Luận án tiến sĩ: Chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm giun lươn Strongyloides stercoralis

Luận án tiến sĩ nghiên cứu chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm giun lươn Strongyloides stercoralis, ứng dụng hiệu quả trong y học.

• Tác giả: Trần Thị Kim Chi
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Xuân Mai
• Trường học: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương
• Chuyên ngành: Ký sinh trùng y học
• Đề tài: Nghiên cứu chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột (Strongyloides stercoralis) ở người
• Loại tài liệu: Luận án tiến sỹ y học
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Lịch sử phát hiện, nghiên cứu giun lươn Strongyloides stercoralis
• 1.2. Đặc điểm sinh học, bệnh học của giun lươn S. stercoralis
• 1.2.1. Hình thái học
• 1.2.2. Chu kỳ phát triển
• 1.2.3. Triệu chứng của bệnh giun lươn
• 1.3. Chẩn đoán và điều trị bệnh giun lươn
• 1.3.1. Định nghĩa ca bệnh do giun lươn Strongyloides stercoralis
• 1.3.2. Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán nhiễm giun lươn
• 1.3.3. Điều trị bệnh giun lươn
• 1.4. Tình hình nhiễm giun lươn
• 1.4.1. Tình hình nhiễm giun lươn trên thế giới
• 1.4.2. Tình hình nhiễm giun lươn tại Việt Nam
• 1.5. Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng LAMP
• 1.5.1. Lịch sử phát triển LAMP
• 1.5.2. Nguyên lý của kỹ thuật LAMP
• 1.5.3. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật LAMP
• 1.5.4. Một số ứng dụng của kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán bệnh ở người
• 1.6. Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa bộ kit LAMP chẩn đoán tác nhân gây bệnh
• 1.6.1. Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP
• 1.6.2. Chuẩn hóa các điều kiện của phản ứng LAMP
• 1.6.3. Xác định ngưỡng phát hiện, xây dựng chuẩn dương của kỹ thuật
• 1.6.4. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit LAMP
• 1.6.5. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ kit
• 2. Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mục tiêu 1: Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.1.3. Thiết kế nghiên cứu
• 2.1.4. Nội dung nghiên cứu
• 2.1.5. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
• 2.1.6. Các chỉ số đánh giá
• 2.2. Mục tiêu 2: Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí nghiệm và thực địa
• 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2.3. Thiết kế nghiên cứu
• 2.2.4. Nội dung nghiên cứu
• 2.2.5. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
• 2.2.6. Các chỉ số đánh giá
• 2.2.7. Xử lý số liệu
• 2.3. Kiểm soát sai số
• 2.4. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người
• 3.1.1. Kết quả thiết kế mồi
• 3.1.2. Kết quả xác định các điều kiện phản ứng LAMP với bộ mồi tự thiết kế
• 3.1.3. Ngưỡng phát hiện của bộ kit LAMP
• 3.1.4. Kết quả xây dựng chứng dương
• 3.1.5. Kết quả chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm S. stercoralis
• 3.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí nghiệm và thực địa
• 3.2.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit LAMP tại phòng thí nghiệm
• 3.2.2. Điều kiện bảo quản và độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột
• 3.2.3. Đánh giá bộ kit tại thực địa, so sánh bộ kit với bộ mồi Pedro và với hai phương pháp chẩn đoán giun lươn thường dùng
• 3.2.4. Kiểm định tiêu chuẩn cơ sở bộ kit
• 4. Chương 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người
• 4.1.1. Kết quả thiết kế mồi
• 4.1.2. Kết quả xác định các điều kiện phản ứng LAMP với bộ mồi tự thiết kế
• 4.1.3. Ngưỡng phát hiện của bộ kit
• 4.1.4. Kết quả xây dựng chứng dương
• 4.1.5. Kết quả chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm S. stercoralis
• 4.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí nghiệm và thực địa
• 4.2.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit LAMP tại phòng thí nghiệm
• 4.2.2. Điều kiện bảo quản và độ ổn định của bộ kit
• 4.2.3. Đánh giá bộ kit tại thực địa, so sánh bộ kit với bộ mồi Pedro và với hai phương pháp chẩn đoán giun lươn thường dùng
• 4.2.4. Đăng ký kiểm định tiêu chuẩn cơ sở của bộ kit
• KẾT LUẬN
• DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN TRỰC TIẾP ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Nghiên cứu

Nghiên cứu về Strongyloides stercoralis đã được thực hiện từ năm 1876, khi Normand phát hiện loài giun này trong mẫu phân của lính Pháp từng ở Việt Nam. Các nghiên cứu tiếp theo của Grassi, Perroncito, và Leuckart đã chứng minh sự tồn tại của hai dạng giun lươn trong ruột và phân. Askanazy (1900) cung cấp bằng chứng về sự ký sinh của giun lươn dưới lớp niêm mạc ruột. Các nghiên cứu sau này của Fulleborn, Nishigori, Faust, và Hartz đã làm sáng tỏ chu kỳ tự nhiễm của giun lươn, khi ấu trùng xâm nhập qua da quanh hậu môn. Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc hiểu rõ chu kỳ sống và đặc điểm sinh học của Strongyloides stercoralis để phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả.

1.1. Lịch sử phát hiện

Strongyloides stercoralis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1876 bởi Normand trong mẫu phân của lính Pháp từng ở Việt Nam. Các nghiên cứu tiếp theo của Grassi, Perroncito, và Leuckart đã chứng minh sự tồn tại của hai dạng giun lươn trong ruột và phân. Askanazy (1900) cung cấp bằng chứng về sự ký sinh của giun lươn dưới lớp niêm mạc ruột. Các nghiên cứu sau này của Fulleborn, Nishigori, Faust, và Hartz đã làm sáng tỏ chu kỳ tự nhiễm của giun lươn, khi ấu trùng xâm nhập qua da quanh hậu môn.

1.2. Phân loại khoa học

Strongyloides stercoralis thuộc giới Animalia, ngành Nematoda, lớp Secernentea, bộ Rhabditida, họ Strongyloididae, giống Strongyloides, và loài Strongyloides stercoralis. Sự phân loại này giúp hiểu rõ hơn về vị trí của loài giun này trong hệ thống phân loại sinh học.

II. Chế tạo

Chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm Strongyloides stercoralis là mục tiêu chính của nghiên cứu này. Quá trình chế tạo bao gồm việc thiết kế mồi, chuẩn hóa các điều kiện phản ứng, xác định ngưỡng phát hiện, và đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit. Bộ kit LAMP được thiết kế để phát hiện nhanh và chính xác sự hiện diện của giun lươn trong mẫu phân, với ưu điểm là không cần thiết bị phức tạp và có thể áp dụng tại thực địa.

2.1. Thiết kế mồi

Thiết kế mồi là bước quan trọng trong quá trình chế tạo bộ kit LAMP. Các mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen đặc hiệu của Strongyloides stercoralis, đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt.

2.2. Chuẩn hóa phản ứng

Chuẩn hóa các điều kiện phản ứng LAMP bao gồm tối ưu hóa nhiệt độ, thời gian phản ứng, và nồng độ các thành phần phản ứng. Điều này giúp đảm bảo bộ kit LAMP hoạt động hiệu quả và ổn định trong các điều kiện khác nhau.

III. Chẩn đoán

Chẩn đoán nhiễm Strongyloides stercoralis hiện nay gặp nhiều thách thức do độ nhạy thấp của các phương pháp truyền thống như soi phân tìm ấu trùng. Bộ kit LAMP được phát triển để khắc phục những hạn chế này, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, đồng thời giảm thời gian và chi phí chẩn đoán. Chẩn đoán bằng bộ kit LAMP có thể được thực hiện tại thực địa, giúp phát hiện sớm và điều trị kịp thời các ca nhiễm giun lươn.

3.1. Phương pháp truyền thống

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như soi phân tìm ấu trùng có độ nhạy thấp và dễ bỏ sót các ca nhiễm. Phương pháp tìm kháng thể trong huyết thanh có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu thấp, gây khó khăn trong việc xác định chính xác ca bệnh.

3.2. Phương pháp LAMP

Bộ kit LAMP được phát triển để cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán nhiễm Strongyloides stercoralis. Phương pháp này không cần thiết bị phức tạp, có thể thực hiện tại thực địa, và cho kết quả nhanh chóng.

IV. Ứng dụng thực tiễn

Bộ kit LAMP có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán nhiễm Strongyloides stercoralis tại các vùng dịch tễ, đặc biệt là ở các khu vực có điều kiện y tế hạn chế. Việc sử dụng bộ kit LAMP giúp giảm thiểu thời gian và chi phí chẩn đoán, đồng thời nâng cao hiệu quả điều trị bằng cách phát hiện sớm các ca nhiễm. Nghiên cứu này cũng mở ra hướng phát triển các bộ kit chẩn đoán khác cho các bệnh ký sinh trùng khác.

4.1. Tại thực địa

Bộ kit LAMP được thiết kế để dễ dàng sử dụng tại thực địa, giúp các nhân viên y tế có thể thực hiện chẩn đoán nhanh chóng và chính xác mà không cần thiết bị phức tạp.

4.2. Tiềm năng thương mại hóa

Nghiên cứu này mở ra tiềm năng thương mại hóa bộ kit LAMP trong tương lai, giúp đáp ứng nhu cầu chẩn đoán nhiễm Strongyloides stercoralis tại các vùng dịch tễ trên toàn thế giới.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh giun lươn (Strongyloidiasis) là bệnh nhiễm ký sinh trùng đường ruột mạn tính ở người do giun tròn thuộc giống Strongyloides gây ra, chủ yếu là loài Strongyloides stercoralis. Theo các báo cáo dịch tễ học, ước tính trên thế giới có khoảng 30 đến 100 triệu người mắc bệnh. Khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam, được xác định là vùng dịch tễ lưu hành của bệnh giun lươn. Đặc điểm sinh học của S. stercoralis có chu kỳ tự nhiễm bên trong cơ thể vật chủ, cho phép ký sinh trùng tồn tại dai dẳng hàng chục năm. Khi gặp điều kiện miễn dịch suy giảm (bệnh nhân dùng corticosteroid kéo dài, mắc HTLV-1, bệnh ác tính, ghép tạng...), người bệnh có nguy cơ rơi vào hội chứng tăng nhiễm hoặc nhiễm giun lươn lan tỏa với tỷ lệ tử vong lên tới 90% nếu không được can thiệp kịp thời.

Tuy nhiên, việc chẩn đoán nhiễm giun lươn tại thực địa và lâm sàng đối mặt với nhiều rào cản. Phương pháp soi phân trực tiếp tìm ấu trùng có độ nhạy rất thấp (khoảng 30%) do lượng ấu trùng thải ra theo phân ít và ngắt quãng; các phương pháp cấy phân (Harada-Mori, đĩa thạch) hoặc kỹ thuật Baermann tuy nâng cao độ nhạy nhưng tốn thời gian, đòi hỏi dụng cụ phức tạp và tiềm ẩn nguy cơ lây nhiễm cho người thực hiện. Xét nghiệm miễn dịch học (ELISA) có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu hạn chế, dễ phản ứng chéo với các loại giun sán khác và không phân biệt được tình trạng đang nhiễm hay đã khỏi bệnh. Các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, real-time PCR có độ chính xác cao nhưng đòi hỏi hệ thống máy luân nhiệt đắt tiền, nhân lực chuyên sâu, khó triển khai tại y tế tuyến cơ sở hoặc điều tra thực địa.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết là việc phát triển một công cụ sinh học phân tử có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thực hiện nhanh chóng, không phụ thuộc vào thiết bị luân nhiệt phức tạp và có thể đọc kết quả trực quan bằng mắt thường. Luận án tiến hành xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng (Loop-Mediated Isothermal Amplification - LAMP) chẩn đoán nhiễm Strongyloides stercoralis ở người.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm hai nội dung:

1. Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người.
2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí nghiệm và thực địa.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Ấu trùng và ADN của Strongyloides stercoralis thu thập từ mẫu phân người bệnh; mẫu phân của các đối tượng nghi ngờ nhiễm giun lươn tại thực địa và bệnh nhân đến khám chuyên khoa; các mẫu ký sinh trùng đường ruột khác (giun móc, giun mỏ, Gnathostoma sp.) dùng làm đối chứng âm; plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích 18S rRNA của S. stercoralis dùng làm chứng dương.
• Không gian nghiên cứu: Khoa Sinh học phân tử và Khoa Ký sinh trùng thuộc Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương; Bộ môn Vi sinh - Ký sinh (Khoa Y, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh); Bộ môn Ký sinh trùng (Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch); Trung tâm Y tế huyện và các xã thuộc huyện Đức Hòa, tỉnh Long An.
• Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2017 đến năm 2020.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa lịch sử phát hiện, đặc điểm sinh học và các phương pháp chẩn đoán ký sinh trùng Strongyloides stercoralis:

• Lịch sử và dịch tễ: S. stercoralis được bác sĩ hải quân Pháp Louis Alexis Normand phát hiện lần đầu năm 1876 tại Toulon trên các bệnh nhân lính Pháp trở về từ miền Nam Việt Nam (khi đó gọi là bệnh tiêu chảy Nam Bộ). Bavay (1876) đặt tên loài là stercoralis. Grassi (1879), Perroncito (1880), Leuckart (1882) làm rõ các dạng ấu trùng; Askanazy (1900) chứng minh giun ký sinh tại lớp nhầy ruột; Fülleborn (1926), Faust (1932–1940) mô tả chi tiết chu trình tự nhiễm. Nghiên cứu tổng hợp của Fabian Schär và cộng sự (2013) ghi nhận tỷ lệ nhiễm giun lươn tại nhiều khu vực trên thế giới, trong đó Đông Nam Á có tỷ lệ dao động lớn (Campuchia 17,5%, Thái Lan 23,7%, Lào 26,2%). Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Galliard (1940), Vũ Thị Lâm Bình và cộng sự, Nguyễn Văn Đề và cộng sự, Lê Đức Vinh và cộng sự ghi nhận tỷ lệ nhiễm biến động từ dưới 1% đến 9,2% tùy theo vùng địa lý và kỹ thuật xét nghiệm áp dụng.
• Phương pháp chẩn đoán truyền thống:
  • Phương pháp soi phân trực tiếp: Đơn giản nhưng độ nhạy chỉ đạt khoảng 30% (Siddiqui và Berk, 2001).
  • Phương pháp Baermann và nuôi cấy phân (Harada-Mori, đĩa thạch Koga theo Sato và cộng sự): Tăng độ nhạy phát hiện lên 1,6 đến 6 lần so với soi trực tiếp nhưng tốn thời gian (nuôi cấy từ vài ngày đến 10 ngày), cần khối lượng phân lớn (lên tới 150g đối với Baermann) và có nguy cơ lây nhiễm.
  • Phương pháp huyết thanh học: ELISA gián tiếp phát hiện IgG hoặc IgG4 có độ nhạy từ 80–95% (Trần Thị Hồng và cộng sự, Gyorkos và cộng sự) nhưng độ đặc hiệu thấp do phản ứng chéo với giun móc, giun lươn đường ruột khác (Yori và cộng sự). Kỹ thuật Luciferase Immunoprecipitation System (LIPS/NIE-LIPS) của Bisoffi và cộng sự cho độ nhạy và đặc hiệu cao nhưng chưa phổ biến ở các phòng xét nghiệm thường quy.
• Kỹ thuật sinh học phân tử và kỹ thuật LAMP:
  • PCR truyền thống, nested-PCR, real-time PCR nhắm vào gen cox1, 18S rRNA (Verweij và cộng sự, Moghaddassani và cộng sự) hoặc 28S rRNA giúp tăng hiệu quả phát hiện gấp nhiều lần so với kính hiển vi, nhưng phụ thuộc máy móc đắt tiền.
  • Kỹ thuật LAMP do tập đoàn Eiken Chemical Co. (Notomi và cộng sự, 2000) phát minh, sử dụng enzyme Bst DNA polymerase có hoạt tính dịch chuyển chuỗi, phản ứng xảy ra ở nhiệt độ đẳng nhiệt duy nhất (55–65°C), sử dụng từ 4 đến 6 mồi nhận biết 6 đến 8 vùng đặc hiệu trên gen đích. Trên thế giới, Matthew và cộng sự (2014) thiết kế mồi LAMP trên gen 28S; Pedro Fernández-Soto và cộng sự (2016, 2017) thiết kế mồi LAMP trên gen 18S rRNA; Miao-Han Deng và cộng sự (2019) ứng dụng LAMP phát hiện đồng thời giun tròn.

Vị trí nghiên cứu của luận án: Luận án là công trình nghiên cứu xây dựng quy trình hoàn chỉnh và chế tạo bộ sinh phẩm kit LAMP chẩn đoán S. stercoralis tại Việt Nam dựa trên vùng gen 18S rRNA bảo tồn, tối ưu hóa điều kiện hóa chất, thiết lập mẫu chứng dương tái tổ hợp, đánh giá độ ổn định và thẩm định trên các mẫu lâm sàng tại thực địa cũng như cơ sở y tế chuyên khoa.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và nguyên lý kỹ thuật

• Nguyên lý phản ứng LAMP: Quá trình khuếch đại DNA diễn ra ở điều kiện nhiệt độ không đổi (60–65°C) nhờ enzyme Bst DNA polymerase xúc tác tổng hợp sợi mới và tự tách chuỗi DNA mà không cần bước biến tính nhiệt. Bộ mồi gồm tối thiểu 4 mồi: hai mồi ngoài (F3, B3) và hai mồi trong (FIP gồm F1c+F2, BIP gồm B1c+B2). Quá trình diễn ra qua 3 giai đoạn: tạo cấu trúc gốc vòng (stem-loop) khởi đầu, chu kỳ tái bản kéo dài chuỗi và lặp lại chu kỳ tạo ra hỗn hợp cấu trúc DNA vòng bậc thang dài với hiệu suất khuếch đại đạt $10^9 - 10^{10}$ bản sao trong thời gian 30–60 phút.
• Nguyên lý chỉ thị màu: Phản ứng giải phóng ion pyrophosphate kết hợp với $Mg^{2+}$ tạo kết tủa magnesium pyrophosphate ($Mg_2P_2O_7$) hoặc làm thay đổi màu sắc của chất chỉ thị Malachite Green (MG). Ở mẫu dương tính, phản ứng đổi sang màu xanh nhạt; ở mẫu âm tính, dung dịch không màu hoặc giữ màu nguyên thủy.

Phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm và nghiên cứu mô tả cắt ngang ngoài thực địa.

• Quy trình thiết kế và tối ưu mồi:
  • Thu thập 30 trình tự gen 18S rRNA của Strongyloides stercoralis trên ngân hàng gen GenBank, gióng hàng bằng phần mềm MEGA 7 để tìm vùng trình tự bảo tồn cao.
  • Sử dụng phần mềm Primer Explorer V5 (Eiken Chemical, Nhật Bản) để thiết kế bộ mồi LAMP thỏa mãn các tiêu chí kỹ thuật: chiều dài đoạn khuếch đại $\le 250\text{ bp}$, tỷ lệ GC từ 40–60%, nhiệt độ nóng chảy (Tm) phù hợp và hạn chế tối đa cấu trúc kẹp tóc (hairpin), dimer mồi ($\Delta G < -2,34\text{ kcal/mol}$).
  • Đánh giá tính đặc hiệu in silico bằng công cụ BLAST trên NCBI.
• Kỹ thuật tách chiết DNA: Sử dụng bộ kit thương mại QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen) để tách chiết DNA từ mẫu phân và mẫu ấu trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
• Thiết lập chuẩn dương tái tổ hợp: Đoạn gen 18S rRNA đích được khuếch đại bằng PCR, gắn vào vector dòng hóa (cloning vector) và biến nạp vào tế bào khả biến, tinh sạch plasmid, định lượng nồng độ bản sao để tạo dãy chuẩn độ nhạy (LOD) và làm chứng dương cho bộ kit.
• Phương pháp thu thập mẫu thực địa và lâm sàng:
  • Thu thập mẫu phân ngẫu nhiên trong cộng đồng tại huyện Đức Hòa, tỉnh Long An.
  • Thu thập mẫu phân và huyết thanh của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm ký sinh trùng tại Khoa Khám bệnh chuyên ngành, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương.
• Kỹ thuật đối chứng: Soi phân trực tiếp tìm ấu trùng dưới kính hiển vi quang học, xét nghiệm real-time PCR (qPCR), xét nghiệm huyết thanh ELISA, phản ứng LAMP sử dụng bộ mồi đã công bố của Pedro Fernández-Soto.
• Chỉ số đánh giá và xử lý số liệu:
  • Tính toán độ nhạy (Sensitivity - Se), độ đặc hiệu (Specificity - Sp), giá trị tiên đoán dương (PPV), giá trị tiên đoán âm (NPV).
  • Đánh giá mức độ đồng thuận giữa các phương pháp bằng hệ số tương đồng Kappa ($\kappa$). Xử lý số liệu trên các phần mềm thống kê y học chuyên dụng.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng hợp toàn diện các nghiên cứu về ký sinh trùng Strongyloides stercoralis từ phương diện sinh học, dịch tễ, lâm sàng đến các công cụ chẩn đoán:

• Về sinh học và bệnh học: Phân tích chi tiết hai chu kỳ phát triển của giun lươn gồm chu kỳ tự do ngoài môi trường và chu kỳ ký sinh - tự nhiễm bên trong cơ thể người. Phân biệt rõ hai giai đoạn ấu trùng: ấu trùng rhabditiform (thực quản ụ phình, xoang miệng ngắn, kích thước $350 \times 20,\mu\text{m}$) và ấu trùng filariform (thực quản hình ống dài, đuôi chẻ, kích thước $500 - 700,\mu\text{m}$ - thể nhiễm). Nêu rõ cơ chế sinh bệnh học của hai thể lâm sàng: thể thông thường (rối loạn tiêu hóa, đau thượng vị, mày đay di chuyển) và thể nặng (hội chứng tăng nhiễm, nhiễm giun lươn lan tỏa) liên quan mật thiết đến tình trạng suy giảm miễn dịch do dùng corticosteroid hoặc đồng nhiễm HTLV-1.
• Về thực trạng chẩn đoán: Phân tích ưu - nhược điểm của các phương pháp hiện hành gồm hình thái học (soi phân trực tiếp, phương pháp Baermann, cấy phân Harada-Mori, đĩa thạch Koga), miễn dịch học (ELISA phát hiện kháng thể IgG/IgG4, IFAT, NIE-LIPS, phát hiện kháng nguyên trong phân) và sinh học phân tử (PCR, real-time PCR). Nêu rõ sự thiếu hụt tiêu chuẩn vàng hoàn hảo trong chẩn đoán giun lươn.
• Về công nghệ LAMP: Khái quát lịch sử phát triển của kỹ thuật LAMP từ năm 2000, phân tích cơ chế phản ứng 3 bước và nguyên lý bám mồi của 4–6 loại mồi chuyên biệt. Điểm lại các ứng dụng thương mại hóa của LAMP trong y học (chẩn đoán sốt rét Plasmodium, Cryptosporidium, Giardia, vi khuẩn E. coli O157) và các nghiên cứu mồi LAMP đơn lẻ trên giun lươn của nhóm tác giả Matthew (gen 28S) và Pedro Fernández-Soto (gen 18S). Phân tích quy trình chuẩn hóa bộ sinh phẩm kit LAMP theo tiêu chuẩn cơ sở.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết thiết kế nghiên cứu, vật liệu và quy trình thực nghiệm tương ứng với hai mục tiêu cụ thể:

• Nội dung thực hiện mục tiêu 1 (Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP):
  • Trình bày quy trình thiết kế bộ mồi trên phần mềm Primer Explorer V5 dựa trên vùng bảo tồn của 30 trình tự gen 18S rRNA trên GenBank; lựa chọn mồi theo các chỉ số Tm, hàm lượng GC, $\Delta G$ liên kết dimer.
  • Mô tả các bước khảo sát tối ưu hóa điều kiện phản ứng LAMP: nhiệt độ phản ứng ($60^\circ\text{C} - 65^\circ\text{C}$), nồng độ $Mg^{2+}$ (4 mM, 6 mM, 8 mM), nồng độ enzyme Bst polymerase, thời gian phản ứng (40 phút và 60 phút), nồng độ chất chỉ thị màu Malachite Green (MG).
  • Trình bày kỹ thuật tạo dòng plasmid mang đoạn gen 18S rRNA tái tổ hợp để làm chuẩn dương và xác định ngưỡng phát hiện sơ cấp, ngưỡng phát hiện giới hạn (LOD 95%).
  • Đưa ra danh mục các thành phần đóng gói hoàn chỉnh của bộ kit LAMP cho 25, 50 hoặc 100 phản ứng.
• Nội dung thực hiện mục tiêu 2 (Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định và thử nghiệm thực địa):
  • Thiết kế quy trình đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trong phòng thí nghiệm trên mẫu chuẩn dương và các mẫu đối chứng âm ký sinh trùng đường ruột khác.
  • Thiết lập điều kiện thử nghiệm độ ổn định của bộ kit: theo dõi sau 1 tháng, 6 tháng và 12 tháng ở điều kiện bảo quản $-20^\circ\text{C}$, cũng như thử nghiệm khả năng chịu đựng chu kỳ đông - tan (4 lần).
  • Thiết kế nghiên cứu thực địa tại huyện Đức Hòa, tỉnh Long An và tại Khoa Khám bệnh chuyên ngành (Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương): lấy mẫu phân, tách chiết DNA, thực hiện song song xét nghiệm LAMP, qPCR, soi phân trực tiếp, ELISA và LAMP với bộ mồi Pedro Fernández-Soto.
  • Nêu rõ các phương pháp kiểm soát sai số, tiêu chuẩn đạo đức nghiên cứu y sinh học và kỹ thuật phân tích thống kê tính toán hệ số Kappa.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm, biểu đồ và bảng kết quả thu được:

• Kết quả thiết kế mồi và tối ưu hóa phản ứng:
  • Thiết kế thành công bộ mồi LAMP đặc hiệu trên gen 18S rRNA của S. stercoralis gồm 4 mồi chính: mồi ngoài F3, B3 và mồi trong FIP, BIP. Kết quả kiểm tra in silico và thực nghiệm cho thấy bộ mồi bắt cặp chính xác, không tạo dimer mồi bất lợi ($\Delta G > -2,34\text{ kcal/mol}$).
  • Xác định điều kiện phản ứng tối ưu: nhiệt độ phản ứng đẳng nhiệt $63^\circ\text{C}$, thời gian khuếch đại 60 phút, nồng độ $Mg^{2+}$ tối ưu đạt 6–8 mM. Nồng độ chất chỉ thị Malachite Green cho phép phân biệt rõ ràng mẫu dương (xanh nhạt) và mẫu âm (không màu) bằng mắt thường mà không làm ức chế phản ứng khuếch đại.
• Kết quả xây dựng chuẩn dương và xác định ngưỡng phát hiện (LOD):
  • Dòng hóa thành công plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 18S rRNA của S. stercoralis, được kiểm tra bằng PCR và giải trình tự gen.
  • Xác định ngưỡng phát hiện (LOD 95%) của bộ kit LAMP đạt độ nhạy phân tích cao, tương đương với kỹ thuật real-time PCR.
• Kết quả đánh giá độ ổn định của bộ kit:
  • Bộ kit duy trì hoạt tính khuếch đại và độ nhạy ổn định sau 1 tháng, 6 tháng và 12 tháng bảo quản ở $-20^\circ\text{C}$.
  • Bộ sinh phẩm giữ nguyên hiệu năng sau 4 chu kỳ đông đá - làm tan lặp lại.
• Kết quả đánh giá hiệu năng trên mẫu thực địa và lâm sàng:
  • Tại thực địa (huyện Đức Hòa, tỉnh Long An), bộ kit LAMP phát hiện tỷ lệ dương tính cao hơn đáng kể so với phương pháp soi phân trực tiếp, tương đương với real-time PCR.
  • So sánh với bộ mồi của tác giả Pedro Fernández-Soto, bộ kit LAMP tự thiết kế cho độ tương đồng cao với hệ số Kappa đạt mức rất tốt.
  • Khi đối chiếu với phương pháp soi phân trực tiếp và ELISA tại Khoa Khám bệnh chuyên ngành, kỹ thuật LAMP giải quyết được các trường hợp âm tính giả của soi phân và sàng lọc được các trường hợp dương tính giả/phản ứng chéo của ELISA.
  • Bộ kit được tổng hợp số liệu và xây dựng thành công bộ Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS).

Chỉ số / Đặc tính	Kết quả ghi nhận của Bộ Kit LAMP
Gen đích	18S rRNA (Strongyloides stercoralis)
Bộ mồi	4 mồi (F3, B3, FIP, BIP) thiết kế qua Primer Explorer V5
Nhiệt độ phản ứng	$63^\circ\text{C}$ (đẳng nhiệt)
Thời gian phản ứng	60 phút
Hệ thống đọc kết quả	Đổi màu chỉ thị Malachite Green (xanh nhạt / không màu) hoặc điện di gel agarose
Độ ổn định bảo quản	Tối thiểu 12 tháng ở nhiệt độ $-20^\circ\text{C}$
Độ bền đông - tan	Ổn định qua tối thiểu 4 chu kỳ đông - làm tan
Độ tương đồng với qPCR	Hệ số Kappa cao, độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương qPCR
Chuẩn dương kiểm soát	Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 18S rRNA

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung phân tích, so sánh các kết quả đạt được với y văn trong nước và quốc tế:

• Về thiết kế mồi và việc lựa chọn gen đích 18S rRNA: Tác giả phân tích lý do chọn vùng gen nhân 18S rRNA thay vì gen ty thể cox1 hay 28S rRNA. Gen 18S rRNA có tính bảo tồn loài cao giữa các chủng S. stercoralis phân lập tại các vùng địa lý khác nhau, có nhiều bản sao trong bộ gen giúp gia tăng độ nhạy phân tích. Bộ mồi tự thiết kế khắc phục được hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu và tương thích tốt với điều kiện hóa chất của phòng thí nghiệm Việt Nam.
• Về các điều kiện tối ưu và chất chỉ thị Malachite Green: Luận án bàn luận sâu về vai trò của nồng độ $Mg^{2+}$ đối với hoạt tính của Bst DNA polymerase trong phản ứng LAMP. Nồng độ $Mg^{2+}$ từ 6–8 mM là khoảng tối ưu để enzyme hoạt động mạnh mà không gây phản ứng phụ. Việc sử dụng Malachite Green (MG) cho phép thêm trực tiếp vào ống phản ứng trước khi ủ nhiệt, đọc kết quả đóng nắp ống giúp loại bỏ hoàn toàn nguy cơ nhiễm chéo aerosol (khí dung sản phẩm khuếch đại) - vốn là nhược điểm lớn nhất của kỹ thuật LAMP khi phải mở nắp nhuộm SYBR Green sau phản ứng.
• Về độ nhạy, độ đặc hiệu và giá trị ứng dụng thực địa: So sánh hiệu năng của bộ kit với các nghiên cứu quốc tế (Matthew và cộng sự 2014, Pedro Fernández-Soto và cộng sự 2016). Phân tích nguyên nhân bộ kit LAMP có độ nhạy vượt trội so với soi phân (vốn bỏ sót ấu trùng ở bệnh nhân nhiễm mạn tính lượng ký sinh trùng thấp) và độ đặc hiệu cao hơn ELISA (loại trừ phản ứng chéo với giun móc Ancylostoma, Necator và Toxocara). Khả năng triển khai tại tuyến huyện/xã được khẳng định do phản ứng chỉ cần bể ủ nhiệt cách thủy hoặc block gia nhiệt đơn giản, không cần máy real-time PCR đắt tiền.
• Về xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định: Bàn luận về tính khả thi trong sản xuất hàng loạt, cung ứng sinh phẩm chẩn đoán chủ động trong nước thay thế sinh phẩm nhập khẩu đắt tiền.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Đóng góp về mặt khoa học kỹ thuật:
   • Đã thiết kế thành công bộ mồi LAMP chuyên biệt trên vùng bảo tồn của gen 18S rRNA của Strongyloides stercoralis phù hợp với các chủng giun lươn lưu hành tại Việt Nam.
   • Xây dựng hoàn chỉnh quy trình phản ứng LAMP một bước với các thông số tối ưu: nhiệt độ đẳng nhiệt $63^\circ\text{C}$, thời gian 60 phút, hệ chỉ thị màu Malachite Green khép kín tránh nhiễm chéo.
   • Chế tạo thành công plasmid tái tổ hợp mang gen 18S rRNA làm nguồn chuẩn dương ổn định, phục vụ kiểm định chất lượng phản ứng.
2. Đóng góp về mặt thực tiễn y tế:
   • Chế tạo thành công bộ kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột hoàn chỉnh đầu tiên tại Việt Nam, đóng gói đồng bộ hóa chất kèm chứng âm, chứng dương và hướng dẫn kỹ thuật.
   • Chứng minh bộ kit đạt độ ổn định sinh học ít nhất 12 tháng ở $-20^\circ\text{C}$ và chịu được 4 chu kỳ đông - tan, đáp ứng các tiêu chí vận chuyển và lưu trữ tại thực địa.
   • Thẩm định hiệu quả chẩn đoán tại cộng đồng (Đức Hòa, Long An) và phòng khám chuyên khoa, chứng minh độ chính xác tương đương real-time PCR nhưng quy trình đơn giản, thời gian nhanh và chi phí thấp hơn.
   • Xây dựng hoàn thiện hồ sơ Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) cho bộ kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột, tạo tiền đề cho việc đăng ký lưu hành và sản xuất sinh phẩm y tế trong nước.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Ứng dụng bộ kit LAMP vào công tác điều tra dịch tễ học diện rộng tại các vùng có nguy cơ lưu hành cao giun lươn ở Việt Nam.
• Đưa kỹ thuật LAMP vào quy trình xét nghiệm sàng lọc giun lươn cho các đối tượng bệnh nhân có nguy cơ cao (chuẩn bị điều trị ức chế miễn dịch, ghép tạng, hóa trị liệu ung thư, bệnh nhân suy giảm miễn dịch) tại các bệnh viện tuyến tỉnh và trung ương.
• Tiếp tục hoàn thiện các thủ tục kiểm định chất lượng cấp quốc gia để sớm đưa bộ sinh phẩm vào sản xuất thương mại phục vụ hệ thống y tế dự phòng và điều trị.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Quy trình vẫn yêu cầu bước tách chiết DNA từ mẫu phân bằng kit thương mại (QIAamp DNA Stool Mini Kit), đòi hỏi trang thiết bị cơ bản như máy ly tâm và micropipette, chưa đạt đến mức độ xét nghiệm tại chỗ hoàn toàn (point-of-care testing không cần ly tâm).
  • Nghiên cứu thực địa mới được triển khai tập trung tại một số điểm dịch tễ đại diện (huyện Đức Hòa, tỉnh Long An) và tại viện chuyên khoa trung ương; cần mở rộng thêm các vùng sinh thái dịch tễ khác nhau trên cả nước.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Nghiên cứu đơn giản hóa quy trình tách chiết DNA nhanh từ phân (sử dụng nhiệt hoặc dung dịch ly giải trực tiếp không cần cột lọc silica và máy ly tâm) để tích hợp đồng bộ vào bộ kit thực địa.
  • Nghiên cứu đông khô hóa các thành phần phản ứng của bộ kit (lyophilization) nhằm cho phép bảo quản ở nhiệt độ phòng, giảm bớt phụ thuộc vào dây chuyền lạnh (bảo quản $-20^\circ\text{C}$).
  • Mở rộng ứng dụng bộ kit LAMP trên các loại bệnh phẩm khác như đờm, dịch rửa phế quản, dịch não tủy để chẩn đoán nhanh hội chứng tăng nhiễm và giun lươn lan tỏa ở bệnh nhân nặng.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và nhà nghiên cứu chuyên ngành Ký sinh trùng y học, Vi sinh vật học, Sinh học phân tử: Luận án cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp thiết kế mồi LAMP (Primer Explorer V5), quy trình tối ưu hóa phản ứng đẳng nhiệt, kỹ thuật dòng hóa tạo plasmid chuẩn dương và phương pháp đánh giá phân tích sinh phẩm chẩn đoán (LOD, Se, Sp, Kappa).
• Đối với bác sĩ lâm sàng, cán bộ xét nghiệm tại các bệnh viện: Cung cấp cơ sở khoa học về giá trị chẩn đoán phân tử của LAMP trong việc khắc phục nhược điểm âm tính giả của soi phân và phản ứng chéo của ELISA, hỗ trợ chỉ định chẩn đoán sớm giun lươn trên bệnh nhân suy giảm miễn dịch.
• Đối với các nhà quản lý y tế dự phòng và y tế công cộng: Cung cấp công cụ kỹ thuật khả thi, chi phí hợp lý để xây dựng các chương trình điều tra, giám sát dịch tễ học và đánh giá gánh nặng bệnh giun lươn trong cộng đồng tại Việt Nam.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao kỹ thuật soi phân trực tiếp thường quy lại có độ nhạy thấp trong chẩn đoán giun lươn?

Trong nhiễm giun lươn mạn tính, giun cái ký sinh trong niêm mạc ruột non đẻ số lượng trứng rất ít. Trứng nở ngay lập tức thành ấu trùng rhabditiform tại các khe tuyến ruột non. Do đó, số lượng ấu trùng thải ra ngoài theo phân rất thấp và xuất hiện không liên tục giữa các ngày. Kỹ thuật soi phân trực tiếp chỉ sử dụng một lượng phân rất nhỏ (vài miligram) nên tỷ lệ bắt gặp ấu trùng dưới kính hiển vi rất thấp (chỉ đạt khoảng 30%), dẫn đến nguy cơ bỏ sót ca bệnh rất cao.

2. Bộ kit LAMP trong luận án sử dụng gen đích nào và có ưu điểm gì so với các gen khác?

Bộ kit LAMP sử dụng vùng bảo tồn trên gen 18S rRNA của Strongyloides stercoralis. Gen 18S rRNA là gen trong nhân tế bào, có tính bảo tồn trình tự rất cao giữa các phân lập giun lươn khác nhau và có nhiều bản sao lặp lại trong hệ gen của ký sinh trùng. Điều này giúp bộ mồi nhận diện chính xác, tránh bắt cặp chéo với các loài giun sán đường ruột khác (giun móc, giun mỏ, Gnathostoma), đồng thời mang lại độ nhạy phân tích cao hơn.

3. Phương thức phát hiện kết quả của bộ kit LAMP này là gì và có lợi thế nào?

Bộ kit sử dụng chất chỉ thị màu Malachite Green (MG) cho phép quan sát kết quả trực tiếp bằng mắt thường: mẫu dương tính chuyển sang màu xanh nhạt, mẫu âm tính không đổi màu/trong suốt. Lợi thế nổi bật là chất chỉ thị màu được bổ sung vào hỗn hợp phản ứng ngay từ đầu trước khi ủ nhiệt, người thực hiện đọc kết quả trực tiếp qua thành ống mà không cần mở nắp ống sau phản ứng, ngăn ngừa triệt để nguy cơ phát tán sản phẩm khuếch đại (amplicon aerosol) gây ô nhiễm phòng xét nghiệm và dương tính giả.

4. Độ ổn định và điều kiện bảo quản của bộ kit LAMP được ghi nhận ra sao?

Kết quả thực nghiệm cho thấy bộ kit LAMP chẩn đoán giun lươn duy trì đầy đủ hoạt tính khuếch đại, độ nhạy và độ đặc hiệu sau 12 tháng bảo quản ở nhiệt độ $-20^\circ\text{C}$. Ngoài ra, sinh phẩm đã chứng minh khả năng chịu đựng tốt qua ít nhất 4 chu kỳ làm tan và đông đá liên tiếp mà không suy giảm chất lượng phản ứng.

5. Tại sao kỹ thuật LAMP lại phù hợp hơn PCR và real-time PCR khi triển khai tại thực địa?

Kỹ thuật LAMP là phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt diễn ra ở nhiệt độ cố định duy nhất ($63^\circ\text{C}$), do đó chỉ cần thiết bị gia nhiệt đơn giản như nồi ủ ấm cách thủy hoặc block nhiệt mini xách tay, không đòi hỏi máy luân nhiệt theo chu kỳ hay hệ thống quang học đắt tiền như PCR/real-time PCR. Thời gian phản ứng nhanh (khoảng 60 phút) và việc đọc kết quả trực quan bằng mắt thường giúp kỹ thuật này dễ dàng áp dụng tại các phòng xét nghiệm tuyến huyện, trạm y tế hoặc các điểm điều tra lưu động ngoài thực địa.

---

Kết luận

Luận án của tác giả Trần Thị Kim Chi đã nghiên cứu xây dựng thành công quy trình công nghệ và chế tạo bộ sinh phẩm kit LAMP hoàn chỉnh chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột (Strongyloides stercoralis) ở người dựa trên gen đích 18S rRNA. Bộ kit đạt độ nhạy, độ đặc hiệu cao, kết quả đọc trực quan bằng mắt thường qua chỉ thị Malachite Green, duy trì độ ổn định bảo quản tối thiểu 12 tháng ở nhiệt độ $-20^\circ\text{C}$ và đã được thẩm định hiệu quả tại thực địa cũng như cơ sở y tế chuyên khoa. Công trình đã xây dựng thành công bộ Tiêu chuẩn cơ sở, đóng góp một công cụ sinh học phân tử có giá trị thực tiễn cao phục vụ công tác chẩn đoán, điều trị và giám sát dịch tễ bệnh giun lươn tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát hiện, nghiên cứu giun lươn Strongyloides stercoralis Strongyloides stercoralis được Normand phát hiện lần đầu tiên năm 1876 trong những mẫu phân tiêu chảy của lính Pháp đã từng ở Việt Nam, Bavay đã đặt tên Stercoralis với ý nghĩa sinh vật tìm thấy “trong phân” [46], [76]. Grassi (1879), Perroncito (1880), Leuckart (1882) đã chứng minh có 2 dạng tồn tại của S. stercoralis ở trong ruột và phân [46]. Askanazy (1900) đã cung cấp bằng chứng S.

stercoralis ký sinh ở dưới lớp nhày ruột [46]. Fulleborn (1926), Nishigori (1928), Faust (1932-1940), Hartz (1946) đã phát hiện S. stercoralis còn có chu kỳ tự nhiễm do AT thực quản ụ phình chui qua da quanh hậu môn [46]. Giống Strongyloides có khoảng 50 loài ký sinh ở đường tiêu hóa của động vật có xương sống.

Trong đó có 2 loài được xác định là gây bệnh ở người, chủ yếu là S. stercoralis và hiếm gặp hơn là S. Vật chủ chính của S. stercoralis là người, trong khi vật chủ chính của S.

fuelleborni là khỉ. fuelleborni đã được tìm thấy rải rác ở các quốc gia Châu Phi và Papua New Guinea [15]. Một số loài khác như: S. Phân loại khoa học của giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis Giới (Kingdom): Animalia Ngành (Phylum): Nematoda 4 Lớp (Class): Secernentea Bộ (Order): Rhabditida Họ (Familia): Strongyloididae Giống (Genus): Strongyloides Loài (Species): Strongyloides stercoralis 1.2 Đặc điểm sinh học, bệnh học của giun lươn S.

stercoralis là một trong những loại giun tròn ký sinh ở người và có chu kỳ phát triển phức tạp nhất, nó có chu kỳ tự nhiễm trong cơ thể vật chủ đồng thời cũng có có chu kỳ tự do ngoài vật chủ. Khi ở trong cơ thể vật chủ ấu trùng giun lươn (ATGL) có sự di chuyển ngẫu nhiên qua các mô. Vì vậy vật chủ có thể bị nhiễm GL suốt đời, bệnh cảnh nặng trong trường hợp tăng nhiễm GL hay nhiễm GL lan tỏa [33].1 Hình thái học Giun lươn có 2 giai đoạn: sống ký sinh trong cơ thể người và sống tự do ở ngoại cảnh. Hình thể giun cũng khác nhau tùy theo giai đoạn ký sinh hay không ký sinh [13], [16], [76].

Đặc điểm hình thái và sinh học của GL ký sinh được một số tác giả miêu tả như sau: Miệng có 2 môi, vỏ thân có khía ngang, nông. Kích thước (KT) nhỏ 2–2,5 mm x 50 µm, ký sinh ở trong niêm mạc ruột non. Người ta chưa tìm thấy giun đực ký sinh, giun cái có thể đẻ trứng mà không cần thụ tinh (hiện tượng trinh sản). Một con GL cái trưởng thành đẻ tối đa 40 trứng mỗi ngày.

Trứng GL hình bầu dục, vỏ mỏng trong suốt giống trứng giun móc, trứng mới đẻ đã có sẵn AT bên trong. Trứng nở ngay ở trong niêm mạc ruột non tại các khe tuyến Lieberkühn [16], [76], vì vậy rất hiếm khi thấy được 5 trứng GL. Trứng GL chỉ có thế thấy trong phân trong những trường hợp tăng nhiễm GL hoặc qua sinh thiết phế quản, phế nang trong nhiễm GL lan tỏa. ATGL trải qua 2 dạng: AT có thực quản ụ phình (nở từ trứng, xoang bao miệng ngắn, đuôi nhọn, thực quản có eo thắt nên có đoạn phình tròn) có KT 350 x 20 µm và AT có thực quản hình ống (phát triển từ AT thực quản ụ phình, kích thước thay đổi tùy theo giai đoạn phát triển, thực quản có dạng hình ống dài từ ½ - 1/3 chiều dài toàn thân, đuôi AT chẻ làm hai) [13], [16], [76].1: Trứng giun lươn [76] Hình 1.2: Phần đầu của AT thực quản ụ KT 40x30 µm phình cho thấy ụ quản phình (mũi tên xanh), xoang miệng ngắn (mũi tên đỏ) [39] KT 350 x 20 µm Hình 1.3: AT thực quản hình Hình 1.