Nghiên Cứu Chế Tạo Kit Chẩn Đoán Nhanh Streptococcus Suis Type 2 Ở Lợn

Bệnh liên cầu khuẩn lợn do *Streptococcus suis* (*S. suis*) gây ra là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, ảnh… 124 trang · Học viện Nông nghiệp Việt Nam · 2020.

• Tác giả: Lê Quốc Việt
• Người hướng dẫn: PGS. Đinh Thị Bích Lân
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
• Đề tài: Nghiên Cứu Chế Tạo Kit Chẩn Đoán Nhanh Streptococcus Suis Type 2 Ở Lợn
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục chữ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận án
• 1.7. Thesis abstract
• 2. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 3. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 6. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 7. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Chẩn Đoán Nhanh S

Bệnh liên cầu khuẩn lợn do Streptococcus suis (S. suis) gây ra là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, ảnh hưởng đến cả lợn và người. S. suis type 2 là một trong những type huyết thanh phổ biến nhất gây bệnh ở người và động vật. Bệnh gây ra các triệu chứng nghiêm trọng như viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, và có thể dẫn đến tử vong hoặc di chứng nặng nề như điếc. Việc chẩn đoán nhanh và chính xác S. suis type 2 là vô cùng quan trọng để có thể điều trị kịp thời và ngăn chặn sự lây lan của bệnh. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nhuộm Gram, phân lập vi khuẩn và PCR có những hạn chế nhất định về thời gian và độ phức tạp. Do đó, nhu cầu về một phương pháp chẩn đoán nhanh, đơn giản và hiệu quả là rất lớn. Nghiên cứu này tập trung vào việc chế tạo một kit chẩn đoán nhanh S. suis type 2 ở lợn, nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết này.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Chẩn Đoán Nhanh Liên Cầu Lợn

Chẩn đoán nhanh bệnh liên cầu lợn là yếu tố then chốt để giảm thiểu thiệt hại kinh tế và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Việc phát hiện sớm giúp bác sĩ thú y và các nhà chăn nuôi có thể áp dụng các biện pháp can thiệp kịp thời, như sử dụng kháng sinh hoặc cách ly lợn bệnh. Điều này giúp giảm tỷ lệ tử vong ở lợn, hạn chế sự lây lan của bệnh trong đàn và giảm nguy cơ lây nhiễm sang người. Hơn nữa, chẩn đoán nhanh còn giúp xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh, từ đó đưa ra phác đồ điều trị phù hợp và hiệu quả nhất.

1.2. Các Phương Pháp Chẩn Đoán S. Suis Hiện Nay

Hiện nay, có nhiều phương pháp chẩn đoán S. suis, bao gồm nhuộm Gram, phân lập vi khuẩn, PCR và ELISA. Nhuộm Gram là phương pháp đơn giản và nhanh chóng, nhưng độ nhạy và độ đặc hiệu thấp. Phân lập vi khuẩn là phương pháp tiêu chuẩn vàng, nhưng tốn thời gian và đòi hỏi kỹ thuật viên có kinh nghiệm. PCR là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, nhưng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và quy trình phức tạp. ELISA là phương pháp bán định lượng, có thể phát hiện kháng thể kháng S. suis, nhưng không thể phân biệt được giữa các type huyết thanh khác nhau.

II. Thách Thức Trong Chẩn Đoán Nhanh Liên Cầu Lợn Type 2

Mặc dù có nhiều phương pháp chẩn đoán S. suis, nhưng việc chẩn đoán nhanh và chính xác S. suis type 2 vẫn còn nhiều thách thức. Một trong những thách thức lớn nhất là sự đa dạng về mặt di truyền của S. suis, dẫn đến sự khác biệt về kháng nguyên giữa các chủng khác nhau. Điều này có thể làm giảm độ nhạy và độ đặc hiệu của các xét nghiệm chẩn đoán. Thêm vào đó, S. suis thường tồn tại cùng với các vi khuẩn khác trong đường hô hấp của lợn, gây khó khăn cho việc phân lập và xác định chính xác. Ngoài ra, các phương pháp chẩn đoán hiện có thường đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có kinh nghiệm và thời gian thực hiện kéo dài, gây khó khăn cho việc ứng dụng rộng rãi trong thực tế.

2.1. Sự Đa Dạng Di Truyền Của Streptococcus Suis

Sự đa dạng di truyền của Streptococcus suis là một thách thức lớn trong việc phát triển các xét nghiệm chẩn đoán hiệu quả. Các chủng S. suis khác nhau có thể có các biến thể di truyền khác nhau, dẫn đến sự khác biệt về kháng nguyên. Điều này có thể làm giảm khả năng phát hiện của các xét nghiệm dựa trên kháng thể hoặc PCR. Do đó, cần phải lựa chọn các mục tiêu di truyền hoặc kháng nguyên bảo tồn để phát triển các xét nghiệm có thể phát hiện được nhiều chủng S. suis khác nhau.

2.2. Phân Biệt S. Suis Type 2 Với Các Type Huyết Thanh Khác

Việc phân biệt S. suis type 2 với các type huyết thanh khác là rất quan trọng, vì mỗi type huyết thanh có thể có độc lực và khả năng gây bệnh khác nhau. Các xét nghiệm chẩn đoán cần phải có độ đặc hiệu cao để tránh phản ứng chéo với các type huyết thanh khác. Điều này đòi hỏi việc sử dụng các kháng thể hoặc mồi PCR đặc hiệu cho S. suis type 2. Ngoài ra, cần phải có các quy trình kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt để đảm bảo tính chính xác của các xét nghiệm.

III. Phương Pháp Chế Tạo Kit Chẩn Đoán Nhanh S

Nghiên cứu này tập trung vào việc chế tạo kit chẩn đoán nhanh S. suis type 2 dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch (ICT). Kỹ thuật này sử dụng các kháng thể đặc hiệu để phát hiện S. suis type 2 trong mẫu bệnh phẩm. Mẫu bệnh phẩm được nhỏ lên một que thử, sau đó di chuyển dọc theo que thử và tương tác với các kháng thể đã được gắn sẵn. Nếu S. suis type 2 có mặt trong mẫu, nó sẽ tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể, tạo ra một vạch màu trên que thử. Kết quả được đọc bằng mắt thường, cho phép chẩn đoán nhanh chóng và dễ dàng ngay tại hiện trường.

3.1. Sản Xuất Kháng Thể Đặc Hiệu Kháng S. Suis Type 2

Việc sản xuất kháng thể đặc hiệu là một bước quan trọng trong việc chế tạo kit chẩn đoán nhanh. Trong nghiên cứu này, kháng thể được sản xuất bằng cách tiêm kháng nguyên S. suis type 2 vào chuột, sau đó thu thập huyết thanh chứa kháng thể. Kháng thể sau đó được tinh chế để loại bỏ các tạp chất và tăng độ đặc hiệu. Kháng thể đặc hiệu này sẽ được sử dụng để gắn lên hạt nano vàng và màng nitrocellulose trong kit chẩn đoán nhanh.

3.2. Ứng Dụng Kỹ Thuật Sắc Ký Miễn Dịch ICT Trong Kit

Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (ICT) là một kỹ thuật đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả để phát hiện các kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu bệnh phẩm. Trong kit chẩn đoán nhanh S. suis type 2, ICT được sử dụng để phát hiện sự có mặt của S. suis type 2 trong mẫu bệnh phẩm. Mẫu bệnh phẩm được nhỏ lên que thử, sau đó di chuyển dọc theo que thử và tương tác với các kháng thể đã được gắn sẵn. Nếu S. suis type 2 có mặt trong mẫu, nó sẽ tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể, tạo ra một vạch màu trên que thử.

3.3. Sử Dụng Hạt Nano Vàng Để Tăng Độ Nhạy Của Kit

Hạt nano vàng được sử dụng để tăng độ nhạy của kit chẩn đoán nhanh. Hạt nano vàng có kích thước rất nhỏ và có khả năng khuếch đại tín hiệu màu. Trong kit chẩn đoán nhanh, kháng thể đặc hiệu được gắn lên hạt nano vàng. Khi S. suis type 2 có mặt trong mẫu, nó sẽ liên kết với kháng thể trên hạt nano vàng, tạo ra một phức hợp có màu sắc rõ ràng, giúp dễ dàng phát hiện bằng mắt thường.

IV. Đánh Giá Độ Nhạy Và Độ Đặc Hiệu Của Kit Chẩn Đoán

Sau khi chế tạo kit chẩn đoán nhanh, cần phải đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kit để đảm bảo tính chính xác và tin cậy. Độ nhạy là khả năng của kit để phát hiện S. suis type 2 trong mẫu bệnh phẩm, ngay cả khi nồng độ vi khuẩn rất thấp. Độ đặc hiệu là khả năng của kit để phân biệt S. suis type 2 với các vi khuẩn khác. Việc đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu được thực hiện bằng cách sử dụng các mẫu bệnh phẩm đã được xác định dương tính hoặc âm tính với S. suis type 2 bằng phương pháp PCR.

4.1. So Sánh Kết Quả Kit Với Phương Pháp PCR

Để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kit chẩn đoán nhanh, kết quả của kit được so sánh với kết quả của phương pháp PCR, phương pháp được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán S. suis. Các mẫu bệnh phẩm được xét nghiệm bằng cả hai phương pháp, và kết quả được so sánh để xác định tỷ lệ dương tính thật, âm tính thật, dương tính giả và âm tính giả. Từ đó, tính toán độ nhạy và độ đặc hiệu của kit.

4.2. Xác Định Ngưỡng Phát Hiện Của Kit Chẩn Đoán Nhanh

Ngưỡng phát hiện của kit chẩn đoán nhanh là nồng độ vi khuẩn tối thiểu mà kit có thể phát hiện được. Để xác định ngưỡng phát hiện, các mẫu bệnh phẩm chứa S. suis type 2 với các nồng độ khác nhau được xét nghiệm bằng kit. Nồng độ thấp nhất mà kit có thể phát hiện được được coi là ngưỡng phát hiện của kit. Ngưỡng phát hiện càng thấp, độ nhạy của kit càng cao.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Kit Chẩn Đoán Nhanh S

Kit chẩn đoán nhanh S. suis type 2 có nhiều ứng dụng thực tiễn trong công tác phòng chống dịch bệnh. Kit có thể được sử dụng để chẩn đoán nhanh S. suis type 2 tại các trang trại chăn nuôi, lò mổ và phòng khám thú y. Việc chẩn đoán nhanh giúp phát hiện sớm các trường hợp nhiễm bệnh, từ đó có thể áp dụng các biện pháp can thiệp kịp thời để ngăn chặn sự lây lan của bệnh. Ngoài ra, kit còn có thể được sử dụng để giám sát dịch bệnh và đánh giá hiệu quả của các biện pháp phòng chống dịch bệnh.

5.1. Chẩn Đoán Nhanh Tại Trang Trại Chăn Nuôi Lợn

Kit chẩn đoán nhanh có thể được sử dụng trực tiếp tại trang trại chăn nuôi lợn để phát hiện sớm các trường hợp nhiễm S. suis type 2. Việc chẩn đoán nhanh giúp người chăn nuôi có thể cách ly lợn bệnh, điều trị bằng kháng sinh và áp dụng các biện pháp vệ sinh phòng bệnh để ngăn chặn sự lây lan của bệnh trong đàn. Điều này giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh gây ra.

5.2. Giám Sát Dịch Bệnh Liên Cầu Lợn Tại Lò Mổ

Kit chẩn đoán nhanh có thể được sử dụng tại các lò mổ để giám sát tình hình nhiễm S. suis type 2 ở lợn. Việc giám sát giúp phát hiện các lô lợn bị nhiễm bệnh, từ đó có thể áp dụng các biện pháp kiểm soát chất lượng thịt và đảm bảo an toàn thực phẩm. Ngoài ra, giám sát dịch bệnh còn giúp theo dõi sự biến đổi của vi khuẩn và đánh giá hiệu quả của các biện pháp phòng chống dịch bệnh.

VI. Kết Luận Và Hướng Phát Triển Kit Chẩn Đoán S

Nghiên cứu này đã thành công trong việc chế tạo kit chẩn đoán nhanh S. suis type 2 dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch. Kit có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, dễ sử dụng và cho kết quả nhanh chóng. Kit có nhiều ứng dụng thực tiễn trong công tác phòng chống dịch bệnh. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để cải tiến kit, tăng độ nhạy và độ đặc hiệu, giảm giá thành và mở rộng phạm vi ứng dụng. Ngoài ra, cần nghiên cứu để phát triển các kit chẩn đoán nhanh cho các bệnh khác ở lợn, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

6.1. Đánh Giá Ưu Điểm Của Kit Chẩn Đoán Nhanh

Kit chẩn đoán nhanh S. suis type 2 có nhiều ưu điểm so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống. Kit cho kết quả nhanh chóng, dễ sử dụng, không đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có kinh nghiệm. Kit có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp phát hiện chính xác các trường hợp nhiễm bệnh. Kit có giá thành hợp lý, phù hợp với điều kiện kinh tế của nhiều trang trại chăn nuôi.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Kit Trong Tương Lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để cải tiến kit chẩn đoán nhanh S. suis type 2. Cần nghiên cứu để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của kit, giảm giá thành và mở rộng phạm vi ứng dụng. Ngoài ra, cần nghiên cứu để phát triển các kit chẩn đoán nhanh cho các bệnh khác ở lợn, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Cần tập trung vào việc sử dụng các công nghệ mới như công nghệ nano, công nghệ sinh học phân tử để phát triển các kit chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh liên cầu khuẩn lợn do Streptococcus suis (S. suis), đặc biệt là Streptococcus suis type 2, là một trong những bệnh truyền lây nguy hiểm giữa động vật và người. Vi khuẩn này cư trú chủ yếu ở đường hô hấp trên, hạch amidan và đường tiêu hóa của lợn. Khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ, vi khuẩn có thể gây ra các bệnh cảnh nghiêm trọng như viêm màng não mủ, nhiễm trùng huyết, viêm nội tâm mạc, viêm khớp và viêm phổi. Ở người, bệnh lây truyền chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp với lợn bệnh hoặc sử dụng các sản phẩm thịt lợn chưa nấu chín kỹ, dẫn đến nguy cơ tử vong cao hoặc để lại di chứng thần kinh nặng nề như điếc hoàn toàn, suy giảm thính lực.

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy vi sinh vật đòi hỏi nhiều thời gian, trong khi kỹ thuật sinh học phân tử như phản ứng chuỗi polymerase (PCR) hay xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) đòi hỏi phòng thí nghiệm hoàn chỉnh, trang thiết bị chuyên dụng và kỹ thuật viên có tay nghề. Khoảng trống nghiên cứu được xác định là tại Việt Nam chưa có nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh (KIT) tại thực địa dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch (Immunochromatographic test - ICT) để phát hiện trực tiếp kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus suis type 2 trên đàn lợn.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án:

1. Chế tạo được KIT phục vụ công tác chẩn đoán nhanh vi khuẩn Streptococcus suis type 2 (Streptococcosis) ở lợn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Đàn lợn tại các lò giết mổ; chủng vi khuẩn Streptococcus suis type 2 phân lập từ dịch mũi lợn; kháng thể đa dòng và hạt nano vàng dùng trong chế tạo que thử.
• Phạm vi không gian: Các lò giết mổ lợn trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế (Bạch Yến, Bãi Dâu, Xuân Phú); Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin, Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế.
• Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai thực hiện từ tháng 12/2014 đến tháng 12/2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn Streptococcus suis:

• Nghiên cứu quốc tế: Windsor and Elliott (1975) đã xác định nhóm liên cầu tương ứng với nhóm R của Moor và đề xuất tên gọi Streptococcus suis type 2. Các khảo sát về dịch tễ và tỷ lệ phân lập được công bố bởi Higgins and Gottschalk (2001) tại Canada (dưới 25%), Kataoka et al. (1993) tại Nhật Bản (28%), Smith et al. (1999) và Gottschalk et al. (2007) tại châu Âu. Trường hợp bệnh ở người được ghi nhận đầu tiên tại Đan Mạch bởi Perch et al. (1968), sau đó là các tổng hợp ca bệnh của Sihvonen et al. (1988) và Touil et al. (1988). Về mặt chẩn đoán và miễn dịch học, Silva et al. (2006) thiết kế cặp mồi CPS2 đặc hiệu khuếch đại đoạn gen 498 bp; Tran Vu Thieu Nga et al. (2011) ứng dụng Real-time PCR phát hiện vi khuẩn trong dịch não tủy; Yang et al. (2007) phát triển kỹ thuật sắc ký miễn dịch phát hiện kháng thể kháng S. suis type 2 dựa trên vỏ polysaccharide; Ju et al. (2010) chế tạo que thử nhanh phát hiện vi khuẩn S. suis type 2. Các nghiên cứu kháng nguyên bề mặt và vắc xin tái tổ hợp được triển khai bởi Li et al. (2006, 2011) và Tan et al. (2008a, 2008b, 2009).
• Nghiên cứu trong nước: Nguyễn Vĩnh Phước (1987), Nguyễn Như Thanh và cs. (2001), Phạm Sĩ Lăng và cs. (2002), Lê Văn Tạo (2005, 2007) đã khảo sát sự lưu hành, nơi cư trú và phương thức truyền lây của vi khuẩn trên đàn lợn. Tại Thừa Thiên Huế, Bùi Thị Hiền và cs. (2017) ghi nhận tỷ lệ nhiễm S. suis trên lợn khỏe là 17,31%. Về ứng dụng sắc ký miễn dịch tại Việt Nam, Đinh Thị Bích Lân và cs. (2009) chế tạo KIT phát hiện kháng thể Toxoplasma gondii; Nguyễn Hoàng Lộc và cs. (2015) chế tạo KIT phát hiện kháng nguyên F4 của E. coli; Phạm Đức Minh và Hoàng Văn Lương (2016) nghiên cứu KIT phát hiện độc tố Vibrio cholerae; Nguyễn Thị Tâm Thư và cs. (2016) phát hiện E. coli trong nước thải.

Vị trí của luận án: Kế thừa các nguyên lý tạo dòng phân tử và sắc ký miễn dịch bằng hạt nano vàng, luận án giải quyết khoảng trống thực tiễn tại Việt Nam bằng việc thiết lập quy trình hoàn chỉnh từ phân lập chủng thực địa, tạo kháng nguyên bất hoạt, sản xuất kháng thể đa dòng tinh sạch trên chuột, cộng hợp nano vàng đến lắp ráp và đánh giá bộ KIT chẩn đoán nhanh S. suis type 2.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

• Cấu trúc sinh học và kháng nguyên: S. suis là cầu khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, không di động, không sinh nha bào, phản ứng catalase (-), oxidase (-), indol (-). Phân loại huyết thanh học dựa trên polysaccharide vỏ bọc giáp mô chia thành 35 type, trong đó type 2 có độc lực cao nhất. Gen mã hóa 6-phosphogluconate-dehydrogenase (6PGD) là gen bảo thủ có vai trò hỗ trợ bám dính vào tế bào biểu mô vật chủ.
• Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (ICT): Dựa trên nguyên lý dòng chảy mao dẫn và phản ứng kết hợp đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể dạng "sandwich". Cấu trúc que thử gồm màng nitrocellulose (NC), đệm mẫu (sample pad), đệm cộng hợp (conjugate pad chứa phức hợp hạt nano vàng - kháng thể 1) và đệm hút (adsorbent pad). Kháng thể 2 được cố định tại vạch kiểm tra (vạch T) để bắt giữ kháng nguyên, trong khi kháng thể kháng IgG chuột (kháng thể 3 tạo trên dê) được cố định tại vạch đối chứng (vạch C).

Phương pháp nghiên cứu

1. Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử:
   • Thu thập dịch mũi lợn khỏe tại các lò mổ bằng tăm bông vô trùng, ủ trong môi trường Brain Heart Infusion (BHI) ở 37°C, 5% CO2 trong 16 giờ.
   • Tách chiết ADN vi khuẩn bằng quy trình ly giải proteinase K và tách chiết Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (P:C:I, tỷ lệ 25:24:1), kết tủa bằng Sodium acetate và isopropanol, rửa bằng ethanol 70%.
   • PCR xác định type 2 bằng cặp mồi CPS2 (CPS2F: 5’-TTTGTCGGGAGGGTTACTTC-3’, CPS2R: 5’-TTTGGAAGCGATTCATCTCC-3’, sản phẩm 498 bp).
   • Nuôi cấy phân lập khuẩn lạc thuần trên môi trường thạch máu cừu 5%, kiểm tra phản ứng sinh hóa, thử nghiệm bile esculin và Kligler Iron Agar.
   • Nhân đoạn gen 6PGD (1428 bp) bằng cặp mồi 6PGDF (5’-GCGGATCCATGACTAAAGCAAATTTTG-3’) và 6PGDR (5’-CCGTCGACCTATTTTGATTCGCTATAC-3’).
   • Tinh sạch sản phẩm PCR bằng KIT Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), gắn vào vector pGEM-T Easy, biến nạp vào tế bào khả biến E. coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt (42°C trong 45 giây), chọn lọc khuẩn lạc trắng trên môi trường Ampicillin/X-gal/IPTG, giải trình tự trên máy 3031 Analysis và phân tích bằng phần mềm BioEdit.
2. Sản xuất kháng nguyên và kháng thể:
   • Nhân sinh khối chủng phân lập trong môi trường Todd Hewitt Broth (THB), bất hoạt bằng formaldehyde 1% ở 37°C trong 7 ngày để thu nhận kháng nguyên thô.
   • Gây miễn dịch trên chuột nhắt trắng Swiss albino (SA) 10 tuần tuổi (30-32g/con) qua đường màng bụng (tiêm phúc mạc). Thử nghiệm các liều kháng nguyên (1x10^8, 1,5x10^8, 2x10^8 CFU/chuột) và các chất bổ trợ (Freund, Montanide ISA 201 VG, Montanide ISA 50V2).
   • Thu nhận huyết thanh, tinh sạch kháng thể IgG bằng bộ KIT Econo-Pac Protein A (Bio-Rad). Định lượng protein kháng thể bằng phương pháp Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo) và kiểm tra độ tinh sạch qua điện di SDS-PAGE 15% nhuộm Coomassie Blue R250.
   • Xác định hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ELISA gián tiếp, đọc mật độ quang ở bước sóng 492 nm.
3. Chế tạo conjugate và lắp ráp KIT chẩn đoán:
   • Tối ưu hóa điều kiện gắn kháng thể với hạt nano vàng (Gold colloid 40 nm, DCN): khảo sát dải pH từ 6,0 đến 9,5 và nồng độ kháng thể từ 0 đến 600 µg/ml trong môi trường NaCl 10%, đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 520 nm.
   • Cố định kháng thể cộng hợp lên đệm conjugate bằng dung dịch đệm chứa 10 mM Tris-HCl (pH 8,2), 1% BSA và 5% sucrose.
   • Phun kháng thể bắt vi khuẩn tại vạch T và kháng thể dê kháng chuột tại vạch C lên màng nitrocellulose bằng máy phun tự động Biodot XYZ3060D0003; cắt dải que thử bằng máy Strip Guillotine Cutter ZQ4000.
   • Đánh giá giới hạn phát hiện (độ nhạy phân tích), kiểm tra phản ứng chéo với E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus ATCC 25923, các chủng S. suis không phải type 2; đối chiếu độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán với phương pháp PCR.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện các cơ sở lý luận và tài liệu khoa học liên quan đến đề tài. Tác giả phân tích nguồn gốc, đặc tính sinh học của vi khuẩn Streptococcus suis, các dạng dung huyết (alpha, beta, gamma) trên thạch máu cừu và các yếu tố độc lực bao gồm cấu trúc kháng nguyên thân, kháng nguyên giáp mô polysaccharide và kháng nguyên bám dính fimbriae mang Lipoteichoic acid (LTA). Phần bệnh lý học làm rõ cơ chế gây bệnh trên lợn và khả năng lây truyền sang người qua đường niêm mạc, vết thương trầy xước và tiêu hóa. Chương này cũng phân tích chi tiết các kỹ thuật chẩn đoán hiện hành (nhuộm soi, sinh hóa, PCR, Real-time PCR, ELISA), đồng thời nêu bật nguyên lý hóa lý của hạt nano vàng và cơ chế mao dẫn trong kỹ thuật sắc ký miễn dịch dạng que thử nhanh (ICT).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết vật liệu sinh học, hóa chất, thiết bị và các quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa. Các công cụ chính gồm có hệ thống máy nhân gen PTC-100, máy đọc ELISA BIO-RAD Coda, thiết bị phun màng tự động Biodot XYZ3060D0003, vector tạo dòng pGEM-T Easy và tế bào khả biến E. coli TOP10. Các bước phân lập từ dịch mũi lợn, ly giải ADN bằng hệ đệm Tris-HCl/Tween-20/Triton X-100 kết hợp Proteinase K, chu trình nhiệt PCR cho mồi CPS2 (30 chu kỳ: 94°C/90s, 58°C/45s, 72°C/1min) và mồi 6PGD (30 chu kỳ: 94°C/90s, 55°C/45s, 72°C/1min), quy trình gây tối miễn dịch chuột Swiss albino và phương pháp xác định điểm cắt (Cut-off) trong ELISA gián tiếp được trình bày đầy đủ, tạo căn cứ thực nghiệm cho các chương sau.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm qua 4 nội dung chính:

1. Phân lập chủng và phân tích sinh học phân tử:
   • Khảo sát 300 mẫu dịch mũi lợn khỏe tại 3 cơ sở giết mổ trên địa bàn Thừa Thiên Huế bằng PCR với cặp mồi CPS2 cho thấy tỷ lệ nhiễm S. suis type 2 trung bình là 9,00%.
   • Chủng phân lập được đặt tên là TTHSS2. Kết quả giải trình tự gen 6PGD cho thấy đoạn gen có chiều dài 1428 bp, độ tương đồng 99% khi so sánh với trình tự của chủng S. suis type 2 SC 19 trên ngân hàng gen NCBI (mã số gb|CP000407).
   • Chủng TTHSS2 được bất hoạt hoàn toàn bằng dung dịch formaldehyde 1% ở 37°C trong 7 ngày, đảm bảo tính an toàn sinh học khi cấy kiểm tra trên thạch máu cừu 5% không thấy vi khuẩn mọc.

Địa điểm thu mẫu	Số mẫu kiểm tra	Số mẫu dương tính	Tỷ lệ nhiễm (%)
Lò mổ Bạch Yến	120	16	13,33
Lò mổ Bãi Dâu	120	9	7,50
Lò mổ Xuân Phú	60	4	6,67
Tổng cộng	300	27	9,00

2. Chế tạo và tinh sạch kháng thể đa dòng:

   • Thử nghiệm trên chuột Swiss albino xác định liều kháng nguyên tối ưu để gây đáp ứng miễn dịch là 1,5x10^8 CFU/chuột.
   • Chất bổ trợ Freund (Freund complete cho mũi 1; Freund incomplete cho mũi 2 và 3) tạo đáp ứng miễn dịch cao nhất và ổn định nhất so với Montanide ISA 201 VG và Montanide ISA 50V2.
   • Tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh chuột bằng cột Econo-Pac Protein A. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy hai băng protein rõ nét tương ứng với chuỗi nặng (khoảng 50 kDa) và chuỗi nhẹ (khoảng 25 kDa).
   • Hàm lượng protein kháng thể sau tinh sạch dao động trong khoảng từ 100 µg/ml đến 2000 µg/ml. Hiệu giá kháng thể đo bằng ELISA gián tiếp ở nồng độ 1000 µg/ml đạt từ 7log2 đến 8log2.

3. Chế tạo kháng thể cộng hợp nano vàng (conjugate):

   • Thử nghiệm độ bền hạt keo vàng nano trong môi trường NaCl 10% xác định được pH tối ưu của dung dịch gold colloid để liên kết bền vững với kháng thể là pH 8,0.
   • Nồng độ kháng thể kháng S. suis type 2 tối thiểu cần thiết để bảo vệ hạt nano vàng không bị ngưng kết đổi màu là 360 µg/ml.
   • Phức hợp nano vàng - kháng thể được ổn định bằng dung dịch đệm bổ sung 1% BSA và 5% sucrose, đảm bảo tái phân tán nhanh trên màng conjugate khi tiếp xúc dung dịch mẫu.

4. Đánh giá các chỉ tiêu kỹ thuật của que thử nhanh:

   • Nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn thích hợp nhất để phun lên vạch kiểm tra (vạch T) của màng nitrocellulose là 2000 µg/ml (tương đương 2 mg/ml).
   • Giới hạn phát hiện tối thiểu (độ nhạy phân tích) của KIT là 5x10^6 CFU/ml (tương ứng với 5x10^5 CFU có trong 100 µl thể tích mẫu thử).
   • Thử nghiệm độ đặc hiệu xác nhận KIT không xuất hiện vạch T đối với các chủng vi khuẩn đối chứng gồm Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus ATCC 25923 và các chủng liên cầu khuẩn lợn không thuộc type 2.
   • Khi tiến hành thử nghiệm song song trên các mẫu thực địa và đối chiếu với kết quả của phương pháp PCR chuẩn, bộ KIT đạt độ nhạy chẩn đoán 93,33% và độ đặc hiệu chẩn đoán đạt 100,00%. Toàn bộ thời gian hiển thị kết quả của que thử diễn ra trong khoảng từ 5 đến 10 phút.

Chỉ tiêu kỹ thuật	Kết quả đạt được của luận án
Kích thước hạt nano vàng cộng hợp	40 nm
pH tối ưu của dung dịch keo vàng	pH 8,0
Nồng độ kháng thể cộng hợp nano vàng	360 µg/ml
Nồng độ kháng thể bắt tại vạch T	2000 µg/ml
Ngưỡng phát hiện vi khuẩn tối thiểu	5x10^6 CFU/ml (5x10^5 CFU/100 µl mẫu)
Phản ứng chéo với vi khuẩn khác	Không (E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, S. suis non-type 2)
Độ nhạy chẩn đoán so với PCR	93,33%
Độ đặc hiệu chẩn đoán so với PCR	100,00%
Thời gian đọc kết quả	5 – 10 phút

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học lý luận

• Cung cấp dữ liệu dịch tễ học phân tử đầu tiên về tỷ lệ lưu hành của vi khuẩn Streptococcus suis type 2 trên đàn lợn khỏe tại các lò giết mổ tập trung ở tỉnh Thừa Thiên Huế với tỷ lệ nhiễm ghi nhận là 9,00%.
• Xác định đầy đủ đặc tính sinh học phân tử của đoạn gen bảo thủ 6PGD (kích thước 1428 bp) từ chủng thực địa TTHSS2, chứng minh mức độ tương đồng 99% so với chủng chuẩn quốc tế SC 19 (gb|CP000407).
• Chuẩn hóa các thông số kỹ thuật tạo phức hợp miễn dịch nano vàng: pH dung dịch gold colloid 8,0 và nồng độ kháng thể 360 µg/ml, đóng góp cơ sở dữ liệu cho việc phát triển các bộ kit sắc ký miễn dịch phát hiện kháng nguyên vi khuẩn Gram dương.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

• Đã chế tạo thành công bộ sinh phẩm KIT chẩn đoán nhanh dạng que thử sắc ký miễn dịch một bước, có khả năng phát hiện trực tiếp vi khuẩn Streptococcus suis type 2 mà không cần thiết bị phức tạp.
• Sản phẩm đạt độ nhạy tương đương với công trình nghiên cứu của Ju et al. (2010), có độ đặc hiệu 100,00% và độ nhạy 93,33% so với PCR, cho kết quả rõ ràng trong vòng 5-10 phút. Bộ KIT đáp ứng trực tiếp nhu cầu kiểm soát dịch tễ tại các lò giết mổ, trang trại chăn nuôi và hỗ trợ phân loại lâm sàng nhanh.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đề xuất ứng dụng quy trình sản xuất kháng thể và que thử nhanh để tiếp tục nghiên cứu chế tạo các bộ KIT phát hiện các type huyết thanh nguy hiểm khác của liên cầu khuẩn lợn hoặc các vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp khác ở vật nuôi.
• Đề nghị đưa sản phẩm que thử nhanh vào áp dụng thử nghiệm diện rộng trong công tác kiểm dịch thú y tại các trạm kiểm soát giết mổ nhằm sàng lọc sớm nguồn lợn mang trùng, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Văn bản luận án cho thấy một số giới hạn và định hướng mở rộng:

• Hạn chế: Nghiên cứu chỉ tập trung khảo sát tình hình nhiễm và thu thập mẫu trên đối tượng lợn khỏe tại địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế trong giai đoạn 2014-2017; bộ KIT được thiết kế đặc hiệu cho Streptococcus suis type 2 mà chưa tích hợp đa type trên cùng một dải thử.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng phạm vi đánh giá que thử trên các đàn lợn bệnh có triệu chứng thần kinh, khớp tại nhiều vùng sinh thái khác nhau; phát triển que thử đa vạch có thể phát hiện đồng thời type 2, type 1 và type 1/2; đánh giá độ ổn định và thời hạn bảo quản của que thử ở các điều kiện nhiệt độ môi trường thực tế kéo dài.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng và tham khảo đối với nhiều đối tượng:

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Thú y, Bệnh lý học vật nuôi, Công nghệ sinh học: Tham khảo chi tiết quy trình tạo dòng TA gen 6PGD, kỹ thuật gây tối miễn dịch chuột nhắt trắng Swiss albino, quy trình tinh sạch kháng thể IgG bằng sắc ký ái lực Protein A và phương pháp xác định điểm ngưng kết keo vàng nano.
• Cán bộ kiểm dịch, bác sĩ thú y thực địa và nhà quản lý dịch tễ: Ứng dụng quy trình sàng lọc mẫu dịch mũi bằng que thử sắc ký miễn dịch để phát hiện nhanh lợn mang mầm bệnh tại các lò giết mổ và trang trại chăn nuôi tập trung mà không phụ thuộc vào thiết bị phòng xét nghiệm.
• Phần đáng tham khảo nhất: Quy trình công nghệ tại Chương 2 và các thông số tối ưu hóa tại Chương 3 về tỷ lệ phối trộn tá dược Freund, điều kiện cố định kháng thể lên màng nitrocellulose bằng máy Biodot và kỹ thuật gắn hạt nano vàng 40 nm ở pH 8,0.

Câu hỏi thường gặp

1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Streptococcus suis type 2 tại các lò mổ ở Thừa Thiên Huế được xác định là bao nhiêu?

Theo kết quả xét nghiệm PCR với cặp mồi đặc hiệu CPS2 trên 300 mẫu dịch mũi lợn khỏe, tỷ lệ nhiễm trung bình trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế là 9,00%. Trong đó, lò mổ Bạch Yến có tỷ lệ nhiễm cao nhất là 13,33% (16/120 mẫu), tiếp theo là lò mổ Bãi Dâu với 7,50% (9/120 mẫu) và lò mổ Xuân Phú là 6,67% (4/60 mẫu).

2. Gen nào được lựa chọn để phân tích đặc tính sinh học phân tử của chủng phân lập và kích thước là bao nhiêu?

Tác giả lựa chọn gen bảo thủ mã hóa enzyme 6-phosphogluconate-dehydrogenase (6PGD) hỗ trợ khả năng bám dính của vi khuẩn vào vật chủ. Đoạn gen này được nhân bản bằng cặp mồi đặc hiệu 6PGDF/6PGDR, có độ dài 1428 bp và đạt độ tương đồng 99% so với trình tự của chủng chuẩn S. suis type 2 SC 19 (gb|CP000407) trên ngân hàng gen NCBI.

3. Điều kiện tối ưu để gây tối miễn dịch trên chuột Swiss albino thu nhận kháng thể là gì?

Liều lượng kháng nguyên bất hoạt formaldehyde 1% thích hợp nhất là 1,5x10^8 CFU/chuột. Chất bổ trợ tối ưu là Freund (sử dụng Freund's complete adjuvant cho mũi tiêm thứ nhất, Freund's incomplete adjuvant cho mũi tiêm thứ 2 và 3) với tổng thể tích tiêm phúc mạc là 400 µl/chuột (gồm 200 µl dịch kháng nguyên phối trộn cùng 200 µl chất bổ trợ).

4. Các thông số kỹ thuật cốt lõi để chế tạo que thử sắc ký miễn dịch nano vàng trong luận án là gì?

Dung dịch keo vàng nano (kích thước hạt 40 nm) đạt trạng thái gắn kết tối ưu ở pH 8,0 với nồng độ kháng thể tối thiểu là 360 µg/ml. Nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn phun tại vạch kiểm tra (vạch T) trên màng nitrocellulose là 2000 µg/ml (2 mg/ml).

5. Ngưỡng phát hiện và độ chính xác chẩn đoán của KIT chẩn đoán nhanh đạt mức nào khi so sánh với PCR?

Ngưỡng phát hiện tối thiểu của que thử là 5x10^6 CFU/ml (tương đương 5x10^5 CFU trong 100 µl mẫu thử). So với phương pháp PCR chuẩn, que thử đạt độ nhạy chẩn đoán là 93,33%, độ đặc hiệu chẩn đoán là 100,00% và không có hiện tượng phản ứng chéo với các vi khuẩn E. coli, P. aeruginosa, S. aureus hay các type S. suis khác. Thời gian đọc kết quả là 5 đến 10 phút.

Kết luận

Luận án của tác giả Lê Quốc Việt đã hoàn thành việc phân lập, định danh phân tử chủng vi khuẩn Streptococcus suis type 2 (TTHSS2) từ đàn lợn tại Thừa Thiên Huế và giải trình tự hoàn chỉnh gen bảo thủ 6PGD dài 1428 bp. Nghiên cứu đã xác lập quy trình công nghệ chuẩn để sản xuất kháng thể đa dòng tinh sạch trên chuột Swiss albino và chế tạo thành công que thử sắc ký miễn dịch hạt nano vàng 40 nm. Bộ KIT chẩn đoán nhanh đạt độ đặc hiệu 100,00%, độ nhạy 93,33% so với PCR, cho phép xác định vi khuẩn ở ngưỡng 5x10^6 CFU/ml trong thời gian 5-10 phút, mang lại công cụ kiểm soát dịch bệnh hiệu quả tại thực địa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ QUỐC VIỆT NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 Ở LỢN Ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9 64 01 02 Người hướng dẫn: PGS. Đinh Thị Bích Lân PGS. Bùi Trần Anh Đào NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày… tháng… năm 2020 Tác giả luận án Lê Quốc Việt i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS. Đinh Thị Bích Lân và PGS. Bùi Trần Anh Đào đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Đặc biệt, tôi xin chân thành cám ơn tác giả Hoàng Thị Thùy Nhung, Đinh Thị Bích Lân, Đặng Thanh Long, Huỳnh Văn Chương, Lê Công Thịnh, Phùng Thăng Long, Nguyễn Xuân Hòa, Lê Đức Thạo và Bùi Trần Anh Đào đã cho phép tôi sử dụng kết quả nghiên cứu đã công bố vào một phần nội dung của luận án. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án.

Hà Nội, ngày. năm 2020 Tác giả luận án Lê Quốc Việt ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan. ii Mục lục .iii Danh mục chữ viết tắt. v Danh mục bảng.

vi Danh mục hình. vii Trích yếu luận án. ix Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài. Phạm vi nghiên cứu. Những đóng góp mới của đề tài. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.

Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. Tổng quan tài liệu. Tổng quan tình hình nghiên cứu.

Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trên thế giới. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước. Một số đặc tính của liên cầu khuẩn lợn. Đặc điểm hình thái.

Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa. Sức đề kháng. Cấu trúc kháng nguyên. Khả năng gây bệnh.

Triệu chứng và bệnh tích của bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra. Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn.

Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở người. Chẩn đoán bằng phương pháp PCR. Chẩn đoán bằng phương pháp ELISA.

Điều trị bằng thuốc kháng sinh .