Khóa Luận Tốt Nghiệp: Chẩn Đoán Virus Hại Lúa Và Tính Gây Bệnh Của Vi Khuẩn Bạc Lá Lúa

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu chẩn đoán virus hại lúa và tính gây bệnh của vi khuẩn bạc lá lúa, cung cấp thông tin chi tiết về bệnh hại lúa.

• Tác giả: Khuất Thị Yến
• Người hướng dẫn: PGS.TS. Hà Viết Cường
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
• Đề tài: Nghiên cứu chẩn đoán virus hại lúa và tính gây bệnh của vi khuẩn bạc lá lúa
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• I. PHẦN I: MỞ ĐẦU
• I.1. Mục đích và yêu cầu
• II. PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• II.1. Tầm quan trọng của cây lúa
• II.2. Thành phần và phân bố bệnh hại do virus gây ra trên cây lúa trên thế giới
• II.3. Các bệnh virus gây hại trên lúa phổ biến tại Việt Nam
• II.3.1. Bệnh vàng lùn lúa: virus gây bệnh vàng lùn lúa rice grassy stunt virus
• II.3.2. Bệnh lùn xoắn lá: virus gây bệnh lùn xoắn lá lúa rice ragged stunt virus
• II.3.3. Bệnh lùn sọc đen phương nam: virus gây bệnh lùn sọc đen phương Nam Southern rice black-streaked dwarf virus
• II.3.4. Bệnh vàng lụi lúa: do virus rice yellow stunt virus gây ra
• II.4. Biện pháp phòng chống các bệnh hại virus chính trên lúa
• II.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh và phát triển kĩ thuật PTA - ELISA
• II.5.1. Các phương pháp chẩn đoán bệnh
• II.5.2. Nghiên cứu phát triển kĩ thuật chẩn đoán dựa vào huyết thanh học ELISA
• II.6. Nghiên cứu bệnh bạc lá lúa: Xanthomonas oryzae pv oryzae
• II.6.1. Phân bố của bệnh bạc lá lúa trên thế giới và Việt Nam
• II.6.2. Triệu chứng, dấu hiệu và quy luật phát sinh phát triển
• II.6.3. Hình thái vi khuẩn và khuẩn lạc
• II.6.4. Biện pháp phòng chống
• III. PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• III.1. Đối tượng nghiên cứu
• III.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• III.2.1. Địa điểm nghiên cứu
• III.2.2. Thời gian nghiên cứu
• III.3. Vật liệu nghiên cứu
• III.4. Môi trường sử dụng nuôi cấy
• III.5. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu chính
• III.6. Phương pháp nghiên cứu
• III.6.1. Phương pháp chiết RNA tổng số
• III.6.2. Phương pháp RT – PCR
• III.6.3. Kĩ thuật điện di sản phẩm RT-PCR trên gel Agarose 1 %
• III.6.4. Gây miễn dịch tạo kháng thể đa dòng trên thỏ
• III.6.5. Đánh giá kháng thể bằng kĩ thuật ELISA
• III.6.6. Phân lập vi khuẩn
• III.6.7. Kỹ thuật PCR kiểm tra các chủng vi khuẩn Xanthomons Oryzae pv oryzae được phân lập
• III.6.8. Đánh giá khả năng gây bệnh các chủng vi khuẩn bạc lá được phân lập
• IV. PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• IV.1. Kết quả kiểm tra các mẫu bệnh
• IV.2. Phát hiện lùn sọc đen phương nam trên mẫu rầy, mẫu lúa thu thập tại Nghệ An (năm 2021) và Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới bằng kĩ thuật RT-PCR, ELISA và DOT BLOT
• IV.3. Phát hiện virus rice yellow stunt virus gây bệnh vàng lụi lúa tại Hà Tĩnh năm 2021 bằng kĩ thuật PTA-ELISA
• IV.4. Phát hiện virus vàng lùn, lùn xoắn lá các mẫu bệnh thu thập tại Hậu Giang và Kiên Giang năm 2021 bằng kĩ thuật RT-PCR
• IV.5. Kiểm tra mẫu virus vàng lùn và lùn xoắn lá mẫu khô tại Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới bằng kĩ thuật RT-PCR
• IV.6. Kết quả nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng
• IV.6.1. Gây miễn dịch trên thỏ và kiểm tra sự có mặt của kháng thể
• IV.6.2. Đánh giá ảnh hưởng của hấp thụ chéo đến phản ứng PTA-ELISA của KHT P9 và S10N với các công thức xử lý dịch nghiền khác nhau
• IV.6.3. Đánh giá toàn bộ KHT virus lúa bằng kỹ thuật PTA- ELISA
• IV.6.4. Đánh giá chất lượng của năm nguồn KHT: RGSV-Virion 08, RGSV- NCP 03, RRSV-Virion 10-L, RRSV-P9-10, RRSV-P9-21 bằng kỹ thuật PTA-ELISA
• IV.7. Kết quả nghiên cứu Xanthomonas oryzae pv oryzae
• IV.7.1. Mẫu thu thập
• IV.7.2. Kiểm tra PCR các dòng vi khuẩn phân lập được
• IV.7.3. Kiểm tra khả năng gây bệnh của các chủng bạc lá phân lập được
• V. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu và mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán virus hại lúa và tính gây bệnh của vi khuẩn bạc lá lúa. Mục tiêu chính là xác định chính xác các loại virus gây bệnh như lùn sọc đen phương nam, vàng lùn, và lùn xoắn lá thông qua kỹ thuật RT-PCR và huyết thanh học. Đồng thời, nghiên cứu cũng phân lập và đánh giá khả năng gây bệnh của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae, tác nhân gây bệnh bạc lá lúa.

1.1. Tầm quan trọng của cây lúa

Cây lúa là cây lương thực chính ở Việt Nam và nhiều nước châu Á. Sản lượng lúa góp phần đảm bảo an ninh lương thực và xuất khẩu. Tuy nhiên, bệnh hại lúa do virus và vi khuẩn gây ra đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất. Các bệnh như vàng lùn, lùn xoắn lá, và bạc lá lúa đã gây thiệt hại lớn trên diện rộng.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu nhằm phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh lúa hiệu quả, bao gồm RT-PCR và ELISA, để xác định sớm các tác nhân gây bệnh. Đồng thời, nghiên cứu cũng đánh giá tính gây bệnh của các chủng vi khuẩn bạc lá lúa nhằm tìm ra biện pháp phòng trừ hiệu quả.

II. Tổng quan về bệnh hại lúa

Các bệnh hại lúa do virus và vi khuẩn gây ra đã được ghi nhận trên toàn thế giới. Tại Việt Nam, các bệnh như vàng lùn, lùn xoắn lá, và bạc lá lúa đã gây thiệt hại lớn về năng suất. Các phương pháp chẩn đoán bệnh hiện đại như RT-PCR và ELISA đã được áp dụng để phát hiện sớm và kiểm soát dịch bệnh.

2.1. Bệnh virus hại lúa

Các virus hại lúa như Rice grassy stunt virus (RGSV), Rice ragged stunt virus (RRSV), và Southern rice black-streaked dwarf virus (SRBSDV) đã gây ra các bệnh nghiêm trọng như vàng lùn, lùn xoắn lá, và lùn sọc đen. Các bệnh này lan truyền chủ yếu qua rầy nâu, gây thiệt hại lớn trên diện rộng.

2.2. Bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm nhất, có thể làm giảm năng suất lên đến 100%. Bệnh lan truyền qua nước, gió, và dụng cụ nông nghiệp, gây khó khăn trong việc kiểm soát.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại như RT-PCR, ELISA, và PCR để chẩn đoán và phân tích các tác nhân gây bệnh. Các mẫu bệnh được thu thập từ các vùng trồng lúa khác nhau, sau đó được phân tích trong phòng thí nghiệm để xác định virus và vi khuẩn gây bệnh.

3.1. Chẩn đoán virus hại lúa

Phương pháp RT-PCR được sử dụng để phát hiện các virus hại lúa như RGSV, RRSV, và SRBSDV. Kỹ thuật ELISA cũng được áp dụng để kiểm tra sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu trong các mẫu bệnh.

3.2. Phân lập và đánh giá vi khuẩn bạc lá lúa

Các mẫu bệnh bạc lá lúa được phân lập và kiểm tra bằng PCR để xác định sự hiện diện của Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn được đánh giá thông qua phương pháp lây nhiễm nhân tạo.

IV. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc chẩn đoán các virus hại lúa và đánh giá tính gây bệnh của vi khuẩn bạc lá lúa. Các kết quả cho thấy hiệu quả của các phương pháp RT-PCR và ELISA trong việc phát hiện sớm các tác nhân gây bệnh. Đồng thời, nghiên cứu cũng cung cấp thông tin quan trọng về khả năng gây bệnh của các chủng Xanthomonas oryzae pv. oryzae.

4.1. Kết quả chẩn đoán virus hại lúa

Phương pháp RT-PCR đã phát hiện thành công các virus hại lúa trong các mẫu bệnh thu thập. Kỹ thuật ELISA cũng cho thấy hiệu quả cao trong việc kiểm tra kháng thể đặc hiệu, giúp xác định sớm các bệnh do virus gây ra.

4.2. Kết quả đánh giá vi khuẩn bạc lá lúa

Các chủng Xanthomonas oryzae pv. oryzae được phân lập và kiểm tra bằng PCR đã cho thấy khả năng gây bệnh cao. Kết quả lây nhiễm nhân tạo cũng xác nhận tính gây hại của các chủng vi khuẩn này trên các giống lúa khác nhau.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã đóng góp quan trọng trong việc chẩn đoán và kiểm soát các bệnh hại lúa do virus và vi khuẩn gây ra. Các phương pháp RT-PCR và ELISA đã chứng minh hiệu quả cao trong việc phát hiện sớm các tác nhân gây bệnh. Đồng thời, nghiên cứu cũng cung cấp thông tin quan trọng về tính gây bệnh của vi khuẩn bạc lá lúa, giúp phát triển các biện pháp phòng trừ hiệu quả.

5.1. Đóng góp của nghiên cứu

Nghiên cứu đã phát triển thành công các phương pháp chẩn đoán bệnh lúa hiệu quả, giúp giảm thiểu thiệt hại do virus và vi khuẩn gây ra. Các kết quả nghiên cứu cũng cung cấp cơ sở khoa học cho việc quản lý dịch bệnh trong nông nghiệp.

5.2. Hướng phát triển trong tương lai

Cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh lúa nhanh chóng và chính xác hơn. Đồng thời, cần tìm hiểu thêm về cơ chế gây bệnh của các virus và vi khuẩn để phát triển các biện pháp phòng trừ bền vững.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực trụ cột đảm bảo an ninh lương thực quốc gia và mang lại giá trị xuất khẩu đạt trên 3,05 tỷ USD mỗi năm cho Việt Nam. Tuy nhiên, sản xuất lúa luôn đối mặt với áp lực dịch hại nghiêm trọng từ các tác nhân virus và vi khuẩn. Điển hình, đại dịch vàng lùn (Rice grassy stunt virus - RGSV) và lùn xoắn lá (Rice ragged stunt virus - RRSV) năm 2006 tại Đồng bằng sông Cửu Long đã gây hại trên 500.000 ha, làm sụt giảm 825.000 tấn lúa với thiệt hại ước tính hơn 2.000 tỷ đồng. Tương tự, dịch lùn sọc đen phương Nam (Southern rice black-streaked dwarf virus - SRBSDV) bùng phát năm 2009 tại miền Bắc và miền Trung đã gây nhiễm 42.385 ha lúa tại 21 tỉnh, buộc tiêu hủy trắng hơn 13.000 ha. Song song đó, bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây tổn thất thường niên 20–30%, cá biệt lên đến 50% năng suất trong vụ Mùa.

Hiện nay, các bệnh do virus trên lúa hoàn toàn không có thuốc điều trị đặc hiệu; giải pháp khả thi duy nhất là phòng trừ môi giới truyền bệnh (rầy nâu Nilaparvata lugens, rầy lưng trắng Sogatella furcifera) và tiêu hủy sớm tàn dư cây bệnh. Tuy nhiên, công tác kiểm soát gặp rào cản lớn do chi phí xét nghiệm RT-PCR đắt đỏ, đòi hỏi thiết bị phức tạp và nhân sự tay nghề cao, trong khi nguồn kit chẩn đoán huyết thanh học ngoại nhập có giá thành cao và phụ thuộc hoàn toàn vào nước ngoài. Đối với vi khuẩn bạc lá Xoo, cơ cấu chủng biến đổi phức tạp theo vùng sinh thái dẫn đến hiện tượng phá vỡ tính kháng của các giống lúa mới.

Đề tài “Nghiên cứu chẩn đoán virus hại lúa và tính gây bệnh của vi khuẩn bạc lá lúa” được thực hiện nhằm giải quyết các mắt xích kỹ thuật trọng tâm:

1. Chẩn đoán chính xác các virus SRBSDV, RGSV, RRSV và RYSV trên mẫu lúa và rầy môi giới bằng kỹ thuật RT-PCR và miễn dịch học.
2. Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng (polyclonal antibody) trên thỏ kháng protein vỏ P9 (RRSV) và S10N (SRBSDV) từ nguồn kháng nguyên tái tổ hợp sạch.
3. Hoàn thiện quy trình PTA-ELISA (Plate trapped antigen - ELISA) tối ưu hóa bước hấp thụ chéo (cross-absorption) nhằm loại bỏ tín hiệu dương tính giả từ protein thực vật.
4. Phân lập, kiểm tra định danh bằng PCR và đánh giá độc lực gây bệnh của các chủng vi khuẩn bạc lá lúa (Xoo) thu thập tại thực địa trên bộ giống chỉ thị mang gen Xa.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Nam Định, Hà Nội (Phúc Thọ), Nghệ An, Hà Tĩnh, Hậu Giang, Kiên Giang và lưu trữ tại Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây Nhiệt đới (Học viện Nông nghiệp Việt Nam).

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Các phương pháp chẩn đoán bệnh virus thực vật hiện hành bộc lộ nhiều ưu nhược điểm khi triển khai ở quy mô diện rộng:

Phương pháp chẩn đoán	Độ nhạy & Độ đặc hiệu	Chi phí trên 1 mẫu	Thời gian phân tích	Yêu cầu thiết bị & Kỹ thuật	Khả năng xử lý mẫu lớn (Mass screening)
Kính hiển vi điện tử (TEM)	Rất cao (quan sát trực tiếp virion)	Rất cao (>500.000 VNĐ)	2–4 giờ	Kính hiển vi điện tử siêu phân giải, kỹ thuật cắt lát siêu mỏng	Kém (1–2 mẫu/lần)
RT-PCR / RT-qPCR	Tuyệt đối (phát hiện ở mức pg RNA)	Cao (120.000–180.000 VNĐ)	4–6 giờ	Máy luân nhiệt PCR, buồng điện di UV, kỹ thuật viên chuyên sâu	Trung bình (24–96 mẫu/mẻ)
DAS-ELISA (Kit nhập ngoại)	Cao (1–10 ng virus protein)	Trung bình (60.000–90.000 VNĐ)	24–48 giờ	Đầu đọc ELISA plate reader, phụ thuộc chuỗi cung ứng quốc tế	Tốt (hàng trăm mẫu/ngày)
PTA-ELISA tối ưu nội địa	Cao (tương đương DAS-ELISA)	Thấp (25.000–35.000 VNĐ)	12–24 giờ	Máy ủ cơ bản, buồng đọc OD quang học, quy trình chuẩn hóa	Rất tốt (hàng nghìn mẫu/ngày)

Yêu cầu phân cấp theo mô hình MoSCoW:

• Must-have: Sản xuất thành công kháng thể đa dòng kháng RRSV-P9 và SRBSDV-S10N; quy trình RT-PCR One-step và Two-step chuẩn hóa; phân lập thuần khiết vi khuẩn Xoo.
• Should-have: Kỹ thuật hấp thụ chéo triệt tiêu nền phản ứng trên PTA-ELISA; bộ mồi đặc hiệu khuếch đại chính xác từng phân đoạn genome virus.
• Could-have: Triển khai chẩn đoán nhanh dạng Dot-blot trên màng nitrocellulose phục vụ trắc nghiệm hiện trường.
• Won't-have: Giải trình tự toàn bộ hệ gene (Next-Generation Sequencing) cho tất cả các chủng thu thập.

Thiết kế hệ thống

Kiến trúc giải pháp chẩn đoán tích hợp được xây dựng theo mô hình phân tích hai nhánh:

graph TD
    A[Mẫu lá lúa / Môi giới rầy nâu, rầy lưng trắng] --> B{Phân tách mẫu}
    B -->|Bệnh phẩm Virus| C[Chiết tách RNA tổng số: CTAB + ME / Easy Blue Kit]
    B -->|Bệnh phẩm Bạc lá| D[Phân lập vi khuẩn trên môi trường PSA / mXOS]
    C --> E[Khuếch đại RT-PCR với cặp mồi chuyên biệt]
    C --> F[Cố định kháng nguyên dịch cây lên phiến nhựa PTA-ELISA]
    E --> G[Điện di Gel Agarose 1% & Soi bản gel UV]
    F --> H[Kháng thể thỏ IgG + Hấp thụ chéo dịch cây khỏe]
    H --> I[Kháng thể thứ cấp liên kết Enzyme AP + Cơ chất pNPP]
    I --> J[Đo mật độ quang OD 405nm / Đánh giá màu Dot-blot]
    D --> K[Kiểm tra Multiplex PCR vi khuẩn Xoo]
    K --> L[Lây bệnh nhân tạo bằng phương pháp cắt kéo trên bộ giống chỉ thị IRBB]

Danh mục hóa chất, sinh phẩm và công cụ chuyên dụng:

• Enzyme & Reagents: RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas), DreamTaq DNA Polymerase (Fermentas), Tripure Isolation Reagent (Roche), M-MuLV Reverse Transcriptase (NEB, 200 U/µl).
• Hệ thống đệm huyết thanh: Đệm Carbonate cố định mẫu (pH 9.6: 15 mM $\text{Na}_2\text{CO}_3$, 35 mM $\text{NaHCO}_3$), Đệm rửa PBS-T (pH 7.4 + 0.05% Tween-20), Đệm hòa mẫu PBS-T + 2% PVP + 0.2% Ovalbumin.
• Chất phát hiện màu: p-Nitrophenyl Phosphate (pNPP, Sigma viên nén 5 mg), Kháng thể thứ cấp Dê kháng Thỏ liên kết kiềm Phosphatase (Goat Anti-Rabbit IgG-AP Conjugate, Sigma).

Methodology

Nghiên cứu áp dụng quy trình thực nghiệm sinh học phân tử và huyết thanh học đa bước:

1. Thu thập mẫu dịch tễ: Lấy mẫu lúa có triệu chứng lá xoắn vặn, u sưng rễ, sọc phồng trắng dọc gân lá tại Nghệ An, Hà Tĩnh, Kiên Giang; mẫu lá bạc lá điển hình tại Nam Định, Hà Nội.
2. Quy trình miễn dịch động vật: Thỏ New Zealand khỏe mạnh (2.0–2.5 kg) được gây miễn dịch bằng kháng nguyên protein tái tổ hợp P9 (RRSV) và S10N (SRBSDV) ở nồng độ 1.69 mg/ml trong dung dịch Urea 4M phối trộn chất bổ trợ Freund theo tỷ lệ 1:1. Tiêm bắp đùi định kỳ 7 ngày/lần trong 4 tuần liên tiếp; thu nhận huyết thanh ở các tuần thứ 5, 6 và 7.
3. Đánh giá rủi ro & QA: Kiểm soát nhiễm chéo mẫu bằng đối chứng âm (cây lúa khỏe trồng cách ly trong nhà lưới) và đối chứng dương (mẫu virus chuẩn từ Trung tâm Bệnh cây Nhiệt đới).

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình tinh chiết RNA tổng số được chuẩn hóa qua 2 quy trình: phương pháp CTAB truyền thống (bổ sung 1% $\beta$-mercaptoethanol, kết tủa LiCl 10M ở $-20^\circ\text{C}$) và kit thương mại Easy Blue.

Hệ thống mồi chuyên biệt và chu trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR:

Cặp mồi SRBSDV (Phân đoạn S10, Kích thước 600 bp):
  RB-S10-F2: 5'-TCCATAATGGCTGACATAAGAC-3'
  RB-S10-R2: 5'-CATTTGAGCAGGAACTTCACG-3'

Cặp mồi RRSV (Khung đọc mở P9, Kích thước 1020 bp):
  RR-P9-F:   5'-AGAGGATCCATGAAGACTGCCTTTGCCAG-3'
  RR-P9-R:   5'-TCTGAGCTCCTACCCCGAGGCCTTCTGAG-3'

Cặp mồi RGSV (Phân đoạn PC5 và P6):
  RG-PC5-F:  5'-AGAGGATCCATGGGTAAAGTGCAATTTGG-3' (980 bp)
  RG-PC5-R:  5'-TCTCTCGAGTCACTTATCAACCAGAGTCT-3'
  RG-P6-F:   5'-AGAGGATCCATGTCTAAATCTCATTCTGAC-3' (540 bp)
  RG-P6-R:   5'-TCTCTCGAGTCATGTTGTTAAGCCACTCA-3'

Cấu hình phản ứng RT-PCR Two-step (Tổng hợp cDNA bằng M-MuLV Reverse Transcriptase ở $42^\circ\text{C}$ trong 60 phút, bất hoạt ở $70^\circ\text{C}$ trong 10 phút):

# Protocol chu trình nhiệt khuếch đại PCR (35 chu kỳ)
thermal_profile = {
    "Initial_Denaturation": {"temp_C": 95, "time_s": 180},
    "Amplification_Cycle_35x": [
        {"step": "Denaturation", "temp_C": 95, "time_s": 20},
        {"step": "Annealing",    "temp_C": 58, "time_s": 30}, # 60°C cho mồi RR-P9
        {"step": "Extension",    "temp_C": 72, "time_s": 45}  # Tốc độ ~1 kb/phút
    ],
    "Final_Extension":      {"temp_C": 72, "time_s": 300},
    "Hold":                 {"temp_C": 4,  "time_s": "infinity"}
}

Quy trình xử lý triệt tiêu phản ứng chéo trong PTA-ELISA: Mẫu lá lúa được nghiền trong đệm Carbonate tỷ lệ 1:10 (w/v), ly tâm 8.000 vòng/phút trong 3 phút, phủ 100 µl dịch nổi vào giếng gián tiếp ủ qua đêm ở $4^\circ\text{C}$. Kháng huyết thanh thỏ được pha loãng ở các nồng độ 1:200, 1:500, 1:1000 và 1:5000 trong dịch chiết lá cây lúa khỏe hòa tan đệm PBS-T + 2% PVP + 0.2% Ovalbumin nhằm hấp thụ hoàn toàn các kháng thể kháng protein thực vật không đặc hiệu.

Testing và validation

Hiệu năng phát hiện virus của các phương pháp được kiểm tra chéo:

• So sánh RT-PCR One-step và Two-step: Trên các mẫu mô lá khô bảo quản lâu năm nhiễm RRSV, phương pháp Two-step cho tỷ lệ khuếch đại vạch 1020 bp đạt 100% (5/5 mẫu dương tính rõ nét), trong khi phương pháp One-step chỉ phát hiện mờ nhạt 2/5 mẫu do sự ức chế của các hợp chất phenolic tồn dư.
• Tối ưu hóa hiệu giá kháng thể PTA-ELISA: Kháng huyết thanh thỏ lấy máu lần 2 đối với RRSV-P9 cho hiệu giá phát hiện đặc hiệu ở độ pha loãng 1:1000 với tỷ số tín hiệu $\text{OD}{405} \text{ (Mẫu bệnh)} / \text{OD}{405} \text{ (Mẫu khỏe)} > 3.8$. Bước hấp thụ chéo dịch cây khỏe đã hạ thấp nền $\text{OD}_{405}$ của đối chứng âm từ 0.385 xuống 0.082, loại bỏ triệt để hiện tượng dương tính giả.
• Kiểm định vi khuẩn bạc lá Xoo: Phân lập thành công các dòng vi khuẩn trên môi trường chọn lọc PSA và mXOS tạo khuẩn lạc tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn. Phản ứng Multiplex PCR xác nhận băng đặc hiệu kích thước chuẩn của Xanthomonas oryzae pv. oryzae.

Kết quả đạt được

1. Khảo sát virus thực địa:
   • 100% mẫu lúa nghi nhiễm lùn sọc đen tại Nghệ An (2021) và mẫu rầy lưng trắng bắt trên ruộng đều cho kết quả dương tính với SRBSDV bằng cặp mồi RB-S10-F2/R2 (vạch 600 bp).
   • Kiểm tra mẫu lúa vàng lụi tại Hà Tĩnh bằng PTA-ELISA xác nhận sự hiện diện của virus Rice yellow stunt virus (RYSV).
   • Xác định chính xác các mẫu lúa u sưng rễ tại Kiên Giang và Hậu Giang nhiễm đồng thời cả RGSV và RRSV.
2. Chất lượng kháng huyết thanh: Đánh giá toàn diện 5 nguồn kháng huyết thanh lưu trữ: RGSV-Virion 08, RGSV-NCP 03, RRSV-Virion 10-L, RRSV-P9-10, RRSV-P9-21. Xác định RGSV-Virion 08 và RRSV-P9-10 có hoạt tính miễn dịch mạnh nhất, cho phản ứng màu đậm rõ rệt trên cả phiến ELISA và màng Dot-blot.
3. Độc lực các chủng Xoo trên bộ giống lúa chỉ thị:
   • Lây bệnh nhân tạo bằng phương pháp cắt kéo (clip-inoculation) với huyền phù vi khuẩn mật độ $10^8 \text{ CFU/ml}$.
   • Chủng vi khuẩn phân lập tại Nam Định và Phúc Thọ gây cháy lá nghiêm trọng trên các giống Bắc Thơm 7, BC15 và nếp địa phương (chiều dài vết bệnh 14.5–18.2 cm sau 14 ngày).
   • Trên bộ giống chỉ thị quốc tế: Các dòng mang gen đơn lẻ Xa2, Xa3, Xa4, Xa10 bị nhiễm từ trung bình đến nặng; trong khi dòng mang gen xa5 (IRBB5) và Xa7 (IRBB7) thể hiện tính kháng cao với chiều dài vết bệnh $< 2.0 \text{ cm}$.

Đổi mới và đóng góp

Nghiên cứu mang lại những đóng góp học thuật và giải pháp kỹ thuật cụ thể:

• Tự chủ công nghệ sinh phẩm chẩn đoán: Chế tạo thành công kháng thể đa dòng kháng protein P9 của RRSV và S10N của SRBSDV tại Việt Nam, phá vỡ sự phụ thuộc vào các bộ kit ELISA thương mại nhập khẩu từ Nhật Bản hoặc châu Âu.
• Tối ưu hóa kỹ thuật loại bỏ nền miễn dịch: Thiết lập công thức đệm hấp thụ chéo dịch cây khỏe cải tiến (PBS-T + PVP + Ovalbumin), giúp kỹ thuật PTA-ELISA đạt độ tin cậy tương đương DAS-ELISA nhưng tiết kiệm 1 bước liên kết kháng thể sơ cấp, rút ngắn 35% thời gian thao tác.
• Tiết kiệm chi phí vận hành: Giảm chi phí xét nghiệm mẫu từ 150.000 VNĐ/mẫu (RT-PCR) xuống dưới 30.000 VNĐ/mẫu (PTA-ELISA), cho phép các trạm BVTV tuyến huyện sàng lọc hàng nghìn mẫu rầy mang virus trước mùa vụ.
• Cập nhật bức tranh dịch tễ học phân tử: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về phổ độc tính của các phân lập Xoo hiện hành tại đồng bằng sông Hồng, làm cơ sở khoa học định hướng sử dụng tổ hợp gen kháng xa5 + Xa7 trong các chương trình chọn giống lúa thuần kháng bạc lá.

Ứng dụng thực tế và triển khai

Quy trình chẩn đoán và dữ liệu từ đề tài được thiết kế để chuyển giao trực tiếp vào mạng lưới bảo vệ thực vật quốc gia:

Triển khai thực địa:

• Bài toán kinh tế & ROI: Một trạm BVTV cấp tỉnh kiểm tra 5.000 mẫu rầy/vụ bằng phương pháp PTA-ELISA nội địa sẽ tiết kiệm hơn 600 triệu đồng chi phí hóa chất so với gửi phân tích RT-PCR dịch vụ, đồng thời rút ngắn thời gian trả kết quả từ 5 ngày xuống 24 giờ.
• Chiến lược phòng trừ sớm: Phát hiện tỷ lệ rầy lưng trắng mang virus SRBSDV $> 5%$ hoặc rầy nâu mang RGSV/RRSV $> 10%$ cho phép kích hoạt ngay các biện pháp can thiệp: phun thuốc trừ rầy tại ruộng mạ, điều chỉnh lịch gieo cấy "né rầy", hoặc tiêu hủy diện hẹp, ngăn chặn hoàn toàn nguy cơ dịch hại trên diện tích hàng trăm nghìn hecta.

Hạn chế và hướng phát triển

• Hạn chế kỹ thuật: Kháng thể đa dòng sản xuất từ huyết thanh thỏ có tính hữu hạn về thể tích và độ đồng nhất giữa các mẻ tiêm khác nhau; vẫn tồn tại nguy cơ suy giảm hoạt tính nếu bảo quản sai nhiệt độ (yêu cầu $-20^\circ\text{C}$ với 50% Glycerol).
• Hướng phát triển tiếp theo:
  1. Ứng dụng công nghệ kháng thể đơn dòng (Monoclonal Antibodies) hoặc kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp (Nanobodies) để sản xuất que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch (Lateral Flow Strip Test) dùng trực tiếp ngoài đồng ruộng trong 15 phút.
  2. Xây dựng quy trình Multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời 4 loại virus (SRBSDV, RRSV, RGSV, RYSV) trong một ống phản ứng duy nhất.
  3. Mở rộng khảo sát tính độc hại của vi khuẩn bạc lá Xoo trên các giống lúa lai nhập nội thế hệ mới.

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên chuyên ngành BVTV/Nông học: Tài liệu tham khảo chuẩn mực về quy trình miễn dịch động vật, chiết tách acid nucleic trên mô thực vật khó tính và kỹ thuật ELISA.
• Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm kiểm dịch thực vật: Sở hữu quy trình chuẩn (SOP) chẩn đoán nhanh, độ nhạy cao, dễ nhân rộng tại các phòng xét nghiệm tiêu chuẩn ISO/IEC 17025.
• Cơ quan quản lý nông nghiệp & Chi cục Trồng trọt - BVTV: Công cụ dự tính dự báo sớm chính xác, hỗ trợ ra quyết định khoanh vùng dập dịch kịp thời.
• Nhà chọn tạo giống cây trồng: Dữ liệu kiểu hình độc tính vi khuẩn Xoo giúp định hướng tích hợp chính xác các gen kháng đa dòng (pyramiding genes) vào giống lúa xuất khẩu.

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu trang thiết bị tối thiểu để triển khai quy trình PTA-ELISA tại cơ sở là gì?
   Cơ sở chỉ cần trang bị: máy đo mật độ quang phiến 96 giếng (ELISA Reader bước sóng 405 nm), máy ủ nhiệt/tủ lạnh $4^\circ\text{C}$, máy ly tâm bàn mini (tối đa 10.000 rpm), máy lắc đĩa và hệ thống micropipette chuẩn.

2. Tại sao phương pháp RT-PCR Two-step lại tối ưu hơn One-step đối với mẫu bệnh lúa khô?
   Mô lúa khô bảo quản lâu ngày thường tích lũy nồng độ cao hợp chất polyphenol và polysaccharide gây ức chế enzyme Taq polymerase. Phương pháp Two-step tách biệt giai đoạn phiên mã ngược tạo cDNA ổn định, cho phép pha loãng dịch cDNA để giảm nồng độ chất ức chế trước khi bước vào chu kỳ khuếch đại PCR.

3. Làm thế nào để xử lý triệt để hiện tượng phản ứng chéo gây dương tính giả trong xét nghiệm ELISA?
   Cần thực hiện bước hấp thụ chéo: Kháng huyết thanh thỏ trước khi cho vào giếng phản ứng được ủ trước với dịch chiết lá lúa khỏe tỷ lệ 1:10 trong đệm PBS-T bổ sung 2% PVP và 0.2% Ovalbumin. Các kháng thể không đặc hiệu sẽ liên kết hết với protein thực vật tự nhiên, chỉ còn lại kháng thể đặc hiệu bắt cặp với kháng nguyên virus.

4. Kháng huyết thanh thỏ sau khi tinh chế bảo quản được trong bao lâu?
   Kháng huyết thanh thô sau khi tách huyết tương, bổ sung $0.02% \text{ NaN}_3$ và $50%$ Glycerol có thể bảo quản ổn định ở $-20^\circ\text{C}$ trong 3–5 năm mà không suy giảm đáng kể hiệu giá kháng thể.

5. Giống lúa nào hiện nay có khả năng kháng tốt nhất với các chủng vi khuẩn bạc lá phân lập được?
   Các dòng lúa chỉ thị mang gen xa5 (như IRBB5) và Xa7 (như IRBB7) thể hiện khả năng kháng hoàn toàn (vết bệnh $< 2\text{ cm}$) đối với tất cả các chủng vi khuẩn Xoo thu thập tại Nam Định và Hà Nội.

Kết luận

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu khoa học đề ra: làm chủ quy trình RT-PCR độ nhạy cao để chẩn đoán chính xác các tác nhân virus nguy hiểm hại lúa (SRBSDV, RGSV, RRSV, RYSV); chế tạo thành công nguồn kháng thể đa dòng kháng P9 và S10N chất lượng cao; hoàn thiện kỹ thuật PTA-ELISA với giải pháp hấp thụ chéo giúp giảm 70% chi phí xét nghiệm; đồng thời xác định độc lực của các chủng vi khuẩn bạc lá Xoo và khẳng định hiệu quả của gen kháng xa5 và Xa7. Kết quả này là bước tiến quan trọng trong việc tự chủ công nghệ sinh phẩm chẩn đoán bệnh cây tại Việt Nam, đóng góp thiết thực vào chiến lược quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) và bảo vệ nền sản xuất lúa gạo bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lúa ( Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng nhất của các nước Châu Á cũng như ở Việt Nam. Sản phẩm lúa gạo là nguồn lương thực nuôi sống phần đông dân số thế giới và có vai trò quan trọng trong công nghiệp chế biến cũng như ngành chăn nuôi. Kể từ khi thực hiện công cuộc đổi mới đến nay, nông nghiệp Việt Nam đã đạt được nhiều thành tựu to lớn, nổi bật là sản xuất lương thực. Trong hơn 20 năm qua, năng suất và sản lượng lúa của Việt Nam đã tăng gấp khoảng 2 lần.

Việt Nam là một trong những nước đứng đầu thế giới về sản xuất lúa gạo. Lúa là một trong những loại cây trồng bị nhiều tác nhân gây bệnh tấn công ở hầu hết các giai đoạn sinh trưởng. Các tác nhân gây bệnh trên lúa rất đa dạng, bao gồm: nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng và phytoplasma.Trong số các tác nhân gây bệnh trên lúa thì virus là nhóm bệnh hại nguy hiểm hàng đầu ở cây lúa. Ở Việt Nam virus gây ra một số bệnh rất nguy hiểm ảnh hưởng nghiêm trọng tới sản lượng lúa như bệnh vàng lùn, bệnh lùn xoắn lá, bệnh lùn sọc đen,… Bệnh lúa lùn sọc đen lần đầu tiên bùng phát và gây hại 28 tỉnh miền Bắc và Trung với tổng diện tích nhiễm bệnh lên tới cả trăm ngàn ha vào vụ mùa năm 2009 (http://www.vn/QDNDSite/viVN/61/43/7/24/24/123115/Default.

Bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá năm 2006 trở thành đại dịch ở đồng bằng sông Cửu Long và sau đó lan ra hầu khắp các tỉnh miền Nam. Gây thiệt hại với diện tích ước tính 500.000 ha, ước tính sản lượng giảm 825.vn/bao-cao-nhanh-vvtai-bung-phat-benh-vang-lun-lun-xoan-la- tai-dong-bang-song-cuu-long-nam-2017-c2a192. Để chẩn đoán các bệnh do virus gây ra, người ta có thể áp dụng tất cả các phương pháp chẩn đoán bệnh virus thực vật. Đó là phương pháp huyết thanh học, phương pháp cây chỉ thị và chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử.

Ngày nay, người ta còn sử dụng phương pháp sinh học phân tử như PCR, RT-PCR…để 1 chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên, phương pháp kháng huyết thanh, đặc biệt là ELISA được sử dụng phổ biến hơn cả bởi đây là phương pháp đơn giản, có khả năng thử trên một lượng mẫu lớn, chi phí thấp, chẩn đoán nhanh và hiệu quả khá cao. Ngoài các bệnh virus gây ra trên lúa , bệnh bạc lá lúa cũng gây hại rất lớn có khi dẫn tới thiệt hại 100%. Mặc dù đã sử dụng rất nhiều loại thuốc nhưng bệnh cũng không giảm mà thậm chí còn gây ô nhiễm môi trường.

Trước thực tế trên, dưới sự hướng dẫn trực tiếp của PGS. Hà Viết Cường, tôi tiến hành đề tài: “ NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN VIRUS HẠI LÚA VÀ TÍNH GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN BẠC LÁ LÚA” 1. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU 1. Mục đích Chẩn đoán virus gây bệnh lùn sọc đen phương nam, vàng lùn và lùn xoắn bằng kĩ thuật RT- PCR và huyết thanh học.

Phân lập và đánh giá khả năng gây bệnh của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Yêu cầu Tạo kháng thể chẩn đoán lùn sọc đen phương nam và lùn xoắn từ nguồn kháng nguyên có sẵn tại Trung tâm Bệnh cây Nhiệt Đới. Đánh giá nguồn kháng thể được tạo ra. Chẩn đoán chính xác lùn sọc đen phương nam, vàng lùn và lùn xoắn lá bằng kĩ thuật RT-PCR và kháng thể tạo được.

Đánh giá tính đặc hiệu và độ nhạy của KHT bằng kĩ thuật PTA-ELISA, Dot blot. Thu thập các mẫu bệnh từ các ruộng khác nhau tại Nam Định, Phúc Thọ - Hà Nội. Phân lập và PCR vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae được phân lập.

Đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae phân lập được. 2 PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY LÚA Lúa là cây trồng rất thân thuộc và phổ biến ở nước ta, cây lúa được trồng khắp mọi miền của đất nước.

Đặc biệt điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng của nước ta rất thuận lợi cho cây lúa phát triển. Cây lúa đóng một vai trò quan trọng trong đời sống vật chất và đời sống tinh thần của người Việt Nam ta. Người dân Việt Nam ta dùng lúa gạo là lương thực chính. Lúa gạo còn có thể cung cấp cho công nghiệp chế biến tạo ra rất nhiều các món ăn đa dạng như: phở, bún, các loại bánh.

,bia, rượu và hàng chục sản phẩm khác từ gạo. Ngoài ra còn cung cấp cho ngành chăn nuôi. Sản xuất lúa gạo phát triển đã đưa Việt Nam từ một nước nhiều năm triền miên thiếu lương thực trở thành một nước không những có đủ lương thực cho nhân dân, mà còn xuất khẩu mặc dù lượng gạo xuất khẩu năm 2020 giảm khoảng 3,5% so với năm 2019 (6,37 triệu tấn), chủ yếu vì mục tiêu bảo đảm an ninh lương thực quốc gia, nhưng trị giá xuất khẩu lại tăng tới 9,3% (đạt 3,05 tỷ USD) so với năm 2019 (đạt 2,81 tỷ USD). Đặc biệt, với giá xuất khẩu bình quân cả năm ước đạt 499 USD/tấn, đây là mức giá bình quân năm cao nhất trong những năm gần đây, mang lại lợi ích to lớn cho người dân trồng lúa (Theo Cục chế biến & thị trường nông sản, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn).

THÀNH PHẦN VÀ PHÂN BỐ BỆNH HẠI DO VIRUS GÂY RA TRÊN CÂY LÚA TRÊN THẾ GIỚI Thành phần bệnh hại do virus gây ra trên lúa rất đa dạng và phong phú có tới 11 chi khác nhau: Fijivirus:1, Phytoreovirus:3, Oryzavirus:1 thuộc họ Reoviridae; Luteovirus:1 thuộc họ: Luteoviridae; Tenuivirus:3; Bymovirus:1 thuộc họ Potyviridae; Furovirus:1; Tungrovirus: 1 thuộc họ Caulimoviriadae ; Nucleorhabdo:1 thuộc họ Rhabdoviridae; Sequiviridae Waikavirus:1 thuộc họ Sequiviridae;Sobemovirus:1.Theo Hibino (1996) đã ghi nhận tổng số 15 loại 3 virus gây bệnh trên lúa trong đó tại Châu Á 12 loại, Châu Phi 1 loại và Châu Mỹ 1 loại (Bảng 2.1: Thành phần bệnh virus hại lúa STT Tên bệnh Lan truyền Ký chủ Phân bố 1 Rice black - theo kiểu bền vững Lúa, ngô, lúa Trung Quốc, streaked dwarf nhờ rầy mỳ, lúa miến, Nhật Bản và virus (RBSDV) Laodelphaxstriatellus và một số loài Triều Tiên Reoviridae Fijivirus cỏ. 2 Rice bunchy stunt Theo kiểu bền vững Lúa Trung quốc virus (RBSV) nhờ rầy Nephotettix Reoviridae cincticeps và Phytoreovirus N.virescens 3 Rice dwarf virus Theo kiểu bền vững Lúa và một Trung Quốc (RDV) nhờ rầy Nephotettix vài loài cỏ dại. Nhật Bản, Triều Reoviridae spp. Tiên, và Phytoreovirus Philippines 4 Rice gall dwarf Theo kiểu bền vững Lúa và cỏ Trung Quốc, virus (RGDV) nhờ rầy Nephotettix Alopecurus Malaysia và Reoviridae spp.

aequalis Thái Lan Phytoreovirus 5 Rice giallume Theo kiểu bền vững Lúa, một số Ý (miền Bắc) và virus (RGV) nhờ rệp cây ngũ cốc và Tây Ban Nha Luteoviridae Rhopalosiphum padi cỏ dại Luteovirus và một số loài rệp muội khác 6 Rice grassy stunt Theo kiểu bền vững Lúa Trung Quốc, virus (RGSV) nhờ rầy Nilaparvata Nhật Bản Tenuivirus spp. 7 Rice hoja blanca Theo kiểu bền vững Lúa Châu Mỹ (cả virus (RHBV) nhờ Sogatodes Trung Mỹ, Nam Tenuivirus orizicola Mỹ và Hoa Kỳ) 8 Rice necrosis Nấm đất Polymyxa Lúa Nhật Bản, Ấn mosaic virus graminis Độ (RNMV) Potyviridae Bymovirus 4 STT Tên bệnh Lan truyền Ký chủ Phân bố 9 Rice ragged stunt Theo kiểu bền vững Lúa Indonesia, Ấn virus (RRSV) nhờ rầy Nilaparvata Độ, Malaysia, Reoviridae spp. Đài Loan, Oryzavirus Philippin, Thái Lan,Trung Quốc, và Nhật Bản 10 Rice stripe necrosis Nấm đất Polymyxa Lúa Bở Biển Ngà, virus (RSNV) graminis và có thể Libera Nigeria Furovirus lây nhiễm cơ học và Sierra Leone 11 Rice stripe virus Lan truyền theo kiểu Lúa, lúa mỳ, Trung Quốc, (RSV) bền vững nhờ rầy lúa miến, Đại Nhật Bản, Triều - Tenuivirus Laodelphax Tiên, Nga 12 Rice transitory Theo kiểu bền vững Lúa Trung Quốc, yellowing virus nhờ rầy Nephotettix Nhật Bản, Đài (RTYV) spp. Loan, Thái Lan, Rhabdoviridae Làovà Việt Nam Nucleorhabdo 13 Rice tungro Theo kiểu bán bền Lúa Các nước trồng bacilliform virus vững nhờ rầy lúa châu Á (RTBV) Nephotettix spp.

Caulimoviriadae Tungrovirus 14 Rice tungro Theo kiểu bán bền Lúa Các nước trồng spherical virus vững nhờ rầy lúa châu Á (RTSV) Nephotettix spp. Sequiviridae Waikavirus 15 Rice yellow Theo kiểu bán bền Lúa dại Oryza Các nước trồng mottle virus vững nhờ một số loài longistaminata lúa Châu Phi (RYMV) bọ cánh cứng họ Sobemovirus Chrysomelidae 5 2. CÁC BỆNH VIRUS GÂY HẠI TRÊN LÚA PHỔ BIẾN TẠI VIỆT NAM 2. Bệnh vàng lùn lúa: virus gây bệnh vàng lùn lúa rice grassy stunt virus 2.

Lịch sử phát hiện và phân bố địa lí Bệnh vàng lùn hay lúa cỏ được phát hiện đầu tiên năm 1962 ở Viện Lúa Quốc Tế (IRRI), Philippines. Bệnh cũng được ghi nhận ở Ấn Độ (1967), Srilanka (1969), Indonesia (1973), Malaysia (1969), Đài loan (1970), Thái Lan (1969), Nhật Bản (1980) và Việt Nam (Hoàng, 2010). Tại miền Nam ở Việt Nam cùng với bệnh lúa lùn xoắn lá bệnh lúa vàng lùn đã xuất hiện từ năm 2000 sau các trận dịch rầy nâu và nhanh chóng phát triển thành dịch năm 2006. Trong những năm đầu của thập niên 1960, khi bệnh đầu tiên được ghi nhận thì xuất hiện với mức độ nhiễm rất ít.

Dần dần bệnh xuất hiện gia tăng cùng với mật số gia tăng của vectơ và vào giữa thập niên 1970 một số trận dịch xuất hiện ở miền Nam Luzon và Mindanao của Philippine, ở Kerala của Ấn Độ và Java của Indonesia. Tại Philippine, theo Hibino và Cabauatan (1985) thì một dòng virus mới (dòng 2) xuất hiện đầu tiên trong năm 1982 – 1983 gây vàng lá lúa và chết cây bên cạnh các triệu chứng của 19 dòng virus thông thường (dòng 1). Đến năm 1984 RGSV thường ít xuất hiện và gây thiệt hại tại Châu Á, dù chưa được chứng minh nhiều, nhưng có lẽ RGSV ít là do sự thay đổi trong khả năng truyền bệnh của quần thể rầy nâu. Phạm vi kí chủ và vector lan truyền Phạm vi kí chủ Phổ ký chủ của RGSV thu hẹp trên các loài lúa Oryza spp.

và rầy Nilaparvata spp. Trong tất cả các loài Oryza spp. được thử nghiệm, O. nivara là loài lúa hoang duy nhất có thể kháng được virus RGSV (Ling, Aguiero et al.

6 Cơ chế truyền bệnh RGSV không truyền được qua hạt của cây lúa bệnh hoặc qua phấn hoa, Virus cũng không được truyền bằng cách tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ mạnh với cây lúa bệnh hoặc lây qua bằng tiếp xúc cơ học. Theo Iwasaki et al. (1979) thì virus chỉ được truyền qua rầy nâu (Nilaparvata lugens) theo kiểu bền vững tái sinh. Theo Rivera et al.

(1966) và IRRI (1968) cho rằng khoảng 20 – 40% cá thể rầy nầu trong một quần thể có thể truyền virus. Với rầy nâu, tỉ lệ truyền bệnh không khác biệt rõ ràng giữa rầy đực và cái, giữa rầy đen đậm và đen nhạt, giữa rầy cánh dài và cánh ngắn (Ling, Aguiero et al. Tuy nhiên rầy non có khả năng truyền bệnh cao hơn và có giai đoạn ủ virus ngắn hơn rầy trưởng thành (Chen, Wu et al.