BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG -----------------*------------------ TRẦN THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KIT LAMP CHẨN ĐOÁN NHIỄM GIUN LƯƠN ĐƯỜNG RUỘT (Strongyloides stercoralis) Ở NGƯỜI 2017-2020 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Hà Nội – Năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KIT LAMP CHẨN ĐOÁN NHIỄM GIUN LƯƠN ĐƯỜNG RUỘT (Strongyloides stercoralis) Ở NGƯỜI 2017-2020 Chuyên ngành: Ký sinh trùng y học Mã số: 62 72 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS. TRẦN XUÂN MAI PGS. NGUYỄN THỊ HƯƠNG BÌNH Hà Nội – Năm 2021 i LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành luận án này, tôi đã được PGS. Trần Xuân Mai và PGS. Nguyễn Thị Hương Bình nhiệt tình hướng dẫn, chỉnh sửa và giúp đỡ trong suốt thời gian qua. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến hai quý thầy cô hướng dẫn của mình. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. Trần Thanh Dương Viện trưởng Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương đã luôn động viên, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành quá trình học. Thầy cũng là chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu chế tạo bộ kít lamp chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ, giun lươn đường ruột tại thực địa”, mã số KC. Một lần nữa tôi xin được cám ơn thầy cùng các thành viên trong đề tài này đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi cũng xin trân trọng cám ơn sự giúp đỡ, nhắc nhở và động viên của PGS. Cao Bá Lợi cùng toàn thể cán bộ Phòng Khoa học – Đào tạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương để tôi có thể từng bước hoàn thành luận án của mình trong thời gian cho phép. Ngoài ra tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến các thầy đã tham gia các hội đồng đánh giá kết quả nghiên cứu và luận án các cấp của tôi. Các thầy đã có rất nhiều đóng góp quý báu, chỉ dẫn giúp tôi hoàn thiện luận án của mình tốt hơn như thầy PGS. Lê Xuân Hùng, PGS. Nguyễn Mạnh Hùng, PGS. Nguyễn Quang Thiều, PGS. Đoàn Huy Hậu, PGS. Nguyễn Khắc Lực, GS. Nguyễn Văn Ba, TS. Nguyễn Thị Hồng Ngọc, TS. Đỗ Trung Dũng, TS. Đỗ Ngọc Ánh, TS. Đỗ Như Bình và TS. Trương Văn Hạnh. ii Tôi xin cám ơn Khoa Sinh học phân tử, Khoa Ký sinh trùng của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; Bộ môn Vi sinh – Ký sinh – khoa Y – Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh, Bộ môn Ký sinh trùng, trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch và Trung tâm y tế huyện và các xã của huyện Đức Hòa, tỉnh Long An đã giúp tôi trong suốt quá trình thu thập mẫu và thực hiện đề tài nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến bố, mẹ, chồng, các con, các anh chị em trong gia đình và bạn bè, đồng nghiệp đã không ngừng động viên, khích lệ, tạo mọi điều kiện giúp tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành luận án. Luận án là bước khởi đầu trong sự nghiệp khoa học của mình, vì vậy những lời cảm ơn này chưa đủ để nói hết những tình cảm thật đáng quý của tất cả mọi người đã bên tôi và giúp đỡ tôi. Tôi sẽ mang theo những tình cảm này trong suốt hành trang cuộc đời mình. Trần Thị Kim Chi iii Luận án này là một nhánh của đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu chế tạo bộ kít lamp chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ, giun lươn đường ruột tại thực địa”, mã số KC. mà tôi là một thành viên tham gia. Tôi xin cam đoan đây các kết quả, số liệu thu được trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ luận án nào khác. Các bước tiến hành thực hiện đề tài đúng như đề cương nghiên cứu, chấp hành đầy đủ các quy định khi tiến hành nghiên cứu. Nếu có sai sót, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả Trần Thị Kim Chi iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Danh mục các từ viết tắt tiếng Việt: Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ADN Acid Deoxy Ribonucleic AIDS Acquired Immunodeficiency Hội chứng suy giảm miễn dịch Syndrome mắc phải AT Ấu trùng ATGL Ấu trùng giun lươn bp Base pair Cặp bazơ nitơ BYT Bộ Y Tế CDC Centers for Disease Control Trung tâm kiểm soát và phòng and Prevention ngừa bệnh tật cox1 Cytochrome c oxydase Tiểu đơn vị 1 enzym Cytochrom subunit 1 C oxidaza CS Cộng sự ĐHYK Đại học y khoa ELISA Enzyme-Linked Xét nghiệm miễn dịch hấp thụ Immunosorbent Assay liên kết Enzyme GL Giun lươn HIV Human Immunodeficiency Virus HTLV-1 Human T-Cell Lymphotropic Virus-1 IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M K Kappa Hệ số Kappa v KHV Kính hiển vi KST Ký sinh trùng KT Kích thước LAMP Loop-Mediated Isothermal Khuếch đại đẳng nhiệt vòng Amplification trung gian LIPA Luciferase Hệ thống kết tủa miễn dịch Immunoprecipitation System Luciferase LIPS Luciferase Xét nghiệm kết tủa miễn dịch Immunoprecipitation Assay Luciferase MG Malachite Green Xanh malachit Multiplex Multiplex Polymerase Chain PCR đa mồi PCR Reaction nested – Nested Polymerase Chain PCR lồng PCR Reaction NPV Negative Predictive Value Giá trị tiên đoán âm PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polymerase PPV Positive Predictive Value Giá trị tiên đoán dương RNA Ribonucleic Acid Se Sensitivity Độ nhạy SHPT Sinh học phân tử Sp Specificity Độ đặc hiệu Tp.HCM Thành phố Hồ Chí Minh WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1 Lịch sử phát hiện, nghiên cứu giun lươn Strongyloides stercoralis .2 Đặc điểm sinh học, bệnh học của giun lươn S.1 Hình thái học .2 Chu kỳ phát triển.3 Triệu chứng của bệnh giun lươn .3 Chẩn đoán và điều trị bệnh giun lươn .1 Định nghĩa ca bệnh do giun lươn Strongyloides stercoralis .2 Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán nhiễm giun lươn .3 Điều trị bệnh giun lươn .4 Tình hình nhiễm giun lươn .1 Tình hình nhiễm giun lươn trên thế giới .2 Tình hình nhiễm giun lươn tại Việt Nam .5 Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng LAMP .1 Lịch sử phát triển LAMP .2 Nguyên lý của kỹ thuật LAMP .3 Ưu, nhược điểm của kỹ thuật LAMP.4 Một số ứng dụng của kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán bệnh ở người .6 Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa bộ kit LAMP chẩn đoán tác nhân gây bệnh .1 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP .2 Chuẩn hóa các điều kiện của phản ứng LAMP .3 Xác định ngưỡng phát hiện, xây dựng chuẩn dương của kỹ thuật.4 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit LAMP .5 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ kit . 33 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .1 Mục tiêu 1: Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người .1 Đối tượng nghiên cứu .2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu .3 Thiết kế nghiên cứu .4 Nội dung nghiên cứu.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu .6 Các chỉ số đánh giá .2 Mục tiêu 2: Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí nghiệm và thực địa .1 Đối tượng nghiên cứu .2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu .3 Thiết kế nghiên cứu .4 Nội dung nghiên cứu.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu .6 Các chỉ số đánh giá .7 Xử lý số liệu .3 Kiểm soát sai số .4 Đạo đức trong nghiên cứu . 51 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .1 Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người .1 Kết quả thiết kế mồi .2 Kết quả xác định các điều kiện phản ứng LAMP với bộ mồi tự thiết kế 59 3.3 Ngưỡng phát hiện của bộ kit LAMP .4 Kết quả xây dựng chứng dương .5 Kết quả chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm S.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí nghiệm và thực địa .1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit LAMP tại phòng thí nghiệm.2 Điều kiện bảo quản và độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột.3 Đánh giá bộ kit tại thực địa, so sánh bộ kit với bộ mồi Pedro và với hai phương pháp chẩn đoán giun lươn thường dùng .4 Kiểm định tiêu chuẩn cơ sở bộ kit. 86 Chương 4 BÀN LUẬN .1 Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người .1 Kết quả thiết kế mồi .2 Kết quả xác định các điều kiện phản ứng LAMP với bộ mồi tự thiết kế 90 4.3 Ngưỡng phát hiện của bộ kit .4 Kết quả xây dựng chứng dương .5 Kết quả chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm S.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí nghiệm và thực địa .1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit LAMP tại phòng thí nghiệm.2 Điều kiện bảo quản và độ ổn định của bộ kit.3 Đánh giá bộ kit tại thực địa, so sánh bộ kit với bộ mồi Pedro và với hai phương pháp chẩn đoán giun lươn thường dùng .4 Đăng ký kiểm định tiêu chuẩn cơ sở của bộ kit . Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người . Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí nghiệm và thực địa . 112 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN TRỰC TIẾP ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO x DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Yêu cầu khoảng cách giữa các mồi [108] .2 Yêu cầu nhiệt độ nóng chảy (Tm) của từng mồi .3 Thành phần phản ứng LAMP .4: Các điều kiện cần tối ưu hóa .5 Bảng tính độ nhạy, độ đặc hiệu .1 Trình tự mồi LAMP thiết kế để chẩn đoán giun lươn đường ruột .2 Vị trí của các mồi được thiết kế .3 Khoảng cách giữa các mồi được thiết kế .4 Nhiệt độ nóng chảy và khả năng tạo bắt cặp dimer mồi (dG <- 2,34) của bộ mồi xác định giun lươn đường ruột .5 Kết quả đánh giá tính đặc hiệu của cặp mồi.6 Báo cáo quan sát chất chỉ thị màu MG ở các nồng độ khác nhau trong thử nghiệm LAMP.
