Nghiên cứu chẩn loại giống rắn cạp nia Bungarus daudin 1803 ở Việt Nam qua hình thái và sinh học phân tử

• Tác giả: Nguyễn Quốc Huy
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thiên Tạo
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Kết hợp hình thái và sinh học phân tử trong nghiên cứu chẩn loại giống rắn cạp nia Bungarus Daudin, 1803 ở Việt Nam
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 0.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 0.3. Nội dung nghiên cứu
• 0.4. Ý nghĩa khoa học của đề tài
• 0.5. Những đóng góp mới của đề tài
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
• 1.1. Lịch sử nghiên cứu về bò sát ở Việt Nam
• 1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA-barcodes)
• 1.3. Các nghiên cứu bổ sung dẫn liệu mới về phân loại học
• 1.4. Tổng quan các nghiên cứu về giống Bungarus
• 1.4.1. Trên thế giới
• 2. CHƯƠNG 2: THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, PHƯƠNG PHÁP VÀ TƯ LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp tiếp cận giải quyết vấn đề nghiên cứu
• 2.3.2. Phương pháp kế thừa
• 2.3.3. Phương pháp khảo sát thực địa thu thập mẫu vật nghiên cứu
• 2.3.4. Phương pháp phân tích hình thái
• 2.3.5. Phương pháp phân tích sinh học phân tử
• 2.3.6. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thành phần loài của giống Bungarus ở Việt Nam
• 3.2. Danh sách các loài Bungarus ghi nhận ở Việt Nam
• 3.3. Đặc điểm hình thái các loài Bungarus ghi nhận ở Việt Nam
• 3.4. Khóa định loại các loài trong giống Bungarus ở Việt Nam
• 3.5. Đặc điểm phân tử vùng gen COI của quần thể và các loài Bungarus
• 3.6. Kết quả tách chiết ADN tổng số mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt Nam
• 3.7. Nhân bản trình tự ADN đích vùng gen COI mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt Nam
• 3.8. Xác định trình tự nucleotide vùng gen COI của các loài trong giống Bungarus tại Việt Nam
• 3.9. Trình tự đoạn gen COI của loài B.
• 3.10. Mối quan hệ di truyền giữa các loài trong giống Bungarus tại Việt Nam
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC TỪ VIẾT TẮT

I. Mở đầu

Nghiên cứu về rắn cạp nia (Bungarus daudin) tại Việt Nam có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển đa dạng sinh học. Việt Nam là một trong những quốc gia có mức độ đa dạng sinh học cao, với nhiều loài bò sát được ghi nhận. Sự gia tăng số lượng loài trong những năm gần đây cho thấy sự cần thiết phải nghiên cứu sâu hơn về phân loại và phân bố của các loài này. Việc áp dụng sinh học phân tử trong nghiên cứu giúp xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài, từ đó hỗ trợ cho công tác bảo tồn và quản lý tài nguyên sinh vật. Đặc biệt, nghiên cứu này sẽ cung cấp những dẫn liệu mới về đặc điểm hình thái và sinh học phân tử của giống Bungarus, góp phần làm rõ tên khoa học và vị trí phân loại của chúng trong hệ thống phân loại.

1.1. Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam có một hệ sinh thái phong phú với nhiều loài bò sát, trong đó có giống Bungarus. Việc nghiên cứu và phân loại các loài rắn cạp nia không chỉ giúp nâng cao hiểu biết về đa dạng sinh học mà còn hỗ trợ cho các nghiên cứu về độc tố và độc điều trị rắn cắn. Sự phát triển của mã vạch ADN đã mở ra hướng đi mới trong việc phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài. Nghiên cứu này sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc bảo tồn và phát triển giống rắn cạp nia tại Việt Nam.

II. Tổng quan về đề tài nghiên cứu

Lịch sử nghiên cứu về bò sát ở Việt Nam đã có từ lâu, nhưng sự phát triển mạnh mẽ chỉ diễn ra trong những thập kỷ gần đây. Nhiều công trình nghiên cứu đã được thực hiện, đặc biệt là trong việc phân loại và mô tả các loài mới. Việc áp dụng sinh học phân tử trong nghiên cứu đã giúp nâng cao độ chính xác trong việc phân loại và xác định mối quan hệ giữa các loài. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng giống Bungarus có nhiều loài tương tự nhau về hình thái, gây khó khăn trong việc phân loại. Do đó, việc kết hợp giữa hình thái và sinh học phân tử là cần thiết để làm rõ mối quan hệ di truyền và phân loại của các loài trong giống này.

2.1. Lịch sử nghiên cứu về bò sát ở Việt Nam

Nghiên cứu về bò sát ở Việt Nam đã có từ những năm đầu thế kỷ XX, với nhiều công trình quan trọng được công bố. Số lượng loài bò sát ghi nhận đã tăng lên đáng kể, từ 258 loài vào năm 1996 lên hơn 500 loài hiện nay. Việc áp dụng sinh học phân tử đã giúp phát hiện nhiều loài mới và làm rõ mối quan hệ giữa các loài. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng giống Bungarus có sự đa dạng cao và cần được nghiên cứu sâu hơn để xác định rõ vị trí phân loại của chúng.

III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng của các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam. Các đặc điểm hình thái và phân tử của các loài đã được phân tích và so sánh. Việc xây dựng khóa định loại cho các loài trong giống Bungarus là một trong những đóng góp quan trọng của nghiên cứu này. Kết quả phân tích ADN cho thấy mối quan hệ di truyền giữa các loài, từ đó cung cấp thông tin quý giá cho việc bảo tồn và phát triển giống rắn cạp nia tại Việt Nam. Nghiên cứu này không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn trong việc quản lý và bảo tồn tài nguyên sinh vật.

3.1. Thành phần loài của giống Bungarus ở Việt Nam

Nghiên cứu đã ghi nhận được nhiều loài thuộc giống Bungarus tại Việt Nam, trong đó có một số loài mới được phát hiện. Đặc điểm hình thái của các loài này đã được mô tả chi tiết, giúp nâng cao hiểu biết về sự đa dạng của giống rắn cạp nia. Việc phân tích sinh học phân tử đã chỉ ra mối quan hệ di truyền giữa các loài, từ đó hỗ trợ cho công tác phân loại và bảo tồn. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về giống Bungarus và các loài bò sát khác tại Việt Nam.

Tổng quan nghiên cứu

Việt Nam là một trong 25 quốc gia có mức độ đa dạng sinh học cao nhất thế giới, với hơn 500 loài bò sát được ghi nhận tính đến năm 2021. Trong đó, giống rắn cạp nia Bungarus Daudin, 1803 thuộc họ rắn hổ Elapidae là nhóm rắn độc có ý nghĩa khoa học và y học quan trọng. Trên thế giới, có 16 loài Bungarus được mô tả, phân bố chủ yếu ở Đông Nam Á và các vùng lân cận. Ở Việt Nam, hiện ghi nhận 4 loài Bungarus phân bố rộng rãi, trong đó có loài Bungarus slowinskii được xếp vào nhóm loài dễ tổn thương theo danh mục đỏ IUCN.

Nghiên cứu tập trung vào việc kết hợp phân tích hình thái và sinh học phân tử nhằm làm rõ đặc điểm phân loại, đa dạng thành phần loài và mối quan hệ di truyền của các loài Bungarus tại Việt Nam. Thời gian khảo sát thực địa kéo dài từ tháng 10/2019 đến tháng 8/2021, với 42 ngày thực địa tại 25 tỉnh trên cả nước. Mục tiêu chính là xây dựng cơ sở khoa học cho công tác giám định, bảo tồn và phát triển các loài rắn cạp nia, đồng thời cung cấp dữ liệu phục vụ nghiên cứu độc tố và điều trị rắn cắn.

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc cập nhật phân bố loài, xác định chính xác các loài Bungarus tại Việt Nam, góp phần nâng cao hiểu biết về đa dạng sinh học và hỗ trợ quản lý bảo tồn hiệu quả. Các chỉ số đa dạng sinh học và phân bố được đánh giá dựa trên số liệu thu thập thực địa và phân tích gen COI, giúp xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài và quần thể.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai khung lý thuyết chính: phân loại học truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và sinh học phân tử sử dụng mã vạch ADN (DNA barcoding). Phân loại học truyền thống dựa vào các chỉ số hình thái như số lượng vảy, kích thước cơ thể, màu sắc và các đặc điểm giải phẫu khác để phân biệt các loài. Tuy nhiên, do sự tương đồng cao về hình thái giữa các loài Bungarus, phương pháp này có hạn chế trong việc phân loại chính xác.

Sinh học phân tử sử dụng đoạn gen ty thể cytochrome c oxidase subunit I (COI) làm mã vạch ADN để phân biệt các loài dựa trên trình tự nucleotide. Phương pháp này giúp xác định mối quan hệ di truyền, phát hiện loài mới và giải quyết các nhầm lẫn trong phân loại hình thái. Các khái niệm chính bao gồm: mã vạch ADN, trình tự gen COI, cây phát sinh chủng loại, và khoảng cách di truyền.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu bao gồm 40 mẫu vật Bungarus thu thập từ 25 tỉnh trên toàn quốc và các mẫu vật lưu giữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam và Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật. Thời gian nghiên cứu từ tháng 10/2019 đến tháng 5/2021, với 5 đợt khảo sát thực địa tổng cộng 42 ngày.

Phương pháp khảo sát thực địa sử dụng máy ảnh, gậy bắt rắn, đèn pin và các dụng cụ lấy mẫu ADN. Mẫu vật được thu thập chủ yếu vào ban đêm tại các khu vực rừng, ven suối và vùng canh tác nông nghiệp. Mẫu vật được gây mê, cố định và bảo quản trong cồn 70% để phục vụ phân tích hình thái và sinh học phân tử.

Phân tích hình thái dựa trên đo đếm các chỉ số kích thước (SVL, TaL, TL, HL, HW, ED, SnL, EN, IND, IOD) và đếm số lượng vảy (ASR, MSR, PSR, VEN, SC, ANA, Lor, SL, IL, PreOc, PostOc, ATem, PTem, Parab). Các chỉ số được thống kê trung bình và độ lệch chuẩn.

Phân tích sinh học phân tử thực hiện tách chiết ADN từ mẫu cơ và gan, nhân bản đoạn gen COI bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự tại phòng thí nghiệm quốc tế. Dữ liệu trình tự được xác thực bằng công cụ BLAST và phân tích xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp Maximum Likelihood và Bayesian Inference sử dụng phần mềm Kakusan, Treefinder và MrBayes.

Xử lý số liệu thống kê sử dụng phần mềm PAST Statistics để so sánh đặc điểm hình thái và tính toán khoảng cách di truyền giữa các loài và quần thể.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Đa dạng loài và phân bố: Nghiên cứu xác nhận có 4 loài Bungarus phân bố tại Việt Nam gồm Bungarus candidus, Bungarus slowinskii, Bungarus fasciatus và Bungarus flaviceps. Ghi nhận mới về phân bố của B. candidus tại Quảng Ninh, Khánh Hòa và Sơn La; B. fasciatus tại Hà Giang. Loài B. slowinskii được xếp vào nhóm dễ tổn thương (VU) theo IUCN.

2. Đặc điểm hình thái: Các loài Bungarus có đặc điểm hình thái phân biệt rõ ràng về số lượng vảy, màu sắc khoanh trên thân và đuôi, kích thước cơ thể. Ví dụ, B. candidus có 15 hàng vảy thân, 14-25 khoanh trắng trên thân, trong khi B. fasciatus có 17 hàng vảy thân và 19-22 khoanh vàng. Độ dài tổng thể (TL) của các loài dao động từ khoảng 900 mm đến trên 1500 mm.

3. Phân tích sinh học phân tử: Tách chiết ADN thành công từ 9 mẫu vật, với tỉ lệ OD260/OD280 đạt 1,8-2,0, đảm bảo độ tinh sạch. Giải trình tự đoạn gen COI dài khoảng 700 bp cho phép phân biệt các loài và xây dựng cây phát sinh chủng loại. Khoảng cách di truyền giữa các loài Bungarus tại Việt Nam thể hiện sự khác biệt rõ rệt, hỗ trợ xác định chính xác loài và mối quan hệ tiến hóa.

4. Khóa định loại: Xây dựng khóa định loại dựa trên đặc điểm hình thái như số hàng vảy quanh thân, số hàng vảy dưới đuôi và màu sắc khoanh trên thân giúp phân biệt các loài Bungarus tại Việt Nam một cách hiệu quả.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa phân tích hình thái và sinh học phân tử là phương pháp hiệu quả để giải quyết các vấn đề phân loại phức tạp trong giống Bungarus, đặc biệt với các loài có hình thái tương đồng cao. Việc ghi nhận phân bố mới của một số loài mở rộng hiểu biết về phạm vi sinh thái và địa lý của chúng tại Việt Nam.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, kết quả phù hợp với quan điểm rằng loài Bungarus multicinctus không phân bố ở Việt Nam, thay vào đó là các loài khác như B. candidus và B. slowinskii. Phân tích gen COI cung cấp bằng chứng di truyền rõ ràng, giúp khắc phục nhầm lẫn do đặc điểm hình thái trùng lặp.

Dữ liệu hình thái và phân tử thu thập được có thể trình bày qua các bảng thống kê chỉ số hình thái, biểu đồ phân bố loài và cây phát sinh chủng loại, giúp minh họa mối quan hệ di truyền và sự khác biệt hình thái giữa các loài. Nghiên cứu góp phần làm rõ cơ sở khoa học cho công tác bảo tồn và quản lý các loài rắn độc tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tăng cường khảo sát thực địa nhằm thu thập thêm mẫu vật Bungarus tại các vùng chưa được nghiên cứu kỹ, đặc biệt các tỉnh miền núi phía Bắc và Tây Nguyên, để cập nhật chính xác đa dạng loài và phân bố trong vòng 3 năm tới. Chủ thể thực hiện: Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật phối hợp với các bảo tàng thiên nhiên.

2. Ứng dụng kết hợp phân tích hình thái và sinh học phân tử trong công tác giám định loài và nghiên cứu độc tố nọc rắn, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị rắn cắn và phát triển các sản phẩm kháng độc tố trong 2 năm tiếp theo. Chủ thể thực hiện: Các viện nghiên cứu y sinh và dược liệu.

3. Xây dựng cơ sở dữ liệu hình thái và gen về giống Bungarus tại Việt Nam, cập nhật thường xuyên và công khai trên nền tảng số để hỗ trợ nghiên cứu và quản lý bảo tồn trong 5 năm tới. Chủ thể thực hiện: Bộ Khoa học và Công nghệ phối hợp với Học viện Khoa học và Công nghệ.

4. Tuyên truyền nâng cao nhận thức cộng đồng về vai trò và tầm quan trọng của các loài rắn cạp nia trong hệ sinh thái, đồng thời hướng dẫn phòng tránh rắn cắn, giảm thiểu rủi ro cho người dân tại các vùng phân bố rắn trong 1-2 năm tới. Chủ thể thực hiện: Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, các tổ chức bảo tồn thiên nhiên.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu sinh học và phân loại học: Luận văn cung cấp dữ liệu hình thái và phân tử chi tiết, hỗ trợ nghiên cứu chuyên sâu về đa dạng sinh học và phân loại học bò sát.

2. Chuyên gia bảo tồn và quản lý tài nguyên thiên nhiên: Thông tin về phân bố và đa dạng loài Bungarus giúp xây dựng kế hoạch bảo tồn hiệu quả, đặc biệt với loài dễ tổn thương như B. slowinskii.

3. Ngành y học và dược học: Dữ liệu về phân loại và mối quan hệ di truyền của các loài rắn độc hỗ trợ nghiên cứu độc tố và phát triển kháng độc tố điều trị rắn cắn.

4. Cơ quan quản lý môi trường và giáo dục: Tài liệu làm cơ sở cho các chương trình giáo dục, tuyên truyền về bảo vệ đa dạng sinh học và phòng tránh rủi ro liên quan đến rắn độc.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần kết hợp phân tích hình thái và sinh học phân tử trong nghiên cứu Bungarus?
   Phân tích hình thái truyền thống có hạn chế do nhiều loài Bungarus có đặc điểm hình thái tương đồng cao, dễ gây nhầm lẫn. Sinh học phân tử cung cấp dữ liệu di truyền chính xác, giúp phân biệt loài và xác định mối quan hệ tiến hóa, tăng độ tin cậy cho kết quả phân loại.

2. Loài Bungarus nào được ghi nhận là dễ tổn thương tại Việt Nam?
   Loài Bungarus slowinskii được xếp vào nhóm dễ tổn thương (VU) theo danh mục đỏ IUCN, do phạm vi phân bố hạn chế và số lượng cá thể giảm.

3. Phương pháp tách chiết ADN và giải trình tự gen COI được thực hiện như thế nào?
   Mẫu cơ hoặc gan được tách chiết ADN bằng bộ Kit chuyên dụng, sau đó nhân bản đoạn gen COI khoảng 700 bp bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự hai chiều tại phòng thí nghiệm quốc tế, dữ liệu được xác thực bằng công cụ BLAST.

4. Khóa định loại Bungarus tại Việt Nam dựa trên những đặc điểm nào?
   Khóa định loại dựa trên số hàng vảy quanh thân (13 hoặc 15-17), số hàng vảy dưới đuôi (đơn hoặc kép), màu sắc khoanh trên thân (vàng hoặc trắng) và các đặc điểm hình thái khác như vảy môi, vảy bụng.

5. Ý nghĩa ứng dụng của nghiên cứu này trong bảo tồn và y học?
   Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc giám định chính xác các loài rắn độc, hỗ trợ phát triển kháng độc tố điều trị rắn cắn, đồng thời giúp xây dựng các chiến lược bảo tồn hiệu quả nhằm duy trì đa dạng sinh học và cân bằng sinh thái.

Kết luận

• Xác định và cập nhật 4 loài Bungarus phân bố tại Việt Nam, trong đó có ghi nhận phân bố mới của B. candidus và B. fasciatus.
• Kết hợp phân tích hình thái và sinh học phân tử giúp phân loại chính xác và làm rõ mối quan hệ di truyền giữa các loài.
• Xây dựng khóa định loại hiệu quả dựa trên đặc điểm hình thái và dữ liệu gen COI.
• Cung cấp dữ liệu khoa học làm cơ sở cho công tác bảo tồn, giám định và nghiên cứu độc tố rắn cạp nia.
• Đề xuất các giải pháp nghiên cứu, bảo tồn và tuyên truyền nhằm nâng cao hiệu quả quản lý và sử dụng nguồn tài nguyên sinh vật quý giá này.

Tiếp theo, cần triển khai khảo sát mở rộng, hoàn thiện cơ sở dữ liệu gen và hình thái, đồng thời tăng cường hợp tác nghiên cứu đa ngành để phát huy tối đa giá trị ứng dụng của kết quả nghiên cứu. Các nhà khoa học, cơ quan quản lý và cộng đồng được khuyến khích tham khảo và áp dụng kết quả nghiên cứu trong thực tiễn bảo tồn và y học.