Nghiên cứu chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh và tàn lụi trên cây có múi sử dụng kỹ thuật miễn dịch

• Tác giả: Chu Hoàng Sơn
• Người hướng dẫn: PGS. Hà Viết Cường
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Bệnh cây
• Đề tài: Nghiên cứu chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh (Candidatus Liberibacter Asiaticus) và bệnh tàn lụi (Citrus Tristeza Virus) trên cây có múi bằng kỹ thuật miễn dịch
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Nội dung nghiên cứu
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng Quan Cây Có Múi
• 2.1.1. Về nguồn gốc
• 2.1.2. Phân loại
• 2.1.3. Tình hình sản xuất cây có múi tại Việt nam
• 2.2. Tổng quan về bệnh vàng lá gân xanh (HLB)
• 2.2.1. Lịch sử và phân bố bệnh vàng lá gân xanh
• 2.2.2. Tác nhân gây bệnh - Vi khuẩn Candidatus liberibacter (Ca. L)
• 2.2.3. Triệu chứng, dấu hiệu bệnh
• 2.2.4. Các phương pháp chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh
• 2.3. Tổng Quan Về Bệnh Tàn Lụi Cây Có Múi (Citrus Tristeza Virus – CTV)
• 2.3.1. Lịch sử và phân bố
• 2.3.2. Tác nhân gây bệnh
• 2.3.3. Triệu chứng, dấu hiệu bệnh
• 2.3.4. Truyền bệnh và biện pháp phòng chống
• 2.4. Tổng Quan Tình Hình Nghiên Cứu Trong Nước Và Ngoài Nước
• 2.4.1. Nghiên cứu trong nước
• 2.4.2. Nghiên cứu nước ngoài
• 2.5. Hệ thống biểu hiện và các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu
• 2.5.1. Hệ thống biểu hiện
• 2.5.2. Hệ thống vector biểu hiện
• 2.5.3. Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu
• 2.5.3.1. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)
• 3. PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm
• 3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.3. Các chất kháng sinh
• 3.4. Môi trường
• 3.5. Các thiết bị máy chủ yếu
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp tách chiết DNA và RNA tổng số bằng CTAB
• 3.7.2. Phương pháp PTA- ELISA (Plate Trapped Antibody - Enzyme Linked Immune Sorbent Assay)
• 3.7.3. Phương pháp gây miễn dịch trên thỏ
• 4. PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả chuẩn bị kháng nguyên tái tổ hợp
• 4.2. Phục hồi nguồn vi khuẩn E. Coli Rossetta DE3 và Rossetta DE3 + pET28a
• 4.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp của các cấu trúc pET28a + OMP-N, pET28a +OMP-C và pET28a + CTV-CP
• 4.4. Điện di các sản phẩm của cảm ứng nhân nuôi
• 4.5. Kết quả sản xuất kháng thể đa dòng đặc hiệu cho HLB và CTV bằng kỹ thuật miễn dịch
• 4.6. Chuẩn bị nguồn kháng nguyên đặc hiệu
• 4.7. Tiến hành gây miễn dịch trên thỏ
• 4.8. Kiểm tra kháng huyết thanh thu được bằng kỹ thuật PTA-ELISA
• 4.9. Chẩn đoán bệnh HLB và CTV bằng kĩ thuật PCR và RT-PCR
• 4.10. Kết quả kiểm tra các mẫu dùng trong phản ứng ELISA bằng phương pháp sinh học phân tử
• 4.11. Một số bệnh thường gặp trên cây có múi và một số triệu chứng không điển hình của bệnh HLB
• 5. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Mục đích và nội dung nghiên cứu

Mục đích của nghiên cứu này là tạo ra kháng thể đa dòng từ kháng nguyên đặc hiệu nhằm chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh (Candidatus Liberibacter Asiaticus) và bệnh tàn lụi (Citrus Tristeza Virus). Nội dung nghiên cứu bao gồm việc tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp của CaLas và CTV trong dòng vi khuẩn E. Coli Rossetta, dựa trên cấu trúc biểu hiện gene mã hóa OMP của Ca. L và CP của CTV. Nghiên cứu cũng sẽ thực hiện việc gây miễn dịch trên thỏ từ kháng nguyên tái tổ hợp đã biểu hiện và đánh giá tính đặc hiệu cũng như hiệu giá của kháng thể thu được bằng các kỹ thuật miễn dịch như ELISA và lai phân tử (Dot-Blot). Việc tạo ra kháng thể đa dòng sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong việc chẩn đoán các bệnh hại nguy hiểm này, từ đó góp phần bảo vệ cây trồng và nâng cao năng suất nông sản.

II. Tổng quan về bệnh vàng lá gân xanh HLB

Bệnh vàng lá gân xanh (HLB) được ghi nhận lần đầu tiên ở Đông Nam Trung Quốc vào năm 1919. Tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Candidatus liberibacter. Bệnh này gây ra các triệu chứng nghiêm trọng trên cây có múi, làm giảm năng suất và chất lượng nông sản. HLB được truyền qua vector là rầy chổng cánh châu Á (Diaphorina citri). Các triệu chứng của bệnh bao gồm lá vàng, gân lá xanh, và quả nhỏ, méo mó. Việc chẩn đoán bệnh HLB thường gặp khó khăn do triệu chứng dễ nhầm lẫn với các bệnh khác. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại như PCR và ELISA có độ chính xác cao nhưng yêu cầu thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có trình độ. Do đó, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán đơn giản và hiệu quả là rất cần thiết để kiểm soát bệnh HLB.

III. Tổng quan về bệnh tàn lụi CTV

Bệnh tàn lụi (Citrus Tristeza Virus - CTV) là một trong những bệnh nghiêm trọng nhất trên cây có múi, gây thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp. CTV được phát hiện lần đầu tiên vào những năm 1930 tại Nam Mỹ và đã lây lan ra nhiều quốc gia khác. Bệnh này gây ra các triệu chứng như cây còi cọc, lá vàng và chết dần. CTV được truyền qua vector là rầy chổng cánh và có thể lây lan qua phương pháp ghép cây. Việc chẩn đoán CTV cũng gặp nhiều khó khăn tương tự như HLB, do triệu chứng không điển hình và dễ nhầm lẫn với các bệnh khác. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại như RT-PCR cho kết quả chính xác nhưng yêu cầu thiết bị và kỹ thuật viên có trình độ. Do đó, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả cho CTV là rất cần thiết.

IV. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh và bệnh tàn lụi. Phương pháp tách chiết DNA và RNA tổng số bằng CTAB được áp dụng để thu thập mẫu. Kỹ thuật PTA-ELISA (Plate Trapped Antibody - Enzyme Linked Immune Sorbent Assay) được sử dụng để kiểm tra kháng huyết thanh thu được từ thỏ. Phương pháp PCR và RT-PCR được áp dụng để chẩn đoán bệnh HLB và CTV từ các mẫu cây thu thập. Các kết quả từ các phương pháp này sẽ được phân tích để đánh giá tính hiệu quả và độ chính xác trong việc chẩn đoán các bệnh hại trên cây có múi. Việc áp dụng các phương pháp này không chỉ giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán mà còn góp phần bảo vệ cây trồng và nâng cao năng suất nông sản.

V. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tạo ra kháng thể đa dòng từ kháng nguyên tái tổ hợp của HLB và CTV là khả thi. Các thí nghiệm đã chứng minh rằng kháng thể thu được có tính đặc hiệu cao và có thể sử dụng trong chẩn đoán bệnh. Kết quả từ phương pháp PCR và RT-PCR cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh HLB và CTV trong các mẫu thu thập là đáng kể. Việc áp dụng các kỹ thuật miễn dịch như ELISA và PTA-ELISA đã cho kết quả chính xác, giúp nâng cao khả năng chẩn đoán bệnh. Những phát hiện này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả cho các bệnh hại trên cây có múi, từ đó góp phần bảo vệ sản xuất nông nghiệp và nâng cao giá trị kinh tế cho người nông dân.