BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN NGUYỄN ĐÀO HỮU TOÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT PHỔ CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TÁCH TỪ KEO ONG KHÔNG NGÒI ĐỐT (Homotrigona Apicalis) Ở BÌNH ĐỊNH Chuyên ngành: Hóa lí thuyết và Hóa lí Mã số : 8440119 Ngƣời hƣớng dẫn: TS. DIỆP THỊ LAN PHƢƠNG TS. NGUYỄN LÊ TUẤN LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của TS. Diệp Thị Lan Phƣơng và TS.
Nguyễn Lê Tuấn. Các số liệu, những kết luận nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận văn này trung thực và chƣa từng công bố dƣới bất kỳ hình thức nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Học viên Nguyễn Đào Hữu Toàn LỜI CẢM ƠN Luận văn này được hoàn thành tại Khoa Khoa học Tự nhiên - Trường Đại học Quy Nhơn.
Trong thời gian thực hiện luận văn, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo tâm huyết, nhiệt tình của thầy cô, gia đình và bạn bè. Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Diệp Thị Lan Phương, TS. Nguyễn Lê Tuấn và NCS.
Hồ Văn Ban đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn tốt nghiêp. Em xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Khoa học và Công nghệ cấp Bộ năm 2022, mã số B2022-DQN-08. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Quy Nhơn đã quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện luận văn. Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn, các anh chị em tập thể lớp Cao học Hóa K23 trường ĐH Quy Nhơn đã luôn hỗ trợ, động viên trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên giúp đỡ em hoàn thành luận văn này. Mặc dù đã rất cố gắng trong thời gian thực hiện luận văn, nhưng vì còn hạn chế về kiến thức cũng như thời gian, kinh nghiệm nghiên cứu nên không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự thông cảm và những ý kiến đóng góp quý báu từ quý thầy cô để luận văn của em được hoàn thiện hơn. Em xin trân trọng cảm ơn! MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.
i DANH MỤC CÁC HÌNH. ii DANH MỤC CÁC BẢNG. Giới thiệu ong không ngòi đốt (Homotrigona Apicalis). Giới thiệu keo ong không ngòi đốt.
Công dụng của keo ong đối với con ngƣời. Giới thiệu các lớp chất có trong mẫu tự nhiên. Terpene và Terpenoid. Hợp chất phenol.
Một số công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM. Phƣơng pháp nghiên cứu. Phƣơng pháp chiết.
Phƣơng pháp hóa lý nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất thu cao chiết EtOH của keo ong không ngòi đốt (Homotrigona Apicalis). Phƣơng pháp định tính các lớp chất có trong keo ong. Phƣơng pháp sắc ký. Phƣơng pháp xác định cấu trúc của hợp chất phân lập.
Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định. Hóa chất và thiết bị. Tạo tro keo ong. Nghiên cứu phân lập hợp chất từ cao chiết EA.
Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất thu cao chiết EtOH31 2. Định tính các lớp chất. Đánh giá thành phần cao chiết EtOH và EA từ keo ong. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu. Hàm lƣợng tro của keo ong Homotrigona Apicalis. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất thu cao chiết EtOH.
Phƣơng pháp ngâm chiết. Phƣơng pháp chiết siêu âm. Định tính các lớp chất chính có trong keo ong. Phát hiện triterpenoid.
Phát hiện alkaloid. Phát hiện hợp chất phenol. Phát hiện steroid. Phát hiện flavonoid.
Đánh giá sơ bộ thành phần hóa học từ cao chiết EtOH và EA. Nghiên cứu phân lập hợp chất từ cao chiết EA. Xác định cấu trúc và tính chất phổ của chất rắn phân lập. Phổ 1H NMR của hợp chất thu đƣợc.
Phổ 13 C NMR và HSQC của hợp chất thu đƣợc. Phổ HMBC của hợp chất thu đƣợc. Phổ MS của chất rắn thu đƣợc. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định của cao chiết EtOH.
68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 71 i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt CC Column chromatography Sắc ký cột 13 C NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Resonance carbon 13 COSY Homonuclear Correlated Phổ COSY Spectroscopy DEPT Distortionless Enhancement Kỹ thuật xác định số proton by Polarisation Transfer đính với carbon EA Ethyl acetate Ethyl acetate IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tƣơng tác di hạt nhân qua Correlation nhiều liên kết 1 H NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Resonance proton HSQC Heteronuclear Single Phổ tƣơng tác trực tiếp H-C Quantum Coherence Hx Hexane Hexane MS Mass spectrum Phổ khối lƣợng EtOH Ethanol Ethanol TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng ii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Ong không ngòi đốt Homotrigona Apicalis. Hình dạng bên ngoài của ong không ngòi đốt Homotrigona Apicalis.
Quá trình hình thành keo ong. keo trong tổ; b. keo sau thu hoạch). Một số chế phẩm trên thị trƣờng từ keo ong.
Một số terpene. Một số terpenoid. Bộ khung của steroid. Một số alkaloid.
Bộ khung của flavonoid. Mẫu sắc ký bản mỏng. Mẫu keo ong Homotrigona Apicalis. Đốt tạo tro keo ong Homotrigona Apicalis.
Sắc ký cột cao EA của keo ong. Các chất ở phân đoạn 2 đƣợc tẩm silica gel. Quy trình tách chiết hợp chất từ keo ong Homotrigona Apicalis. Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ bột keo ong với thể tích EtOH.
Thiết bị chiết siêu âm dùng trong thí nghiệm. Bột keo ong Homotrigona Apicalis. Đồ thị biễu diễn sự ảnh hƣởng của tỉ lệ bột keo ong (g) : thể tích EtOH (mL) đến hàm lƣợng cao chiết EtOH trong ngâm chiết. Đồ thị biễu diễn sự ảnh hƣởng của thời gian ngâm chiết đến hàm lƣợng cao chiết EtOH.
Đồ thị biễu diễn sự ảnh hƣởng của tỉ lệ bột keo ong (g) : thể tích EtOH (mL) đến hàm lƣợng cao chiết EtOH trong chiết siêu âm. Đồ thị biễu diễn sự ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến hàm lƣợng cao chiết EtOH trong chiết siêu âm. Kết quả định tính triterpenoid bằng thuốc thử Liebermann - Burchard. Kết quả định tính alkaloid bằng thuốc thử Wagner.
Kết quả định tính các hợp chất phenol bằng thuốc thử FeCl3. Kết quả định tính Steroid bằng phản ứng Salkowski. Kết quả định tính các hợp chất Flavonoid. Dịch chiết EtOH của keo ong.
Cao chiết EtOH của keo ong. Chiết keo ong với dung môi EA. Cao chiết EA của keo ong. TLC của cao chiết EtOH hiện màu với Ce(SO4)2.
TLC của cao chiết EA hiện màu với Ce(SO4)2. TLC của phân đoạn 2 cao chiết EA. TLC của chất rắn sạch. Quy ƣớc đánh số trong công thức của Spathulenol và công thức 3D.
Phổ 1H NMR của chất phân lập trong CDCl3. Phổ 1H NMR của chất phân lập kéo giãn đoạn 2,45 – 1,75 ppm. Phổ 1H NMR của chất phân lập kéo giãn đoạn 1,8 – 0,5 ppm. Phổ COSY của chất phân lập.
Phổ 13C NMR của chất rắn phân lập trong CDCl3. Phổ HSQC của chất phân lập. Phổ HMBC của chất phân lập trong CDCl3. Phổ HMBC của chất phân lập kéo giãn 2,4-0,6 ppm.
Phổ MS của chất phân lập. 67 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Cấu trúc hóa học và tên thông thƣờng một số hợp chất phenol loại C6C1, C6C3. Hàm lƣợng tro của keo ong dú Lisotrigona furva.
Ảnh hƣởng của tỉ lệ giữa khối lƣợng bột keo ong và thể tích EtOH đến hàm lƣợng cao chiết trong ngâm chiết. Ảnh hƣởng của thời gian ngâm chiết đến hàm lƣợng cao chiết. Ảnh hƣởng của tỉ lệ khối lƣợng bột keo ong và thể tích dung môi EtOH đến hàm lƣợng cao chiết trong chiết siêu âm. Ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến hàm lƣợng cao chiết.
So sánh các yếu tố ảnh hƣởng của cả 2 phƣơng pháp. Kết quả định tính các lớp chất có mặt trong keo ong. Số liệu phổ 1H NMR của chất thu đƣợc và số liệu tham khảo. Số liệu phổ 13C NMR của chất phân lập và số liệu tham khảo.
Kết quả phổ MS của chất phân lập và công thức của mảnh ion. Kết quả kháng vi sinh vật và nấm của cao chiết EtOH. Lý do chọn đề tài Trong những năm gần đây, keo ong ngày càng thu hút nhiều nghiên cứu bởi những tác dụng có lợi đến sức khỏe con ngƣời nhƣ đƣợc sử dụng trong thực phẩm, đồ uống, chất bổ sung dinh dƣỡng, mỹ phẩm…1,2. Keo ong là hỗn hợp nhựa tự nhiên đƣợc tạo ra do những con ong thu thập nhựa từ các kẽ hở của vỏ, chồi của thực vật và dịch chiết ra từ tuyến nƣớc bọt của ong, đƣợc sử dụng để hàn kín tổ giúp bảo vệ sự phát triển của ấu trùng và bản thân khỏi sự tấn công của tác nhân gây bệnh 1.
Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng keo ong có nhiều chức năng sinh học khác nhau, chẳng hạn nhƣ chống vi khuẩn 3,4 , chống ung thƣ 5,6, các hoạt động chống oxy hóa và chống viêm 7,8. Thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt là đa dạng, khác nhau do phụ thuộc vào loài ong, khu vực địa lý và hệ thực vật quanh đàn ong. Tuy nhiên chƣa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loại keo ong không ngòi đốt ở Việt Nam. Ở Bình Định, các cơ sở nuôi ong không ngòi đốt còn tự phát theo kinh nghiệm dân gian, thậm chí keo ong còn bỏ phí không sử dụng, đã không phát huy hết công dụng và lãng phí nguồn tài nguyên thiên nhiên giá trị này.
Vì vậy, rất cần thiết để nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của keo ong không ngòi đốt ở Bình Định nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác, sử dụng một cách hiệu quả, tạo các chế phẩm có giá trị cao từ nguồn keo ong không ngòi đốt còn bỏ ngỏ này.