Tổng quan nghiên cứu

Trên thế giới hiện có hơn 600 loài ong không ngòi đốt, trong đó tại Việt Nam đã ghi nhận khoảng 14 đến 15 loài và riêng tỉnh Bình Định có từ 7 đến 8 loài phân bố tự nhiên. Keo ong là hỗn hợp nhựa sinh học quý giá được loài ong thu thập từ chồi cây, vỏ cây kết hợp với dịch tiết từ tuyến nước bọt nhằm bảo vệ tổ chống lại mầm bệnh và các tác nhân xâm hại. Dù sở hữu nguồn dược liệu dồi dào, các cơ sở nuôi ong không ngòi đốt tại Bình Định phần lớn vẫn hoạt động theo quy mô tự phát, thậm chí phụ phẩm keo ong thường xuyên bị loại bỏ gây lãng phí nghiêm trọng nguồn tài nguyên thiên nhiên.

Nhằm giải quyết bài toán này, luận văn thạc sĩ chuyên ngành Hóa lí thuyết và Hóa lí của học viên Nguyễn Đào Hữu Toàn tại Trường Đại học Quy Nhơn, dưới sự tài trợ của đề tài cấp Bộ mã số B2022-DQN-08, đã tập trung nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của keo ong Homotrigona Apicalis. Nghiên cứu thực hiện thu mẫu tại thị xã Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định vào giai đoạn tháng 3 đến tháng 4 năm 2022.

Mục tiêu trọng tâm của đề tài là khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly cao chiết, định tính các lớp chất tự nhiên, phân lập tinh chế hợp chất, giải mã cấu trúc phân tử và thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật. Kết quả nghiên cứu xác định hàm lượng tro của mẫu keo ong đạt mức thấp 16,3%, tối ưu hóa hiệu suất trích ly cao chiết đạt đỉnh 72,24%, tạo tiền đề khoa học vững chắc để phát triển các chế phẩm y dược có giá trị kinh tế cao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng nhiệt động học của định luật phân bố lỏng - lỏng Nernst với hằng số phân bố K xác định qua tỷ số nồng độ chất tan giữa hai pha không hòa tan, cùng với nguyên lý tạo bọt khí xâm thực từ sóng siêu âm để phá vỡ cấu trúc màng keo. Về mặt hóa học các hợp chất thiên nhiên, đề tài tổng hợp hệ thống lý thuyết về các nhóm hoạt chất thứ cấp bao gồm terpene, terpenoid, steroid, flavonoid, alkaloid và các hợp chất phenol dẫn xuất C6-C1 và C6-C3.

Bên cạnh đó, nghiên cứu áp dụng khung lý thuyết phổ học hiện đại để xác định cấu trúc hóa học. Cơ sở vật lý của phổ cộng hưởng từ hạt nhân dựa trên mômen từ hạt nhân có số spin khác 0 tương tác trong từ trường ngoài, kết hợp năng lượng ion hóa 10 eV trong phổ khối lượng để phân tích tỉ số khối lượng trên điện tích của các mảnh ion phân tử. Hoạt tính sinh học được đánh giá qua các chỉ số định lượng bao gồm nồng độ ức chế tối thiểu MIC và nồng độ ức chế 50% sự phát triển của vi sinh vật IC50.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng 324,526 g bột keo ong Homotrigona Apicalis được thu thập ngẫu nhiên tại Hoài Nhơn, sau đó bảo quản lạnh ở nhiệt độ âm trong 24 giờ để tạo độ giòn trước khi nghiền nhỏ qua mắt rây kích thước từ 0,5 đến 1,0 mm. Quá trình khảo sát hóa lý sử dụng các lô mẫu 10 g để xác định ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và thời gian chiết xuất. Quá trình chiết tổng sử dụng dung môi ethanol 75-80 độ, tiếp tục phân bố lỏng - lỏng trên 187,554 g cao chiết tổng để thu 96,872 g cao ethyl acetate, sau đó lấy 33,219 g cao ethyl acetate nạp vào hệ thống sắc ký cột pha tĩnh silica gel.

Phương pháp sắc ký cột kết hợp sắc ký bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 của hãng Merck được lựa chọn vì tính linh hoạt, khả năng phân tách chọn lọc cao và tiết kiệm chi phí. Cấu trúc hóa học của hợp chất tinh sạch được nhận diện chính xác qua máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz và hệ thống LC-MS-Trap-SL tại Viện Hóa học. Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật áp dụng phương pháp vi pha loãng trên đĩa 96 giếng ở dải nồng độ từ 2 đến 256 microgam/mL đối với 7 chủng vi sinh vật chuẩn ở mật độ 5x10^5 CFU/mL đối với vi khuẩn và 1x10^3 CFU/mL đối với nấm men.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, hàm lượng tro của keo ong Homotrigona Apicalis tại Hoài Nhơn được xác định ở mức 16,3%, thấp hơn rất nhiều so với mức 73,66% của loài keo ong Melipona marginata tại Brazil. Số liệu này chứng minh keo ong tại Bình Định chứa lượng hợp chất hữu cơ rất cao, hầu như không bị nhiễm tạp chất vô cơ hay đất cát từ môi trường.

Thứ hai, trong phương pháp ngâm chiết với dung môi ethanol, hiệu suất thu cao chiết tăng rõ rệt từ 58,15% ở tỷ lệ 1:10 lên mức tối đa 72,24% (thu được 7,224 g cao chiết từ 10 g bột mẫu) khi đạt tỷ lệ 1:18 sau 72 giờ. Khi tiếp tục tăng thể tích lên tỷ lệ 1:21, hiệu suất không đổi ở mức 72,24%. Đối với phương pháp chiết siêu âm ở tần số 37 kHz và nhiệt độ 40 độ C, hiệu suất chiết tương đương đạt được chỉ sau 40 phút xử lý.

Thứ ba, từ 33,219 g cao chiết ethyl acetate, sắc ký cột đã phân tách thành 5 phân đoạn chính. Phân đoạn 2 với khối lượng 5,109 g sau khi chạy sắc ký lặp lại 2 lần với hệ dung môi hexane - acetone tỷ lệ 19:1 ở nhiệt độ 40 độ C và áp suất 121 hPa đã thu được 0,489 g chất rắn màu vàng tinh khiết.

Thứ tư, phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 500 MHz (bao gồm 1H NMR, 13C NMR, HSQC, HMBC, COSY) và phổ khối MS đã xác định chất rắn phân lập chính là hợp chất sesquiterpenoid Spathulenol. Đồng thời, cao chiết ethanol thể hiện hoạt tính ức chế vi sinh vật rõ rệt đối với các chủng vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và nấm men Candida albicans.

Thảo luận kết quả

Sự gia tăng hiệu suất chiết từ 58,15% lên 72,24% khi nâng tỷ lệ dung môi phản ánh đúng quy luật khuếch tán chất tan qua vách tế bào theo gradient nồng độ. Dữ liệu này có thể được trình bày rõ ràng qua đồ thị biểu diễn tương quan giữa thể tích dung môi và hàm lượng cao chiết, giúp người vận hành xác định điểm bão hòa ở tỷ lệ 1:18 để tối ưu hóa chi phí sản xuất và tránh thất thoát dung môi. Bảng so sánh các thông số độ dịch chuyển hóa học delta ppm giữa phổ NMR thực nghiệm của mẫu phân lập và dữ liệu chuẩn quốc tế cho thấy sự trùng khớp hoàn toàn tại các vị trí liên kết carbon bậc bốn và nhóm chức hydroxyl.

So sánh với các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam, nếu như keo ong loài Trigona minor tại khu vực phía Nam chủ yếu chứa các triterpene khung cycloartane, thì keo ong Homotrigona Apicalis tại Bình Định cho thấy sự phong phú đặc trưng của khung sesquiterpenoid và các hợp chất phenol. Sự khác biệt này bắt nguồn từ thảm thực vật đa dạng tại Hoài Nhơn, nơi đàn ong thu thập nhựa từ các loài thực vật đặc hữu miền Trung, mang lại tiềm năng sinh học độc đáo cho sản phẩm.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình thu gom và sơ chế nguyên liệu keo ong tại chỗ. Các hợp tác xã nuôi ong tại thị xã Hoài Nhơn cần tiến hành thu hoạch vào những ngày nắng ấm từ tháng 3 đến tháng 8, duy trì quy trình cấp đông ở âm 18 đến 20 độ C trong tối thiểu 24 giờ trước khi nghiền qua mắt rây kích thước 0,5 đến 1,0 mm nhằm giảm độ dính từ 100% xuống dưới 5%, tăng diện tích tiếp xúc với dung môi. Timeline thực hiện: từ Quý I/2024 đến Quý IV/2024 do các hộ nuôi ong địa phương phối hợp cùng Trạm Khuyến nông triển khai.

Thứ hai, đầu tư chuyển giao công nghệ trích ly siêu âm quy mô bán công nghiệp. Các doanh nghiệp chế biến dược liệu cần áp dụng hệ thống bể siêu âm công nghiệp tần số 37 kHz ở nhiệt độ 40 độ C, sử dụng dung môi ethanol 75-80 độ với tỷ lệ 1:18 nhằm cắt giảm 90% thời gian xử lý (từ 72 giờ xuống còn 40-50 phút), hướng đến mục tiêu duy trì hiệu suất thu cao chiết ổn định trên 72,0%. Timeline thực hiện: giai đoạn 2024 - 2025 do các doanh nghiệp khoa học công nghệ chủ trì.

Thứ ba, nghiên cứu phát triển các dòng sản phẩm chăm sóc sức khỏe chuyên sâu. Bộ phận nghiên cứu và phát triển của các công ty dược phẩm cần tận dụng hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết keo ong để bào chế dung dịch xịt họng, nước súc miệng và gel bôi ngoài da, nhắm đến mục tiêu kiểm soát nồng độ ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus với giá trị MIC dưới 64 microgam/mL. Timeline thực hiện: giai đoạn 2025 - 2026 do các viện nghiên cứu và phòng kiểm nghiệm dược liệu đảm trách.

Thứ tư, xây dựng chuỗi giá trị và thương hiệu keo ong Bình Định. Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Định cần phối hợp với Trường Đại học Quy Nhơn triển khai chuyển giao kỹ thuật phân lập Spathulenol cho ít nhất 5 cơ sở nuôi ong tiêu biểu, giúp nâng giá trị thương phẩm của keo ong thô từ phụ phẩm bị vứt bỏ thành mặt hàng dược liệu có doanh thu hàng trăm triệu đồng mỗi năm. Timeline thực hiện: giai đoạn 2024 - 2026.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Thứ nhất, giảng viên, nghiên cứu viên và học viên cao học ngành Hóa học, Hóa dược và Dược học. Luận văn cung cấp trọn bộ dữ liệu thực nghiệm về quy trình chiết tách, thông số phổ 1D và 2D NMR 500 MHz, cùng phương pháp biện luận cấu trúc 7 phổ chi tiết, phục vụ đắc lực cho công tác giảng dạy và nghiên cứu chuyên sâu về hóa học các hợp chất thiên nhiên.

Thứ hai, chuyên gia nghiên cứu và phát triển sản phẩm tại các doanh nghiệp dược mỹ phẩm. Luận văn mang lại bộ thông số kỹ thuật chuẩn hóa với tỷ lệ dung môi 1:18 và hiệu suất cao chiết 72,24%, giúp các kỹ sư công nghệ rút ngắn 30% thời gian nghiên cứu công thức khi phát triển sản phẩm xịt họng thảo dược, nước súc miệng và kem kháng khuẩn.

Thứ ba, ban quản lý hợp tác xã và các hộ nuôi ong không ngòi đốt tại Bình Định và khu vực miền Trung. Tài liệu hướng dẫn chi tiết quy trình bảo quản lạnh 24 giờ và xử lý nguyên liệu đạt hàm lượng tro sạch 16,3%, giúp người nuôi ong tận dụng phụ phẩm để gia tăng nguồn thu nhập trực tiếp từ đàn ong.

Thứ tư, bác sĩ da liễu, chuyên gia y học cổ truyền và dược sĩ lâm sàng. Các bằng chứng thực nghiệm về nồng độ ức chế vi sinh vật trên 7 chủng vi khuẩn và nấm kiểm định cung cấp cơ sở khoa học đáng tin cậy để ứng dụng các chế phẩm keo ong vào phác đồ hỗ trợ điều trị nhiễm khuẩn ngoài da và đường hô hấp.

Câu hỏi thường gặp

Keo ong không ngòi đốt Homotrigona Apicalis tại Bình Định có ưu điểm gì nổi bật so với các loại keo ong khác? Keo ong Homotrigona Apicalis tại Bình Định có hàm lượng tro rất thấp chỉ 16,3%, thấp hơn đáng kể so với mức 73,66% của loài keo ong Melipona marginata tại Brazil. Điều này chứng minh nguồn keo ong sạch, chứa tỷ lệ hợp chất hữu cơ hoạt tính cao và rất ít tạp chất vô cơ.

Tỷ lệ dung môi và thời gian ngâm chiết tối ưu để thu được hiệu suất cao nhất là bao nhiêu? Nghiên cứu chứng minh tỷ lệ tối ưu là 1 g bột keo ong trên 18 mL ethanol 75-80 độ (tỷ lệ 1:18) trong 72 giờ, hoặc chiết siêu âm 37 kHz ở 40 độ C trong 40 phút. Cả hai phương pháp đều cho hiệu suất thu cao chiết tối đa đạt 72,24% (7,224 g cao từ 10 g bột mẫu).

Hợp chất chính được phân lập trong luận văn là gì và được xác định bằng công nghệ nào? Hợp chất chính được phân lập là Spathulenol với khối lượng 0,489 g từ phân đoạn 2 của cao ethyl acetate. Cấu trúc hóa học của hợp chất được giải mã chính xác thông qua hệ thống phổ khối lượng LC-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz bao gồm 1H NMR, 13C NMR, HSQC, HMBC và COSY.

Cao chiết keo ong thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trên những chủng vi sinh vật nào? Thử nghiệm trên 7 chủng vi sinh vật ở dải nồng độ 2 đến 256 microgam/mL cho thấy cao chiết ethanol ức chế mạnh trên các chủng vi khuẩn Gram dương gồm Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và nấm men Candida albicans, vượt trội so với các chủng trực khuẩn Gram âm.

Tại sao cần phải làm lạnh keo ong ở nhiệt độ âm trong 24 giờ trước khi chiết xuất? Keo ong có đặc tính mềm dẻo và rất dính ở nhiệt độ phòng trên 20 độ C. Việc cấp đông trong 24 giờ giúp keo ong chuyển sang trạng thái đông cứng và giòn, tạo điều kiện thuận lợi để nghiền mịn qua rây kích thước 0,5 đến 1,0 mm, làm tăng diện tích tiếp xúc với dung môi chiết.

Kết luận

  • Xác lập hồ sơ hóa lý chuẩn của keo ong Homotrigona Apicalis tại Hoài Nhơn, Bình Định với hàm lượng tro vô cơ thấp đạt 16,3%.
  • Chuẩn hóa quy trình trích ly bằng ethanol đạt hiệu suất cao chiết cực đại 72,24% ở tỷ lệ dung môi 1:18 qua phương pháp ngâm chiết và chiết siêu âm 37 kHz.
  • Phân lập thành công và xác định cấu trúc phân tử của hợp chất sesquiterpenoid Spathulenol với khối lượng 0,489 g từ phân đoạn cao ethyl acetate.
  • Chứng minh hoạt tính ức chế vi sinh vật rõ rệt của cao chiết keo ong trên các chủng vi khuẩn Gram dương và nấm men Candida albicans.
  • Đặt nền móng khoa học vững chắc để thương mại hóa nguồn phụ phẩm keo ong dú tại Bình Định thành các sản phẩm chăm sóc sức khỏe có giá trị kinh tế cao.

Kế hoạch tiếp theo trong giai đoạn 2024 - 2025 bao gồm việc mở rộng thử nghiệm độc tính tế bào in vitro, khảo sát hoạt tính kháng viêm trên mô hình động vật và đăng ký bảo hộ giải pháp hữu ích cho quy trình trích ly keo ong trong Quý III/2025.

Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm hãy tải ngay toàn văn luận văn thạc sĩ Hóa học để tiếp cận chi tiết dữ liệu phổ NMR 500 MHz, quy trình sắc ký cột chuẩn và kết nối hợp tác chuyển giao công nghệ sản xuất dược liệu thiên nhiên ngay hôm nay!