Nghiên Cứu Chiết Xuất Chitin-Chitosan Từ Ruồi Lính Đen (Hermetia illucens)

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu chiết xuất chitin chitosan từ ruồi lính đen Hermetia illucens, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.

• Tác giả: Nguyen Thi Thuy Dung
• Người hướng dẫn: TS. Nguyen Ngoc Ha
• Trường học: Trường Đại học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Chiết Xuất Chitin-Chitosan Từ Ruồi Lính Đen (Hermetia illucens)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Ruồi lính đen (Hermetia illucens)
• 1.2. Vòng đời của Ruồi lính đen
• 1.3. Ứng dụng của Ruồi lính đen
• 1.4. Chitin và chitosan
• 1.4.1. Cấu trúc hóa học và nguồn gốc của chitin
• 1.4.2. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan
• 1.4.3. Ứng dụng của chitin và chitosan
• 1.4.4. Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
• 1.4.5. Một số phương pháp trong và ngoài nước về chiết xuất chitin và chitosan
• 1.4.6. Một số nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Ứng dụng phương pháp hóa học khảo sát hàm lượng chitin của RLD
• 2.2.2. Xây dựng quy trình chiết xuất chitin bằng phương pháp sinh học
• 2.2.3. Tối ưu hóa các điều kiện khử protein bằng enzyme Alcalase 2,5L
• 2.2.4. Tối ưu hóa các điều kiện trong trình khử khoáng bằng axit hữu cơ
• 2.2.5. Chuyển chitin thành chitosan
• 2.3. Phương pháp phân tích các thành phần bên trong mẫu
• 2.3.1. Hiệu suất quá trình khử protein, khử khoáng và hiệu suất thu hồi chitin
• 2.3.2. Khảo sát các đặc điểm hóa lý của chitosan
• 2.3.2.1. Xác định độ deacetyl (DD), độ nhớt và độ tan
• 2.3.2.2. Độ tinh khiết và cấu trúc hóa học
• 2.3.2.3. Cấu trúc bề mặt
• 2.3.3. Xác định khối lượng phân tử (Mw) của mẫu chitosan
• 2.3.4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của chitosan đã chiết xuất được
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Hàm lượng chitin Ruồi lính đen xác định bằng phương pháp hóa học
• 3.2. Thành phần hóa học của RLĐ ở các ngày tuổi
• 3.3. Quá trình tạo chitin
• 3.3.1. Khử protein bằng NaOH 5%
• 3.3.2. Tạo chitin bằng phương pháp sinh học
• 3.3.3. Tối ưu hóa quá trình khử protein bằng phương pháp đáp ứng bề mặt
• 3.3.4. Khử khoáng bằng axit lactic
• 3.3.5. Đánh giá tính chất vật lý của chitin được thu nhận bằng 2 phương pháp
• 3.3.6. Cấu trúc hóa học và độ tinh khiết
• 3.4. Chuyển hóa chitin thành chitosan
• 3.4.1. Đánh giá các đặc điểm hóa lý của chitosan
• 3.4.2. Những đặc điểm nổi bật của 2 phương pháp tạo chitosan
• 3.4.3. Độ tinh khiết và cấu trúc hóa học
• 3.4.4. Cấu trúc bề mặt của chitosan
• 3.4.5. Hoạt tính kháng khuẩn
• 3.4.5.1. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan với Bacillus subtilis
• 3.4.5.2. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan với Vibrio alginolyticus
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Chitin Chitosan Từ Ruồi Lính Đen

Nghiên cứu về chitin và chitosan từ ruồi lính đen (RLĐ) đang trở nên quan trọng do tiềm năng ứng dụng rộng rãi và tính bền vững của nguồn nguyên liệu này. RLĐ không chỉ giải quyết vấn đề thiếu hụt protein trong thức ăn chăn nuôi mà còn góp phần xử lý chất thải hữu cơ. Theo Kim và ctv (2019), thị trường côn trùng ăn được dự kiến vượt quá 522 triệu đô la vào năm 2023, cho thấy tiềm năng kinh tế lớn. Việc khai thác chitin và chitosan từ RLĐ mở ra cơ hội tận dụng phụ phẩm nông nghiệp và công nghiệp, hướng tới nền kinh tế tuần hoàn. Nghiên cứu này đánh giá hàm lượng và đặc tính của chitin chiết xuất từ RLĐ ở các giai đoạn khác nhau, đồng thời so sánh hiệu quả của phương pháp hóa học và sinh học.

1.1. Tiềm năng kinh tế và ứng dụng của Ruồi Lính Đen

RLĐ đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Từ sản xuất thức ăn chăn nuôi đến xử lý chất thải hữu cơ, RLĐ mang lại lợi ích kinh tế đáng kể. Hàm lượng protein cao trong ấu trùng RLĐ khiến chúng trở thành nguồn thức ăn tiềm năng cho gia súc, gia cầm và thủy sản. Ngoài ra, khả năng phân hủy nhanh chóng chất thải hữu cơ của RLĐ giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tạo ra phân bón hữu cơ. Nghiên cứu này tập trung vào việc khai thác giá trị gia tăng từ RLĐ thông qua việc chiết xuất chitin và chitosan, hai biopolymer có nhiều ứng dụng trong y sinh, nông nghiệp và công nghiệp.

1.2. Chitin và Chitosan Khái niệm cấu trúc và tính chất

Chitin là một polysaccharide quan trọng, cấu thành nên bộ xương ngoài của côn trùng, vỏ của các loài giáp xác. Chitosan là một dẫn xuất của chitin, được tạo ra thông qua quá trình deacetyl hóa. Cả hai chất này đều có những đặc tính sinh học và hóa học độc đáo. Theo Knidriet và ctv (2018), chitin là polysaccharide phong phú thứ hai trên Trái Đất sau cellulose. Chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, và tương thích sinh học cao. Vì thế, chitin và chitosan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

II. Thách Thức Chiết Xuất Chitin Chitosan Từ Ruồi Lính Đen

Mặc dù tiềm năng lớn, việc chiết xuất chitin và chitosan từ ruồi lính đen (RLĐ) vẫn đối mặt với nhiều thách thức. Phương pháp hóa học truyền thống sử dụng axit và kiềm mạnh có thể gây ô nhiễm môi trường và làm thay đổi cấu trúc của chitin/chitosan. Ngoài ra, hiệu suất chiết xuất chitin từ RLĐ có thể biến đổi tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của ấu trùng, chế độ ăn, và phương pháp xử lý. Việc tìm kiếm các phương pháp chiết xuất thân thiện với môi trường và tối ưu hóa quy trình chiết xuất là rất cần thiết.

2.1. Nhược điểm của phương pháp chiết xuất hóa học truyền thống

Phương pháp hóa học chiết xuất chitin từ vỏ tôm cua truyền thống sử dụng axit clohydric (HCl) để khử khoáng và natri hydroxit (NaOH) để khử protein. Phương pháp này, mặc dù hiệu quả, có nhiều nhược điểm. Việc sử dụng hóa chất mạnh có thể gây ô nhiễm môi trường do tạo ra lượng lớn chất thải axit và kiềm. Ngoài ra, axit clohydric có thể gây ảnh hưởng tiêu cực đến cấu trúc và thành phần hóa học của chitin. Chi phí xử lý chất thải và bảo trì thiết bị cũng là một gánh nặng đáng kể.

2.2. Biến động hàm lượng Chitin theo giai đoạn phát triển RLĐ

Hàm lượng chitin trong ruồi lính đen có thể thay đổi đáng kể tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của ấu trùng. Các yếu tố như chế độ ăn và điều kiện nuôi cũng có thể ảnh hưởng đến hàm lượng chitin. Do đó, cần phải xác định giai đoạn phát triển tối ưu để chiết xuất chitin với hiệu suất cao nhất. Nghiên cứu này khảo sát hàm lượng chitin ở các giai đoạn khác nhau của RLĐ (ấu trùng, tiền nhộng, nhộng, ruồi chết và vỏ kén) để xác định giai đoạn tiềm năng nhất cho việc chiết xuất chitin.

2.3. Sự cần thiết của các phương pháp chiết xuất thân thiện môi trường

Do những hạn chế của phương pháp hóa học truyền thống, việc phát triển các phương pháp chiết xuất chitin và chitosan thân thiện với môi trường trở nên vô cùng quan trọng. Các phương pháp sinh học, sử dụng enzyme hoặc vi sinh vật để loại bỏ protein và khoáng chất, là một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn. Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất chitin bằng phương pháp sinh học, sử dụng enzyme Alcalase và axit lactic, nhằm giảm thiểu tác động đến môi trường và đảm bảo chất lượng chitin.

III. Phương Pháp Chiết Xuất Chitin Bằng Enzyme Alcalase 2

Nghiên cứu này sử dụng enzyme Alcalase 2.5L trong quá trình chiết xuất chitin từ ruồi lính đen (RLĐ) bằng phương pháp sinh học. Alcalase là một protease có khả năng phân hủy protein hiệu quả, giúp loại bỏ protein khỏi mẫu và làm tăng độ tinh khiết của chitin. Quy trình chiết xuất bao gồm các bước khử protein bằng enzyme Alcalase, khử khoáng bằng axit lactic, và thu hồi chitin. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được sử dụng để tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất (thời gian, nhiệt độ, tỷ lệ enzyme) nhằm đạt được hiệu suất cao nhất.

3.1. Quy trình khử Protein bằng Enzyme Alcalase 2.5L

Quá trình khử protein là một bước quan trọng trong chiết xuất chitin. Enzyme Alcalase 2.5L được sử dụng để phân hủy protein trong mẫu RLĐ. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả khử protein bao gồm thời gian ủ, nhiệt độ và tỷ lệ enzyme so với mẫu. Nghiên cứu này tiến hành tối ưu hóa các yếu tố này bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) để đạt được hiệu suất khử protein tối đa.

3.2. Tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất bằng phương pháp RSM

Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là một công cụ thống kê mạnh mẽ được sử dụng để tối ưu hóa các quy trình thực nghiệm. Trong nghiên cứu này, RSM được sử dụng để xác định các điều kiện chiết xuất tối ưu (thời gian, nhiệt độ, tỷ lệ enzyme) để đạt được hiệu suất khử protein cao nhất. Mô hình Box-Behnken được sử dụng để thiết kế các thí nghiệm và phân tích kết quả.

3.3. Khử khoáng bằng Axit Lactic Giải pháp thay thế thân thiện

Sau khi khử protein, bước tiếp theo là khử khoáng để loại bỏ các khoáng chất như canxi cacbonat. Nghiên cứu này sử dụng axit lactic, một axit hữu cơ, làm tác nhân khử khoáng thay thế cho axit clohydric. Axit lactic ít gây ô nhiễm hơn và có khả năng phân hủy sinh học. Điều kiện khử khoáng (thời gian, nhiệt độ, nồng độ axit) cũng được tối ưu hóa để đạt hiệu quả cao nhất.

IV. Chuyển Đổi Chitin Thành Chitosan và Đánh Giá Đặc Tính

Sau khi chiết xuất chitin, nó được chuyển đổi thành chitosan thông qua quá trình deacetyl hóa. Nghiên cứu này sử dụng NaOH 70% ở nhiệt độ 80°C trong 8 giờ để thực hiện quá trình này. Các đặc tính lý hóa của chitosan (khối lượng phân tử, độ nhớt, độ deacetyl, độ hòa tan) được đánh giá bằng các phương pháp như phổ FTIR, ảnh SEM, và các phép đo vật lý. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan cũng được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa.

4.1. Quy trình deacetyl hóa Chitin để tạo Chitosan

Chitosan được tạo ra từ chitin thông qua quá trình deacetyl hóa, loại bỏ nhóm acetyl (CH3CO) khỏi phân tử chitin. Nghiên cứu sử dụng dung dịch NaOH 70% ở nhiệt độ 80°C trong 8 giờ để thực hiện phản ứng này. Điều kiện phản ứng (nồng độ NaOH, nhiệt độ, thời gian) có thể ảnh hưởng đến mức độ deacetyl hóa và các đặc tính của chitosan.

4.2. Đánh giá đặc tính lý hóa của Chitosan FTIR và SEM

Các đặc tính lý hóa của chitosan được đánh giá bằng nhiều phương pháp khác nhau. Phổ FTIR (Fourier-transform infrared spectroscopy) được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học và các nhóm chức của chitosan. Ảnh SEM (scanning electron microscopy) cung cấp thông tin về hình thái bề mặt của chitosan. Các phép đo vật lý như khối lượng phân tử, độ nhớt, độ deacetyl và độ hòa tan cũng được thực hiện để đánh giá chất lượng của chitosan.

4.3. Khảo sát Hoạt tính kháng khuẩn của Chitosan từ Ruồi Lính Đen

Chitosan có hoạt tính kháng khuẩn đối với nhiều loại vi khuẩn và nấm. Nghiên cứu này đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của chitosan chiết xuất từ RLĐ đối với hai loại vi khuẩn: Bacillus subtilis (Gram dương) và Vibrio alginolyticus (Gram âm) bằng phương pháp khuếch tán đĩa. Đường kính vòng vô khuẩn được đo để đánh giá mức độ kháng khuẩn của chitosan.

V. Kết Quả Nghiên Cứu và So Sánh Phương Pháp Chiết Xuất

Nghiên cứu này cho thấy cả phương pháp hóa học và sinh học đều có thể được sử dụng để chiết xuất chitin và chitosan từ ruồi lính đen (RLĐ). Phương pháp hóa học cho hiệu suất cao hơn nhưng kém thân thiện với môi trường hơn. Phương pháp sinh học sử dụng enzyme Alcalase 2.5L và axit lactic cho phép chiết xuất chitin với độ tinh khiết cao hơn và ít gây ô nhiễm hơn. Chitosan chiết xuất từ cả hai phương pháp đều có hoạt tính kháng khuẩn, tuy nhiên, chitosan từ phương pháp sinh học có hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn.

5.1. So sánh hiệu suất chiết xuất giữa hai phương pháp

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp hóa học có hiệu suất chiết xuất chitin cao hơn so với phương pháp sinh học. Tuy nhiên, cần xem xét các yếu tố khác như chi phí, tính bền vững và tác động môi trường khi lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp.

5.2. Đánh giá đặc tính và độ tinh khiết của Chitin Chitosan

Phân tích FTIR và SEM cho thấy chitin và chitosan chiết xuất từ cả hai phương pháp đều có cấu trúc tương tự nhau. Tuy nhiên, chitosan chiết xuất bằng phương pháp sinh học có độ tinh khiết cao hơn và ít bị biến đổi cấu trúc hơn so với chitosan chiết xuất bằng phương pháp hóa học.

5.3. So sánh hoạt tính kháng khuẩn của Chitosan từ hai phương pháp

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cho thấy chitosan chiết xuất từ phương pháp sinh học có hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn so với chitosan chiết xuất từ phương pháp hóa học. Điều này có thể là do sự khác biệt về khối lượng phân tử, độ deacetyl và cấu trúc bề mặt của chitosan.

VI. Ứng Dụng Tiềm Năng và Hướng Nghiên Cứu Chitin Chitosan

Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc khai thác chitin và chitosan từ ruồi lính đen (RLĐ) như một nguồn nguyên liệu bền vững. Chitin và chitosan từ RLĐ có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y sinh, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, và xử lý môi trường. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình chiết xuất, nâng cao chất lượng sản phẩm, và mở rộng phạm vi ứng dụng của chitin và chitosan từ RLĐ.

6.1. Ứng dụng Chitin Chitosan trong nông nghiệp bền vững

Chitosan có thể được sử dụng làm chất kích thích sinh trưởng cây trồng, chất bảo vệ thực vật tự nhiên, và chất cải tạo đất. Chitosan giúp tăng cường khả năng chống chịu của cây trồng đối với các bệnh do nấm và vi khuẩn gây ra. Ngoài ra, chitosan còn có khả năng giữ ẩm và cải thiện cấu trúc đất.

6.2. Triển vọng ứng dụng Chitin Chitosan trong lĩnh vực y sinh

Chitosan có nhiều ứng dụng tiềm năng trong y sinh như làm vật liệu băng bó vết thương, chất mang thuốc, và chất hỗ trợ trong phẫu thuật. Chitosan có khả năng thúc đẩy quá trình lành vết thương, giảm đau, và ngăn ngừa nhiễm trùng.

6.3. Hướng nghiên cứu tiếp theo về Chitin Chitosan từ Ruồi Lính Đen

Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất chitin và chitosan, nâng cao chất lượng sản phẩm, và khám phá các ứng dụng mới của chitin và chitosan từ RLĐ. Cần có thêm nhiều nghiên cứu về tác động của chitin và chitosan đến sức khỏe con người và môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ruồi lính đen (Hermetia illucens) là một loài côn trùng có vòng đời khoảng 40-45 ngày, được nuôi phổ biến trong các hệ thống xử lý chất thải hữu cơ và sản xuất protein sinh học. Theo ước tính, thị trường côn trùng ăn được toàn cầu dự kiến vượt 522 triệu đô la vào năm 2023, trong đó ruồi lính đen chiếm khoảng 80% tổng số công ty sản xuất côn trùng tại châu Âu. Bộ xương ngoài của ruồi lính đen chứa tới 35% chitin, một polysaccharide tự nhiên có giá trị thương mại cao, được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp y sinh, thực phẩm và nông nghiệp.

Nghiên cứu này tập trung vào việc chiết xuất chitin và chitosan từ các giai đoạn vòng đời khác nhau của ruồi lính đen, bao gồm ấu trùng, tiền nhộng, nhộng, ruồi chết và vỏ kén, sử dụng hai phương pháp chính là hóa học và sinh học. Mục tiêu cụ thể là đánh giá hàm lượng chitin, tối ưu hóa quy trình chiết xuất sinh học, xác định đặc tính hóa lý của chitin và chitosan thu nhận được, cũng như đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của chitosan. Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, trong khoảng thời gian từ tháng 5/2022 đến tháng 10/2023.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển nguồn nguyên liệu chitin/chitosan bền vững từ ruồi lính đen, góp phần thúc đẩy kinh tế tuần hoàn và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Đồng thời, nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng chitosan trong các lĩnh vực y sinh và công nghiệp, đặc biệt là trong việc phát triển vật liệu sinh học có hoạt tính kháng khuẩn cao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc hóa học của chitin và chitosan: Chitin là polysaccharide được cấu tạo từ các đơn vị N-acetyl-D-glucosamine liên kết bằng liên kết β-1,4-glucosid, tồn tại chủ yếu dưới dạng α-chitin trong ruồi lính đen. Chitosan là dẫn xuất của chitin, được tạo thành qua quá trình deacetyl hóa, chứa nhiều nhóm amin, có khả năng hòa tan trong dung dịch acid loãng và mang điện tích dương, giúp tăng khả năng tương tác với các ion âm và vi sinh vật.

• Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM): Đây là phương pháp thống kê dùng để tối ưu hóa các điều kiện thí nghiệm, xác định ảnh hưởng của các yếu tố như nồng độ enzyme, thời gian và nhiệt độ đến hiệu suất khử protein và khử khoáng trong quá trình chiết xuất chitin sinh học.

• Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan: Dựa trên khả năng tương tác của chitosan với màng tế bào vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn Gram dương và Gram âm, giúp ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu và mẫu nghiên cứu: Ruồi lính đen được nuôi tại Khu thực nghiệm CJ Black Soldier Fly, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Mẫu thu thập gồm ấu trùng (10-14 ngày tuổi), tiền nhộng (15-28 ngày tuổi), nhộng (29-40 ngày tuổi), ruồi chết và vỏ kén, mỗi loại khoảng 0,5-1,5 kg.

• Phương pháp chiết xuất chitin:

  • Phương pháp hóa học: Khử protein bằng dung dịch NaOH 5%, khử khoáng bằng HCl 4%, xử lý tẩy màu và deacetyl hóa bằng NaOH 70% ở 80°C trong 8 giờ.
  • Phương pháp sinh học: Tối ưu hóa quá trình khử protein sử dụng enzyme Alcalase 2.5L và khử khoáng bằng axit lactic, áp dụng mô hình Box-Behnken trong RSM để xác định điều kiện tối ưu.

• Phân tích đặc tính hóa lý: Sử dụng phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) để xác định cấu trúc hóa học, kính hiển vi điện tử quét (SEM) để quan sát cấu trúc bề mặt, đo khối lượng phân tử (MW), độ nhớt, độ deacetyl (DA) và độ hòa tan của chitosan.

• Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Phương pháp khuếch tán đĩa được sử dụng để kiểm tra khả năng ức chế vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis) và Gram âm (Vibrio alginolyticus) của chitosan thu nhận từ hai phương pháp.

• Timeline nghiên cứu: Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 5/2022 đến tháng 10/2023, bao gồm các giai đoạn thu mẫu, xử lý mẫu, tối ưu hóa quy trình, phân tích đặc tính và đánh giá hoạt tính sinh học.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Hàm lượng chitin thu được: Phương pháp hóa học cho hàm lượng chitin dao động từ 7,18% đến 35,5%, với hàm lượng cao nhất ở vỏ kén. Phương pháp sinh học tối ưu hóa từ vỏ kén đạt hàm lượng chitin khoảng 63,2 ± 0,17%, cao hơn gần gấp đôi so với phương pháp hóa học.

2. Đặc tính hóa lý của chitin: Phân tích FTIR và SEM cho thấy chitin thu nhận từ cả hai phương pháp đều có cấu trúc tương đồng, thuộc dạng α-chitin với độ kết tinh cao. Hình ảnh SEM thể hiện bề mặt chitin mịn và có cấu trúc sợi đặc trưng.

3. Hiệu suất chuyển hóa chitin thành chitosan: Phương pháp hóa học cho hiệu suất thu hồi chitosan cao hơn so với phương pháp sinh học. Chitosan từ phương pháp hóa có độ deacetyl, độ nhớt và khối lượng phân tử cao hơn, trong khi chitosan từ phương pháp sinh học có đặc tính kháng khuẩn tốt hơn.

4. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan: Cả hai loại chitosan đều thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Đường kính vòng vô khuẩn của chitosan sinh học lớn hơn, chứng tỏ hoạt tính kháng khuẩn vượt trội so với chitosan hóa học.

Thảo luận kết quả

Sự khác biệt về hàm lượng chitin giữa hai phương pháp phản ánh hiệu quả tối ưu hóa của quá trình sinh học, đặc biệt là việc sử dụng enzyme Alcalase và axit lactic trong khử protein và khử khoáng. Mặc dù phương pháp hóa học cho hiệu suất thu hồi chitosan cao hơn, nhưng quá trình này sử dụng nhiều hóa chất mạnh, có thể ảnh hưởng đến cấu trúc phân tử và môi trường.

Đặc tính hóa lý tương đồng của chitin từ hai phương pháp khẳng định tính ổn định của cấu trúc α-chitin trong ruồi lính đen, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về chitin côn trùng. Độ deacetyl và khối lượng phân tử cao của chitosan hóa học giúp tăng độ nhớt và khả năng tạo màng, trong khi chitosan sinh học với đặc tính kháng khuẩn tốt hơn có thể do cấu trúc phân tử nhỏ hơn và độ hòa tan cao hơn.

Kết quả hoạt tính kháng khuẩn phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, cho thấy chitosan là vật liệu tiềm năng trong ứng dụng y sinh và bảo quản thực phẩm. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hàm lượng chitin, hiệu suất thu hồi chitosan và đường kính vòng vô khuẩn để minh họa rõ ràng sự khác biệt giữa hai phương pháp.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Ứng dụng quy trình chiết xuất sinh học: Khuyến khích áp dụng phương pháp sinh học với enzyme Alcalase và axit lactic để chiết xuất chitin từ vỏ kén ruồi lính đen, nhằm tăng hiệu suất và giảm tác động môi trường. Thời gian thực hiện: 6-12 tháng; chủ thể: các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học.

2. Phát triển sản phẩm chitosan kháng khuẩn: Tận dụng đặc tính kháng khuẩn vượt trội của chitosan sinh học để phát triển các sản phẩm y sinh như băng gạc, vật liệu phủ bảo quản thực phẩm. Thời gian: 12-18 tháng; chủ thể: công ty dược phẩm và công nghiệp thực phẩm.

3. Mở rộng nghiên cứu quy mô công nghiệp: Thử nghiệm quy trình chiết xuất chitin và chitosan ở quy mô pilot nhằm đánh giá tính khả thi và chi phí sản xuất, đồng thời tối ưu hóa các bước xử lý. Thời gian: 18-24 tháng; chủ thể: các trung tâm nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật chiết xuất chitin/chitosan cho các đơn vị sản xuất và nghiên cứu, thúc đẩy ứng dụng rộng rãi công nghệ sinh học trong ngành công nghiệp sinh học. Thời gian: 6-12 tháng; chủ thể: trường đại học và viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và phương pháp tối ưu trong chiết xuất chitin/chitosan từ nguồn nguyên liệu mới, phục vụ cho các đề tài liên quan.

2. Doanh nghiệp sản xuất vật liệu sinh học và dược phẩm: Thông tin về quy trình chiết xuất và đặc tính sản phẩm giúp phát triển các sản phẩm chitosan ứng dụng trong y sinh và bảo quản thực phẩm.

3. Ngành công nghiệp nuôi trồng và xử lý chất thải hữu cơ: Nghiên cứu mở ra hướng sử dụng phụ phẩm từ nuôi ruồi lính đen làm nguyên liệu giá trị, góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế và bảo vệ môi trường.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách: Cung cấp dữ liệu khoa học để xây dựng chính sách phát triển kinh tế tuần hoàn, thúc đẩy công nghệ sinh học thân thiện môi trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Chitin và chitosan khác nhau như thế nào?
   Chitin là polysaccharide tự nhiên cấu tạo từ N-acetyl-D-glucosamine, trong khi chitosan là dẫn xuất của chitin được tạo ra bằng quá trình deacetyl hóa, chứa nhiều nhóm amin hơn, có khả năng hòa tan trong dung dịch acid loãng và mang điện tích dương, giúp tăng tính ứng dụng trong y sinh và công nghiệp.

2. Tại sao chọn ruồi lính đen làm nguồn nguyên liệu chiết xuất chitin?
   Ruồi lính đen có vòng đời ngắn, dễ nuôi, khả năng xử lý chất thải hữu cơ cao và chứa hàm lượng chitin lên đến 35% trong bộ xương ngoài, tạo nguồn nguyên liệu bền vững và thân thiện môi trường so với các nguồn truyền thống như vỏ tôm, cua.

3. Ưu điểm của phương pháp chiết xuất sinh học so với hóa học là gì?
   Phương pháp sinh học sử dụng enzyme và axit hữu cơ giúp giảm sử dụng hóa chất độc hại, bảo tồn cấu trúc phân tử chitin/chitosan, tăng hiệu suất chiết xuất và giảm tác động môi trường, mặc dù thời gian xử lý có thể dài hơn.

4. Chitosan có thể ứng dụng trong lĩnh vực nào?
   Chitosan được ứng dụng rộng rãi trong y học (băng gạc, thuốc bôi), công nghiệp thực phẩm (bao bì bảo quản), nông nghiệp (thuốc trừ sâu sinh học), xử lý nước thải và mỹ phẩm nhờ đặc tính kháng khuẩn, khả năng tạo màng và tương hợp sinh học.

5. Làm thế nào để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của chitosan?
   Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán đĩa, đo đường kính vòng vô khuẩn trên môi trường thạch đối với các vi khuẩn Gram dương và Gram âm, từ đó xác định khả năng ức chế sự phát triển vi sinh vật của chitosan.

Kết luận

• Nghiên cứu đã thành công trong việc chiết xuất chitin và chitosan từ các giai đoạn vòng đời của ruồi lính đen bằng hai phương pháp hóa học và sinh học, với hàm lượng chitin cao nhất đạt khoảng 63,2% từ phương pháp sinh học.
• Chitin thu nhận thuộc dạng α-chitin, có cấu trúc hóa học và đặc tính vật lý tương đồng giữa hai phương pháp.
• Chitosan từ phương pháp sinh học có hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn, trong khi phương pháp hóa học cho hiệu suất thu hồi cao hơn.
• Kết quả nghiên cứu mở ra tiềm năng phát triển nguồn nguyên liệu chitin/chitosan bền vững từ ruồi lính đen, góp phần thúc đẩy kinh tế tuần hoàn và ứng dụng trong y sinh.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu mở rộng quy mô sản xuất, phát triển sản phẩm ứng dụng và chuyển giao công nghệ trong vòng 1-2 năm tới.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp liên quan áp dụng quy trình chiết xuất sinh học để phát triển sản phẩm chitosan chất lượng cao, đồng thời thúc đẩy hợp tác nghiên cứu đa ngành nhằm khai thác tối đa tiềm năng của ruồi lính đen.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1. Rudi lính đen (Hermetia illucens) Rudi lính đen (Black Soldier Fly), tên khoa học là Hermetia illucens, thuộc họ Stratiomyidae tộc Hermetia, loài 77. 7//cens được tìm thay trên toàn thế giới, nhưng nó được cho là có nguồn gốc từ châu Mỹ. Rudi linh den (Black Soldier Fly).

Nó thường được tim thấy ở các vùng nhiệt đới va ôn đới trên khắp thế giới. Mặc dù thích nghi chủ yếu ở những vùng này, nó có thể chịu được nhiệt độ cực cao ngoại trừ khi đẻ trứng. Chúng thường được coi là một loai côn trùng có ích và không gây hại. Ruồi trưởng thành không có phần miệng hoặc cơ quan tiêu hóa; do đó, chúng không căn hoặc chích và không kiêm ăn trong thời gian tôn tại ngắn ngủi của nó.

Vòng đời của Ruồi lính đen Vòng đời của rudi lính đen kéo dài khoảng hơn 1 tháng, bắt đầu từ trứng, au trùng, nhộng, cuối cùng lột xác thành ruồi lính đen trưởng thành. là vòng đời được nuôi và nghiên cứu trực tiếp tại khu thực nghiệm Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trứng sẽ được nở từ 2 — 4 ngày, chúng sẽ được cung cấp dinh dưỡng trong suốt quá trình phát triển. Từ ngày 1 đến khoảng ngày thứ 18 là giai đoạn tiền nhộng, sau đó 7 ngày chúng phát triển thành nhộng khi đó vỏ bên ngoài của chúng có màu đen. Từ nhộng phát triển thành Rudi trưởng thành mat khoảng 7 ngày, khi chúng đã tưởng thành sẽ giao phối trong giai đoạn này chúng không cần thức ăn và sau 2 ngày chúng đẻ trứng, tiếp tục vòng đời sinh trưởng.

2 -3 ngày Trứng (500 — 1000 con) Giao phối Tiền nhộng 2 ngày 7 ngày Rudi BSF 7 ngay Hình 1. Vong đời của Hermetia illucens. Với điều kiện thực hiện thí nghiệm, Ruôi lính đen trong quá trình thí nghiệm trai qua 5 giai đoạn chính trong vòng đời: trứng (từ 5 - I0NT, au trùng (từ 10 — 14NT), tiền nhộng (từ 15 — 28NT), nhộng (từ 29 — 40NT) va con trưởng thành. Giai đoạn dài nhất trong vòng đời của RLĐ là ở giai đoạn ấu trùng và nhộng, trong khi giai đoạn trứng và trưởng thành lại ngắn và tùy theo nguồn thức ăn mà các giai đoạn vòng đời khác nhau.

Trung bình, trứng nở trong bốn ngày và thay đôi theo mùa, vùng và nhiệt độ. Có khoảng sáu ngày tuổi trong giai đoạn au trung. Au trùng nở ra từ trứng bắt đầu ăn ngay lập tức các loại chất hữu cơ khác nhau, với mức tiêu thụ chất hữu cơ tăng đáng ké trong giai đoạn ấu trùng. Khi ấu trùng đạt đến ngày tuổi thứ 6, sẽ bắt đầu trai qua quá trình tạo hắc tố khiến lớp biểu bì có màu sẫm hơn dé dần trở thành nhộng.

Trong giai đoạn này, côn trùng làm rỗng đường tiêu hóa và ngừng ăn. Sau đó, au trùng di chuyên từ nguồn thức ăn đến các kẽ hở khô dé biến thành nhộng trong 7-10 ngày. Giai đoạn nhộng, chúng hạn chế di chuyền và không ăn trong ít nhất 8 ngày, kết thúc khi trưởng thành. Rudi trưởng thành không ăn gì ngoại trừ nước và dua vào chất béo dự trữ ở giai đoạn ấu trùng.

Theo Ferrarezi và ctv năm 2016, tổng chu kỳ của BSF là 45 ngày. Nó trải qua hai giai đoạn của cuộc đời trong giá thé nuôi cay là trứng (4 ngày) và giai đoạn ấu trùng (18 ngày). Chỉ khi chúng chuyền đổi từ giai đoạn tiền nhộng (14 ngày) sau 9 ngày là con trưởng thành. Con trưởng thành sống được khoảng hai tuần khi chỉ được cung cấp nước.

Thông thường con đực xuất hiện trước hai ngày so với con cái và giao phối diễn ra sau đó hai ngày. Rudi lính den là một loài côn trùng giao phối trong lúc bay, và do đó cần có những khu vực rộng rãi cho chuyển bay tự do của nó (Caruso và ctv, 2013). Chúng thường giao phối một lần và con cái sẽ đẻ một lứa trứng trong suốt cuộc đời của chúng, thường là hai ngày sau khi giao phối. Kết quả là trứng nở trong khoảng bốn ngày với au trùng cần khoảng hai tuần dé phát triển hoàn thiện (Tomberlin và ctv, 2002).

Giai đoạn tiền ấu trùng, giai đoạn sau của ấu trùng trước khi hình thành nhộng va chúng phân tán ra khỏi nguồn thức ăn dé tìm kiếm một nơi khô ráo và được bảo vệ dé tạo thành nhộng. Nhộng cũng cần khoảng hai tuần dé phát triển (Surendra, 2020). Ruồi trưởng thành tồn tại nhờ chất béo được lưu trữ trong giai đoạn au tring, sau đó, chúng không ăn gi ngoại trừ nước. Rudi lính đen trưởng thành có màu den, dài 15 - 20 mm với mau đen khói,chia thành ba phần riêng biệt là phần đầu, ngực và bụng.

Ruồi cái trưởng thành thường lớn hơn con đực và có đầu bụng màu đỏ trong khi con đực có đầu bụng màu đồng bạc và thường đẻ trứng ở gần hoặc trên nền hữu cơ 4m và chat thai 4m ướt và trong trường hợp không có môi trường như vậy, con cái không thé đẻ trứng. Trứng ruồi lính đen có hình bau dục và có kích thước xấp xi 1 mm (chiều dai). Trứng vừa mới đẻ có màu trắng sau đó chuyền sang màu vàng nhạt hoặc trắng kem. Âu trùng ruồi lính đen mới nở nhỏ, màu trắng và dải khoảng 1,8 mm.

Theo thời gian, màu sắc ấu trùng dan dan thay đổi từ sáng đến xám. Au trùng có hình ngư lôi và det ở mặt dưới. Đầu ấu trùng chứa phần miệng nhai trong khi phần lưng được phân đoạn chứa lỗ chân lông dé thở. Cơ thé ấu trùng được bao phủ bởi một làn da săn chắc, déo dai và độ déo dai phụ thuộc vào độ tuôi.

Ung dụng của Rudi lính đen Au trùng có thé sinh trưởng rất nhanh. Một ấu trùng có thé ăn 25 - 500 mg thức ăn tươi/ngày. Thức ăn của chúng khá đa dạng, đồng thời cũng là chất nền, từ phân bón chăn nuôi, đến các loại rác thải thực phẩm, phụ pham nông nghiệp. Một chu kỳ sinh trưởng của ấu trùng ruôi lính đen kéo dài 15 ngày tới khi đạt trọng lượng trung bình 0,25 g trong điều kiện nhiệt độ tối ưu (30 °C).

Au trùng này có tốc độ xử lý rác thải hữu cơ rất cao (trung bình gấp 5 lần trọng lượng cơ thê), thời gian xử lý dài (từ 2 - 3 tuần). Loài côn trùng này không chỉ có khả năng giảm ô nhiễm chất thải động thực vật lên đến 50% mà còn làm giảm số lượng vi khuẩn có hại (Makkar, 2014). Theo Xiu (2017), ấu trùng Rudi lính đen tái chế đinh dưỡng lãng phí bang cách chuyền đổi phân gia cam, phân lợn, phân bò sữa, phân người, chat thải thực vật, và chat thải thực phẩm của con người. Phân và chat thải cung cấp cho ruồi lính den khoảng 40% protein và 30% chất béo.

Sự tích tụ lipid thay đổi tùy theo các nguyên liệu cho ăn khác nhau. Chúng được sử dụng rộng rãi như một nguôn thức ăn tuyệt vời trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi và thủy sản. Là một nguyên liệu thô sinh học mới, cũng có thé được sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học, làm cho công nghệ xử lý chất thải thành năng lượng trở nên khả thi hơn. Ruôi lính đen được sử dụng làm thức ăn cho chăn nuôi lon, gia cầm, thủy sản và xử lý chất thải trong nông nghiệp.

Ngoài ra, ấu trùng ruồi có thé cô đặc, sấy khô phối trộn với các chất dinh dưỡng của Ruồi lính đen khác làm thức ăn thay thế hoàn toàn bột cá trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, thủy sản. Các nguồn protein có nguồn gốc động vat, chang hạn như bột côn trùng, có thé được sử dụng làm nguồn thay thé cho thức ăn thủy sản (Kortner, 2020). Bột ấu trùng lính đen được coi là một trong những lựa chọn thay thế tốt nhất dé thay thế một phan hoặc hoàn toàn bột cá trong khẩu phan ăn của cá rô phi Nile ma không ảnh hưởng đến năng suất tăng trưởng, hiệu suất thức ăn và tình trạng sức khỏe (Tippayadara, 2021). Đây là loại mỗi sống rat thích hợp cho làm thức ăn cho các loại gia súc, gia cầm, thủy hải sản.

Chúng còn bổ sung canxi và phốt pho cho gia cầm như: gà, vịt, ngan, ngỗng,. giúp bổ sung chất dinh dưỡng, tăng sức đề kháng, kích thích ra lông tốt,. Ngoài ra, rudi lính den còn rất phù hợp với nhiều loại thú cưng khác như cá cảnh, chim cảnh, bò sát, kỳ tôm,. Chúng còn là loại côn trùng có ích, chúng có thể xử lí rác thải hữu cơ thành phân bón hữu ích cho cây cảnh.

Chính từ lợi ích nhiều mặt của ruôi lính đen, trên thị trường gần đây xuất hiện nhiều mô hình nuôi ruôi lính đen làm nguồn thức ăn hữu ích cho nhiều loại vật nuôi. Thành phần dinh dưỡng của au trùng RLĐ đã có nhiều công bố và phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng cũng như sé luong chat nền làm thức ăn. Au trùng chứa ham lượng protein thô dao động từ 38 — 63% va chất béo thô dao động từ 7 — 42%. Protein của ấu trùng ruồi lính đen chứa rất nhiều các axit amin thiết yếu và không thiết yếu, các khoáng chất như Ca nhiều hơn so với hầu hết các loại côn trùng khác từ 6,6 — 9,3% vật chất khô (Makkar và ctv, 2014; Paul và ctv, 2017).

Điều đó mang lại một lợi thé đáng ké về mặt dinh dưỡng trong việc cung cấp đầy đủ các khoáng chất và vitamin thiết yếu so với các loài côn trùng khác. Bên cạnh đó còn có nghiên cứu khác về hàm lượng dinh dưỡng của RLD, giá trị dinh dưỡng của ấu trùng RLĐ khô chứa tới 50% protein, 35% chất béo (có thành phần axit amin tương tự bột cá), 6% canxi, 1,2% Phốt pho, 1% Magié và 0,3% natri. Hàm lượng độ am, tro, protein, lipid, chất xơ lần lượt dao động trong khoảng 3,21 — 7,10%, 7,26 — 8,27%, 39,38-48,20%, 25,69—38,36%, 7,41%-9,96% va 6,45—7,88% (Nor và ctv, 2022). Theo Augusta va ctv (2017), thành phan axit béo BSF chu yếu là axit lauric (46,7 + 0,6%), tiếp theo là axit oleic (15,1 + 0,9%), axIt miristic (8,3 + 0,1%), palmitic (8,4 + 0,2%) và palmitoleic (7,6 + 0,4%) bên cạnh đó lipid chiếm 37% trọng lượng, protein chiếm 32% va chitin chiếm 9%.

Vì vậy, ấu trùng RLĐ được công nhận và sử dụng rộng rãi làm nguồn protein thay thế cho gia cam, lợn và một sô loài cá, tôm. Chitin va Chitosan 1. Cau trúc hóa học và nguồn gốc của chitin Chitin được cấu tạo từ các đơn vị N- acetyl-D-glucosamine (NADG) liên két với nhau bằng các liên kết B-1,4-glucozid. CH N-acetyl group I 2 Glucosamine =0 CH,OH CH,OH H | ao.

0 0 OH OH H h H H NA aa Oar CH CH, = at Hình 1. Cấu trúc hóa học phan tử chitin.