Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học nghiên cứu chiết xuất chitin chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính đen hermetia illucens bằng phương pháp sinh học

Khóa luận nghiên cứu chiết xuất chitin, chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính đen bằng phương pháp sinh học, góp phần phát triển công nghệ sinh học.

• Tác giả: Lê Quang Trường
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Ngọc Hà
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Chiết Xuất Chitin-Chitosan Từ Vỏ Nhộng Ruồi Lính Đen
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Đặc điểm của Ruồi lính đen
• 2.2. Cấu trúc hóa học và nguồn gốc của chitin
• 2.3. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
• 3.2. Phương pháp thực hiện
• 3.2.1. Tối ưu hóa quá trình khử protein vỏ nhộng ruồi lính đen bằng enzyme Alcalase
• 3.2.2. Tối ưu hóa quá trình khử khoáng vỏ nhộng ruồi lính đen bằng axit lactic
• 3.2.3. Tối ưu hóa quá trình chuyển hóa chitin thành chitosan bằng phương pháp sinh học
• 3.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Tối ưu hóa quá trình khử protein vỏ nhộng ruồi lính đen
• 4.2. Thành phần hóa học của vỏ nhộng ruồi lính đen
• 4.3. Tối ưu các điều kiện cho quá trình khử protein bằng enzyme Alcalase
• 4.4. Tối ưu hóa quá trình khử khoáng bằng axit lactic
• 4.5. Đặc điểm lý hóa của Chitin
• 4.6. Độ tinh khiết và cấu trúc hóa học
• 4.7. Cấu trúc bề mặt
• 4.8. Chuyển hóa chitin thành chitosan bằng phương pháp sinh học
• 4.9. Kết quả kiểm tra thực nghiệm
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• PHỤ LỤC
• DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Chiết Xuất Chitin Chitosan Từ Vỏ Nhộng Ruồi Lính Đen

Nghiên cứu chiết xuất chitin và chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính đen (Hermetia illucens) đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Chitin là một polysaccharide phong phú trong tự nhiên, nhưng khả năng ứng dụng của nó bị hạn chế do độ hòa tan thấp. Việc chiết xuất chitosan từ nguồn nguyên liệu này không chỉ giúp giảm thiểu chất thải mà còn tạo ra sản phẩm có giá trị cao. Nghiên cứu này nhằm tối ưu hóa quy trình chiết xuất bằng phương pháp sinh học, mang lại hiệu quả cao và thân thiện với môi trường.

1.1. Đặc Điểm Của Vỏ Nhộng Ruồi Lính Đen

Vỏ nhộng ruồi lính đen chứa nhiều chitin và protein, là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho việc chiết xuất. Đặc điểm sinh học của loài này cho phép thu hoạch dễ dàng và hiệu quả, đồng thời giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Chitin Và Chitosan

Chitin và chitosan có nhiều ứng dụng trong y sinh, nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm. Chúng có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và có thể được sử dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng.

II. Vấn Đề Trong Quy Trình Chiết Xuất Chitin Chitosan

Quy trình chiết xuất chitin và chitosan truyền thống thường sử dụng hóa chất độc hại, gây ô nhiễm môi trường. Việc sử dụng phương pháp sinh học để chiết xuất từ vỏ nhộng ruồi lính đen là một giải pháp tiềm năng. Tuy nhiên, các thách thức như tối ưu hóa điều kiện chiết xuất và đảm bảo chất lượng sản phẩm vẫn cần được giải quyết.

2.1. Thách Thức Trong Việc Tối Ưu Hóa Quy Trình

Tối ưu hóa các điều kiện như pH, nhiệt độ và thời gian là rất quan trọng để đạt được hiệu suất cao trong quá trình chiết xuất. Các yếu tố này ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng của chitin và chitosan.

2.2. Ảnh Hưởng Của Hóa Chất Đến Môi Trường

Việc sử dụng hóa chất trong quy trình chiết xuất truyền thống không chỉ gây ô nhiễm mà còn tạo ra chất thải nguy hại. Phương pháp sinh học giúp giảm thiểu vấn đề này, nhưng cần có nghiên cứu sâu hơn để đảm bảo tính khả thi.

III. Phương Pháp Chiết Xuất Chitin Chitosan Bằng Enzyme Alcalase

Phương pháp chiết xuất chitin và chitosan bằng enzyme Alcalase đã được nghiên cứu và chứng minh hiệu quả. Enzyme này giúp khử protein trong vỏ nhộng ruồi lính đen mà không gây hại cho cấu trúc của chitin. Điều này mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất chitosan chất lượng cao.

3.1. Quy Trình Khử Protein Bằng Enzyme

Quy trình khử protein sử dụng enzyme Alcalase với các điều kiện tối ưu như tỷ lệ enzyme/co chất và nhiệt độ. Điều này giúp tăng hiệu suất chiết xuất và giảm thiểu thời gian xử lý.

3.2. Lợi Ích Của Phương Pháp Sinh Học

Phương pháp sinh học không chỉ an toàn cho môi trường mà còn giúp sản phẩm cuối cùng đạt chất lượng cao hơn. Chitosan thu được từ phương pháp này có tính kháng khuẩn và kháng nấm tốt hơn.

IV. Quy Trình Khử Khoáng Bằng Axit Lactic Trong Chiết Xuất Chitin

Quá trình khử khoáng bằng axit lactic là một bước quan trọng trong quy trình chiết xuất chitin. Axit lactic giúp loại bỏ các khoáng chất không mong muốn mà không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của chitin. Điều này đảm bảo rằng sản phẩm cuối cùng có độ tinh khiết cao.

4.1. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Khử Khoáng

Các yếu tố như tỷ lệ mẫu/axit và thời gian xử lý cần được tối ưu hóa để đạt hiệu suất cao nhất trong quá trình khử khoáng. Nghiên cứu cho thấy rằng điều kiện tối ưu có thể cải thiện đáng kể chất lượng của chitin.

4.2. Ảnh Hưởng Của Axit Lactic Đến Chất Lượng Chitin

Axit lactic không chỉ giúp khử khoáng mà còn có tác dụng tích cực đến tính chất của chitin. Sản phẩm thu được có khả năng hòa tan tốt hơn và dễ dàng chuyển đổi thành chitosan.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Về Chiết Xuất Chitin Chitosan

Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình chiết xuất chitin và chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính đen bằng phương pháp sinh học đạt hiệu suất cao. Chitin thu được có hàm lượng protein và khoáng chất thấp, đảm bảo chất lượng sản phẩm. Hiệu suất tạo chitosan cũng được cải thiện đáng kể.

5.1. Hiệu Suất Chiết Xuất Chitin

Nghiên cứu cho thấy hiệu suất chiết xuất chitin đạt 63,21%, với hàm lượng protein chỉ 37,26%. Điều này cho thấy quy trình chiết xuất hiệu quả và thân thiện với môi trường.

5.2. Hiệu Suất Tạo Chitosan

Hiệu suất tạo chitosan từ chitin đạt 2,02%. Sản phẩm này có tiềm năng ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực, từ y sinh đến thực phẩm chức năng.

VI. Kết Luận Và Hướng Đi Tương Lai Trong Nghiên Cứu Chitin Chitosan

Nghiên cứu chiết xuất chitin và chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính đen mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Phương pháp sinh học không chỉ giúp giảm thiểu ô nhiễm mà còn tạo ra sản phẩm có giá trị cao. Hướng đi tương lai cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình và mở rộng ứng dụng của chitosan.

6.1. Tiềm Năng Ứng Dụng Của Chitosan

Chitosan có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y sinh, nông nghiệp và thực phẩm chức năng. Nghiên cứu thêm về tính chất và ứng dụng của chitosan sẽ giúp khai thác tối đa tiềm năng của nó.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần có thêm nhiều nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình chiết xuất và phát triển các ứng dụng mới cho chitin và chitosan. Điều này sẽ góp phần vào sự phát triển bền vững trong ngành công nghiệp sinh học.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Chitin là nguồn polysaccharide tự nhiên dồi dào thứ hai trên Trái Đất (chỉ sau cellulose), tuy nhiên khả năng ứng dụng thực tế của chitin bị hạn chế bởi độ kết tinh cao và độ hòa tan thấp. Để nâng cao giá trị sử dụng, chitin thường được chuyển hóa thành các dẫn xuất sinh học có hoạt tính cao hơn, tiêu biểu là chitosan thông qua phản ứng khử nhóm acetyl. Nhờ đặc tính tương hợp sinh học, khả năng phân hủy tự nhiên, không độc hại, tạo màng, tạo gel và kháng khuẩn, chitosan được ứng dụng rộng rãi trong y sinh, bao gói thực phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp và xử lý nước thải.

Hiện nay, nguồn nguyên liệu truyền thống để sản xuất chitin-chitosan chủ yếu dựa vào vỏ động vật giáp xác (tôm, cua, ghẹ) và quy trình sản xuất công nghiệp chủ yếu áp dụng phương pháp hóa học với axit vô cơ và kiềm nồng độ cao. Quy trình hóa học tuy đem lại sản phẩm có độ tinh khiết cao nhưng tạo ra lượng lớn nước thải gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Trong khi đó, ấu trùng và nhộng ruồi lính đen (Hermetia illucens) đang được chăn nuôi rộng rãi để xử lý chất thải hữu cơ và làm thức ăn chăn nuôi; phần vỏ nhộng thải ra sau giai đoạn vũ hóa là nguồn phế phẩm sinh học dồi dào, giàu chitin nhưng chưa được tận dụng triệt để. Tại Việt Nam, các nghiên cứu chiết xuất chitosan từ ruồi lính đen bằng phương pháp sinh học thân thiện với môi trường vẫn còn hạn chế.

Đề tài "Nghiên cứu chiết xuất Chitin-chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính đen (Hermetia illucens) bằng phương pháp sinh học" của sinh viên Lê Quang Trường (ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM) thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hà, trong khuôn khổ đề tài cấp cơ sở mã số CS – CB22 – Vien CNSH - 02.

Mục tiêu nghiên cứu:

• Xây dựng quy trình chiết xuất chitin và chitosan từ nguồn phụ phẩm vỏ nhộng ruồi lính đen bằng phương pháp sinh học.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Khảo sát và tối ưu hóa quá trình khử protein từ vỏ nhộng ruồi lính đen bằng enzyme thương mại Alcalase 2,4L.
2. Khảo sát và tối ưu hóa quá trình khử khoáng từ vỏ nhộng ruồi lính đen bằng axit hữu cơ (axit lactic).
3. Khảo sát và tối ưu hóa quá trình chuyển hóa chitin thành chitosan bằng phương pháp lên men sử dụng chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Vỏ nhộng ruồi lính đen thu nhận từ khu thực nghiệm Black Soldier Project RIBE - CJ KOREA thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường; enzyme Alcalase 2,4L (Novozymes, Đan Mạch); chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens (cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II).
• Phạm vi không gian: Phòng Độc chất học Môi trường (RIBE 104-106), Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
• Phạm vi thời gian: Từ tháng 8/2023 đến tháng 11/2023.
• Quy mô nghiên cứu: Quy mô phòng thí nghiệm.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận kết hợp nền tảng hóa sinh học polymer tự nhiên với phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm thống kê:

Khung lý thuyết và mô hình sinh hóa

• Cấu trúc phân tử Chitin và Chitosan: Chitin là polymer mạch thẳng cấu tạo từ các đơn vị N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) liên kết với nhau qua liên kết $\beta$-(1,4)-glycosidic, tồn tại dưới 3 dạng cấu trúc không gian ($\alpha$, $\beta$, $\gamma$-chitin), trong đó $\alpha$-chitin có độ rắn tinh thể cao nhất. Chitosan là polymer của D-glucosamine và N-acetyl-D-glucosamine với hằng số phân ly axit $pK_a$ từ 6,2 đến 6,8, mang điện tích dương trong môi trường axit loãng.
• Cơ chế khử khoáng bằng axit hữu cơ: Phân hủy các muối canxi carbonate và hợp chất vô cơ thành muối hữu cơ tan trong nước mà không làm suy thoái cấu trúc mạch polymer.
• Cơ chế khử protein bằng enzyme protease: Sử dụng endopeptidase (Alcalase 2,4L) để cắt liên kết peptide giữa protein nền và chitin.
• Cơ chế khử acetyl sinh học: Hoạt tính xúc tác của enzyme Chitin Deacetylase (CDA, họ carbohydrate esterase 4, khối lượng phân tử 25–80 kDa) do Bacillus amyloliquefaciens tiết ra nhằm thủy phân liên kết N-acetamido.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Thiết kế thực nghiệm và bề mặt đáp ứng (RSM - Response Surface Methodology): Áp dụng mô hình Box-Behnken (BBD) kết hợp phần mềm Design Expert 11 để lập ma trận thực nghiệm, phân tích phương sai (ANOVA), thiết lập phương trình hồi quy bậc hai dạng tổng quát: $$Y = \beta_0 + \sum \beta_i X_i + \sum \beta_{ij} X_i X_j + \sum \beta_{ii} X_i^2$$ Độ tương thích của mô hình được kiểm định qua hệ số xác định ($R^2 > 0,8$), hiệu số $|R^2_{adj} - R^2_{pred}| < 0,2$, tỷ số tín hiệu trên nhiễu ($Adeq\ Precision > 4$) và giá trị $p_{Lack\ of\ fit} > 0,05$.
• Phương pháp phân tích tiêu chuẩn:
  • Xác định độ ẩm: TCVN 4048:2011.
  • Xác định tro khoáng: TCVN 5105:2009 (nung ở 500–550°C).
  • Xác định nitơ tổng số: TCVN 8557:2010 (phương pháp Kjeldahl).
  • Xác định nitơ-protein hòa tan: Thủy phân bằng NaOH 5% ở 90°C và chuẩn độ Kjeldahl.
  • Xác định chất hữu cơ: TCVN 9294:2012 (oxy hóa bicromat).
  • Xác định axit humic và fulvic: TCVN 8561:2010.
  • Xác định Canxi - Magie: TCVN 12598:2018 (chuẩn độ EDTA).
  • Xác định Photpho: TCVN 8940:2011 (đo màu quang phổ).
  • Xác định Kali: TCVN 8562:2010 (quang kế ngọn lửa).
  • Hoạt độ protease: Phương pháp Anson.
  • Định tính chitosan: Phản ứng màu Lugol/H₂SO₄ (Richards, 1951).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương này nêu rõ tính cấp thiết của việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu thay thế cho vỏ giáp xác và phát triển các giải pháp chiết xuất sinh học thân thiện với môi trường. Đặt ra mục tiêu tổng quát và 3 nội dung nghiên cứu cụ thể nhằm tận dụng nguồn phế phẩm vỏ nhộng ruồi lính đen tại các cơ sở chăn nuôi côn trùng.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa đặc điểm sinh học và vòng đời của ruồi lính đen (Hermetia illucens), cấu trúc hóa học, phân loại và ứng dụng của chitin-chitosan trong các lĩnh vực đời sống. Chương này so sánh phương pháp chiết xuất hóa học truyền thống với phương pháp sinh học:

Tiêu chí	Phương pháp hóa học	Phương pháp sinh học
Hóa chất sử dụng	Dung dịch kiềm (NaOH, KOH) và axit vô cơ (HCl) đậm đặc	Enzyme protease, axit hữu cơ (axit lactic), vi sinh vật
Khử deacetyl	Xử lý kiềm đậm đặc ở nhiệt độ cao	Enzyme Chitin Deacetylase (CDA) qua lên men sinh học
Tác động môi trường	Tạo lượng lớn chất thải độc hại, áp lực xử lý cao	Thân thiện với môi trường, an toàn sinh học
Chất lượng phụ phẩm	Khó thu hồi dinh dưỡng do lẫn hóa chất nồng độ cao	Dịch đạm và khoáng có thể dùng làm dinh dưỡng bổ sung
Hiệu suất & độ sạch	Hiệu suất cao, khử triệt để protein và khoáng	Hiệu suất còn thấp, thời gian dài, protein còn sót lại

Tổng quan tài liệu cũng phân tích các nghiên cứu tiền đề từ Wasko và ctv (2016), Lê Thị Thúy Hằng (2017), Nguyễn Ngọc Hà và ctv (2022) cùng lý thuyết quy hoạch thực nghiệm RSM Box-Behnken.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp

Chương 3 mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu, hóa chất, thiết bị và các bước thực nghiệm:

1. Chuẩn bị nguyên liệu: Rửa sạch vỏ nhộng, sấy khô ở 60°C trong 24 giờ, xay nhỏ và phân tích các chỉ tiêu hóa lý ban đầu.
2. Quy hoạch tối ưu hóa khử protein: Khảo sát 5 biến độc lập gồm tỷ lệ enzyme/cơ chất ($A$: 1–3%), tỷ lệ cơ chất/dung dịch ($B$: 1:10–1:25 g/mL), nhiệt độ ($C$: 50–65°C), thời gian ($D$: 2–6 giờ), pH ($E$: 6,5–8,0) với 46 nghiệm thức Box-Behnken. Bất hoạt enzyme ở 90°C trong 5 phút sau phản ứng.
3. Quy hoạch tối ưu hóa khử khoáng: Khảo sát 3 biến gồm tỷ lệ mẫu/axit ($A$: 1:1–1:8 g/mL), thời gian ($B$: 0,3–5 giờ), nồng độ axit lactic ($C$: 3–9%) với 17 nghiệm thức Box-Behnken ở nhiệt độ phòng.
4. Khử màu và tinh chế chitin: Xử lý bằng dung dịch KMnO₄ 1% (tỷ lệ 1:20 w/v) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó tẩy màu bằng axit oxalic 4% ở 60°C trong 1 giờ, rửa đến pH trung tính và sấy khô ở 60°C.
5. Quy hoạch tối ưu hóa khử deacetyl: Sử dụng dịch vi khuẩn B. amyloliquefaciens ($OD_{600} = 0,5 \approx 6 \times 10^8\text{ CFU/mL}$) trong môi trường lên men (chitin, tinh bột, cao nấm men, khoáng), khảo sát 3 yếu tố: pH (5–8), thời gian (1–5 ngày), nhiệt độ (35–45°C) với 20 nghiệm thức. Thu hồi chitosan theo quy trình kết tủa của Vadake (1998).

Chương 4: Kết quả và thảo luận

1. Thành phần hóa học ban đầu của vỏ nhộng ruồi lính đen

Kết quả phân tích mẫu vỏ nhộng thô ban đầu trước khi xử lý:

STT	Chỉ tiêu phân tích	Kết quả (%)
1	Độ ẩm	10,23 ± 0,05
2	Tro khoáng	32,27 ± 0,24
3	Nitơ tổng số	7,03 ± 0,05
4	Nitơ-protein	37,98 ± 0,54
5	Chất hữu cơ (OC)	39,95 ± 0,19
6	Axit humic	8,98 ± 0,04
7	Axit fulvic	4,23 ± 0,23
8	Canxi	4,44 ± 0,10
9	Magie	0,30 ± 0,01
10	Photpho	0,49 ± 0,008
11	Kali	0,39 ± 0,03

2. Tối ưu hóa quá trình khử protein bằng Alcalase 2,4L

Qua 46 nghiệm thức Box-Behnken, hiệu suất khử protein (DP) dao động từ 9,11% (NT 19) đến 25,48% (NT 33). Phân tích ANOVA cho thấy mô hình có ý nghĩa thống kê cao ($p < 0,0001$, $F = 11,88$, $R^2 = 0,9048$, $R^2_{adj} = 0,8286$, $R^2_{pred} = 0,6505$, $Adeq\ Precision = 10,2465$, $p_{Lack\ of\ fit} = 0,2941$).

Phương trình hồi quy đa thức bậc hai thu được: $$\begin{aligned} DP\ (%) = & 17,60 + 1,12A - 5,18B + 2,83C + 1,69D - 1,26E - 0,3744AB - 1,11AC \ & + 0,9631AD - 0,3237AE - 1,84BC + 0,344BD - 0,5595BE - 2,68CD \ & - 0,4491CE - 0,3508DE - 0,1658A^2 + 0,3043B^2 - 1,85C^2 - 0,2862D^2 - 0,3369E^2 \end{aligned}$$

Tối ưu hóa mô hình xác định bộ thông số: Enzyme/cơ chất 2% (w/w), cơ chất/dung dịch 1:17,5 (w/v), nhiệt độ 57,5°C, thời gian 4 giờ, pH 7,25. Thí nghiệm kiểm chứng lặp lại 5 lần ghi nhận hiệu suất thực nghiệm đạt $16,34 \pm 0,86%$, nằm trong khoảng dự đoán lý thuyết ($15,43% - 19,77%$).

3. Tối ưu hóa quá trình khử khoáng bằng axit lactic

Khảo sát 17 nghiệm thức Box-Behnken cho thấy hiệu suất khử khoáng (DA) biến thiên từ 16,94% (NT 6) đến 99,67% (NT 12). Mô hình hồi quy đạt độ tương thích gần như tuyệt đối ($p < 0,0001$, $F = 7204,28$, $R^2 = 0,9999$, $R^2_{adj} = 0,9998$, $R^2_{pred} = 0,9987$, $Adeq\ Precision = 259,5338$, $p_{Lack\ of\ fit} = 0,1010$).

Phương trình hồi quy dự đoán hiệu suất khử khoáng: $$\begin{aligned} DA\ (%) = & 0,1090 - 0,0524A - 0,0009B - 0,0193C + 0,0009AB + 0,012AC \ & + 0,0008BC + 0,0423A^2 + 0,002B^2 + 0,0083C^2 \end{aligned}$$

Điều kiện tối ưu cho quá trình khử khoáng được xác định: Tỷ lệ mẫu/axit 1:4,5 (w/v), thời gian 2,65 giờ, nồng độ axit lactic 6%. Chitin thành phẩm sau khử khoáng và tẩy màu đạt hiệu suất tạo chitin 63,21%, hàm lượng khoáng còn lại giảm mạnh xuống 1,27%, tuy nhiên hàm lượng protein còn lại ở mức 37,26%.

4. Chuyển hóa chitin thành chitosan bằng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

Quá trình lên men khử deacetyl bằng B. amyloliquefaciens đạt điều kiện tối ưu tại: pH 6,37; thời gian lên men 1,9 ngày; nhiệt độ 37,6°C. Hiệu suất thu hồi chitosan thực nghiệm đạt 2,02%. Sản phẩm kết tủa được kiểm tra định tính bằng phản ứng màu Lugol/H₂SO₄ cho phản ứng dương tính (chuyển từ nâu sẫm sang tím sẫm).

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng hợp toàn bộ các thông số tối ưu cho ba công đoạn chiết xuất và đưa ra đề xuất nghiên cứu hoàn thiện quy trình.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính

• Thành phần vỏ nhộng ban đầu: Độ ẩm $10,23%$; tro khoáng $32,27%$; nitơ-protein $37,98%$; chất hữu cơ $39,95%$.
• Công đoạn khử protein (Alcalase 2,4L): Điều kiện tối ưu: Tỷ lệ enzyme 2% (w/w), tỷ lệ dung dịch 1:17,5 (w/v), nhiệt độ 57,5°C, thời gian 4 giờ, pH 7,25. Hiệu suất khử protein thực nghiệm đạt $16,34 \pm 0,86%$.
• Công đoạn khử khoáng (Axit lactic): Điều kiện tối ưu: Tỷ lệ mẫu/axit 1:4,5 (w/v), thời gian 2,65 giờ, nồng độ axit lactic 6%. Hàm lượng khoáng trong sản phẩm chitin giảm từ $32,27%$ xuống còn $1,27%$.
• Sản phẩm Chitin thu nhận: Hiệu suất thu hồi đạt $63,21%$, hàm lượng khoáng $1,27%$, hàm lượng protein $37,26%$.
• Công đoạn khử deacetyl sinh học (B. amyloliquefaciens): Điều kiện tối ưu: pH 6,37; thời gian 1,9 ngày; nhiệt độ 37,6°C. Hiệu suất tạo chitosan đạt $2,02%$, định tính dương tính với phản ứng màu Lugol/H₂SO₄.

Đóng góp khoa học và thực tiễn

• Thiết lập bộ dữ liệu thực nghiệm hoàn chỉnh về việc chiết xuất chitin-chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính đen bằng phương pháp sinh học kết hợp enzyme Alcalase, axit hữu cơ lactic và vi sinh vật Bacillus amyloliquefaciens.
• Xây dựng mô hình toán học bề mặt đáp ứng (RSM Box-Behnken) với độ tin cậy cao ($R^2$ từ 0,9048 đến 0,9999) giúp làm chủ và kiểm soát các yếu tố công nghệ trong quy trình sinh học.
• Đặt nền móng nghiên cứu giải pháp xanh thay thế phương pháp hóa học độc hại, hướng tới tận dụng hiệu quả phụ phẩm chăn nuôi côn trùng tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được xác nhận từ kết quả

• Khử protein chưa triệt để: Hiệu suất khử protein bằng Alcalase chỉ đạt 16,34%, khiến hàm lượng protein còn tồn dư trong sản phẩm chitin tương đối cao (37,26%), do protein vỏ nhộng liên kết chặt chẽ với cấu trúc chitin.
• Hiệu suất chuyển hóa chitosan còn thấp: Quá trình lên men sinh học bằng B. amyloliquefaciens chỉ đạt hiệu suất thu hồi chitosan 2,02%.
• Quy mô khảo sát: Mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (50 mL môi trường lên men), chưa thử nghiệm ở quy mô pilot hoặc sản xuất lớn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Khảo sát phối hợp các hệ enzyme protease khác nhau hoặc kết hợp tiền xử lý cơ-lý để nâng cao hiệu quả cắt mạch protein liên kết.
• Tối ưu hóa sâu hơn thành phần môi trường dinh dưỡng và mật độ vi sinh vật lên men nhằm tăng cường hoạt tính enzyme Chitin Deacetylase (CDA) của chủng Bacillus amyloliquefaciens.
• Mở rộng quy mô thực nghiệm để đánh giá tính khả thi kỹ thuật và chi phí kinh tế khi triển khai ứng dụng thực tế.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu viên thuộc các ngành Công nghệ Sinh học, Kỹ thuật Hóa học, Khoa học Môi trường, Chế biến Phụ phẩm Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch.
• Nội dung giá trị chuyên sâu:
  • Quy trình chi tiết ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng Box-Behnken trong thiết kế và xử lý thống kê đa biến trên Design Expert.
  • Các quy trình phân tích thành phần hóa lý tiêu chuẩn (TCVN) trên nền mẫu phụ phẩm côn trùng.
  • Bộ thông số công nghệ cụ thể về điều kiện nhiệt độ, pH, thời gian và nồng độ xử lý sinh học cho enzyme Alcalase 2,4L và Bacillus amyloliquefaciens.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lựa chọn enzyme Alcalase và axit lactic thay vì hóa chất NaOH/HCl thông thường?

Phương pháp hóa học sử dụng NaOH và HCl đậm đặc tạo ra lượng lớn nước thải ăn mòn và gây áp lực ô nhiễm môi trường. Việc sử dụng enzyme Alcalase 2,4L và axit lactic (axit hữu cơ) giúp quy trình vận hành trong điều kiện ôn hòa hơn, an toàn sinh học, giảm thiểu ô nhiễm và cho phép thu hồi dịch đạm/khoáng hòa tan làm phụ phẩm dinh dưỡng.

2. Thành phần khoáng và protein trong vỏ nhộng ruồi lính đen ban đầu là bao nhiêu?

Theo kết quả phân tích tại Bảng 4.1 của khóa luận, vỏ nhộng ruồi lính đen ban đầu có hàm lượng tro khoáng là $32,27 \pm 0,24%$ và hàm lượng nitơ-protein là $37,98 \pm 0,54%$, trong đó chất hữu cơ chiếm $39,95 \pm 0,19%$.

3. Điều kiện tối ưu cho quá trình khử protein bằng Alcalase 2,4L và hiệu suất thực nghiệm đạt được?

Bộ điều kiện tối ưu được xác định gồm: Tỷ lệ enzyme/cơ chất 2% (w/w), tỷ lệ cơ chất/dung dịch 1:17,5 (w/v), nhiệt độ 57,5°C, thời gian 4 giờ và pH 7,25. Hiệu suất khử protein thực nghiệm đạt $16,34 \pm 0,86%$ (phù hợp với khoảng dự đoán mô hình là 15,43% – 19,77%).

4. Hiệu suất tạo chitin và chitosan cuối cùng của nghiên cứu là bao nhiêu?

Nghiên cứu đạt hiệu suất tạo chitin là $63,21%$ (chitin thành phẩm có hàm lượng khoáng 1,27% và protein 37,26%). Hiệu suất tạo chitosan qua quá trình lên men sinh học bằng Bacillus amyloliquefaciens đạt $2,02%$.

5. Phương pháp nào được sử dụng để định tính sản phẩm chitosan sau lên men?

Nghiên cứu sử dụng phương pháp thử màu Lugol/H₂SO₄ (Richards, 1951). Dưới tác dụng của dung dịch iod/KI và axit hóa bằng H₂SO₄ 1%, kết tủa chitosan chuyển từ màu nâu sẫm sang màu tím sẫm đặc trưng trong dung dịch không màu.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Quang Trường đã nghiên cứu và tối ưu hóa thành công quy trình chiết xuất chitin và chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính đen bằng phương pháp sinh học với mô hình thực nghiệm Box-Behnken. Nghiên cứu đã xác định chính xác các thông số công nghệ tối ưu cho quá trình khử protein bằng enzyme Alcalase 2,4L, khử khoáng bằng axit lactic và khử deacetyl bằng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens. Dù hiệu suất chuyển hóa sinh học còn khiêm tốn so với phương pháp hóa học, đề tài đã cung cấp dữ liệu thực nghiệm quan trọng, chứng minh tiềm năng tận dụng phế phẩm nông nghiệp để sản xuất vật liệu sinh học thân thiện với môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Chitin là polysaccharide đứng thứ hai về mức độ phong phú trong tự nhiên trên trái đất chỉ sau cellulose, nhưng khả năng ứng dụng của nó bị hạn chế do độ kết tỉnh cao và độ hòa tan thấp. Chitin có thể được chuyền đổi thành các dẫn xuất với các đặc tính được cải thiện, chang hạn như chitosan (CHS), chitooligosaccharide (COS) và N-acetylglucosamine (GlcNAc). Trong đó, chitosan là một dẫn xuất phố biến của chitin được tạo ra bằng phản ứng khử oxy hóa. Do đặc tính sinh học và hóa học đặc biệt của nó, chitosan đã thu hút sự chú ý của nhiều dự án nghiên cứu trên toàn thế giới.

Chitosan có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: công nghiệp, y sinh, từ phân phối thuốc và mỹ phẩm đến chế biến thực phẩm và nông nghiệp, khả năng tạo mang, tao gel, tính phân giải cham, tính kháng oxy hóa, kháng nam, kháng khuẩn. Chitin — chitosan thường có nguồn gốc từ động vật giáp xác như tôm, cua, ghe và một số loài nam, lớp biểu bì của, vỏ của một số loài côn trùng. Hiện nay việc sử dụng côn trùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất chitin-chitosan đang được quan tâm. Rudi lính đen ngày càng được nuôi phô biến và nghiên cứu nhờ vào tính ứng dung của nó, vỏ nhộng ruồi lính đen được xem là phế phẩm trong quá trình nuôi nhưng đây được xem là nguồn nguyên liệu mới và đồi dào dé chiết xuất chitin-chitosan.

Quy trình sản xuất công nghiệp chitin-chitosan chủ yếu bằng phương pháp hóa học bao gồm việc loại bỏ cacbonat canxi, protein bằng các bước khử khoáng và khử protein tương ứng. Thông thường, xử lý hóa học cung cấp chitin va chitosan tinh khiết, nhưng nó tạo ra khối lượng lớn chất thải do nồng độ hóa chất được sử dụng cao. Việc chiết xuất chitosan ở Việt Nam chủ yếu bằng phương pháp hóa học, điều đó gây một áp lực lớn cho môi trường. Bên cạnh đó hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nao công bố về chiết xuất chitosan 6 Ruồi lính den, đặc biệt bằng phương pháp sinh học.

Từ những thực tế trên cho thấy đây là hướng nghiên cứu tiềm năng cần được quan tâm nhiều hơn và đó cũng là lý do đề tài “Nghiên cứu chiết xuất Chitin-chitosan từ vỏ nhộng ruôi lính đen (Hermetia illucens) bằng phương pháp sinh học” được thực hiện. Mục tiêu đề tài Xây dựng được quy trình chiết xuất chitin - chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính den bang phương pháp sinh học. Nội dung thực hiện Khử protein vỏ nhộng ruồi lính đen bang enzyme Alcalase. Khử khoáng vỏ nhộng ruôi lính den bằng axit lactic.

Chuyên hóa chitin thành chitosan bang vi khuan Bacillus amyloliquefaciens. Chương 2: TÔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Đặc diém của Ruôi lính den Ngành Arthropoda Lớp Insecta Bộ Diptera Ho Strtiomyidae Giống Hermetia Loai Hillucens Hình 2.1 Rudi lính den. Ruồi lính đen trưởng thành có mau đen, dài 12 — 20 mm, trông hình dạng dé lẫn lộn với loài ong; có vòng đời khoảng hon 1 tháng, bat đầu từ trứng, ấu trùng, nhộng, cuối cùng lột xác thành rudi lính đen.

Rudi trưởng thành chỉ sống khoảng 3 — 5 ngày và hoàn toàn không ăn uống gì cho đến chết. Con cái trưởng thành đẻ từ 500-800 trứng. Vòng đời của ruồi lính đen có 5 giai đoạn chính bao gồm: trứng, ấu trùng, giai đoạn tiền nhộng, nhộng và ruôi trưởng thành (Smets và ctv, 2020). 2-3 ngày Trứng va âu trùng (1-18 ngày) Tiền BS 7 ngày Rudi BSF Nhộng 7 ngày Hình 2.

Vòng đời của Hermetia illucens. là vòng đời được nuôi và nghiên cứu trực tiếp tại khu thực nghiệm Black Solder Project RIBE-CJ KOREA, thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường. Trứng sẽ được nở từ 2 — 3 ngày, chúng sẽ được cung cấp dinh đưỡng trong suốt quá trình phát triển. Từ ngày 1 đến khoảng ngày thứ 18 là giai đoạn tiền nhộng, sau đó 7 ngày chúng phát triển thành nhộng khi đó vỏ bên ngoài của chúng có màu đen.

Từ nhộng phát triển thành ruồi trưởng thành mất khoảng 7 ngày, khi chúng đã tưởng thành sẽ giao phối trong giai đoạn này chúng không cần thức ăn và sau 2 ngày chúng đẻ trứng, tiếp tục vòng đời sinh trưởng. Chitin và Chitosan 2. Cau trúc hóa học và nguồn gốc của chitin Chitin được cấu tao từ các don vị N-acetyl - D-glucosamine (NADG) liên kết với nhau bằng các liên kết B-1,4-glucozid. Ƒ CH N-acetyl group rg Glucosamine tê CH,OH N CH,OH H H q ie) | 0 OH OH H H " H Nan ae a L CH, CH, Ae Hình 2.

Cau trúc hóa học phan tử chitin. Dựa trên nguồn gốc và cấu trúc hóa học, chitin được chia làm 3 dạng: Dạng a-chitin đã được thương mại hóa và có nguồn thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ. Trong khi dạng 6-chitin thu nhận từ mai mực va dạng y-chitin thu nhận từ vách tế bào nam, nam men. Ba dạng chitin này khác nhau về số mạch chitin, sự sắp xếp các mạch này và kích thước của chúng trong mỗi đơn vị cấu trúc.

Cụ thé, a-chitin gồm các mach chitin sắp xếp song song ngược chiều nhau được thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua và vỏ ghẹ. Còn B-chitin gồm các mạch chitin sắp xếp song song cùng chiều, có tính hydrat hóa cao. Trong khi, y-chitin là sự kết hop của 2 dang ơ và và thường được thu nhận từ vách tế bào nam và vách tế bao vi khuẩn. Các cấu trúc khác nhau dẫn đến tính chất cũng khác nhau.

Cụ thể, ơ-chitin có độ rắn tinh thé (Cr]) cao nhất, còn B-chitin thì có độ rắn thấp nhất. 4 a-chitin B-chitin y-chitin Hình 2. Sự sắp xếp của chuỗi chitin: ơ-chitin, B-chitin, y-chitin. Chitin không tan trong nước, axit loãng, kiềm và một số dung môi như ete, rượu mà tan trong dung dich đặc nóng của muối thyoxyanat liti (LiSCN) và muối thyoxyanat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo.

Chitin kết tinh ở dang vô định hình, khó hòa tan trong dung dịch amoniac (NH3). Điều này có thé là do sự thay đổi nhóm hydroxy (-OH) tại vị tri C2 bằng nhóm acetamic (NHCOCH:) đã ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết. Khi đun nóng chitin trong dung dich NaOH đậm đặc thì chitin sẽ bị khử mat gốc acetyl tạo thành chitosan. Khi đun nóng chitin trong HCI đặc thi chitin sẽ bị thủy phân tạo thành glucosamine và axit axetic.

Chitin thường được phân lập từ bộ xương ngoài của động vật giáp xác, đặc biệt là vỏ tôm và cua có nhiều o-chitin (Minke va Blackwell, 1978). Ở thực vat chitin tồn tại trong vách tế bao của một số loài nam (Mucor rouxi và Aspergillis) (Kafetzopoulos và ctv, 1993) và một số loài tảo. Ngoài ra chitin còn có ở một số loài côn trùng, lớp vỏ ngoài của bọ cánh cứng. Cầu trúc hóa học và tính chất của chitosan Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl khỏi mach chitin còn gọi là quá trình deacetyl hoá, vì vay chitosan là polyme chứa rất nhiều các đơn vị glucosamine nên có rất nhiều nhóm amin.

Công thức cấu tạo của chitosan gần giống như chitin va cellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhóm amin ở cacbon vi trí thứ 2. Chitosan là một polysaccharide mach thang được cấu tạo từ các D-glucosamine (đơn vị đã deacetyl hóa) và N-acetyl-D-Glucosamine (đơn vị chứa nhóm acetyl) liên kết tại vị 5 trí B-(1-4). Nó được sản xuất từ quá trình xử ly vỏ các loài giáp xác với dung dich kiềm NaOH. CH;OH CH,OH ‘CH,OH O | QO O H H Xử H H Xà Hi NI O { 0.4 OH Hf OH H NJ\ on H HO (Hi E H NH, H NH, H NH, B-(1,4)-D-glucosamine Hình 2.

Cấu trúc hóa học của chitosan. Không giống như chitin chỉ tan trong một số ít hệ dung môi, chitosan tan tốt trong các axit hữu co thông thường như axit formic, axit acetic, axit propionic, axit citric, axit lactic. Hang số phân li axit (pKa) của chitosan có giá trị từ 6,2 đến 6,8 nên khi hoà tan trong môi trường axit loãng chitosan tạo thành dung dịch keo dương, đây là một điểm rất đặc biệt vì đa số các keo polysaccharide tự nhiên tích điện âm. Trong khi chitosan tích điện dương nên có khả năng bám đính bề mặt trên các ion tích điện âm, có khả năng tạo phức với các ion kim loại và tương tác tốt với các polyme tích điện âm.

Ngoài ra, loại dung môi axit cũng ảnh hưởng đến các hoạt tính sinh học của chitosan khi hòa tan. Các đặc tính như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, hấp phụ kim loại, kết dính với chất béo, tính kháng khuẩn, kháng nắm, mang DNA, phân giải chậm, .của chitosan phụ thuộc rất lớn vào độ deacetyl hóa. Chitosan có độ deacetyl càng cao thì có khả năng hap phụ chất mau, tạo phức với kim loại càng tốt. Tương tu, khả năng kháng khuẩn, kháng nắm của chitosan cao hơn ở các mẫu chitosan có độ deacetyl cao.

Cụ thé, khả năng kháng khuẩn tốt đối với chitosan có độ deacetyl trên 90%. Chitosan được sản xuất trong công nghiệp bằng phương pháp deacetyl hóa chitin, vốn là chat tạo nên cấu trúc của lớp vỏ của các loài giáp xác và thành tế bao của loài nam. Độ deacetyl hóa có thé được xác định bằng phương pháp đo phổ NMR, độ deacetyl hóa của chitosan thương mại thường dao động trong khoảng từ 60 đến 100 %. Nhìn chung, phân tử lượng của chitosan thương mại nằm trong khoảng 3800 - 20000 Daltons.

Phương pháp 6 deacetyl hóa chitosan thông dụng là sử dụng lượng dư dung dich NaOH. Phương pháp này cho phép thu được sản pham có độ deacetyl hóa cao đến 98%. Chitosan là polysacharide có đạm không độc hại, có khối lượng phân tử lớn. Chitosan có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, không tan trong nước, dung dịch kiềm và axit đậm đặc nhưng tan trong axit loãng (pH 6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309 — 31 1°C.

Trong tự nhiên, chitosan rất hiém gặp, chỉ có trong vách ở một số lớp vi nam và ở vai loài côn trùng. Ứng dụng của Chitin va Chitosan Chitin và chitosan đều được quan tâm, chủ yếu về lĩnh vực thương mại, nhờ vào tỷ lệ nito cao (6,89%) trong cau tạo, so với cellulose thay thế tổng hợp (chỉ 1,25%). Điều này khiến chitin trở thành chất chelatin hữu ích. Hầu hết các polyme ngày nay là vật liệu tổng hợp, vì thế tính tương hợp sinh học và khả năng phân hủy sinh học của chúng bị giảm đi nhiều, so với các polyme có nguồn gốc tự nhiên như cellulose, chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng.

Tuy nhiên, những nguồn tự nhiên này cũng thê hiện sự hạn chế trong khả năng phản ứng, khả năng xử lý và ứng dụng.