Tổng quan nghiên cứu

Đậu tương (Glycine max) là cây trồng quan trọng trên thế giới, chiếm 85,4% diện tích trồng tại châu Mỹ và 12,1% tại châu Á (FAOSTAT, 2016). Ở Việt Nam, đậu tương đóng vai trò thiết yếu trong dinh dưỡng và chăn nuôi, tuy nhiên năng suất còn thấp, chỉ đạt khoảng 1,57 tấn/ha năm 2016, chưa đáp ứng nhu cầu trong nước. Nguyên nhân chính ảnh hưởng đến năng suất là các điều kiện bất lợi như hạn hán, sâu bệnh và biến đổi khí hậu. Trong bối cảnh đó, việc phát triển giống đậu tương chịu hạn bằng công nghệ chuyển gen trở nên cấp thiết nhằm tăng năng suất và ổn định sản xuất.

Luận văn tập trung nghiên cứu chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22, một giống phổ biến tại Việt Nam với năng suất từ 18-27 tạ/ha, nhưng khả năng chịu hạn còn hạn chế. Mục tiêu chính là biến nạp gen GmNAC004 thông qua vector pZY101-Asc và chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101, kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây thế hệ T0 và chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử bằng phun thuốc diệt cỏ Basta. Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 01/2017 đến 05/2018 tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa khoa học trong việc mở rộng ứng dụng công nghệ chuyển gen vào giống đậu tương bản địa, đồng thời góp phần thực tiễn trong phát triển giống đậu tương chịu hạn, tăng năng suất và ổn định sản xuất trong điều kiện biến đổi khí hậu ngày càng khắc nghiệt.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về công nghệ chuyển gen thực vật, đặc biệt là phương pháp biến nạp gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Hai lý thuyết chính được áp dụng gồm:

  1. Lý thuyết chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Vi khuẩn này có khả năng chuyển đoạn DNA (T-DNA) vào bộ gen thực vật thông qua quá trình lây nhiễm mô bị tổn thương, nhờ biểu hiện gen Vir trên Ti-plasmid. Phương pháp này được xem là hiệu quả và phổ biến trong biến đổi gen cây trồng, đặc biệt là đậu tương.

  2. Lý thuyết về yếu tố phiên mã NAC (NAM, ATAF, CUC): Các gen thuộc họ NAC được chứng minh có vai trò quan trọng trong việc tăng cường khả năng chịu hạn, mặn và lạnh ở cây trồng. Gen GmNAC004 là một trong những gen có biểu hiện cao ở các giống đậu tương chịu hạn, có khả năng điều hòa các gen chức năng giúp cây thích nghi với điều kiện bất lợi.

Các khái niệm chính bao gồm: promoter 35S (tăng cường biểu hiện gen), vector pZY101-Asc (véc tơ mang gen mục tiêu), chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101 (trung gian chuyển gen), và kỹ thuật phun thuốc diệt cỏ Basta để chọn lọc dòng chuyển gen.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các mẫu nửa lá mầm của giống đậu tương ĐT22 được xử lý trong phòng thí nghiệm. Tổng số 1339 mẫu nửa lá mầm được sử dụng trong 5 thí nghiệm biến nạp gen.

Phương pháp biến nạp gen được thực hiện theo quy trình chuyển gen qua nốt lá mầm của Zhang và cộng sự (2004), bao gồm các bước: khử trùng hạt, chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens EHA101 mang vector pZY101::35S::GmNAC004, lây nhiễm mẫu lá mầm, đồng nuôi cấy trên môi trường CCM, cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM, kéo dài chồi trên môi trường SEM, ra rễ trên môi trường RM và chuyển cây ra bầu đất.

Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển được thực hiện bằng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho gen bar và cấu trúc 35S::GmNAC004. Chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử được tiến hành qua các thế hệ T1 đến T3 bằng phun thuốc diệt cỏ Basta (nồng độ 100 mg/l), theo dõi tỷ lệ sống sót và phân ly theo quy luật Mendelian.

Phân tích số liệu sử dụng phần mềm Microsoft Excel, tính toán các chỉ tiêu như tỷ lệ mẫu tạo đa chồi, tỷ lệ sống sót sau chọn lọc, hiệu suất biến nạp gen ở thế hệ T0.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Hiệu quả tạo đa chồi và chọn lọc mẫu biến nạp: Trong 5 thí nghiệm với 1339 mẫu nửa lá mầm, có 740 mẫu tạo đa chồi trên môi trường SIM, đạt tỷ lệ trung bình 55,27%. Tỷ lệ sống sót sau chọn lọc trên môi trường SEM là 2,97% với 22 chồi sống sót cuối cùng.

  2. Số cây chuyển gen sống sót sau ra đất: Từ 22 chồi sống sót, có 9 cây đậu tương chuyển gen sống sót sau khi trồng ra bầu đất trong nhà lưới, tương đương tỷ lệ 0,67% trên tổng số mẫu ban đầu.

  3. Kết quả chọn lọc bằng phun thuốc diệt cỏ Basta: Sau 2 lần phun thuốc Basta (100 mg/l), có 5 cây sống sót trên tổng số 9 cây ra đất, đạt tỷ lệ 55,56%. Các cây này được xác nhận mang gen chuyển bằng phân tích PCR.

  4. Phân tích PCR xác nhận gen chuyển: PCR cho thấy sự có mặt của gen bar và cấu trúc 35S::GmNAC004 trong các cây sống sót, khẳng định thành công việc biến nạp gen vào giống đậu tương ĐT22.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ tạo đa chồi đạt trên 55% cho thấy quy trình biến nạp gen qua nốt lá mầm với vector pZY101::35S::GmNAC004 và chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA101 phù hợp với giống đậu tương ĐT22. Tỷ lệ sống sót cuối cùng sau chọn lọc và ra đất thấp (khoảng 0,67%) là thách thức phổ biến trong nghiên cứu chuyển gen đậu tương do đặc tính khó tái sinh và biến đổi gen của cây.

Việc chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ Basta giúp loại bỏ các cây thể khảm, đảm bảo dòng chuyển gen đồng hợp tử được duy trì qua các thế hệ. Kết quả PCR xác nhận sự tích hợp gen chuyển vào bộ gen thực vật, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về chuyển gen đậu tương.

So sánh với các nghiên cứu chuyển gen đậu tương trên giống mô hình như G. max 'Jack' hay Williams, nghiên cứu này mở rộng thành công trên giống bản địa ĐT22, có ý nghĩa thực tiễn lớn trong phát triển giống chịu hạn tại Việt Nam. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tỷ lệ tạo đa chồi, tỷ lệ sống sót sau chọn lọc và biểu đồ phân ly cây chuyển gen qua các thế hệ để minh họa hiệu quả quy trình.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tối ưu hóa quy trình biến nạp gen: Cần nghiên cứu điều chỉnh nồng độ vi khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy và thành phần môi trường nuôi cấy để nâng cao tỷ lệ sống sót và hiệu quả biến nạp gen, hướng tới tăng tỷ lệ cây chuyển gen sống sót trên 5% trong vòng 1-2 năm.

  2. Mở rộng đánh giá tính ổn định và biểu hiện gen: Tiến hành đánh giá biểu hiện gen GmNAC004 và khả năng chịu hạn của các dòng chuyển gen qua các thế hệ T1-T3 trong điều kiện nhà lưới và đồng ruộng, nhằm xác định tính ổn định và hiệu quả thực tiễn trong 2-3 năm tới.

  3. Phát triển quy trình chọn lọc dòng đồng hợp tử: Áp dụng kỹ thuật phun thuốc diệt cỏ Basta kết hợp phân tích PCR để chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử, đảm bảo tính di truyền ổn định, thực hiện liên tục qua các thế hệ trong 3 năm.

  4. Hợp tác nghiên cứu ứng dụng và nhân giống: Kết nối với các trung tâm nghiên cứu và doanh nghiệp để nhân giống, thử nghiệm đồng ruộng và phát triển sản phẩm giống đậu tương chuyển gen chịu hạn, hướng tới thương mại hóa trong 5 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Sinh học thực nghiệm, Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cung cấp quy trình chuyển gen và kỹ thuật phân tích PCR, giúp nâng cao kiến thức và kỹ năng thực nghiệm trong lĩnh vực biến đổi gen thực vật.

  2. Chuyên gia chọn tạo giống cây trồng: Tham khảo để áp dụng công nghệ chuyển gen vào phát triển giống đậu tương chịu hạn, tăng năng suất và thích nghi với biến đổi khí hậu.

  3. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách nông nghiệp: Cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển giống cây trồng biến đổi gen, góp phần nâng cao an ninh lương thực và phát triển nông nghiệp bền vững.

  4. Doanh nghiệp sản xuất giống và công nghệ sinh học: Hướng dẫn kỹ thuật chuyển gen và chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử, hỗ trợ phát triển sản phẩm giống đậu tương chuyển gen thương mại.

Câu hỏi thường gặp

  1. Tại sao chọn giống đậu tương ĐT22 để chuyển gen?
    Giống ĐT22 được chọn vì có khả năng tiếp nhận gen tốt, năng suất cao (18-27 tạ/ha), phổ biến tại nhiều vùng trồng ở Việt Nam, nhưng khả năng chịu hạn còn hạn chế, phù hợp để cải thiện bằng công nghệ chuyển gen.

  2. Phương pháp chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có ưu điểm gì?
    Phương pháp này cho phép chuyển gen ổn định vào bộ gen thực vật, ít gây biến đổi gen không mong muốn, chi phí thấp và được ứng dụng rộng rãi trong biến đổi gen cây trồng, đặc biệt là đậu tương.

  3. Làm thế nào để xác định cây chuyển gen thành công?
    Cây chuyển gen được xác định qua chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ Basta (cây mang gen kháng thuốc sống sót) và phân tích PCR để phát hiện sự có mặt của gen chuyển trong bộ gen cây.

  4. Tỷ lệ thành công của biến nạp gen trong nghiên cứu này là bao nhiêu?
    Tỷ lệ tạo đa chồi đạt khoảng 55,27%, tỷ lệ sống sót sau chọn lọc khoảng 2,97%, và tỷ lệ cây chuyển gen sống sót sau ra đất là khoảng 0,67%, trong đó 55,56% cây sống sót sau phun Basta được xác nhận mang gen chuyển.

  5. Ý nghĩa của gen GmNAC004 trong cây đậu tương là gì?
    Gen GmNAC004 là yếu tố phiên mã thuộc họ NAC, có vai trò điều hòa biểu hiện các gen chức năng giúp cây đậu tương tăng cường khả năng chịu hạn, mặn và lạnh, góp phần cải thiện khả năng thích nghi với điều kiện bất lợi môi trường.

Kết luận

  • Đã thành công trong việc chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc và vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101.
  • Tỷ lệ tạo đa chồi đạt 55,27%, tỷ lệ sống sót sau chọn lọc là 2,97%, với 5 cây chuyển gen được xác nhận qua phun thuốc Basta và phân tích PCR.
  • Nghiên cứu mở ra hướng mới trong chọn tạo giống đậu tương chịu hạn bằng công nghệ chuyển gen tại Việt Nam.
  • Cần tiếp tục tối ưu quy trình biến nạp, đánh giá biểu hiện gen và khả năng chịu hạn của các dòng chuyển gen qua các thế hệ tiếp theo.
  • Khuyến nghị hợp tác nghiên cứu ứng dụng và nhân giống để phát triển giống đậu tương chuyển gen thương mại, góp phần nâng cao năng suất và ổn định sản xuất trong điều kiện biến đổi khí hậu.

Hành động tiếp theo: Các nhà nghiên cứu và đơn vị liên quan nên triển khai đánh giá đồng ruộng, nhân giống và phát triển sản phẩm giống đậu tương chuyển gen chịu hạn dựa trên kết quả nghiên cứu này.