Phân lập và so sánh đặc điểm cấu trúc gen GmDREB2 của các giống đậu tương chịu hạn

Nghiên cứu phân lập và so sánh cấu trúc gen gmdreb2 ở các giống đậu tương chịu hạn, góp phần nâng cao khả năng chống chịu cho cây trồng.

• Tác giả: Phạm Thị Thu Miền
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Thị Thu Thủy
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu cấu trúc gen GmDREB2 ở các giống đậu tương chịu hạn
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• Mục tiêu nghiên cứu
• Nội dung nghiên cứu
• 1. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cây đậu tương
• 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm sinh học của cây đậu tương
• 1.1.2. Giá trị kinh tế của cây đậu tương
• 1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam
• 1.1.4. Đặc điểm hóa sinh của hạt đậu tương
• 1.2. Hạn và khả năng chịu hạn của cây
• 1.2.1. Hạn và ảnh hưởng của hạn đối với cây trồng
• 1.2.2. Cơ sở sinh lý, sinh hóa và cơ chế phân tử liên quan đến tính chịu hạn
• 1.2.3. Đặc tính chịu hạn của cây đậu tương
• 1.3. Gen liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương
• 1.3.1. Các gen chức năng
• 1.3.2. Gen DREB và DREB2
• 2. Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất - Thiết bị
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp sinh học phân tử
• 2.2.1.1. Thiết kế mồi nhân gen DREB2
• 2.2.1.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
• 2.2.1.3. Tổng hợp cDNA
• 2.2.1.4. Khuyếch đại gen DREB2
• 2.2.1.5. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel
• 2.2.1.6. Tách dòng gen và xác định trình tự nucleotid của gen
• 2.2.2. Phương pháp phân tích số liệu
• 2.3. Địa điểm nghiên cứu
• 3. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Đặc điểm sinh học của các giống đậu tương nghiên cứu
• 3.2. Kết quả phân lập gen DREB2 từ giống đậu tương DT 26
• 3.2.1. Kết quả tách RNA
• 3.2.2. Kết quả nhân bản gen DREB2 bằng phản ứng RT-PCR
• 3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α
• 3.2.4. Kết quả chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp
• 3.2.5. Kết quả tách plasmid
• 3.2.6. Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen DREB2
• 3.3. Kết quả phân tích gen DREB2
• 3.3.1. Cấu trúc gen DREB2
• 3.3.2. So sánh trình tự nucleotide
• 3.3.3. So sánh trình tự protein suy diễn
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu cấu trúc gen GmDREB2 ở đậu tương chịu hạn

Nghiên cứu cấu trúc gen GmDREB2 là một phần quan trọng trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của các giống đậu tương. Gen này đóng vai trò quyết định trong việc điều chỉnh phản ứng của cây trước điều kiện khô hạn. Việc hiểu rõ cấu trúc gen GmDREB2 sẽ giúp phát triển các giống đậu tương có khả năng chịu hạn tốt hơn, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

1.1. Đậu tương và tầm quan trọng của gen GmDREB2

Đậu tương (Glycine max) là cây trồng quan trọng, cung cấp nguồn thực phẩm và nguyên liệu cho ngành công nghiệp. Gen GmDREB2 có vai trò trong việc điều chỉnh khả năng chịu hạn, giúp cây phát triển tốt trong điều kiện khắc nghiệt.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu cấu trúc gen GmDREB2

Mục tiêu chính của nghiên cứu là phân lập và so sánh gen GmDREB2 từ các giống đậu tương khác nhau, nhằm xác định đặc điểm cấu trúc và chức năng của gen này trong việc chịu hạn.

II. Thách thức trong nghiên cứu gen GmDREB2 ở đậu tương chịu hạn

Khả năng chịu hạn của đậu tương phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có gen GmDREB2. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và ứng dụng gen này gặp nhiều thách thức. Các giống đậu tương hiện tại vẫn chưa đạt được mức độ chịu hạn tối ưu, do đó cần có những nghiên cứu sâu hơn để cải thiện tình trạng này.

2.1. Tình trạng hạn hán và ảnh hưởng đến năng suất đậu tương

Hạn hán là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất đậu tương. Các giống đậu tương hiện tại thường không đủ khả năng chịu đựng điều kiện khô hạn kéo dài, dẫn đến thiệt hại lớn cho nông dân.

2.2. Khó khăn trong việc xác định gen chịu hạn

Việc xác định và phân tích gen GmDREB2 gặp khó khăn do sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương. Cần có các phương pháp nghiên cứu hiện đại để phân tích chính xác cấu trúc và chức năng của gen này.

III. Phương pháp nghiên cứu cấu trúc gen GmDREB2 ở đậu tương

Nghiên cứu cấu trúc gen GmDREB2 được thực hiện thông qua các phương pháp sinh học phân tử hiện đại. Các kỹ thuật như PCR, phân tích trình tự nucleotide và so sánh gen sẽ được áp dụng để xác định đặc điểm cấu trúc của gen này.

3.1. Phương pháp phân lập gen GmDREB2

Gen GmDREB2 sẽ được phân lập từ các giống đậu tương bằng kỹ thuật PCR. Phương pháp này cho phép thu được gen với độ chính xác cao và hiệu suất tốt.

3.2. Phân tích trình tự nucleotide của gen GmDREB2

Sau khi phân lập, trình tự nucleotide của gen GmDREB2 sẽ được phân tích để xác định các biến thể gen. Việc này giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của gen trong việc chịu hạn.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của gen GmDREB2

Kết quả nghiên cứu cho thấy gen GmDREB2 có sự khác biệt rõ rệt giữa các giống đậu tương. Những giống có gen GmDREB2 mạnh mẽ hơn cho thấy khả năng chịu hạn tốt hơn, từ đó có thể ứng dụng trong việc phát triển giống mới.

4.1. So sánh đặc điểm gen GmDREB2 giữa các giống

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng gen GmDREB2 ở giống đậu tương DT 26 có cấu trúc khác biệt so với các giống khác, cho thấy tiềm năng cải thiện khả năng chịu hạn.

4.2. Ứng dụng gen GmDREB2 trong nông nghiệp

Việc ứng dụng gen GmDREB2 trong chọn giống có thể giúp phát triển các giống đậu tương chịu hạn tốt hơn, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm trong điều kiện khí hậu biến đổi.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu gen GmDREB2

Nghiên cứu gen GmDREB2 mở ra nhiều triển vọng cho việc phát triển giống đậu tương chịu hạn. Việc hiểu rõ cấu trúc và chức năng của gen này sẽ giúp cải thiện năng suất và chất lượng đậu tương trong tương lai.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu gen GmDREB2

Nghiên cứu gen GmDREB2 không chỉ giúp cải thiện giống đậu tương mà còn góp phần vào việc đảm bảo an ninh lương thực trong bối cảnh biến đổi khí hậu.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về gen GmDREB2 và các gen liên quan khác để phát triển các giống đậu tương có khả năng chịu hạn tốt hơn, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Cây đậu tương (tên khoa học: Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp và cây thực phẩm ngắn ngày giữ vị trí chiến lược trong nền nông nghiệp toàn cầu, sở hữu hàm lượng protein vượt trội từ 20% đến 40% cùng tỷ lệ lipid từ 18% đến 20%. Tại Việt Nam, sản lượng đậu tương giai đoạn 2007 - 2013 chỉ dao động từ 213,6 nghìn đến 350 nghìn tấn mỗi năm với năng suất trung bình đạt khoảng 1,45 đến 1,52 tấn/ha, thấp hơn đáng kể so với mức bình quân 2,58 tấn/ha trên thế giới. Khoảng 70% diện tích gieo trồng tập trung tại các tỉnh phía Bắc, trong đó 65% diện tích nằm ở vùng địa hình đồi núi dốc thường xuyên chịu cảnh khô hạn cục bộ. Đậu tương là loài cây rất mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh, cần tiêu tốn từ 500 đến 530 kg nước để tạo thành 1 kg chất khô và đòi hỏi lượng nước nảy mầm lên tới 50% khối lượng hạt. Tình trạng thiếu hụt nước nghiêm trọng làm giảm từ 30% đến 50% năng suất thu hoạch, đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc giải mã các cơ chế di truyền liên quan đến tính chịu hạn.

Mục tiêu trọng tâm của luận văn thạc sĩ là phân lập thành công gen GmDREB2 từ giống đậu tương DT26 có khả năng chống chịu hạn tốt, xác định trình tự nucleotide và so sánh đặc điểm cấu trúc phân tử của chuỗi polypeptide suy diễn với các trình tự đã công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế. Đề tài được triển khai trong năm 2014 tại Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên phối hợp cùng Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nghiên cứu mang ý nghĩa học thuật và thực tiễn sâu sắc, cung cấp dữ liệu phân tử chuẩn xác để định hướng công tác chọn tạo giống đậu tương chịu hạn, hướng tới nâng cao năng suất gieo trồng đạt trên 2 tấn/ha và gia tăng khả năng thích ứng của cây trồng trước biến đổi khí hậu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Khả năng chống chịu stress hạn hán ở thực vật được điều hòa bởi mạng lưới truyền tín hiệu phức tạp gồm con đường phụ thuộc axit abscisic (ABA) và con đường không phụ thuộc ABA. Khung lý thuyết của đề tài tập trung vào họ yếu tố phiên mã DREB (Dehydration Responsive Element Binding) thuộc phân họ AP2/EREBP, giữ vai trò kích hoạt dòng thác biểu hiện của hàng loạt gen chức năng chống chịu mất nước không phụ thuộc ABA.

Các khái niệm và cơ sở khoa học cốt lõi bao gồm:

• Yếu tố phiên mã DREB: Nhóm protein điều hòa có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với các trình tự cis trên vùng khởi động promoter của các gen chức năng đáp ứng hạn như LEA, P5CS, HSP, giúp kích hoạt quá trình phiên mã bảo vệ tế bào.
• Yếu tố cis DRE/CRT: Đoạn trình tự nucleotide dài 9 bp (TACCGACAT) chứa vùng lõi bảo thủ giàu cytosine CCGAC trên promoter của gen đích.
• Miền liên kết DNA AP2: Cấu trúc bảo thủ gồm 59 amino acid gồm 3 chuỗi beta-sheet và 1 chuỗi xoắn alpha-helix, trong đó vị trí valine thứ 14 và glutamic acid thứ 19 giữ vai trò quyết định khả năng gắn vào yếu tố DRE.
• Cơ chế bảo vệ thẩm thấu: Quá trình tích lũy các phân tử hữu cơ bảo vệ màng tế bào và duy trì áp suất thẩm thấu khi độ ẩm đất suy giảm dưới 40%.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 5 giống đậu tương đại diện: DT26, DT2008, DT2101, DT51 và DVN14 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm chọn tạo. Phương pháp chọn mẫu tập trung vào các giống thuần mang đặc tính nông sinh học đối lập, trong đó giống DT26 được chọn làm đối tượng phân lập gen chính nhờ khả năng chống đổ, phục hồi tốt và chịu hạn vượt trội ngoài đồng ruộng.

Phương pháp sinh học phân tử được lựa chọn nhằm thu nhận chính xác vùng mã hóa hoàn chỉnh (ORF) không chứa intron của gen GmDREB2:

• Tách chiết RNA tổng số: Thu mẫu từ 200 mg mô lá non 9 ngày tuổi, nghiền mịn trong nitơ lỏng và tinh sạch qua màng silica bằng bộ kit chuyên dụng.
• Tổng hợp cDNA: Phiên mã ngược phân tử mRNA thành chuỗi cDNA sợi đôi bằng enzyme RevertAid M-MuLV reverse transcriptase tại 42 độ C trong 60 phút.
• Khuếch đại gen bằng RT-PCR: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu DREB2soyF và DREB2soyR, thực hiện 30 chu kỳ nhiệt với nhiệt độ gắn mồi tối ưu ở 56 độ C.
• Tách dòng và giải trình tự: Sản phẩm tinh sạch được ghép nối vào vector pBT bằng enzyme T4 ligase ở 22 độ C trong 3 giờ, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến vi khuẩn E. coli chủng DH5alpha bằng sốc nhiệt 42 độ C trong 90 giây. Dòng tái tổ hợp được chọn lọc qua hệ thống chỉ thị màu xanh trắng IPTG/X-gal kết hợp colony-PCR và đọc trình tự trên máy ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer. Số liệu được phân tích bằng phần mềm BioEdit, MegAlign và DNAStar.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khảo nghiệm và phân tích thực nghiệm đã thu được 4 phát hiện quan trọng:

Thứ nhất, phân tích hình thái 5 giống đậu tương cho thấy sự đa dạng cao về khối lượng 1000 hạt, dao động từ 112,56 gam ở giống DT51 đến 200,44 gam ở giống DT2008. Giống đối tượng DT26 đạt khối lượng 172,93 gam, hạt dạng trung bình, vỏ màu vàng và rốn hạt màu nâu đậm.

Thứ hai, phản ứng RT-PCR khuếch đại gen GmDREB2 từ cDNA của giống DT26 với cặp mồi đặc hiệu đã nhân bản thành công một phân đoạn DNA đơn nhất, rõ nét có kích thước khoảng 480 bp trên gel agarose 1%, hoàn toàn trùng khớp với tính toán lý thuyết.

Thứ ba, sản phẩm biến nạp vector tái tổ hợp pBT-DREB2 vào tế bào E. coli DH5alpha tạo ra nhiều khuẩn lạc trắng mang đoạn chèn mong muốn. Kết quả giải trình tự khẳng định đoạn gen GmDREB2 phân lập từ giống DT26 có chiều dài chính xác 480 bp, tạo thành một khung đọc mở hoàn chỉnh mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 159 amino acid.

Thứ tư, phân tích cấu trúc protein suy diễn xác định miền bảo thủ AP2 nằm từ amino acid thứ 34 đến thứ 92 với chiều dài 59 amino acid. Miền này chứa đầy đủ 11 vị trí amino acid tham gia gắn trực tiếp vào DNA tại các tọa độ 35, 36, 38, 40, 42, 44, 48, 50, 57, 59 và 61.

Thảo luận kết quả

Khi tiến hành so sánh trình tự nucleotide và chuỗi polypeptide suy diễn của giống DT26 với các trình tự GmDREB2 công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI, mức độ tương đồng đạt từ 98% đến 99%. Sự sai khác nucleotide không làm thay đổi các vùng chức năng cốt lõi. Trong vùng liên kết AP2, hai vị trí đặc trưng là valine thứ 14 và glutamic acid thứ 19 được bảo tồn tuyệt đối, tương đồng chặt chẽ với các nghiên cứu tương tự trên cây lúa mì (độ tương đồng 99%), cây thuốc lá và hoa cúc.

Dữ liệu di truyền này được trực quan hóa qua ma trận căn hàng trình tự và sơ đồ cây phát sinh loài (phylogenetic tree), chứng minh gen GmDREB2 của giống DT26 thuộc phân họ A5 của nhóm yếu tố phiên mã DREB. Cơ chế phân tử này giải thích rõ tại sao giống DT26 có khả năng duy trì hoạt động sinh lý ổn định khi thiếu nước từ 3 đến 5 ngày, bởi protein DREB2 kích hoạt nhanh chóng các chất chống oxy hóa và điều hòa thẩm thấu nội bào mà không cần sự tích lũy chậm trễ của hormone ABA.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả phân lập thành công gen GmDREB2 từ giống DT26, đề tài đưa ra 4 khuyến nghị hành động thiết thực:

Thứ nhất, ứng dụng trình tự gen 480 bp đã giải mã để xây dựng hệ thống chỉ thị phân tử chức năng (functional marker). Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm cùng các trường đại học cần áp dụng marker này trong chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS), giúp rút ngắn thời gian tuyển chọn giống đậu tương chịu hạn từ 6 - 8 năm xuống còn 3 - 4 năm.

Thứ hai, phát triển các cấu trúc vector mang gen GmDREB2 phục vụ công tác chuyển gen nâng cao tính chống chịu. Các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học nông nghiệp cần phối hợp triển khai chuyển gen vào các giống đậu tương năng suất cao nhưng chịu hạn kém trong giai đoạn 2026 - 2030, hướng đến mục tiêu duy trì tỷ lệ nảy mầm trên 85% và giữ mức suy giảm năng suất dưới 10% khi gặp hạn.

Thứ ba, Trung tâm Khuyến nông các tỉnh miền núi phía Bắc và Đông Nam Bộ cần xây dựng quy trình canh tác tối ưu cho giống DT26 trên chân đất dốc, kết hợp phủ bổi giữ ẩm nhằm nâng cao năng suất thực tế đạt mốc 1,8 đến 2,2 tấn/ha trong vòng 2 năm tới.

Thứ tư, mở rộng nghiên cứu phân tích mức độ biểu hiện định lượng của gen GmDREB2 bằng kỹ thuật Real-time PCR trên các mô khác nhau (rễ, thân, lá) ở các giai đoạn 15 đến 30 ngày sau gieo dưới các mức độ stress mất nước khác nhau.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị chuyên môn cao và là nguồn tài liệu hữu ích cho 4 nhóm đối tượng:

Thứ nhất, các nhà khoa học và chuyên gia di truyền thực vật: Sử dụng nguồn dữ liệu trình tự 480 bp và cấu trúc miền AP2 để làm đối chứng phân tử, phục vụ nghiên cứu tiến hóa và chức năng các họ yếu tố phiên mã chống chịu stress phi sinh học.

Thứ hai, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Di truyền học, Sinh học, Công nghệ sinh học: Tiếp cận quy trình thực nghiệm chuẩn hóa từ thao tác tách chiết RNA thực vật, tổng hợp cDNA, khuếch đại RT-PCR, tạo dòng tái tổ hợp trên E. coli DH5alpha đến phân tích tin sinh học bằng BioEdit và MegAlign.

Thứ ba, kỹ sư nông nghiệp và cán bộ khuyến nông tại 28 tỉnh trồng đậu tương: Tham khảo số liệu đánh giá hình thái hạt và đặc tính chống chịu của 5 giống khảo nghiệm (khối lượng 1000 hạt từ 112,56 đến 200,44 gam) để lập kế hoạch cơ cấu giống phù hợp cho từng tiểu vùng khí hậu.

Thứ tư, các doanh nghiệp giống cây trồng nông nghiệp: Khai thác giống DT26 làm vật liệu bố mẹ trong các chương trình lai tạo giống thương phẩm thích ứng với hạn hán, gia tăng sức cạnh tranh cho hạt đậu tương nội địa.

Câu hỏi thường gặp

Yếu tố phiên mã GmDREB2 có vai trò sinh học cụ thể như thế nào đối với cây đậu tương? Protein GmDREB2 hoạt động như một nhân tố điều hòa phiên mã không phụ thuộc ABA, có khả năng nhận diện và gắn đặc hiệu vào vùng lõi CCGAC trên promoter của các gen bảo vệ tế bào. Khi cây gặp hạn, GmDREB2 kích hoạt nhanh chóng sự tổng hợp proline và các protein chống sốc nhiệt, giúp duy trì áp suất thẩm thấu màng tế bào.

Tại sao nghiên cứu lại phân lập gen GmDREB2 từ phân tử mRNA thay vì DNA tổng số? Việc sử dụng khuôn mẫu mRNA thông qua phiên mã ngược thành cDNA cho phép thu nhận chính xác khung đọc mở hoàn chỉnh dài 480 bp của gen GmDREB2 mà không bị xen lẫn các đoạn intron không mã hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho việc biểu hiện gen và suy diễn chuỗi 159 amino acid.

Giống đậu tương DT26 sở hữu những đặc tính nông học và di truyền nào nổi bật? Giống DT26 là giống lai giữa ĐT2000 và ĐT12, có khối lượng 1000 hạt đạt 172,93 gam, hạt màu vàng, rốn hạt nâu đậm, khả năng chống đổ tốt, phục hồi nhanh sau khi bị dòi đục thân và mang kiểu gen GmDREB2 có tính bảo thủ cao giúp thích ứng hiệu quả với điều kiện khô hạn.

Cấu trúc miền AP2 trong protein GmDREB2 có điểm gì đặc biệt? Miền AP2 của giống DT26 gồm 59 amino acid (từ vị trí 34 đến 92), bảo tồn nghiêm ngặt vị trí valine thứ 14 và glutamic acid thứ 19, đồng thời sở hữu 11 vị trí amino acid chuyên biệt tạo liên kết trực tiếp với DNA đích để kích hoạt tín hiệu phiên mã.

Mức độ tương đồng về trình tự của gen GmDREB2 ở giống DT26 so với dữ liệu quốc tế là bao nhiêu? Trình tự gen GmDREB2 ở giống DT26 đạt độ tương đồng rất cao, dao động từ 98% đến 99% so với các công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế NCBI, chứng minh tính bảo thủ cao trong tiến hóa của phân họ gen DREB chịu hạn ở cây họ đậu.

Kết luận

Công trình nghiên cứu đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu khoa học đề ra thông qua các đóng góp then chốt:

• Phân tích chi tiết đặc điểm hình thái và khối lượng hạt của 5 giống đậu tương nghiên cứu, ghi nhận sự dao động khối lượng 1000 hạt từ 112,56 gam đến 200,44 gam.
• Phân lập thành công đoạn gen GmDREB2 kích thước 480 bp từ cDNA của giống đậu tương chịu hạn DT26 bằng kỹ thuật RT-PCR tối ưu ở 56 độ C.
• Tách dòng và giải mã hoàn chỉnh khung đọc mở mã hóa chuỗi polypeptide gồm 159 amino acid mang miền bảo thủ AP2 dài 59 amino acid.
• Khẳng định độ tương đồng phân tử đạt 98% đến 99% so với các trình tự chuẩn trên GenBank, bảo tồn nguyên vẹn 11 vị trí liên kết DNA và các amino acid then chốt.
• Cung cấp cơ sở khoa học định lượng vững chắc phục vụ công tác chọn tạo giống đậu tương chịu hạn giai đoạn 2026 - 2030, mở ra tiềm năng lớn trong việc nâng cao năng suất cây trồng thích ứng với biến đổi khí hậu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc cây họ đậu (Fabaceae), là cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Hạt đậu tương có hàm lượng protein từ 20% - 40%, dễ tan và chứa hầu hết các loại amino acid, đặc biệt là các loại amino acid không thay thế (lysin, triptophan, metionin. Hàm lượng lipid từ 18 - 20%, có chứa tỷ lệ lớn các axit béo chưa no, có hệ số đồng hóa lớn (98%) và chỉ số iốt cao, tốt cho việc phòng chống bệnh bướu cổ ở người. Trong hạt đậu tương còn có nhiều loại vitamin khác như: Vitamin A, D, E, PP, K… cung cấp nguồn dinh dưỡng phong phú, cần thiết cho người và động vật [2], [3], [4].

Cây đậu tương là một trong những cây trồng quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới. Các sản phẩm rất quen thuộc của đậu tương như đậu phụ, nước tương, dầu ăn. có vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hằng ngày của con người. Các nhà khoa học đã nghiên cứu phát hiện ra khả năng phòng và điều trị bệnh ung thư, tim mạch trong hạt đậu tương.

Đặc tính quan trọng nữa của đậu tương, đó là khả năng cải tạo đất do hệ rễ của chúng có nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm. Cùng với thân và lá làm thay đổi tính chất lý, hóa và tăng độ phì nhiêu cho đất. Chính vì vậy, trồng đậu tương ngoài việc đem lại hiệu quả kinh tế còn góp phần vào công cuộc cải tạo đất trồng trọt [4]. Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê chính thức của Chính phủ, đậu tương được trồng ở 28 tỉnh trên khắp cả nước, trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam.

Khoảng 65% đậu tương nước ta được trồng ở vùng cao, những nơi đất không cần màu mỡ và 35% được trồng ở những vùng đất thấp ở khu vực Đồng bằng sông Hồng. Đậu tương được trồng ở nhiều địa phương trên khắp cả nước vào từng thời điểm khác nhau nên có cả vụ xuân, vụ hè và vụ đông [3]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ Sản lượng đậu tương trên thế giới đạt hàng trăm triệu tấn/ năm. Tuy nhiên, ở Việt Nam đậu tương chỉ đạt vài trăm nghìn tấn/ năm.

Để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và chế biến nước ta vẫn phải nhập khẩu đậu tương từ các nước trên thế giới đặc biệt là Mĩ [62]. Thực trạng này cũng chứng tỏ một điều là diện tích gieo trồng và năng suất đậu tương của nước ta còn thấp so với các nước trong khu vực và trên thế giới. Một trong những nguyên nhân làm sụt giảm năng suất cây trồng nói chung và đậu tương nói riêng chính là hạn hán [2]. Việt Nam nằm trong khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề của biến đổi khí hậu, hơn nữa nhiều tỉnh miền núi của nước ta có địa hình dốc cho nên tình trạng hạn hán cục bộ xảy ra rất phổ biến.

Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc nhóm cây chịu hạn kém, vì thế hạn xảy ra sẽ làm giảm năng suất của đậu tương [2], [3], [4]. Do đó, công tác tuyển chọn giống đậu tương có kiểu gen chịu hạn ngày càng được quan tâm nghiên cứu. Khả năng chịu hạn của thực vật là tính trạng do nhiều gen quy định. Cho đến nay, người ta vẫn chưa tìm được một gen cụ thể nào thực sự quyết định tính chịu hạn, mà mới chỉ xác định được các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương [9].

Các trình tự gen liên quan đến tính chịu hạn ở đậu tương đã được công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế, trong đó có gen DREB. DREB (Dehydration Responsive Element Binding) là một họ gen sản xuất protein kích hoạt nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của thực vật nói chung và của cây đậu tương nói riêng. Việc nghiên cứu về DREB đã thành công trên các đối tượng như cây Arabidopsis [37], lúa mì [28], thuốc lá [38], hoa cúc [35], hướng dương [23], ngô [47], lúa [24]… Trong phân họ DREB của đậu tương, việc nghiên cứu gen DREB2 liên quan đến tính chịu hạn cho thấy đây là nhóm gen đa dạng về cấu trúc, chức năng và các tác giả khuyến cáo cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu. Công bố đầu tiên về gen DREB2 ở cây đậu tương bởi Chen và cộng sự (2006), với việc phân lập gen DREB2 từ mRNA có kích thước 480bp.

Theo nhóm nghiên cứu, trong cây đậu tương, gen DREB2 tham gia tích cực vào việc cải tiến khả năng chịu hạn của cây [22], [54]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ Nhằm tìm hiểu đặc điểm cấu trúc của gen DREB2 liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương, chúng tôi lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập và so sánh đặc điểm cấu trúc gen GmDREB2 của một số giống đậu tương có khả năng chịu hạn khác nhau”. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập và so sánh gen DREB2 của giống đậu tương DT 26 với một số trình tự đã công bố. Nội dung nghiên cứu - Phân lập gen DREB2 từ mRNA của giống DT 26 bằng kỹ thuật PCR.

- So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB2 với một số trình tự đã công bố. - So sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen DREB2 với một số trình tự đã công bố. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cây đậu tƣơng 1.

Nguồn gốc và đặc điểm sinh học của cây đậu tương Cây đậu tương hay đậu nành (Glycine max L. Merill) là một trong những loại cây trồng được biết đến rất sớm. Bằng chứng về lịch sử, địa lý, khảo cổ học đã chỉ ra, đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc, được thuần hóa và trồng làm thực phẩm vào khoảng thế kỉ XVII trước Công nguyên. Từ Trung Quốc, đậu tương được đưa sang Triều Tiên, Nhật Bản, Nga, sang Đông Nam Á và Nam Á qua con đường tơ lụa [4].

Ở Việt Nam đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh trung du, miền núi phía Bắc và miền Đông Nam Bộ. Hiện nay, đậu tương được trồng ở Việt Nam có hai nguồn gốc, đó là các giống địa phương và các giống nhập nội [3], [4]. Về phân loại thực vật học, cây đậu tương hay còn gọi là đậu nành, tên khoa học Glycine max (L. Các giống đậu tương trồng ở Việt Nam thuộc loài Glycine max (L.) Merill (2n = 40) trong giống phụ G.Soya, giống Glycine thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae) [2], [3].

Về hình thái, cây đậu tương có các bộ phận chính là rễ, thân, lá, hoa và quả. Rễ cây đậu tương khác với rễ cây hoà thảo là có rễ chính và rễ phụ. Rễ chính có thể ăn sâu 30-50cm và có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm2 [2].

Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần. Đó là các u bướu nhỏ bám vào các rễ. Nốt sần là kết quả cộng sinh của một số loại vi sinh vật có tên khoa học là Rhizobium Japonicum với rễ cây đậu tương. Trong một nốt sần có khoảng 3-4 tỷ vi sinh vật, mà ta chỉ có thể nhìn thấy chúng qua kính hiển vi phóng đại 600 - 1000 lần [4].

Nốt sần đóng vai trò chính trong quá trình cố định Nito thành đạm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ dễ tiêu. Bộ rễ phân bố nông, sâu, rộng, hẹp, số lượng nốt sần ít hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, khí hậu và kỹ thuật trồng [3]. Đậu tương là cây hai lá mầm thân thảo, ít phân cành, dạng bụi. Thân cây có hình tròn, trên thân có nhiều lông tơ có tác dụng giảm thoát hơi nước và chống bệnh.

Thân non có thể có màu xanh hoặc màu tím, màu sắc thân non có tương quan chặt chẽ tới màu sắc của hoa, thân xanh hoa trắng, thân tím hoa tím. Thân có trung bình 14-15 lóng, các lóng ở phía dưới thường ngắn, các lóng ở phía trên thường dài. Thân có nhiều dạng như đứng, bò, nửa bò và leo. Đường kính thân thay đổi tùy theo giống và có liên quan chặt chẽ tới tính chống đổ của cây.

Số cành trên thân nhiều hay ít phụ thuộc vào giống và các kỹ thuật canh tác. Có giống chỉ có 1 - 2 cành hoặc thậm chí không có cành. Các cành mọc ra từ chồi ở các nách lá. Các chồi ở dưới thân chính sẽ phát triển thành các chùm quả, các chồi ở giữa và ngọn thì phát triển thành các chùm hoa.

Các cành mọc ra ở đốt thứ nhất hay đốt thứ hai sẽ khỏe hơn các cành mọc ở phía trên. Các cành cùng với thân sẽ tạo thành tán cây [2], [3], [4]. Đậu tương là cây hai lá mầm nên có ba loại lá: lá mầm, lá đơn, và lá thật. Lá mầm cung cấp dinh dưỡng cho cây ở thời kì đầu, về sau rụng đi.

Lá đơn mọc đối là lá thật chưa hoàn chỉnh có khả năng quang hợp cho cây. Lá thật hay lá kép có ba lá chét, nhưng cá biệt cũng có lúc có 4 đến 5 lá chét. Phiến lá có nhiều hình dạng khác nhau, hình dạng của lá thay đổi theo từng giống, những lá nhỏ và dài chịu hạn tốt nhưng cho năng suất thấp, những giống lá to thường cho năng suất cao nhưng khả năng chịu hạn thường kém [4]. Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa đậu tương nhỏ không có mùi, có màu tím, tím nhạt, hoặc màu trắng, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn.

Một hoa có từ 1800-6800 hạt phấn tuỳ theo giống khác nhau, giống hạt to thì có bao phấn to và nhiều hạt phấn. Hạt phấn thường hình tròn, số lượng và kích thước hạt phấn tuỳ giống khác nhau, giống hạt to thường có hạt phấn to và nhiều hơn so với giống có hạt nhỏ. Quả đậu tương thuộc loại quả ráp thẳng hoặc hơi cong, có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ nhiều lông khi chín màu vàng hoặc xám. Một quả chứa từ 1 tới 5 hạt, nhưng hầu hết các giống quả thường từ 2 đến 3 hạt.

Hạt đậu tương không có nội nhũ mà chỉ có một lớp mỏng bao quanh một phôi lớn. Hạt có hình tròn, ôvan, dẹt, bầu dục. Vỏ hạt nhẵn có thể có màu vàng đậm, vàng nhạt, xanh hoặc nâu, đen nhưng phổ biến là hạt màu vàng [2], [3]. Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cung cấp dầu quan trọng bậc nhất trong các cây lấy dầu.