CHƯƠNG 1. Giới thiệu chung Nhóm chất trong phân tử có vòng benzen đính hai nhóm hydroxyl (nhóm catechol) và một nhóm amin được gọi là nhóm catecholamin. Dopamin (DA) chính là catecholamin với công thức hóa học đơn giản nhất, công thức phân tử của dopamin C6H3(OH)2-CH2-CH2-NH2, danh pháp hoá học theo IUPAC là 4- (2-aminoetyl) benzen-1,2-diol. Dopamin cũng thuộc nhóm các chất phenetylamin (chứa vòng benzen và nhóm amin) là nhóm các dược chất liên quan đến bệnh thần kinh.
Tên gọi dopamin xuất phát do là một monoamin và là tiền chất của 3,4-dihydroxyphenylalanin (levodopamin hoặc L-DOPA). OH OH HO HO HO NH2 HO HN NH2 HO CH3 HO Dopamin Epinephrin Norepinephrin (Adrenalin) (Noradrenalin) Hình 1. Các chất quan trọng trong sinh hóa thuộc nhóm catecholamin DA có khối lượng mol phân tử 153,178 g/ mol, tan hoàn toàn trong nước và trong etanol 95 %; không tan trong ete, ete dầu hỏa, clorofoc, benzen và toluen. DA bị phân hủy bởi ánh sáng và oxi trong không khí.
Trong dung dịch nước DA có hằng số phân ly pKa = 8,93. Trong dung dịch trung hòa hoặc axit DA tồn tại ở dạng kết hợp với proton, tương đối dễ tan và bền vững. Trong môi trường kiềm, DA phân ly proton và tồn tại ở trạng thái khó tan, dễ dàng bị oxi hóa bởi oxi không khí. Trong thực tế dạng hóa chất hoặc dược phẩm thường được sử dụng là dopamin hydroclorua (DA.HCl), tức là dạng muối hydroclorua do dopamin kết hợp với axit clohydric.
Ở trạng thái khô DA.HCl dạng bột không màu, khi hòa tan trong nước dung dịch tạo thành có pH axit nhẹ nên 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com dung dịch tương đối bền. Trong cơ thể dưới tác dụng xúc tác của enzym monoamin oxidaza, dopamin bị oxi hóa. DA cũng tự oxi hóa ở điều kiện thường, phản ứng trực tiếp với oxi tạo thành quinon và các gốc tự do. Tốc độ oxi hóa có thể tăng do sự có mặt muối sắt (II), kiềm hoặc các tác nhân oxi hóa khác.
Trong điều kiện thích hợp DA có thể polime hóa hình thành hạt kích thước nano hoặc lớp phủ polidopamin thuộc loại melanin (nhóm các polime tạo sắc tố) với nhiều tính chất lý hóa hữu ích như làm lớp chắn ánh sáng, bao phim dược phẩm, chế tạo cảm biến sinh học [90]. DA được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1910, được phân tích xác định tồn tại trong não người vào năm 1957. Ngày nay, DA được tổng hợp trong phòng thí nghiệm từ phản ứng demetyl hóa 3,4-dimethoxyphenethylamin với hydro bromua [31]. O NH2 HO NH2 H3C HBr H3C O HO 3,4-dimethoxyphenethylamin Dopamin Hình 1.
Phản ứng tổng hợp DA trong phòng thí nghiệm DA được sử dụng trong y học làm thuốc chống sốc do nhồi máu cơ tim, chấn thương, nhiễm khuẩn huyết và trong phẫu thuật tim làm thuốc tăng co cơ tim. DA thường được coi là thuốc thông dụng trong liệu pháp hàng đầu điều trị suy tim. DA được sử dụng dạng thuốc tiêm với nồng độ DA.HCl 40 mg/mL, 80 mg/mL và 160 mg/mL. Vai trò của dopamin trong cơ thể Năm 1952, Arvid Carlsson và Nils-Åke Hillarp đã chứng minh DA không chỉ là tiền chất của các chất là norepinephrin (noradrenalin) và epinephrin (adrenalin) mà còn là chất dẫn truyền thần kinh quan trọng trong chu trình tổng hợp sinh hóa.
Năm 2000, Carlsson được nhận giải thưởng Nobel sinh lý học và y khoa vì phát hiện này. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trong cơ thể DA được tổng hợp từ các axit amin tiền chất là tyrosin và là chất trung gian để tổng hợp noradrenalin. DA được tìm thấy với nồng độ cao trong tủy thượng thận, não và nhân đuôi (thuộc hạch đáy, liên quan tới việc điều chỉnh các cử động tự ý ở mức độ tiềm thức). DA tạo cảm giác hưng phấn trong não.
Nó cung cấp thông tin liên lạc giữa các tế bào thần kinh cũng như giữa các tế bào thần kinh và tế bào cơ bắp. DA ức chế một số loại nơron và kích thích một số khác. DA là chất ức chế chính của sự tiết prolactin ở tuyến phía trước tuyến yên. Trong thùy trán, dopamin kiểm soát dòng chảy của các thông tin từ các khu vực trong não.
DA có vai trò tích cực trong hành vi và nhận thức, động lực, trừng phạt, phấn khích. Nó đóng vai trò chủ chốt đối với những trải nghiệm của chúng ta về sự vui thú và nỗi đau, liên quan đến khao khát, sự nghiện ngập, và được sản sinh khi cơ thể ở trong trạng thái khỏe mạnh, sảng khoái, vui vẻ. DA cũng liên quan đến quá trình hồi tỉnh sau gây mê và hồi phục trí nhớ [25]. Quá trình sinh tổng hợp DA xảy ra trong các nơron và tế bào tủy sống tuyến thượng thận gồm các bước L-phenylalanin → L-tyrosin → L-DOPA → DA.
Như vậy, cơ thể có thể sản sinh DA gián tiếp từ phenylalanin, một loại axit amin cơ thể không thể tự tổng hợp mà phải lấy từ thức ăn, hoặc trực tiếp từ tyrosin là axit amin cơ thể có thể tự tổng hợp. Mặc dù DA có thể tồn tại trong nhiều loại thực phẩm nhưng không thể trực tiếp cung cấp DA cho não bộ do cơ chế tự bảo vệ của màng não. DA không tác dụng khi uống do không thể trực tiếp đi qua màng não mà phải được sinh ra trong não do chuyển hóa từ tiền chất của nó. Khớp thần kinh (synapse) là một khớp nối đặc biệt, qua đó tín hiệu từ tế bào thần kinh sẽ truyền qua một tế bào thần kinh khác cũng như qua một loại tế bào không phải là tế bào thần kinh (như tế bào cơ hoặc tế bào tuyến).
Mỗi nơron thần kinh có khả năng sản xuất chỉ một loại chất truyền dẫn thần kinh. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Khớp thần kinh và vai trò truyền dẫn tín hiệu của DA [175] Trong y học, người ta chỉ định xét nghiệm catecholamin để chẩn đoán bệnh u tế bào ưa crôm (pheochromocytoma), là loại u tế bào thận có thể gây chết vì tăng huyết áp và suy tim [78]. Người ta cũng chỉ định xét nghiệm catecholamin đối với trẻ sơ sinh để nhằm phát hiện sớm bệnh u nguyên bào thần kinh (neuroblastoma), là khối u thể rắn ngoài não thường gặp nhất ở trẻ em [129, 150].
Nồng độ catecholamin trong cơ thể rất dễ thay đổi để đáp ứng lại trạng thái hoặc cảm xúc. Nhiệt độ môi trường, mất máu, tập thể thao, hạ đường huyết, thậm chí thay đổi tư thế đứng lên ngồi xuống và ngược lại đều có thể làm cho cơ thể thay đổi nồng độ catecholamin. Các kết quả xét nghiệm đơn bằng lấy mẫu tức thời không chính xác để chẩn đoán bệnh trong y học. Lấy tổng hợp toàn bộ nước tiểu trong vòng 24 giờ (mẫu nước tiểu/ 24 giờ) là giải pháp xét nghiệm nồng độ catecholamin áp dụng trong xét nghiệm y tế.
Kết quả xét nghiệm là manh mối chẩn đoán ban đầu với một số bệnh nguy hiểm. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DA Để xác định DA cũng như các chất thuộc nhóm catecholamin khác trong mẫu sinh học các phương pháp được áp dụng phổ biến nhất gồm sắc ký lỏng ghép nối cảm biến huỳnh quang (HPLC/FL), sắc ký lỏng ghép nối cảm biến điện hóa (HPLC/ECD), sắc ký lỏng ghép nối cảm biến khối phổ (HPLC/MS), 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com và phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) [7, 105]. Trong đó, phương pháp điện hóa với điện cực biến tính được sử dụng cho các phép đo trực tiếp trên cơ thể [43, 65, 89, 115]. Hàm lượng bình thường của DA trong huyết tương và trong nước tiểu/ 24 giờ theo khuyến cáo của các cơ sở y tế và tài liệu tham khảo được chỉ ra ở Bảng 1.
Hàm lượng bình thường dopamin trong mẫu sinh học STT Loại mẫu/ chỉ tiêu Hàm lượng bình thường (DA) 1 Mẫu huyết tương ≤ 100 pg/ mL 2 Mẫu nước tiểu/ 24 giờ ≤ 600 µg/ 24 giờ (3900 nmol/ 24 giờ) 3 Trực tiếp trong cơ thể 10 nM–1 µM [96] Trong cơ thể DA ở ngưỡng nồng độ nanomol và trong hệ thần kinh nồng độ DA liên tục thay đổi bởi nhiều yếu tố phức tạp. Do đó, phân tích dopamin đòi hỏi quy trình đặc biệt, tiêu tốn nhiều thời gian chuẩn bị mẫu cũng như phân tích. Các phương pháp phân tích các catecholamin trong đó có dopamin được thừa nhận gồm phương pháp sắc ký lỏng (LC) với cột tách pha đảo và tác nhân tạo cặp ion ghép nối cảm biến điện hóa (ECD), khối phổ (MS), hoặc huỳnh quang (FL) [126]. Do nền mẫu phức tạp với nhiều thành phần gây nhiễu cho tín hiệu phân tích nên các quy trình xử lý mẫu trước khi mẫu được phân tích sắc ký lỏng thường đòi hỏi khắt khe.
Các phương pháp phân tích catecholamin bị ảnh hưởng bởi các dược phẩm và thức ăn mà người bệnh sử dụng nên khi xét nghiệm việc yêu cầu tránh sử dụng một số chất cũng là cách giúp kết quả chính xác hơn. Phương pháp khối phổ được áp dụng phân tích các catecholamin cho độ chọn lọc cao dựa trên quy trình xử lý mẫu phù hợp và có ưu điểm là độ đặc hiệu cao. Ngoài ra, phương pháp miễn dịch liên kết enzym (ELISA) với ưu điểm thời gian phân tích tương đối nhanh nên được ứng dụng phổ biến trong thực tế để phân tích mẫu máu, mẫu nước tiểu. Các phương pháp phân tích này đều cần các trang thiết bị hiện đại, kinh phí đầu tư ban đầu lớn, chi phí và thời 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com gian chuẩn bị mẫu cao, thử nghiệm viên phải được đào tạo chuyên sâu.
Dưới đây là tổng quan những ưu điểm và hạn chế của từng phương pháp. Phương pháp huỳnh quang Các phân tử catecholamin có nhóm chức phenolic nên có thể trực tiếp phân tích phổ huỳnh quang với bước sóng kích thích và phát xạ tương ứng 280 nm và 310 nm. Phương pháp huỳnh quang chủ yếu được vận dụng để chế tạo đe-tec-tơ ghép nối với các hệ tách chất như sắc ký lỏng, điện di. So với đe-tec- tơ điện hóa, đe-tec-tơ huỳnh quang dễ vận hành và phổ biến hơn.
Để gia tăng độ nhạy và phạm vi ứng dụng, các cột dẫn xuất hóa được sử dụng để dẫn xuất các phân tử catecholamin nhằm gia tăng tính chất huỳnh quang trước khi đi vào hệ phân tích [2, 128, 164]. Đã có rất nhiều thuốc thử huỳnh quang khác nhau được sử dụng để dẫn xuất hóa các catecholamin. Trong hệ thống phân tích, các catecholamin được chạy qua một cột dẫn xuất hóa (còn gọi là tiền cột), tại đây catecholamin được tác dụng với thuốc thử huỳnh quang tạo thành dẫn xuất có huỳnh quang trước khi được tách trong hệ sắc ký lỏng hoặc điện di mao quản và phát hiện ở đe- tec-tơ huỳnh quang.