứu.

Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học hoặc thực tiễn của đề tài. Tổng quan tài liệu. Giới thiệu chung về virus gây dịch tiêu chảy cấp trên lợn (PEDV). Hình thái cấu trúc và bộ gen virus.

Các loại protein cấu trúc của PEDV. Đặc tính nuôi cấy của virus PED trên tế bào. Tính không đồng nhất. Tình hình nghiên cứu trong nước và nước ngoài.

Nghiên cứu trong nước. Nghiên cứu nước ngoài. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng PED trên thế giới và việt nam. Trên thế giới.

Tại Việt Nam. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.

Đối tượng -Vật liệu nghiên cứu. Đối tượng - Nguyên liệu nghiên cứu. Môi trường, hóa chất. Thiết bị, dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm.

Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp thu thập và xử lí mẫu. Phương pháp phân lập virus PED trên tế bào Vero.

Phương pháp kiểm tra vô trùng và thuần khiết. Phương pháp RT – PCR. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá virus (TCID50/ml). Phương pháp kiểm tra tính độc.

Phương pháp chẩn đoán nhanh PEDV bằng PED-Ag test kit. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của virus. Phương pháp giải trình tự gen. Phương pháp xây dựng cây sinh học phân tử.