Đặt vấn đề Chitin là polysaccharide đứng thứ hai về mức độ phong phú trong tự nhiên trên trái đất chỉ sau cellulose, nhưng khả năng ứng dụng của nó bị hạn chế do độ kết tỉnh cao và độ hòa tan thấp. Chitin có thể được chuyền đổi thành các dẫn xuất với các đặc tính được cải thiện, chang hạn như chitosan (CHS), chitooligosaccharide (COS) và N-acetylglucosamine (GlcNAc). Trong đó, chitosan là một dẫn xuất phố biến của chitin được tạo ra bằng phản ứng khử oxy hóa. Do đặc tính sinh học và hóa học đặc biệt của nó, chitosan đã thu hút sự chú ý của nhiều dự án nghiên cứu trên toàn thế giới.
Chitosan có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: công nghiệp, y sinh, từ phân phối thuốc và mỹ phẩm đến chế biến thực phẩm và nông nghiệp, khả năng tạo mang, tao gel, tính phân giải cham, tính kháng oxy hóa, kháng nam, kháng khuẩn. Chitin — chitosan thường có nguồn gốc từ động vật giáp xác như tôm, cua, ghe và một số loài nam, lớp biểu bì của, vỏ của một số loài côn trùng. Hiện nay việc sử dụng côn trùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất chitin-chitosan đang được quan tâm. Rudi lính đen ngày càng được nuôi phô biến và nghiên cứu nhờ vào tính ứng dung của nó, vỏ nhộng ruồi lính đen được xem là phế phẩm trong quá trình nuôi nhưng đây được xem là nguồn nguyên liệu mới và đồi dào dé chiết xuất chitin-chitosan.
Quy trình sản xuất công nghiệp chitin-chitosan chủ yếu bằng phương pháp hóa học bao gồm việc loại bỏ cacbonat canxi, protein bằng các bước khử khoáng và khử protein tương ứng. Thông thường, xử lý hóa học cung cấp chitin va chitosan tinh khiết, nhưng nó tạo ra khối lượng lớn chất thải do nồng độ hóa chất được sử dụng cao. Việc chiết xuất chitosan ở Việt Nam chủ yếu bằng phương pháp hóa học, điều đó gây một áp lực lớn cho môi trường. Bên cạnh đó hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nao công bố về chiết xuất chitosan 6 Ruồi lính den, đặc biệt bằng phương pháp sinh học.
Từ những thực tế trên cho thấy đây là hướng nghiên cứu tiềm năng cần được quan tâm nhiều hơn và đó cũng là lý do đề tài “Nghiên cứu chiết xuất Chitin-chitosan từ vỏ nhộng ruôi lính đen (Hermetia illucens) bằng phương pháp sinh học” được thực hiện. Mục tiêu đề tài Xây dựng được quy trình chiết xuất chitin - chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính den bang phương pháp sinh học. Nội dung thực hiện Khử protein vỏ nhộng ruồi lính đen bang enzyme Alcalase. Khử khoáng vỏ nhộng ruôi lính den bằng axit lactic.
Chuyên hóa chitin thành chitosan bang vi khuan Bacillus amyloliquefaciens. Chương 2: TÔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Đặc diém của Ruôi lính den Ngành Arthropoda Lớp Insecta Bộ Diptera Ho Strtiomyidae Giống Hermetia Loai Hillucens Hình 2.1 Rudi lính den. Ruồi lính đen trưởng thành có mau đen, dài 12 — 20 mm, trông hình dạng dé lẫn lộn với loài ong; có vòng đời khoảng hon 1 tháng, bat đầu từ trứng, ấu trùng, nhộng, cuối cùng lột xác thành rudi lính đen.
Rudi trưởng thành chỉ sống khoảng 3 — 5 ngày và hoàn toàn không ăn uống gì cho đến chết. Con cái trưởng thành đẻ từ 500-800 trứng. Vòng đời của ruồi lính đen có 5 giai đoạn chính bao gồm: trứng, ấu trùng, giai đoạn tiền nhộng, nhộng và ruôi trưởng thành (Smets và ctv, 2020). 2-3 ngày Trứng va âu trùng (1-18 ngày) Tiền BS 7 ngày Rudi BSF Nhộng 7 ngày Hình 2.
Vòng đời của Hermetia illucens. là vòng đời được nuôi và nghiên cứu trực tiếp tại khu thực nghiệm Black Solder Project RIBE-CJ KOREA, thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường. Trứng sẽ được nở từ 2 — 3 ngày, chúng sẽ được cung cấp dinh đưỡng trong suốt quá trình phát triển. Từ ngày 1 đến khoảng ngày thứ 18 là giai đoạn tiền nhộng, sau đó 7 ngày chúng phát triển thành nhộng khi đó vỏ bên ngoài của chúng có màu đen.
Từ nhộng phát triển thành ruồi trưởng thành mất khoảng 7 ngày, khi chúng đã tưởng thành sẽ giao phối trong giai đoạn này chúng không cần thức ăn và sau 2 ngày chúng đẻ trứng, tiếp tục vòng đời sinh trưởng. Chitin và Chitosan 2. Cau trúc hóa học và nguồn gốc của chitin Chitin được cấu tao từ các don vị N-acetyl - D-glucosamine (NADG) liên kết với nhau bằng các liên kết B-1,4-glucozid. Ƒ CH N-acetyl group rg Glucosamine tê CH,OH N CH,OH H H q ie) | 0 OH OH H H " H Nan ae a L CH, CH, Ae Hình 2.
Cau trúc hóa học phan tử chitin. Dựa trên nguồn gốc và cấu trúc hóa học, chitin được chia làm 3 dạng: Dạng a-chitin đã được thương mại hóa và có nguồn thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ. Trong khi dạng 6-chitin thu nhận từ mai mực va dạng y-chitin thu nhận từ vách tế bào nam, nam men. Ba dạng chitin này khác nhau về số mạch chitin, sự sắp xếp các mạch này và kích thước của chúng trong mỗi đơn vị cấu trúc.
Cụ thé, a-chitin gồm các mach chitin sắp xếp song song ngược chiều nhau được thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua và vỏ ghẹ. Còn B-chitin gồm các mạch chitin sắp xếp song song cùng chiều, có tính hydrat hóa cao. Trong khi, y-chitin là sự kết hop của 2 dang ơ và và thường được thu nhận từ vách tế bào nam và vách tế bao vi khuẩn. Các cấu trúc khác nhau dẫn đến tính chất cũng khác nhau.
Cụ thể, ơ-chitin có độ rắn tinh thé (Cr]) cao nhất, còn B-chitin thì có độ rắn thấp nhất. 4 a-chitin B-chitin y-chitin Hình 2. Sự sắp xếp của chuỗi chitin: ơ-chitin, B-chitin, y-chitin. Chitin không tan trong nước, axit loãng, kiềm và một số dung môi như ete, rượu mà tan trong dung dich đặc nóng của muối thyoxyanat liti (LiSCN) và muối thyoxyanat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo.
Chitin kết tinh ở dang vô định hình, khó hòa tan trong dung dịch amoniac (NH3). Điều này có thé là do sự thay đổi nhóm hydroxy (-OH) tại vị tri C2 bằng nhóm acetamic (NHCOCH:) đã ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết. Khi đun nóng chitin trong dung dich NaOH đậm đặc thì chitin sẽ bị khử mat gốc acetyl tạo thành chitosan. Khi đun nóng chitin trong HCI đặc thi chitin sẽ bị thủy phân tạo thành glucosamine và axit axetic.
Chitin thường được phân lập từ bộ xương ngoài của động vật giáp xác, đặc biệt là vỏ tôm và cua có nhiều o-chitin (Minke va Blackwell, 1978). Ở thực vat chitin tồn tại trong vách tế bao của một số loài nam (Mucor rouxi và Aspergillis) (Kafetzopoulos và ctv, 1993) và một số loài tảo. Ngoài ra chitin còn có ở một số loài côn trùng, lớp vỏ ngoài của bọ cánh cứng. Cầu trúc hóa học và tính chất của chitosan Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl khỏi mach chitin còn gọi là quá trình deacetyl hoá, vì vay chitosan là polyme chứa rất nhiều các đơn vị glucosamine nên có rất nhiều nhóm amin.
Công thức cấu tạo của chitosan gần giống như chitin va cellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhóm amin ở cacbon vi trí thứ 2. Chitosan là một polysaccharide mach thang được cấu tạo từ các D-glucosamine (đơn vị đã deacetyl hóa) và N-acetyl-D-Glucosamine (đơn vị chứa nhóm acetyl) liên kết tại vị 5 trí B-(1-4). Nó được sản xuất từ quá trình xử ly vỏ các loài giáp xác với dung dich kiềm NaOH. CH;OH CH,OH ‘CH,OH O | QO O H H Xử H H Xà Hi NI O { 0.4 OH Hf OH H NJ\ on H HO (Hi E H NH, H NH, H NH, B-(1,4)-D-glucosamine Hình 2.
Cấu trúc hóa học của chitosan. Không giống như chitin chỉ tan trong một số ít hệ dung môi, chitosan tan tốt trong các axit hữu co thông thường như axit formic, axit acetic, axit propionic, axit citric, axit lactic. Hang số phân li axit (pKa) của chitosan có giá trị từ 6,2 đến 6,8 nên khi hoà tan trong môi trường axit loãng chitosan tạo thành dung dịch keo dương, đây là một điểm rất đặc biệt vì đa số các keo polysaccharide tự nhiên tích điện âm. Trong khi chitosan tích điện dương nên có khả năng bám đính bề mặt trên các ion tích điện âm, có khả năng tạo phức với các ion kim loại và tương tác tốt với các polyme tích điện âm.
Ngoài ra, loại dung môi axit cũng ảnh hưởng đến các hoạt tính sinh học của chitosan khi hòa tan. Các đặc tính như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, hấp phụ kim loại, kết dính với chất béo, tính kháng khuẩn, kháng nắm, mang DNA, phân giải chậm, .của chitosan phụ thuộc rất lớn vào độ deacetyl hóa. Chitosan có độ deacetyl càng cao thì có khả năng hap phụ chất mau, tạo phức với kim loại càng tốt. Tương tu, khả năng kháng khuẩn, kháng nắm của chitosan cao hơn ở các mẫu chitosan có độ deacetyl cao.
Cụ thé, khả năng kháng khuẩn tốt đối với chitosan có độ deacetyl trên 90%. Chitosan được sản xuất trong công nghiệp bằng phương pháp deacetyl hóa chitin, vốn là chat tạo nên cấu trúc của lớp vỏ của các loài giáp xác và thành tế bao của loài nam. Độ deacetyl hóa có thé được xác định bằng phương pháp đo phổ NMR, độ deacetyl hóa của chitosan thương mại thường dao động trong khoảng từ 60 đến 100 %. Nhìn chung, phân tử lượng của chitosan thương mại nằm trong khoảng 3800 - 20000 Daltons.
Phương pháp 6 deacetyl hóa chitosan thông dụng là sử dụng lượng dư dung dich NaOH. Phương pháp này cho phép thu được sản pham có độ deacetyl hóa cao đến 98%. Chitosan là polysacharide có đạm không độc hại, có khối lượng phân tử lớn. Chitosan có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, không tan trong nước, dung dịch kiềm và axit đậm đặc nhưng tan trong axit loãng (pH 6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309 — 31 1°C.
Trong tự nhiên, chitosan rất hiém gặp, chỉ có trong vách ở một số lớp vi nam và ở vai loài côn trùng. Ứng dụng của Chitin va Chitosan Chitin và chitosan đều được quan tâm, chủ yếu về lĩnh vực thương mại, nhờ vào tỷ lệ nito cao (6,89%) trong cau tạo, so với cellulose thay thế tổng hợp (chỉ 1,25%). Điều này khiến chitin trở thành chất chelatin hữu ích. Hầu hết các polyme ngày nay là vật liệu tổng hợp, vì thế tính tương hợp sinh học và khả năng phân hủy sinh học của chúng bị giảm đi nhiều, so với các polyme có nguồn gốc tự nhiên như cellulose, chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng.
Tuy nhiên, những nguồn tự nhiên này cũng thê hiện sự hạn chế trong khả năng phản ứng, khả năng xử lý và ứng dụng.