Nghiên cứu chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh và tàn lụi trên cây có múi sử dụng kỹ thuật miễn dịch

Khóa luận nghiên cứu chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh và tàn lụi trên cây có múi bằng kỹ thuật miễn dịch, ứng dụng hiệu quả trong nông nghiệp.

• Tác giả: Chu Hoàng Sơn
• Người hướng dẫn: PGS. Hà Viết Cường
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Bệnh cây
• Đề tài: Nghiên cứu chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh (Candidatus Liberibacter Asiaticus) và bệnh tàn lụi (Citrus Tristeza Virus) trên cây có múi bằng kỹ thuật miễn dịch
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Nội dung nghiên cứu
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng Quan Cây Có Múi
• 2.1.1. Về nguồn gốc
• 2.1.2. Phân loại
• 2.1.3. Tình hình sản xuất cây có múi tại Việt nam
• 2.2. Tổng quan về bệnh vàng lá gân xanh (HLB)
• 2.2.1. Lịch sử và phân bố bệnh vàng lá gân xanh
• 2.2.2. Tác nhân gây bệnh - Vi khuẩn Candidatus liberibacter (Ca. L)
• 2.2.3. Triệu chứng, dấu hiệu bệnh
• 2.2.4. Các phương pháp chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh
• 2.3. Tổng Quan Về Bệnh Tàn Lụi Cây Có Múi (Citrus Tristeza Virus – CTV)
• 2.3.1. Lịch sử và phân bố
• 2.3.2. Tác nhân gây bệnh
• 2.3.3. Triệu chứng, dấu hiệu bệnh
• 2.3.4. Truyền bệnh và biện pháp phòng chống
• 2.4. Tổng Quan Tình Hình Nghiên Cứu Trong Nước Và Ngoài Nước
• 2.4.1. Nghiên cứu trong nước
• 2.4.2. Nghiên cứu nước ngoài
• 2.5. Hệ thống biểu hiện và các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu
• 2.5.1. Hệ thống biểu hiện
• 2.5.2. Hệ thống vector biểu hiện
• 2.5.3. Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu
• 2.5.3.1. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)
• 3. PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm
• 3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.3. Các chất kháng sinh
• 3.4. Môi trường
• 3.5. Các thiết bị máy chủ yếu
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp tách chiết DNA và RNA tổng số bằng CTAB
• 3.7.2. Phương pháp PTA- ELISA (Plate Trapped Antibody - Enzyme Linked Immune Sorbent Assay)
• 3.7.3. Phương pháp gây miễn dịch trên thỏ
• 4. PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả chuẩn bị kháng nguyên tái tổ hợp
• 4.2. Phục hồi nguồn vi khuẩn E. Coli Rossetta DE3 và Rossetta DE3 + pET28a
• 4.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp của các cấu trúc pET28a + OMP-N, pET28a +OMP-C và pET28a + CTV-CP
• 4.4. Điện di các sản phẩm của cảm ứng nhân nuôi
• 4.5. Kết quả sản xuất kháng thể đa dòng đặc hiệu cho HLB và CTV bằng kỹ thuật miễn dịch
• 4.6. Chuẩn bị nguồn kháng nguyên đặc hiệu
• 4.7. Tiến hành gây miễn dịch trên thỏ
• 4.8. Kiểm tra kháng huyết thanh thu được bằng kỹ thuật PTA-ELISA
• 4.9. Chẩn đoán bệnh HLB và CTV bằng kĩ thuật PCR và RT-PCR
• 4.10. Kết quả kiểm tra các mẫu dùng trong phản ứng ELISA bằng phương pháp sinh học phân tử
• 4.11. Một số bệnh thường gặp trên cây có múi và một số triệu chứng không điển hình của bệnh HLB
• 5. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Mục đích và nội dung nghiên cứu

Mục đích của nghiên cứu này là tạo ra kháng thể đa dòng từ kháng nguyên đặc hiệu nhằm chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh (Candidatus Liberibacter Asiaticus) và bệnh tàn lụi (Citrus Tristeza Virus). Nội dung nghiên cứu bao gồm việc tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp của CaLas và CTV trong dòng vi khuẩn E. Coli Rossetta, dựa trên cấu trúc biểu hiện gene mã hóa OMP của Ca. L và CP của CTV. Nghiên cứu cũng sẽ thực hiện việc gây miễn dịch trên thỏ từ kháng nguyên tái tổ hợp đã biểu hiện và đánh giá tính đặc hiệu cũng như hiệu giá của kháng thể thu được bằng các kỹ thuật miễn dịch như ELISA và lai phân tử (Dot-Blot). Việc tạo ra kháng thể đa dòng sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong việc chẩn đoán các bệnh hại nguy hiểm này, từ đó góp phần bảo vệ cây trồng và nâng cao năng suất nông sản.

II. Tổng quan về bệnh vàng lá gân xanh HLB

Bệnh vàng lá gân xanh (HLB) được ghi nhận lần đầu tiên ở Đông Nam Trung Quốc vào năm 1919. Tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Candidatus liberibacter. Bệnh này gây ra các triệu chứng nghiêm trọng trên cây có múi, làm giảm năng suất và chất lượng nông sản. HLB được truyền qua vector là rầy chổng cánh châu Á (Diaphorina citri). Các triệu chứng của bệnh bao gồm lá vàng, gân lá xanh, và quả nhỏ, méo mó. Việc chẩn đoán bệnh HLB thường gặp khó khăn do triệu chứng dễ nhầm lẫn với các bệnh khác. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại như PCR và ELISA có độ chính xác cao nhưng yêu cầu thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có trình độ. Do đó, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán đơn giản và hiệu quả là rất cần thiết để kiểm soát bệnh HLB.

III. Tổng quan về bệnh tàn lụi CTV

Bệnh tàn lụi (Citrus Tristeza Virus - CTV) là một trong những bệnh nghiêm trọng nhất trên cây có múi, gây thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp. CTV được phát hiện lần đầu tiên vào những năm 1930 tại Nam Mỹ và đã lây lan ra nhiều quốc gia khác. Bệnh này gây ra các triệu chứng như cây còi cọc, lá vàng và chết dần. CTV được truyền qua vector là rầy chổng cánh và có thể lây lan qua phương pháp ghép cây. Việc chẩn đoán CTV cũng gặp nhiều khó khăn tương tự như HLB, do triệu chứng không điển hình và dễ nhầm lẫn với các bệnh khác. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại như RT-PCR cho kết quả chính xác nhưng yêu cầu thiết bị và kỹ thuật viên có trình độ. Do đó, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả cho CTV là rất cần thiết.

IV. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh và bệnh tàn lụi. Phương pháp tách chiết DNA và RNA tổng số bằng CTAB được áp dụng để thu thập mẫu. Kỹ thuật PTA-ELISA (Plate Trapped Antibody - Enzyme Linked Immune Sorbent Assay) được sử dụng để kiểm tra kháng huyết thanh thu được từ thỏ. Phương pháp PCR và RT-PCR được áp dụng để chẩn đoán bệnh HLB và CTV từ các mẫu cây thu thập. Các kết quả từ các phương pháp này sẽ được phân tích để đánh giá tính hiệu quả và độ chính xác trong việc chẩn đoán các bệnh hại trên cây có múi. Việc áp dụng các phương pháp này không chỉ giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán mà còn góp phần bảo vệ cây trồng và nâng cao năng suất nông sản.

V. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tạo ra kháng thể đa dòng từ kháng nguyên tái tổ hợp của HLB và CTV là khả thi. Các thí nghiệm đã chứng minh rằng kháng thể thu được có tính đặc hiệu cao và có thể sử dụng trong chẩn đoán bệnh. Kết quả từ phương pháp PCR và RT-PCR cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh HLB và CTV trong các mẫu thu thập là đáng kể. Việc áp dụng các kỹ thuật miễn dịch như ELISA và PTA-ELISA đã cho kết quả chính xác, giúp nâng cao khả năng chẩn đoán bệnh. Những phát hiện này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả cho các bệnh hại trên cây có múi, từ đó góp phần bảo vệ sản xuất nông nghiệp và nâng cao giá trị kinh tế cho người nông dân.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây ăn quả có múi (Citrus spp.) thuộc họ Rutaceae, bộ Sapindales, là nhóm cây trồng có giá trị kinh tế cao và giữ vị trí chủ lực trong cơ cấu sản xuất cây ăn quả tại Việt Nam. Theo số liệu của Cục Trồng trọt được trích dẫn trong công trình, tính đến hết năm 2019, tổng diện tích cây có múi cả nước đạt 256,86 nghìn ha (chiếm 24,07% tổng diện tích cây ăn quả) với sản lượng hơn 2,46 triệu tấn. Riêng tại các tỉnh phía Bắc, giai đoạn 2009–2019 ghi nhận tốc độ tăng trưởng bình quân 10%/năm về diện tích (tăng 7,3 nghìn ha/năm) và 12,5%/năm về sản lượng (tăng 69,4 nghìn tấn/năm).

Tuy nhiên, ngành sản xuất cây có múi đang đối mặt với sự tàn phá nghiêm trọng của hai dịch bệnh nguy hiểm nhất:

1. Bệnh vàng lá gân xanh (Huanglongbing - HLB): Do vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus (Ca. Las) gây ra, truyền qua vector rầy chổng cánh châu Á (Diaphorina citri).
2. Bệnh tàn lụi cây có múi (Citrus Tristeza Virus - CTV): Do virus thuộc chi Closterovirus gây ra, lây truyền chủ yếu qua các loài rệp muội (Toxoptera citricidus, Aphis gossypii...).

Thực tế canh tác cho thấy việc chẩn đoán bệnh qua triệu chứng ngoại hình thường thiếu chính xác do dễ nhầm lẫn với hiện tượng thiếu vi lượng (như thiếu kẽm) hoặc các dạng stress sinh lý. Các kỹ thuật phân tử như PCR và RT-PCR tuy có độ nhạy và độ chính xác cao nhưng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, chi phí vận hành lớn và kỹ thuật viên trình độ cao, không thuận tiện cho việc sàng lọc lượng mẫu lớn ngoài thực địa. Trong khi đó, kỹ thuật miễn dịch học (ELISA, que thử nhanh) có giá thành thấp hơn nhưng phụ thuộc vào nguồn kháng thể đặc hiệu thương mại nhập khẩu với chi phí rất cao.

Mục tiêu nghiên cứu: Tạo được kháng thể đa dòng từ thỏ dựa trên nguồn kháng nguyên tái tổ hợp đặc hiệu nhằm phục vụ chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh (Candidatus Liberibacter asiaticus) và bệnh tàn lụi (Citrus Tristeza Virus) trên cây có múi.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Tạo kháng nguyên tái tổ hợp của vi khuẩn Ca. Las và virus CTV trong dòng vi khuẩn Escherichia coli Rosetta (DE3) dựa trên cấu trúc biểu hiện gen mã hóa protein màng ngoài (OMP) của Ca. Las và protein vỏ capsid (CP) của CTV.
2. Gây miễn dịch trên thỏ bằng các protein kháng nguyên tái tổ hợp đã biểu hiện.
3. Thu nhận và tạo kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ chẩn đoán hai đối tượng bệnh hại.
4. Đánh giá tính đặc hiệu và hiệu giá của kháng thể thu được từ huyết thanh thỏ bằng kỹ thuật miễn dịch PTA-ELISA.
5. Kiểm tra, chẩn đoán các mẫu cây cam thu thập ngoài sản xuất nhiễm HLB và CTV bằng kỹ thuật PCR và RT-PCR.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus, virus Citrus Tristeza Virus, hệ thống biểu hiện vi khuẩn E. coli Rosetta mang vector pET28a, thỏ thí nghiệm New Zealand và các mẫu bệnh cây có múi.
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 03/2021 đến tháng 09/2021.
• Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây Nhiệt đới (Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam) và các vùng trồng cây ăn quả có múi tại Gia Lâm (Hà Nội), Thanh Hóa, Nghệ An, Cao Bằng.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và sinh học phân tử của tác nhân gây bệnh

• Vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus (Ca. Las): Thuộc phân lớp α-Proteobacteria, vi khuẩn Gram âm, dạng hình gậy (kích thước 0,15–0,25 µm × 1–4 µm), vách dày 25 nm, sống ký sinh bắt buộc trong hệ thống mạch rây (phloem) của cây và không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo. Gen OmpA của Ca. Las có kích thước 2364 nucleotide, mang tính bảo thủ cao trong loài (độ tương đồng 99,9%) và khác biệt rõ rệt với Ca. L. africanus (75%). Do biểu hiện toàn bộ gen OmpA trên E. coli gặp khó khăn, tác giả tiếp cận việc biểu hiện từng phần gồm vùng đầu N (đoạn POTRA) và vùng đầu C (đoạn ống beta).
• Virus Citrus Tristeza Virus (CTV): Thuộc chi Closterovirus, họ Closteroviridae. Hạt virus có dạng sợi xoắn mềm (kích thước 2000 nm × 10–12 nm), bộ gen là phân tử RNA sợi đơn dương (+ssRNA) kích thước khoảng 19,3 kb với 12 khung đọc mở (ORF), mã hóa ít nhất 17 protein. Trong đó, vỏ capsid cấu tạo từ protein CP (25 kDa) và CPm (27 kDa). Protein CP được chọn làm kháng nguyên mục tiêu.
• Hệ thống biểu hiện tái tổ hợp: Sử dụng vector pET28a(+) biến nạp vào chủng chủ E. coli Rosetta (DE3). Vector mang gen kháng Kanamycin, promoter T7, chuỗi lac operator kiểm soát phiên mã dưới tác động cảm ứng của chất cảm ứng Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) hoặc cơ chế tự cảm ứng qua môi trường chứa lactose.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Tách chiết nucleic acid: Sử dụng phương pháp CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) bổ sung β-mercaptoethanol (β-ME) để thu nhận DNA và RNA tổng số từ 0,1 g gân lá mẫu bệnh. Quá trình tủa DNA/RNA thực hiện bằng Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), Isopropanol và làm sạch bằng Ethanol 70%.
• Chẩn đoán phân tử (PCR và RT-PCR):
  • Phản ứng PCR chẩn đoán HLB: Sử dụng enzyme DreamTaq Master Mix (2X) kết hợp các cặp mồi đặc hiệu OMP-N3/OMP-N5 hoặc A2/J5. Chu trình nhiệt: Biến tính ban đầu 95°C trong 2 phút; 35 chu kỳ gồm (95°C: 35 giây, 56°C: 35 giây, 72°C: 1 phút); kéo dài chuỗi ở 72°C trong 5 phút.
  • Phản ứng RT-PCR chẩn đoán CTV: Sử dụng hệ enzyme phiên mã ngược M-MuLV Reverse Transcriptase tạo cDNA ở 42°C trong 30 phút, tiếp nối bằng phản ứng khuếch đại với cặp mồi CTV-F1/CTV-R1.
  • Sản phẩm nhân bản được kiểm tra qua điện di trên gel agarose 0,5% trong đệm TAE 0,5X, nhuộm Ethidium bromide và quan sát dưới ánh sáng tia UV so với thang chuẩn DNA Marker 1 kb.
• Điện di protein SDS-PAGE: Phân tích protein tái tổ hợp theo hệ thống gel đứng Laemmli (1970) gồm gel cô (Stacking gel) và gel tách (Resolving gel). Nhuộm gel bằng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250.
• Quy trình tạo kháng thể và kiểm tra miễn dịch:
  • Gây miễn dịch: Tiêm kháng nguyên protein tái tổ hợp đã tinh sạch vào thỏ cái giống New Zealand (3 tháng tuổi), thực hiện tổng cộng 4 lần tiêm nhắc lại.
  • Kiểm tra kháng huyết thanh: Sử dụng phương pháp Plate Trapped Antibody ELISA (PTA-ELISA / Indirect ELISA), đo mật độ quang (OD) với cơ chất p-Nitrophenyl Phosphate (pNPP) và enzyme liên hợp Alkaline Phosphatase (AP).

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần II: Tổng quan tài liệu

Phần tổng quan tổng hợp toàn diện lịch sử phát sinh, phân bố địa lý, tác nhân sinh học và triệu chứng gây hại của hai bệnh HLB và CTV trên cây ăn quả có múi tại Việt Nam và trên thế giới.

• Đối với HLB: Bệnh xuất hiện đầu tiên tại miền Nam Trung Quốc (1919) và ghi nhận ở Việt Nam từ năm 1960. Các tài liệu điều tra giai đoạn 1990–1994 cho thấy tỷ lệ nhiễm HLB tại các vườn cam quýt miền Bắc dao động từ 10,49% đến 50,93%, cá biệt có vùng lên tới 82,5%. Sự đồng nhiễm giữa HLB và CTV chiếm tỷ lệ rất cao (58,33% – 73,33%).
• Đối với CTV: Lịch sử ghi nhận các trận đại dịch lớn làm chết hơn 50 triệu gốc ghép cam chua tại Nam Mỹ vào những năm 1930 và hàng triệu cây tại Tây Ban Nha, Israel, Venezuela. Virus truyền hiệu quả nhất qua rệp muội nâu (Toxoptera citricida).
• Chương này cũng phân tích sâu ưu nhược điểm của các phương pháp chẩn đoán: chỉ thị sinh học (ghép cây chỉ thị chanh Mexico), hiển vi điện tử, kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, Real-time PCR, RT-PCR) và kỹ thuật huyết thanh học (ELISA). Đồng thời, hệ thống hóa nguyên lý cấu trúc của vector pET28a(+) và cơ chế phiên mã - dịch mã trong vật chủ E. coli Rosetta.

Phần III: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục hóa chất, sinh phẩm, môi trường nuôi cấy và thông số kỹ thuật của các thí nghiệm:

• Nguồn gen và vector: Sử dụng cấu trúc pET28a + OMP-N3, pET28a + OMP-C5 (mang gen mã hóa protein màng ngoài Ca. Las) và pET28a + CTV-CP (mang gen vỏ capsid của CTV) được chuyển vào chủng E. coli Rosetta (DE3).
• Nồng độ các chất kháng sinh chọn lọc: Kanamycin (100 µg/µl), Rifamycin (50 µg/µl), Chloramphenicol (34 µg/µl), Tetracycline (100 µg/µl).
• Bảng thành phần chi tiết của gel SDS-PAGE phân tách protein:

Thành phần hóa chất	Gel tách (ml)	Gel cô (ml)
Nước cất khử ion ($H_2O$)	1,55	0,62
Acrylamide 30%	2,15	0,86
Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)	1,25	—
Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8)	—	0,50
SDS 10%	0,05	0,02
Ammonium persulfate (APS) 10%	0,025	0,01
TEMED	0,0025	0,002
Tổng thể tích	5,00	2,00

• Quy trình chi tiết 9 bước tách chiết DNA/RNA bằng dung dịch đệm CTAB và thiết lập thành phần phản ứng khuếch đại phân tử PCR/RT-PCR thể tích 10–15 µl.

Phần IV: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương kết quả tập trung vào 4 nội dung thực nghiệm chính:

1. Biểu hiện protein tái tổ hợp: Phục hồi thành công các chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp. Quá trình cảm ứng bằng IPTG và tự cảm ứng cho thấy sự biểu hiện mạnh mẽ của 3 protein mục tiêu: OMP-N, OMP-C (vi khuẩn Ca. Las) và CTV-CP (virus CTV). Kết quả điện di SDS-PAGE xác nhận các phân tử protein có kích thước vạch băng tương ứng với khối lượng phân tử lý thuyết.
2. Sản xuất kháng thể đa dòng: Sau quy trình 4 lần gây miễn dịch trên thỏ New Zealand, tiến hành thu kháng huyết thanh. Thử nghiệm PTA-ELISA ngày 13/05/2021 đối với 3 công thức kháng thể cho thấy: Kháng huyết thanh kháng OMP-N (HLB-N) và OMP-C (HLB-C) có hiệu giá kháng thể cao, phản ứng dương tính rõ rệt với kháng nguyên đặc hiệu so với đối chứng âm. Kháng huyết thanh kháng CTV-CP bước đầu bắt tín hiệu nhưng cần thêm các thử nghiệm tối ưu để tăng tính ổn định.
3. Kiểm tra, chẩn đoán mẫu thực địa bằng kỹ thuật phân tử:
   • Kiểm tra 12 mẫu lưu trữ tại Trung tâm Bệnh cây Nhiệt đới bằng PCR chẩn đoán HLB.
   • Kiểm tra các mẫu lá cam thu thập tại Thanh Hóa bằng PCR (chẩn đoán HLB) và RT-PCR (chẩn đoán CTV).
   • Kiểm tra 16 mẫu lá cam thu thập tại Nghệ An bằng kỹ thuật PCR chẩn đoán HLB.
   • Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại khẳng định sự hiện diện của đoạn gen đích ở các mẫu bệnh phẩm biểu hiện triệu chứng ngoài đồng ruộng.
4. Mô tả bệnh học lâm sàng: Phân tích sự khác biệt giữa các triệu chứng điển hình của HLB (vàng lốm đốm, gân chính nổi vàng, gân phụ còn xanh, lá dựng hình tai thỏ) với các triệu chứng không điển hình hoặc bệnh hại khác trên cây có múi thu thập tại Cao Bằng như bệnh đốm dầu, bệnh khô cành và bệnh loét vi khuẩn.

---

Kết quả và đóng góp của đề tài

Kết quả nghiên cứu chính

• Biểu hiện kháng nguyên: Đã nhân nuôi và cảm ứng thành công 3 cấu trúc protein tái tổ hợp OMP-N, OMP-C của vi khuẩn gây bệnh HLB và CTV-CP của virus CTV trong vật chủ vi khuẩn E. coli Rosetta (DE3).
• Thu nhận kháng thể: Sản xuất thành công kháng thể đa dòng từ thỏ kháng lại 2 tiểu phần protein màng ngoài OMP-N và OMP-C của vi khuẩn Ca. Las, đạt độ đặc hiệu cao trong phản ứng miễn dịch PTA-ELISA.
• Giám định dịch tễ học thực địa: Thiết lập thành công quy trình chẩn đoán phân tử PCR (mồi OMP-N3/OMP-N5, A2/J5) và RT-PCR (mồi CTV-F1/CTV-R1) để giám định chính xác tỷ lệ nhiễm bệnh trên tập mẫu thu thập tại Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An và Cao Bằng.

Bảng tổng hợp các mảng thực nghiệm và thông số kỹ thuật cốt lõi

Hạng mục thực nghiệm	Đối tượng / Hệ thống	Phương pháp / Kỹ thuật	Kết quả đạt được
Biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp	Gen OMP-N, OMP-C (Ca. Las) và gen CP (CTV)	Vector pET28a(+), E. coli Rosetta, cảm ứng IPTG	Biểu hiện thành công cả 3 loại protein tái tổ hợp
Sản xuất kháng thể đa dòng	Kháng nguyên OMP-N, OMP-C, CTV-CP	Gây miễn dịch thỏ New Zealand (4 lần tiêm)	Thu nhận kháng huyết thanh kháng HLB-N, HLB-C và CTV-CP
Đánh giá tính đặc hiệu miễn dịch	Kháng huyết thanh thỏ sau 4 lần tiêm	Kỹ thuật PTA-ELISA (đo quang cơ chất pNPP)	Kháng thể HLB-N và HLB-C bắt cặp đặc hiệu; CTV-CP cần đánh giá thêm
Giám định mẫu thực địa	Mẫu lá cam tại TT Bệnh cây, Thanh Hóa, Nghệ An	Kỹ thuật PCR (HLB) và RT-PCR (CTV)	Phát hiện chính xác các mẫu dương tính với HLB và CTV

Đề xuất và kiến nghị của tác giả

• Tiếp tục thực hiện các thí nghiệm chuẩn hóa, tinh sạch và nâng cao hiệu giá cũng như độ nhạy của kháng thể đa dòng kháng CTV-CP.
• Ứng dụng nguồn kháng thể HLB đầu N và đầu C đã thu nhận để phát triển các kit thử nghiệm miễn dịch nhanh tại chỗ (dạng que thử sắc ký miễn dịch/dipstick) phục vụ công tác kiểm dịch và sản xuất cây giống sạch bệnh quy mô lớn.
• Mở rộng phạm vi điều tra, thu thập mẫu bệnh trên các vùng sinh thái trồng cây ăn quả có múi khác trên toàn quốc.

Đóng góp khoa học

• Chứng minh tính khả thi của việc sử dụng các tiểu phần protein tái tổ hợp OMP đầu N và đầu C của vi khuẩn Ca. Las để thay thế cho toàn bộ gen nguyên bản trong tạo dòng và biểu hiện kháng nguyên phục vụ công nghệ sản xuất kháng thể.
• Xây dựng cơ sở dữ liệu thực nghiệm và vật liệu sinh học nền tảng (kháng nguyên, kháng thể đa dòng) phục vụ mục tiêu tự chủ công nghệ sản xuất kit chẩn đoán bệnh cây có múi tại Việt Nam, giảm sự phụ thuộc vào các sinh phẩm thương mại nước ngoài.

---

Hạn chế và hướng phát triển nghiên cứu

Hạn chế của đề tài

• Tính đặc hiệu của kháng thể CTV-CP: Kháng huyết thanh thu được đối với protein vỏ capsid của virus CTV chưa đạt độ ổn định và tính đặc hiệu cao như kỳ vọng trong các phép thử ELISA ban đầu, cần có thêm các bước tinh chế bổ sung.
• Quy mô khảo sát mẫu: Số lượng mẫu kiểm tra thực địa còn tương đối giới hạn (tập trung tại Thanh Hóa, Nghệ An và mẫu lưu trữ tại phòng thí nghiệm), chưa phản ánh toàn diện biến động di truyền của các chủng Ca. Las và CTV trên khắp các vùng miền.
• Mức độ ứng dụng: Nghiên cứu mới dừng lại ở mức độ đánh giá trong phòng thí nghiệm bằng kỹ thuật PTA-ELISA, chưa hoàn thiện thành sản phẩm que thử nhanh thương phẩm hoàn chỉnh.

Hướng phát triển tiếp theo

• Tiếp tục tối ưu hóa quy trình biểu hiện và tinh sạch protein CTV-CP nhằm nâng cao chất lượng kháng huyết thanh trên thỏ.
• Thử nghiệm phối hợp các kỹ thuật lai phân tử (Dot-Blot) để đối chiếu song song với kết quả PTA-ELISA.
• Tiến hành thiết kế và chế tạo que thử sắc ký dòng chảy ngang (Lateral flow strip test) ứng dụng trực tiếp ngoài đồng ruộng cho nông dân và cán bộ bảo vệ thực vật.

---

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu học thuật có giá trị tham khảo thực tiễn cao đối với:

• Sinh viên, học viên cao học: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Bảo vệ thực vật, Bệnh cây, Di truyền và Chọn giống cây trồng.
• Cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên: Làm việc tại các viện nghiên cứu nông nghiệp, trung tâm kiểm dịch thực vật, trạm bảo vệ thực vật và các vườn ươm giống cây có múi sạch bệnh.

Nội dung đáng tham khảo nhất:

1. Giao thức biểu hiện gen mục tiêu: Quy trình tối ưu hóa biểu hiện các protein màng khó cuộn xoắn (như OMP của vi khuẩn Liberibacter) bằng hệ thống vector pET28a(+) trong E. coli Rosetta.
2. Quy trình miễn dịch học động vật: Chi tiết lịch trình tiêm kháng nguyên tái tổ hợp, phương pháp thu nhận và bảo quản kháng huyết thanh trên thỏ New Zealand.
3. Quy trình chẩn đoán phân tử chuẩn: Bảng thành phần hóa chất, thiết lập chu trình nhiệt chi tiết cho phản ứng PCR và RT-PCR chẩn đoán vi khuẩn và virus trên cây trồng.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu không biểu hiện toàn bộ gen OmpA của vi khuẩn Ca. Las mà phải chia thành hai đoạn gen đầu N và đầu C?
Gen OmpA hoàn chỉnh của vi khuẩn Ca. Las có kích thước 2364 nucleotide. Các công trình nghiên cứu trước đây đã chứng minh việc biểu hiện toàn bộ gen này trong tế bào chủ E. coli không thành công do kích thước lớn và đặc tính protein màng gây độc cho tế bào. Do đó, tác giả lựa chọn biểu hiện 2 vùng bảo thủ: phần đầu N (tương ứng đoạn POTRA) và phần đầu C (tương ứng đoạn ống beta), giúp protein được tổng hợp hiệu quả và vẫn đảm bảo tính kháng nguyên đặc hiệu cao.

2. Vector và chủng vi khuẩn nào đã được lựa chọn để biểu hiện các protein tái tổ hợp?
Nghiên cứu sử dụng vector biểu hiện plasmid pET28a(+) (Novagen) mang promoter mạnh T7, gen kháng Kanamycin và nhãn His-tag. Chủng vi khuẩn chủ được sử dụng là Escherichia coli Rosetta (DE3) – dòng vi khuẩn chứa các tRNA hiếm giúp tối ưu hóa quá trình dịch mã các gen ngoại lai có nguồn gốc từ sinh vật khác.

3. Quy trình tạo kháng thể đa dòng được tiến hành trên đối tượng động vật nào và kiểm tra bằng kỹ thuật gì?
Quy trình tạo kháng thể đa dòng được thực hiện trên thỏ cái giống New Zealand 3 tháng tuổi thông qua 4 lần tiêm kháng nguyên tái tổ hợp đã cảm ứng biểu hiện. Kháng huyết thanh sau đó được thu nhận và kiểm tra hiệu giá, tính đặc hiệu bằng kỹ thuật Plate Trapped Antibody ELISA (PTA-ELISA / Indirect ELISA) đo mật độ quang quang phổ với cơ chất pNPP.

4. Những cặp mồi nào đã được sử dụng trong các phản ứng PCR và RT-PCR để giám định mẫu bệnh thực địa?
Để chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh (HLB), tác giả sử dụng cặp mồi OMP-N3/OMP-N5 và cặp mồi A2/J5. Để chẩn đoán bệnh tàn lụi (CTV) bằng kỹ thuật RT-PCR, phản ứng sử dụng cặp mồi CTV-F1/CTV-R1 kết hợp với enzyme phiên mã ngược M-MuLV RT.

5. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các loại kháng huyết thanh thu được trên PTA-ELISA đạt được như thế nào?
Kháng huyết thanh thỏ kháng lại 2 protein tái tổ hợp OMP-N và OMP-C của vi khuẩn Ca. Las cho phản ứng bắt cặp rất rõ ràng và đặc hiệu với kháng nguyên đích, có sự khác biệt rõ rệt so với mẫu đối chứng âm. Riêng đối với kháng thể kháng CTV-CP, tín hiệu phản ứng ban đầu đã được ghi nhận nhưng hiệu giá chưa ổn định hoàn toàn, cần tiếp tục tinh sạch và tối ưu hóa ở các nghiên cứu tiếp theo.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Chu Hoàng Sơn đã giải quyết thành công bài toán biểu hiện các protein kháng nguyên tái tổ hợp OMP-N, OMP-C (vi khuẩn Ca. Las) và CP (virus CTV) bằng hệ thống vector pET28a(+) trong tế bào chủ E. coli Rosetta. Công trình đã sản xuất thành công kháng thể đa dòng từ thỏ có tính đặc hiệu cao với tác nhân gây bệnh vàng lá gân xanh (HLB), đồng thời hoàn thiện quy trình chẩn đoán phân tử PCR và RT-PCR trên các mẫu cam thực địa tại miền Bắc và Bắc Trung Bộ. Đây là tiền đề khoa học và vật liệu quan trọng hướng tới việc phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh, giá thành rẻ phục vụ công tác quản lý dịch bệnh và bảo tồn nguồn giống cây có múi tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Cây ăn quả có múi (Citrus sp.) hay cây có múi thuộc họ: Rutaceae, bộ: Sapindales là cây trồng có nguồn gốc từ vùng khí hậu cận nhiệt và nhiệt đới ở đông nam châu Á. Cây có múi được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên Thế giới từ những nước có khí hậu phù hợp ở Nhiệt đới cho đến cả những quốc gia thuộc khí hậu Ôn đới. Tại Việt nam, với khí hậu và điều kiện thổ nhưỡng thích hợp nên cây có múi được trồng phổ biến ở khắp các tỉnh địa phương trải dọc từ Bắc đến Nam. Hiện nay cây có múi được xác định là cây ăn quả quan trọng nhất trong hệ thống cây trồng của đất nước, là cây có giá trị kinh tế cao và ổn định.

Trong họ cây có múi gồm có rất nhiều các loài cây như cam, chanh, quất, bưởi và nhiều loài khác. Trong đó cam (Sinensis) và bưởi (Pomelo) là những cây được trồng rộng rãi nhất tại Việt nam. Trong đó, có rất nhiều địa phương nổi tiếng với những giống cam và bưởi đặc sản bưởi có hương vị độc nhất như: Bưởi Đoan Hùng, Bưởi Diễn, Cam Hàm Yên, Cam Cao Phong, Cam Vinh….Trong cây có múi có chứa hàm lượng các vitamin cao như B1, B2, A, đặc biệt hàm lượng vitamin C rất cao có lợi cho sức khỏe nên rất được ưa chuộng. Trên cây có múi xuất hiện nhiều bệnh với nhiều tác nhân gây ra, gây hại cho cây ở nhiều bộ phận khác nhau, gây hại ở nhiều giai đoạn sinh trưởng của cây.

Bênh vàng lá gân xanh có tên khoa học Huanglongbinh (HLB) do vi khuẩn Liberobacter Asiaticus và bệnh Tàn lụi do Citrus Tristeza Virus (CTV) là 2 bệnh gây ra thiệt hại nghiêm trọng trên cây có múi cả về sản lượng và chất lượng nông sản.HLB được ghi nhận lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 1929, tại Nam Phi năm 1939 và bệnh lần đầu xuất hiện tại Việt nam năm 1960 và kể từ đó đã xuất hiện 2 đợt bùng dịch ở nước ta (H. Trong khi đó, bệnh CTV bắt đầu gây hại vào những năm 1930 tại các quốc gia Nam Mỹ, bệnh làm chết hơn 50 triệu gốc ghép cam chua trước khi được phát hiện (Lee, Baker et al. Tại Việt nam, bệnh CTV gây hại nghiêm trọng đến các diện tích trồng cây có múi, đặc biệt là cam trên các vùng trồng cam khắp cả nước. Cùng với HLB thì CTV làm cản trở việc mở rộng diện tích trồng và thiệt hai lớn về kinh tế.

Hiện nay có một số phương pháp chẩn đoán bệnh HLB và CTV: Chẩn đoán dựa vào triệu chứng, dấu hiệu bệnh tuy dễ dàng nhưng có đọ chính xác không cao và dễ nhầm lẫn. Chẩn đoán bằng PCR (Đối với HLB), RT-PCR (Đối với CTV) tuy rằng có độ chính xác cao và có thể định lương nhưng quá trình thực hiện khá phức tạp, đòi hỏi trình độ chuyên môn và có trang thiết bị hiện đại. Chẩn đoán bằng ELISA đơn giản hơn PCR, với giá thành hạ cho kết quả chính xác cao nhưng cần có kháng thể đặc hiệu cho CTV, nhưng giá thành của kháng thể đặc hiệu này khá cao. Trên Thế giới, kít chẩn đoán bệnh HLB đã được thương mại nhưng giá thành rất cao, trong khi đó Việt nam vẫn chưa có nghiên cứu nhằm tạo ra kít chẩn đoán của bệnh này.

Tại Việt nam yêu cầu về một phương pháp chẩn đoán HLB và CTV cho kết quả nhanh, chính xác và đơn giản là vô cùng cần thiết. Yêu cầu sản xuất que thử nhanh là rất hữu ích đối với việc chẩn đoán 2 bệnh hại nguy hiểm này. Để làm được điều này, trước tiên cần sản xuất được kháng thể đặc hiệu cho HLB và CTV. Để có thể tạo được kháng thể đa dòng thì trước tiên cần phải tạo được kháng nguyên tái tổ hợp của CTV và HLB và biểu hiện thành công để có thể thu được.

Do tính cấp thiết và những áp dụng to lớn khi tạo được kháng thể đa dòng đặc hiệu của HLB và CTV nên tôi cùng với sự hướng dẫn tiến hành đề tài: “NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN BỆNH VÀNG LÁ GÂN XANH (Candidatus Liberibacter Asiaticus) VÀ BỆNH TÀN LỤI (Citrus Tristeza Virus) TRÊN CÂY CÓ MÚI BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH”. Mục đích và nội dung nghiên cứu 1. Mục đích nghiên cứu Tạo được kháng thể đa dòng của thỏ từ kháng nguyên đặc hiệu nhằm chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh (Ca. L) và bệnh tàn lụi (CTV).

Nội dung nghiên cứu  Tạo được kháng nguyên tái tổ hợp của CaLas và CTV trong dòng vi khuẩn E. Coli Rosseta dựa trên cấu trúc biểu hiện gene mã hóa OMP cùa Ca. L và CP của CTV.  Gây miễn dịch trên thỏ từ kháng nguyên tái tổ hợp đã biểu hiện của Ca.

 Đánh giá tính đặc hiệu và hiệu giá của kháng thể thu được từ thỏ bằng các kỹ thuật miễn dịch ELISA và lai phân tử (Dot-Blot). TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng Quan Cây Có Múi 2. Về nguồn gốc: Cây có múi có nguồn gốc từ đâu hiện vẫn còn nhiều tranh cãi, nhưng theo một số nhà khoa học cho rằng các giống cam quýt trồng hiện nay có nguồn gốc từ vùng cận nhiệt và nhiệt đới ở châu Á (Tanaka,1954).

Tanaka đã vạch ra ranh giới của giống thuộc chi citrus từ phía đông Ấn Độ qua Úc, miền nam Trung Quốc và Nhật Bản. Trần Thế Tục cho rằng nghề trồng cam quýt ở Trung Quốc cách đây 3000 – 4000 năm trước (Thế,1980). Nhiều tác giả cho rằng nguồn gốc quýt Kinh (Citrus nobilis Lour) là ở miền Nam Việt Nam. Thực tế ở Việt Nam ta từ bắc chí nam ở vùng nào cũng có trồng cam sành với nhiều vật liệu giống với các tên địa phương khác nhau mà không nơi nào trên thế giới có như: cam sành Bố Hạ, cam sành Hàm Yên, Yên Bái, Cam sen Yên Bái, Cam sen Đình Cả - Bắc Sơn, cam bù Hà Tĩnh Sau đó được trồng rộng rãi ở Trung Quốc, miền nam nước Nhật, tây Ấn Độ, Địa Trung Hải, Mỹ.

Theo Tôn Thất Trình (1995) bưởi có nguồn gốc ở Ấn Độ. Như vậy các tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu về nguồn gốc thấy rằng: Bưởi có nguồn gốc từ Ấn Độ, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á thuộc vùng khí hậu nhiệt đới và Á nhiệt đới nóng (Trình,1995). Phân loại: Sự phân loại cam quýt khá phức tạp vì có các yếu tố như: vòng di thực và khả năng thích ứng rộng, có rất nhiều giống (Cultivars) trong sản xuất và các dạng con lai của giống này (Hybrids), hiện tượng hạt đa phôi, đột biến và hiện tượng đa bội thể cũng là những nhân tố gây khó khăn cho phân loại cam quýt. (Hibino, Usugi et al.,1985) Chi cam, chanh (Citrus sp.) là một chi thực vật có hoa trong họ Cửu lý hương (Rutaceae), có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới ở đông nam châu Á.

Các loại cây trong chi này là các cây bụi lớn hay cây thân gỗ nhỏ, cao tới 5–15 m tùy loại, với thân cây có gai và các lá thường xanh mọc so le có mép nhẵn. Hoa mọc đơn hay thành ngù hoa nhỏ, mỗi hoa có đường kính 2–4 cm với 5 (ít khi 4) cánh hoa màu trắng và rất nhiều nhị hoa. Hoa thông thường có mùi thơm rất mạnh. Quả là loại quả có múi, một dạng quả mọng đặc biệt, hình cầu hay cầu thuôn dài, chiều dài 4–30 cm và đường kính 4–20 cm, bên trong quả khi bóc lớp vỏ và cùi sẽ thấy lớp vỏ mỏng, dai, màu trắng bao quanh các múi bên trong chứa nhiều tép mọng nước.

Chi này có vai trò quan trọng về mặt thương mại do nhiều loài (hoặc cây lai ghép) được trồng để lấy quả. Sự phân loại nội bộ trong chi này rất phức tạp và hiện nay người ta vẫn không biết chính xác số lượng loài có nguồn gốc tự nhiên, do nhiều loài được coi là có nguồn gốc lai ghép. Các loại cây trong chi Citrus được trồng có thể là con cháu của chỉ 4 loài tổ tiên (Ashmore,2014). Tình hình sản xuất cây có múi tại Việt nam Theo Cục trồng trọt thì diện tích, sản lượng cây có múi cả nước liên tục tăng trong những năm gần đây, với tốc độ tăng trưởng cao; trong đó tại phía Bắc, trong 10 năm từ 2009 đến 2019, tốc độ tăng trưởng cây có múi bình quân 10%/năm về diện tích (tương ứng 7,3 nghìn ha/năm), 12,5%/năm về sản lượng (69,4 nghìn tấn/năm).

Cây có múi hiện là nhóm cây ăn quả có diện tích, sản lượng lớn nhất trong sản xuất cây ăn quả nước ta nói chung và các tỉnh phía Bắc nói riêng: Tổng diện tích cây có múi cả nước đến hết năm 2019 đạt 256,86 nghìn ha, chiếm 24,07% tổng diện tích cây ăn quả; tiếp theo lần lượt là nhóm nhãn, vải, chôm chôm (14,97%); chuối (14,06%); xoài (9,83%).; Tổng sản lượng quả có múi đạt hơn 2,46 triệu tấn; tiếp theo lần lượt là chuối (2,2 triệu tấn); thanh long (1,25 triệu tấn); vải, nhãn, chôm chôm (1,15 triệu tấn)…. Riêng các tỉnh phía Bắc: tổng diện tích cây có múi 121,97 nghìn ha, chiếm 47,5% so cả nước; chiếm 29,09% so tổng diện tích cây ăn quả Miền Bắc.Tổng quan về bệnh vàng lá gân xanh (HLB) 2. Lịch sử và phân bố bệnh vàng lá gân xanh Bệnh vàng lá gân xanh được ghi nhận đầu tiên ở đông nam Trung Quốc vào năm 1919. Vào năm 1921, Theo một số báo cáo bệnh xuất hiện tại philipin nhưng bị nhầm lẫn với triệu chứng thiếu kẽm.

Tại miền nam châu Phi bệnh xuất hiện dưới nhiều tên gọi khác nhau như chổi vàng (Yellow shoot) hay Greening và vào năm 1937 lần đầu tiên HLB được mô tả và tính độc và giả thiết cơ chế gây bệnh.Từ năm 1941 – 1955 các nghiên cứu về HLB được tiến hành mở rộng ở đông nam Trung Quốc. Năm 1960 bệnh xuất hiện lần đầu tiên tại Thái Lan. Năm 1965, một số nghiên cứu chỉ ra rằng bệnh được truyền qua gốc ghép và bời 1 loài rầy châu Phi (Trioza erytreae) gây hại trên họ cây có múi. Tại Philipin và Ấn Độ vào năm 1966 , một số nhà nghiên cứu nhận thấy rằng có sự giống nhau giữa các triệu chứng là lốm đốm và bệnh gây chết cây có múi do HLB ở Đài Loan, Trung Quốc và bệnh vàng lá ở Châu Phi.

Các nhà khoa học ở Philipin đã chứng minh rằng lá lốm đốm (mottle leaf) và gây chết cây có múi (citrus dieback) được truyền bở rầy chổng cánh châu Á (Diaphorina citri).Năm 1998, rầy chổng cánh châu Á xuất hiện tại Florida, Mỹ. Bệnh xuất hiện tại Brazil vào năm 2004. Năm 2005, bệnh được ghi nhận tại Florida (Bové,2006). Hiện nay bệnh đã được ghi nhận ở hơn 40 quốc gia trên toàn Thế giới trải dài từ châu Á, châu Phi châu Mỹ.