Đặt vấn đề Trong tự nhiên khu hệ vi sinh vật phân giải Xenlulo rất phong phú và đa dạng. Tuy nhiên nếu chỉ sử dụng các vi sinh vật tự nhiên có sẵn trong đất thì quá trình phân hủy thường diễn ra chậm. Để thúc đẩy nhanh quá trình lên men phân giải các hợp chất hữu cơ, người ta thường bổ sung thêm các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải xenlulo cao. Do vậy việc phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân hủy xenlulo cao để tạo chế phẩm nhằm phân hủy nhanh xenlulo là rất quan trọng.
Không chỉ đóng góp vai trò trong tru chình cacbon tự nhiên, vi sinh vật phân giải xenlulo còn có tiềm năng lớn trong việc phân hủy xenlulo trong nước ô nhiễm, rác thải và chuyển hóa xenlulo thành nhiên liệu sinh học thay thế nhiên liệu hóa thạch, chuyển hóa sinh học xenlulo thành nhiên liệu sinh học và các hóa chất mang lại các sản phẩm thiết yếu với năng suất cao dẫn đến lợi ích về kinh tế cũng như một giá thành thấp cho các sản phẩm này. Chế phẩm sinh học đa chủng bao gồm vi sinh vật phân hủy Xenlulo sẽ có nhiều ưu việt về cả mặt kinh tế, kỹ thuật và môi trường. Giúp quá trình phân giải xenlulo diễn ra nhanh hơn có khả năng phân giải cành khô lá dụng trên mặt đất, dưới tán rừng và phế phẩm nông nghiệp tạo ra nguồn hữu cơ tại chỗ cho đất, làm tăng độ phì của đất, tăng sinh trưởng và phát triển của cây,làm giảm thiểu nguy cơ cháy rừng và giải quyết được sự thiếu hụt về phân hữu cơ trong thâm canh hiện nay. Trước tiềm năng ứng dụng to lớn của vi sinh vật phân giải cellulose, chúng ta cần có những hiểu biết nhất định về chúng bao gồm các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy xenlulo cao, đặc biệt là các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose.
Xuất phát từ những lợi ích thực tế trên nên tôi h 2 chọn thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật phân giải Xenlulo được phân lập dưới tán rừng thông ở Tĩnh Gia Thanh Hóa” nhằm xác định được đặc điểm sinh học như điều kiện sinh trưởng và phát triển tối ưu nhất cho các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân hủy xenlulo cao ứng dụng vào trong sản xuất chế phẩm sinh học phân hủy xenlulo nhanh, để phục vụ trong lĩnh vực sản xuất Nông - Lâm nghiệp và ứng dụng trong phòng chống cháy rừng. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được đặc điểm sinh học, điều kiện sinh trưởng và phát triển tối ưu của các chủng vi sinh vật là cơ sở khoa học để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm phân hủy xenlulo. Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Đề tài góp phần bổ sung cơ sở lý luận trong việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học nhằm phân hủy nhanh xenlulo.
Ý nghĩa trong thực tiễn - Là cơ sở để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm phân hủy nhanh xenlulo phục vụ trong lĩnh vực sản xuất Nông - Lâm nghiệp và phòng chống cháy rừng. - Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với việc nghiên cứu khoa học, kỹ năng thực hành học trong phòng thí nghiệm. Qua đó kết hợp với các kiến thức lý thuyết đã được học sinh viên sẽ có những hiểu biết chuyên sâu về chuyên nghành đào tạo. h 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan tài liệu nghiên cứu 2.1 Tổng quan về Emzym cellulase Xenlulo là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (polyme hóa) từ các gốc β-Dglucose bằng cầu nối β-1,4-glycosid nhờ vào khả năng tự dưỡng dưới ánh sáng của thực vật.
Vì vậy, xenlulo là hợp chất phổ biến nhất trong tự nhiên. Xenlulo có cấu trúc mạch thẳng dạng sợi rất bền, khó bị phân hủy (Gupta, Pratima et al. Xenlulo là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose.
Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân hủy xenlulo thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình Khả và cộng sự, 2007)[14]. Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân xenlulo tạo thành các phân tử đường β-glucose. Theo nghiên cứu của một số tác giả, xenlulo bị phân hủy dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β- (1,4)-glucanase hay enzyme C1 , Endo-β-glucanase hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC–ase hay Cx và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase: Exo-1,4-gluconase giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên xenlulo và định hình hoặc xenlulo đã bị phân giải một phần.
Tác dụng lên xenlulo kết tinh không rõ ràng nhưng khi có một endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. h 4 β-1,4-glucosidase thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tinh thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên.1 Phân loại cellulase Cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân xenlulo thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4-glycoside tạo thành các phân tử đường β- glucose. Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được chia thành ba loại: - 1,4- -D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.91) - 1,4- -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.4) - -D-glucoside glucohydrolase (EC 3.21) Các enzyme này được tìm thấy trong vi khuẩn sống trong dạ dày cỏ bò và mối và trong một số nấm như Trichoderma, Aspergillus… Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.4) thủy phân liên kết ß- 1,4-glucoside và tác động vào chuỗi xenlulo một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose.
Do thủy phân CMC hoặc xenlulo theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi xenlulo và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên xenlulo vô định hình hoặc xenlulo đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên xenlulo kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt.
ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.21) thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên h 5 cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân xenlulo thành cellobiose và cuối cùng thành glucose. Sự phân giải xenlulo dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau: Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C 1, xenlulo bị thủy phân thành xenlulo hòa tan.
Trong giai đoạn thứ hai, xenlulo hòa tan sẽ bị thủy phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme C x tạo thành đường cellobiose. Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase tới cellulose h 6 Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy xenlulo trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.
Ứng dụng của emzym cellulose Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rượu, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất giấy, trong nông nghiệp. Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn. Trong công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất chế phẩm vi sinh.
Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con người. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả. Enzyme này có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignoxenlulo và xenlulo trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giàu năng lượng khác. Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học.
Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, h 7 pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin. Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy. Enzyme cellulase được bổ sung vào nhiều giai đoạn khác nhau trong quá trình sản xuất giấy.
Trong công nghiệp dệt, người ta sử dụng enzyme cellulase để giữ màu vải sáng, bền và không bị sờn cũ. Đối với vải jean, cellulase được dùng để làm mềm vải jean và tạo ra các vệt “stone washed”. Trước đây các vệt “stone washed” được làm thủ công bằng cách dùng đá bọt chà lên vải jean, làm mất lớp kiềm trên bề mặt vải và tạo ra những sợi chỉ trắng. Hiện nay người ta sử dụng enzyme cellulase trong giai đoạn giặt vải jean thay cho việc sử dụng đá bọt.
Enzyme cellulase chỉ phân hủy theo các vết kiềm trên vải jean đã nhuộm màu để tạo ra các vệt “stone washed”. Các vệt “stone washed” được tạo ra bằng phương pháp này bền hơn bằng cách dùng đá bọt.