Tổng quan luận án

Công trình nghiên cứu "Nghiên cứu cải tiến năng suất một số dòng/giống lúa bằng chỉ thị phân tử" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thúy Anh, thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học (mã số: 9 42 02 01), dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trần Đăng Khánh và GS. Trần Trung tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam vào năm 2018. Luận án nhận nguồn kinh phí hỗ trợ từ đề tài độc lập cấp Nhà nước mã số ĐTĐL.2012-G36 và đề tài thuộc chương trình KC.

Tính cấp thiết của đề tài và khoảng trống nghiên cứu

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực chủ lực tại Việt Nam và là nguồn cung cấp lương thực chính cho hơn một nửa dân số thế giới. Báo cáo năm 2017 của Quỹ Nông lương Liên hợp Quốc (FAO) chỉ ra rằng thế giới đối mặt với nguy cơ khủng hoảng lương thực do biến đổi khí hậu toàn cầu, sự gia tăng dân số nhanh và diện tích đất nông nghiệp bị thu hẹp; khoảng 815 triệu người rơi vào tình trạng thiếu đói, tập trung chủ yếu tại châu Á và châu Phi. Theo dự báo được tác giả trích dẫn, nhu cầu lúa gạo toàn cầu cần bổ sung khoảng 763 triệu tấn vào năm 2020 và 852 triệu tấn vào năm 2035, đòi hỏi sản lượng sản xuất lúa phải gia tăng 25% trong bối cảnh các điều kiện bất thuận sinh học và phi sinh học (sâu bệnh hại, khô hạn, ngập, mặn) diễn biến phức tạp. Tại Việt Nam, lúa gạo vừa là nguồn nuôi dưỡng hơn 90 triệu dân vừa là mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ lực, đứng thứ hai thế giới (chiếm khoảng 50% tổng sản lượng gạo thương mại toàn cầu).

Về mặt học thuật và thực tiễn chọn giống, các phương pháp truyền thống như khai thác ưu thế lai, chọn tạo dạng hình siêu lúa hoặc phát triển lúa C4 đòi hỏi chu kỳ thời gian dài và gặp nhiều khó khăn trong việc chọn lọc các tính trạng số lượng phức tạp chịu ảnh hưởng lớn từ môi trường. Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là: mặc dù các công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại (MABC) đã phát triển mạnh trên thế giới, việc chuyển vị trí tính trạng số lượng (QTL) kiểm soát năng suất cao cụ thể là locus yd7 (locus làm tăng số hạt trên bông có nguồn gốc từ loài lúa hoang) vào các giống lúa thuần canh tác đại trà hoặc dòng lúa mới triển vọng tại vùng đồng bằng sông Hồng vẫn chưa được tiến hành một cách bài bản ở Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) để lai chuyển QTL/gen yd7 quy định tính trạng tăng số hạt trên bông.
  2. Cải tiến năng suất một số dòng/giống lúa đang trồng đại trà và dòng lúa mới, triển vọng cho vùng đồng bằng sông Hồng mà không làm thay đổi các tính trạng nông học quý của giống gốc.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Các giống lúa thuần mang locus gen yd7 được nhập nội (dòng cho gen KC25 có nguồn gốc từ tổ hợp lai giữa lúa hoang Oryza minuta và lúa trồng Hwaseongbyeo); các dòng/giống lúa thuần đang được trồng đại trà (Khang dân 18); dòng lúa mới triển vọng (dòng NPT1 - New Plant Type 1); cùng hệ thống chỉ thị phân tử liên kết (chỉ thị vi vệ tinh - SSR).
  • Phạm vi không gian:
    • Thí nghiệm trong phòng thí nghiệm được triển khai tại Bộ môn Sinh học Phân tử và Bộ môn Kỹ thuật Di truyền thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp.
    • Thí nghiệm đồng ruộng được thực hiện tại Trung tâm Chuyển giao Công nghệ và Khuyến nông (Thanh Trì, Hà Nội); khu ruộng thí nghiệm xã Tây Mỗ (Từ Liêm, Hà Nội); và khu ruộng thí nghiệm xã Lại Yên (Hoài Đức, Hà Nội).
  • Phạm vi thời gian: Toàn bộ các nội dung nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành liên tục từ năm 2013 đến năm 2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước mà tác giả điểm lại

Tác giả đã hệ thống hóa các thành tựu nghiên cứu về chỉ thị di truyền và ứng dụng trong công tác chọn tạo giống lúa:

  1. Lịch sử và phân loại chỉ thị di truyền: Khái niệm chỉ thị di truyền được hệ thống theo Paterson và cộng sự (1996), phân chia thành ba nhóm chính gồm chỉ thị hình thái, chỉ thị sinh hóa (đa hình protein/enzym) và chỉ thị phân tử ADN. Trong nhóm chỉ thị ADN, luận án điểm lại các kỹ thuật: RFLP (Botstein và cs., 1980), RAPD (Williams và cs., 1990), AFLP (Vos và cs., 1995), RGA, SNP và chỉ thị SSR. Chỉ thị SSR được khẳng định là công cụ ưu việt do tính đồng trội, độ đa hình cao, phân bố đều trên hệ gen và dễ thực hiện qua phản ứng PCR.
  2. Quy trình MABC và mô hình khôi phục nền di truyền: Luận án dẫn lý thuyết chọn giống của Mackill và Collard (2006) và nghiên cứu mô phỏng 1.000 lần lặp lại của Hospital (2003) về hiệu quả khôi phục hệ gen của dòng nhận (RP - recurrent parent). Qua đó, MABC kết hợp chọn lọc gen mục tiêu (foreground selection) và chọn lọc nền di truyền (background selection) giúp khôi phục nền di truyền đạt 79,0% ở BC1, 92,2% ở BC2, 98,0% ở BC3 và 99,0% ở BC4, vượt trội hơn so với lai hồi giao truyền thống (75,0% ở BC1, 87,5% ở BC2, 93,7% ở BC3).
Thế hệ lai trở lại Số lượng cá thể % đồng hợp tử alen RP tại NST mục tiêu % đồng hợp tử alen RP tại các NST khác % hệ gen RP theo MABC % hệ gen RP theo lai hồi giao truyền thống
BC1 70 38,4 60,6 79,0 75,0
BC2 100 73,6 87,4 92,2 87,5
BC3 150 93,0 98,8 98,0 93,7
BC4 300 100,0 100,0 99,0 96,9
  1. Cơ sở di truyền các tính trạng cấu thành năng suất lúa: Luận án điểm lại các QTL/gen kiểm soát:
    • Tính trạng đẻ nhánh và số bông: Các gen MOC1 mã hóa họ protein GRAS (Li và cs., 2003); D3, D10, D14, D17, D27 liên quan đến sinh tổng hợp và truyền tín hiệu strigolacton (Ishikawa và cs., 2005; Zou và cs., 2006; Arite và cs., 2007, 2009; Lin và cs., 2009); DEP1 mã hóa protein kiểu PEBP (Huang và cs., 2009); IPA1/WFP mã hóa protein OsSPL14 (Miura và cs., 2010); OsTB1/FC1 mã hóa yếu tố phiên mã TCP (Minakuchi và cs., 2010).
    • Tính trạng số hạt trên bông: LAX1 (Komatsu và cs., 2003); Gn1a mã hóa cytokinin oxidase/dehydrogenase OsCKX2 (Ashikari và cs., 2005; Wang và cs., 2015); SP1 (Li và cs., 2009); Ghd7 (Xue và cs., 2008); DEP2 (Li và cs., 2010); LP1 (Liu và cs., 2016); và đặc biệt là QTL yd7 (Lĩnh và cs., 2008, 2013).
    • Tính trạng kích thước và khối lượng hạt: D1, D2, D11, D61 (Ashikari và cs., 1999; Yamamuro và cs., 2000; Hong và cs., 2003; Tanabe và cs., 2005); GS3 (Fan và cs., 2006); GW2 (Song và cs., 2007); GW5 (Weng và cs., 2008); GS5 (Li và cs., 2011); GIF1 (Li và cs., 2003; Wang và cs., 2008).
  2. Các nghiên cứu ứng dụng MABC cải tiến năng suất trên thế giới:
Tính trạng QTL/gen Phương pháp Cặp bố mẹ Hiệu quả cải tiến năng suất Tác giả và năm
PBP, GN yld1 MABC O. rufipogon × Weiyou 64 Năng suất tăng 18% Xiao và cs., 1996
PBP, GN yld2 MABC O. rufipogon × Weiyou 64 Năng suất tăng 17% Xiao và cs., 1998
PBP, GN yld1, yld2 MABC O. rufipogon × 9311 Tăng 11,9% số hạt/bông, 14% số bông/khóm, tăng 33% năng suất Liang và cs., 2004
GN Gn1a MAS Habataki × Koshihikari Tăng 44% số hạt/bông, tăng năng suất 23% Ashikari và cs., 2005
GS GS3 MABC Minghui 63 × Chuan 7 Tăng 52% khối lượng nghìn hạt, 22,5% chiều dài hạt Fan và cs., 2006
GS GW2 MAS WY3 × Fengaizhan 1 Tăng 49,8% khối lượng hạt, 26,2% chiều rộng hạt Song và cs., 2007
GN Ghd7 MAS Minghui 63 × Zhenshan 97 Tăng 65,8% số hoa/bông, tăng 40% chiều cao cây Xue và cs., 2008
PBP qSBN1 MAS Habataki × Sasanishiki Tăng 35% số hạt/bông, tăng 47,5% số nhánh thứ cấp Ando và cs., 2008
  1. Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử tại Việt Nam: Tác giả điểm lại các công trình chọn giống kháng bệnh bạc lá mang gen Xa21, Xa23; chuyển gen chịu ngập Sub1 vào giống lúa OM6976 sử dụng chỉ thị ART5 và SC3 kết hợp 53 chỉ thị nền di truyền (Nguyễn Thị Lang và cs., 2011); chuyển locus Saltol chịu mặn vào giống AS996 bằng ba chỉ thị AP3206, RM3412, RM10793 và 63 chỉ thị nền di truyền (Nguyễn Thị Lang và cs., 2008); chuyển Saltol vào giống Bắc thơm 7 đạt độ phục hồi nền di truyền 96,8% đến 100% (Bùi Huy Thủy và cs., 2010).

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Các công trình tại Việt Nam thời điểm trước năm 2018 tập trung chủ yếu vào tính chống chịu bất thuận (chịu ngập, chịu mặn, kháng bạc lá). Đối với tính trạng năng suất, việc ứng dụng MABC để chuyển các locus gen quy định số hạt trên bông còn rất hạn chế. Locus yd7 đã được nhóm tác giả Lĩnh và cộng sự (2008, 2013) xác định nằm trong đoạn 28,6 kb trên vai dài nhiễm sắc thể số 7 (giữa hai chỉ thị RM4952 và RM21605, bao gồm 4 gen: LOC-Os07g30150, LOC-Os07g30154, LOC-Os07g30160, LOC-Os07g30171) có khả năng làm tăng số nhánh sơ cấp và tăng số hạt trên bông từ 15-20%. Luận án chọn giải quyết việc ứng dụng chỉ thị phân tử để đưa đoạn mang QTL yd7 từ dòng cho KC25 vào hai giống nhận đại diện cho hai đối tượng canh tác: giống thuần đại trà Khang dân 18 và dòng lúa dạng hình mới NPT1, đồng thời theo dõi tính ổn định nông học và năng suất thực thu qua các vụ thử nghiệm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung phân tích và cơ sở lý thuyết

  • Mô hình MABC hai bước:
    • Chọn lọc gen đích (Foreground selection): Sử dụng các chỉ thị liên kết chặt hoặc chỉ thị cận biên bao quanh locus yd7 để xác định chính xác các cá thể con lai mang alen mong muốn từ dòng cho gen ở trạng thái dị hợp tử qua các thế hệ hồi giao (BC1F1, BC2F1, BC3F1), sau đó chọn lọc cá thể đồng hợp tử ở thế hệ tự thụ BC3F2.
    • Chọn lọc nền di truyền (Background selection): Sử dụng hệ thống chỉ thị phân tử đa hình phân bố đều trên toàn bộ 12 cặp nhiễm sắc thể của lúa nhằm đánh giá tỷ lệ phục hồi hệ gen của giống nhận, hạn chế tối đa hiện tượng liên kết kéo theo (linkage drag) của các đoạn gen không mong muốn từ dòng cho.
  • Lý thuyết cấu thành năng suất lúa: Dựa trên tương quan nông học giữa số bông/khóm, số hạt/bông, tỷ lệ hạt chắc và khối lượng nghìn hạt (Nguyễn Văn Hoan, 2006). Locus yd7 can thiệp vào quá trình phân hóa hoa trong thời kỳ sinh trưởng sinh thực, làm tăng số nhánh gié bậc một, từ đó làm tăng tổng số hạt trên bông mà không làm suy giảm tỷ lệ hạt chắc nếu được đảm bảo chế độ chăm sóc phù hợp.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

  • Vật liệu nghiên cứu:
    • Dòng cho gen: 13 dòng lúa mang QTL/gen tăng số hạt trên bông nhập nội, trong đó dòng KC25 (mang locus yd7) được lựa chọn làm dòng cho chính.
    • Dòng/giống nhận gen: Khang dân 18 (KD18 - giống lúa thuần gieo cấy phổ biến tại đồng bằng sông Hồng) và NPT1 (dòng lúa thuần dạng hình mới triển vọng).
  • Phương pháp sinh học phân tử:
    • Tách chiết ADN tổng số từ mô lá lúa non bằng phương pháp CTAB cải tiến.
    • Kỹ thuật PCR: Thành phần phản ứng gồm đệm PCR (1X), dNTPs (0,2 mM), mồi xuôi và mồi ngược (0,2 µM), Taq DNA polymerase (1 đơn vị), và 20-30 ng ADN khuôn; chu trình nhiệt PCR được cài đặt trên máy luân nhiệt theo chương trình chuẩn (biến tính ban đầu ở 94°C, 35 chu kỳ biến tính - gắn mồi - kéo dài, và kéo dài kết thúc ở 72°C).
    • Điện di: Phân tách sản phẩm khuếch đại bằng điện di trên gel polyacrylamide 6% hoặc gel agarose 2-3%, nhuộm ethidium bromide hoặc bạc, chụp ảnh và đọc băng dưới ánh sáng tử ngoại.
    • Chỉ thị phân tử: Sử dụng tập hợp các cặp mồi SSR tại locus yd7 (RM445, RM500, RM21615, RM1208, RM5365, RM5480, RM10916, RM24865, RM331, RM3, RM528, RM22825) và các mồi SSR phân bố đều trên 12 nhiễm sắc thể.
    • Phân tích di truyền: Sử dụng phần mềm Graphical Genotypes (GGT 2.0) để lập bản đồ tỷ lệ phục hồi nền di truyền mẹ qua từng thế hệ và phần mềm Mapmaker/EXP 3.0.
  • Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng và nông học:
    • Bố trí thí nghiệm đánh giá tập đoàn bố mẹ và các dòng con lai theo phương pháp tuần tự hoặc khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) có nhắc lại.
    • Đánh giá hình thái, sinh trưởng và năng suất theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng (VCU) của giống lúa: đo đếm thời gian sinh trưởng (TGST), chiều cao cây (CCC), số bông/khóm (B/K), chiều dài bông (PL), số hạt chắc/bông (HC/B), số hạt lép/bông (HL/B), tỷ lệ lép (%), khối lượng 1000 hạt (KL1000), năng suất lý thuyết (NSLT) và năng suất thực thu (NSTT).
    • Đánh giá mức độ nhiễm sâu bệnh (rầy nâu, đạo ôn, bạc lá), tính chống đổ và độ thuần đồng ruộng theo thang điểm của IRRI (0-9).
    • Xử lý số liệu: Thống kê mô tả (trung bình, sai số), phân tích phương sai (ANOVA), kiểm định sự sai khác có ý nghĩa bằng phép thử LSD ở mức xác suất p < 0,05 và tính hệ số biến động CV%.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này bao gồm 36 trang (từ trang 4 đến trang 39 của luận án), hệ thống hóa cơ sở lý luận về:

  • Các loại chỉ thị di truyền, nhấn mạnh sự dịch chuyển từ chỉ thị hình thái và sinh hóa sang chỉ thị ADN, đặc biệt là SSR và SNP trong nghiên cứu phân tích hệ gen cây trồng.
  • Cơ chế tác động của các QTL/gen kiểm soát ba thành phần cấu thành năng suất lúa:
    • Gen kiểm soát đẻ nhánh: Chi tiết về chức năng của MOC1 kiểm soát phân chia chồi bên, cùng hệ thống các gen liên quan đến hormone strigolacton (D3, D10, D14, D17, D27), DEP1 và IPA1/WFP.
    • Gen kiểm soát số hạt trên bông: Vai trò của Gn1a trong việc ức chế enzyme phân hủy cytokinin, các gen LAX1, Ghd7, DEP1, SP1, LP1. Tác giả phân tích cấu trúc của locus yd7 trên vai dài nhiễm sắc thể số 7, bản đồ liên kết do Lĩnh và cộng sự (2008, 2013) thiết lập định vị yd7 trong phạm vi 28,6 kb chứa 4 khung đọc mở liên quan đến các enzyme APT, POE12, trehalose phosphate và nitrilase.
    • Gen kiểm soát kích thước hạt: Hoạt tính của các gen GS3, GW2, GW5, GS5, GIF1.
  • Kinh nghiệm và hiệu quả của phương pháp MABC trong việc nâng cao năng suất (tăng từ 5,7% đến 36%) từ các nguồn gen lúa hoang dại (O. rufipogon, O. minuta) được công bố trên thế giới.

Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày từ trang 40 đến trang 57, xác lập chi tiết hệ thống thực nghiệm:

  • Nguồn vật liệu: Danh sách 13 dòng cho gen nhập nội mang QTL làm tăng số hạt trên bông (chọn dòng KC25 làm dòng cho chính mang yd7); giống lúa thuần Khang dân 18 và dòng lúa thuần NPT1 làm dòng nhận gen.
  • Nội dung nghiên cứu: Luận án triển khai 4 nội dung trọng tâm:
    1. Đánh giá nguồn vật liệu phục vụ công tác chọn tạo giống lúa (hình thái, sinh trưởng, năng suất và tính chống chịu sâu bệnh).
    2. Khảo sát đa hình ADN giữa dòng cho và dòng nhận tại vị trí QTL yd7 và trên toàn bộ 12 nhiễm sắc thể.
    3. Cải tiến năng suất Khang dân 18 và NPT1 bằng MABC: lai tạo con lai F1, lai trở lại liên tiếp qua BC1F1, BC2F1, BC3F1 kết hợp sàng lọc cá thể mang gen đích và cá thể có nền di truyền mẹ cao; tự thụ phấn tạo thế hệ BC3F2 để cố định kiểu gen đồng hợp tử mang yd7.
    4. Trồng thử nghiệm, đánh giá các dòng triển vọng ở các thế hệ con lai phân ly và cố định (tập trung đánh giá dòng K2 và N8 ở thế hệ BC3F5).
  • Quy trình kỹ thuật: Mô tả chi tiết hóa chất, nồng độ phản ứng PCR (Bảng 2.3), chu trình nhiệt (Bảng 2.4), kỹ thuật điện di, bảng trình tự mồi SSR (Bảng 2.2) và công thức tính toán các yếu tố cấu thành năng suất.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 là phần thực nghiệm trọng tâm của luận án, kéo dài từ trang 58 đến trang 122, gồm các kết quả chính:

1. Đánh giá nguồn vật liệu ban đầu

  • Khảo nghiệm vụ Xuân 2013 tại Từ Liêm (Hà Nội) trên 13 dòng cho gen và các dòng nhận:
    • Dòng KC25 thể hiện ưu thế vượt trội về số hạt trên bông, cấu trúc bông phân nhánh gié cấp một phát triển mạnh, thời gian sinh trưởng và khả năng chống đổ ở mức trung bình khá, mức độ nhiễm sâu bệnh hại nhẹ đến trung bình (Bảng 3.1, 3.2).
    • Giống nhận Khang dân 18 và dòng nhận NPT1 sinh trưởng ổn định, độ thuần đồng ruộng cao, khả năng thích ứng tốt với điều kiện miền Bắc, nhưng số hạt chắc trên bông cần được cải thiện để gia tăng năng suất (Bảng 3.3).

2. Khảo sát đa hình ADN giữa dòng cho và nhận

  • Tại vị trí QTL yd7 trên NST số 7: Khảo sát các chỉ thị SSR liên kết vùng 2,3 Mb và 28,6 kb. Kết quả xác định được các chỉ thị RM445, RM500 và RM21615 cho băng khuếch đại đa hình rõ rệt, phân biệt rõ giữa alen của dòng cho KC25 và alen của hai dòng nhận KD18 và NPT1 (Hình 3.2, 3.3, 3.4, 3.5).
  • Trên 12 cặp nhiễm sắc thể: Sàng lọc hàng trăm chỉ thị SSR phân bố đều trên hệ gen, lập danh mục các chỉ thị SSR đa hình phục vụ sàng lọc nền di truyền cho tổ hợp Khang dân 18/KC25 (Bảng 3.4, Bản đồ Hình 3.6) và tổ hợp NPT1/KC25 (Bảng 3.5, Bản đồ Hình 3.7).

3. Cải tiến giống Khang dân 18 bằng phương pháp MABC (tổ hợp KD18/KC25)

  • Thế hệ BC1F1: Gieo 312 cá thể. Sàng lọc kiểu gen bằng chỉ thị RM445 và RM500 phát hiện 84 cá thể mang gen mục tiêu ở trạng thái dị hợp tử (Hình 3.8, 3.9). Tiếp tục đánh giá nền di truyền trên 32 cá thể mang QTL yd7 (Hình 3.10, Bảng 3.6). Cá thể số 74 có tỷ lệ phục hồi nền di truyền mẹ cao nhất (Hình 3.11, 3.12) được chọn để lai hồi giao tạo thế hệ tiếp theo.
  • Thế hệ BC2F1: Điện di sàng lọc bằng bộ ba chỉ thị RM445, RM500, RM21615 (Hình 3.13, 3.14, 3.15). Xác định được 15 cá thể mang locus yd7 (Bảng 3.8). Kiểm tra nền di truyền (Hình 3.16, 3.17) chọn được cá thể số 59 có nền di truyền mẹ vượt trội (Hình 3.18).
  • Thế hệ BC3F1: Sàng lọc cá thể mang gen đích (Hình 3.19, 3.20, 3.21) và kiểm tra nền di truyền (Hình 3.22), chọn được cá thể ưu tú C1-74-59-14 có nền di truyền giống mẹ đạt tỷ lệ gần như hoàn chỉnh (Hình 3.23).
  • Thế hệ BC3F2: Cho cá thể C1-74-59-14 tự thụ phấn. Sàng lọc quần thể BC3F2 bằng các chỉ thị RM445, RM500, RM21615 (Hình 3.24, 3.25, 3.26) nhằm xác định các cá thể mang kiểu gen đồng hợp tử alen của dòng cho KC25 tại locus yd7 (Bảng 3.8).

4. Cải tiến dòng NPT1 bằng phương pháp MABC (tổ hợp NPT1/KC25)

  • Áp dụng quy trình chọn lọc tương tự qua các thế hệ:
    • Ở BC1F1: Sàng lọc bằng RM445, RM500, RM21615 (Hình 3.27, 3.28, 3.29), đánh giá nền di truyền (Hình 3.30) và chọn cá thể số 54 (Hình 3.31).
    • Ở BC2F1: Sàng lọc kiểu gen (Hình 3.32, 3.33, 3.34, 3.35) và chọn cá thể C37-54-122 (Hình 3.36).
    • Ở BC3F1: Sàng lọc kiểu gen (Hình 3.37, 3.38, 3.39, 3.40) và chọn cá thể C37-122-51 (Hình 3.41).
    • Ở BC3F2: Kiểm tra kiểu gen bằng RM445, RM500, RM21615 (Hình 3.42, 3.43, 3.44) thu được các cá thể đồng hợp tử mang gen mục tiêu (Bảng 3.9).

5. Trồng thử nghiệm và đánh giá các dòng triển vọng

  • Khảo nghiệm thế hệ phân ly (BC3F3, BC3F4): Thực hiện trong vụ Xuân 2016 và vụ Mùa 2016 tại Lại Yên (Hoài Đức, Hà Nội).
    • Tổ hợp KD18/KC25: Các dòng triển vọng duy trì được các đặc điểm sinh trưởng, chiều cao cây, thời gian sinh trưởng tương đương Khang dân 18 đối chứng (Bảng 3.10, 3.13), khả năng kháng sâu bệnh hại không suy giảm (Bảng 3.11, 3.14). Yếu tố số hạt/bông và tỷ lệ hạt chắc tăng dẫn đến năng suất thực thu của các dòng cải tiến cao hơn đối chứng ở cả hai vụ (Bảng 3.12, 3.15, Hình 3.45, 3.46, 3.47).
    • Tổ hợp NPT1/KC25: Các dòng triển vọng thể hiện dạng hình tốt, cấu trúc bông to, mức độ nhiễm sâu bệnh tương đương hoặc thấp hơn NPT1 đối chứng (Bảng 3.16, 3.17, 3.19, 3.20), năng suất thực thu tăng rõ rệt trong cả hai vụ (Bảng 3.18, 3.21, Hình 3.48, 3.49, 3.50).
  • Khảo nghiệm chuyên sâu thế hệ BC3F5 (vụ Xuân 2017 tại Hoài Đức - Hà Nội):
    • Đánh giá tập trung trên hai dòng ưu tú nhất: dòng K2 (chọn từ tổ hợp KD18/KC25) và dòng N8 (chọn từ tổ hợp NPT1/KC25).
    • Về hình thái sinh trưởng: Dòng K2 và dòng N8 có thời gian sinh trưởng và chiều cao cây không sai khác đáng kể so với giống gốc đối chứng Khang dân 18 và NPT1 (Bảng 3.22).
    • Về khả năng chống chịu sâu bệnh: Mức độ nhiễm sâu cuốn lá, sâu đục thân, rầy nâu, bệnh đạo ôn và bạc lá của dòng K2 và dòng N8 đều ở mức nhẹ (điểm 1 - 3), đạt tiêu chuẩn chống chịu đồng ruộng (Bảng 3.23).
    • Về năng suất và các yếu tố cấu thành:
      • Dòng K2 đạt số hạt chắc trên bông cao vượt trội, dẫn đến năng suất thực thu tăng 28,3% so với giống gốc đối chứng Khang dân 18.
      • Dòng N8 đạt năng suất thực thu tăng 9,4% so với dòng gốc đối chứng NPT1 (Bảng 3.24, Hình 3.51).

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới của luận án

Theo công bố chính thức tại phần Mở đầu của luận án, công trình có ba đóng góp mới cốt lõi:

  1. Đây là một trong những công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam ứng dụng chỉ thị phân tử và phương pháp lai trở lại (MABC) đã lai chuyển thành công QTL/gen yd7 quy định tính trạng tăng số hạt trên bông để cải tiến năng suất lúa.
  2. Nghiên cứu đã xác định được các chỉ thị phân tử SSR đa hình (RM445, RM500, RM21615) giữa giống cho gen và dòng/giống nhận gen tại vị trí QTL/gen yd7 để phục vụ chọn lọc cá thể mang gen mục tiêu; đồng thời xác định hệ thống các chỉ thị đa hình trải đều trên 12 cặp nhiễm sắc thể để phục vụ chọn lọc nền di truyền.
  3. Cải tiến thành công năng suất một số dòng/giống lúa nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại mà không làm thay đổi các tính trạng nông học quý của giống gốc. Trong đó, tác giả đã chọn tạo được:
    • Dòng K2 (thế hệ BC3F5 của tổ hợp Khang dân 18/KC25) có năng suất thực thu tăng 28,3% so với giống đối chứng Khang dân 18.
    • Dòng N8 (thế hệ BC3F5 của tổ hợp NPT1/KC25) có năng suất thực thu tăng 9,4% so với dòng đối chứng NPT1.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Tiếp tục đưa dòng lúa cải tiến K2 và N8 vào mạng lưới khảo nghiệm diện rộng sinh thái tại các tiểu vùng sinh thái khác nhau của đồng bằng sông Hồng nhằm đánh giá độ ổn định và tính thích nghi trước khi công nhận giống.
  • Sử dụng quy trình chọn lọc MABC với bộ ba chỉ thị cận biên RM445, RM500, RM21615 làm tài liệu kỹ thuật chuẩn để tiếp tục khai thác chuyển vị trí gen yd7 vào các bộ giống lúa thuần chất lượng cao khác.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Phạm vi khảo nghiệm đồng ruộng mới chỉ tập trung tại một số địa bàn thuộc Hà Nội (Tây Mỗ - Từ Liêm, Lại Yên - Hoài Đức, Thanh Trì) trong các vụ Xuân và Mùa giai đoạn 2013-2017; chưa có dẫn liệu kiểm chứng tính thích ứng trên các loại đất đặc thù khác (đất phèn, đất mặn, đất phù sa ven biển) của vùng đồng bằng Bắc Bộ.
  • Nghiên cứu chỉ tập trung can thiệp cải tiến đơn tính trạng năng suất thông qua chuyển duy nhất một QTL yd7, chưa thực hiện quy tụ đồng thời (gene pyramiding) các gen kháng sâu bệnh hại (như Xa21, Bph) hoặc gen chống chịu bất thuận phi sinh học trên cùng một nền di truyền.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng khảo nghiệm sản xuất và đánh giá chất lượng nông sản (hàm lượng amylose, độ bền gel, độ bóng hạt gạo) của dòng K2 và dòng N8 ở quy mô liên tỉnh.
  • Kết hợp dòng K2 và N8 làm vật liệu khởi đầu để thực hiện các chương trình quy tụ thêm các gen kháng bệnh bạc lá (Xa), đạo ôn (Pi), hoặc chịu ngập (Sub1) nhằm tạo ra các dòng lúa vừa có năng suất cao vừa có tính chống chịu đa yếu tố.

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng và ứng dụng

  • Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Di truyền - Chọn giống cây trồng và Công nghệ sinh học nông nghiệp: Có thể tham khảo phương pháp luận thiết kế quy trình chọn giống MABC hai bước, kỹ thuật kết hợp sàng lọc gen đích với sàng lọc nền di truyền bằng chỉ thị SSR, và cách ứng dụng phần mềm phân tích di truyền đồ họa (GGT).
  • Các nhà chọn giống tại các viện, trung tâm nghiên cứu: Kế thừa bộ mồi SSR đặc hiệu (RM445, RM500, RM21615) liên kết với locus yd7 để rút ngắn chu kỳ chọn tạo giống lúa năng suất cao từ các nguồn gen hoang dại; sử dụng các dòng chuyển gen đã ổn định làm vật liệu lai tạo mới.
  • Cơ quan quản lý và khuyến nông tại đồng bằng sông Hồng: Có thêm dẫn liệu thực nghiệm về tiềm năng phát triển dòng K2 (nâng cao năng suất trên nền Khang dân 18 - giống lúa có diện tích gieo trồng lớn nhưng năng suất tiệm cận trần) và dòng N8 (phát triển giống lúa dạng hình mới NPT).

Câu hỏi thường gặp

1. QTL/gen yd7 có nguồn gốc từ đâu và cơ chế làm tăng năng suất lúa của locus này là gì?

QTL/gen yd7 có nguồn gốc từ loài lúa hoang Oryza minuta, được phát hiện và lập bản đồ lần đầu trong tổ hợp lai giữa O. minuta và dòng lúa Japonica Hwaseongbyeo bởi nhóm tác giả Lĩnh và cộng sự (2008, 2013). Về mặt cơ chế, yd7 định vị trên vai dài nhiễm sắc thể số 7 trong vùng 28,6 kb chứa 4 gen mã hóa. Locus này tác động trực tiếp vào quá trình phân hóa hoa ở thời kỳ làm đòng, thúc đẩy hình thành số lượng nhánh sơ cấp trên bông, nhờ đó làm tăng đáng kể tổng số hạt trên bông và gia tăng năng suất thực thu từ 15-20% mà không làm giảm tỷ lệ hạt chắc.

2. Những chỉ thị phân tử nào được xác định để phục vụ chọn lọc gen mục tiêu yd7 trong luận án?

Luận án đã xác định được bộ ba chỉ thị phân tử vi vệ tinh (SSR) gồm RM445, RM500 và RM21615. Các chỉ thị này nằm sát và bao quanh vị trí locus yd7 trên nhiễm sắc thể số 7, thể hiện tính đa hình rõ nét giữa dòng cho gen KC25 với hai dòng nhận gen Khang dân 18 và NPT1, cho phép sàng lọc chính xác trạng thái dị hợp tử ở các thế hệ BC1F1, BC2F1, BC3F1 và kiểu gen đồng hợp tử ở thế hệ BC3F2.

3. Hiệu quả cải tiến năng suất của dòng K2 và dòng N8 so với các giống đối chứng gốc đạt mức bao nhiêu?

Theo kết quả khảo nghiệm tại thế hệ BC3F5 vào vụ Xuân 2017 tại Hoài Đức (Hà Nội), dòng K2 đạt mức tăng năng suất thực thu 28,3% so với giống gốc đối chứng Khang dân 18. Dòng N8 đạt mức tăng năng suất thực thu 9,4% so với dòng gốc đối chứng NPT1. Cả hai dòng này đều giữ nguyên được các đặc tính nông học cơ bản (thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, độ thuần) và mức độ nhiễm sâu bệnh hại ở ngưỡng an toàn đồng ruộng.

4. Luận án đã sử dụng công cụ nào để kiểm soát sự phục hồi nền di truyền mẹ trong quá trình hồi giao?

Luận án đã sử dụng hệ thống hàng trăm chỉ thị SSR phân bố đều trên toàn bộ 12 cặp nhiễm sắc thể của cây lúa để rà soát kiểu gen của các cá thể con lai ở mỗi thế hệ lai trở lại. Dữ liệu băng điện di đa hình được phân tích và mô phỏng trực quan thông qua phần mềm di truyền đồ họa Graphical Genotypes (GGT 2.0), cho phép phát hiện chính xác các cá thể mang tỷ lệ alen giống mẹ cao nhất (như cá thể 74 ở BC1F1, cá thể 59 ở BC2F1, cá thể C1-74-59-14 ở BC3F1 của tổ hợp KD18/KC25) nhằm đẩy nhanh tốc độ phục hồi nền di truyền sau 3 thế hệ lai hồi giao.

5. Tại sao phương pháp MABC được khẳng định là ưu việt hơn phương pháp chọn giống truyền thống trong đề tài này?

Theo dẫn giải của tác giả, phương pháp MABC dựa trên việc nhận diện trực tiếp hệ gen thông qua chỉ thị ADN thay vì phụ thuộc vào biểu hiện kiểu hình vốn chịu tác động lớn của môi trường. MABC cho phép sàng lọc cá thể ngay từ giai đoạn cây mạ, phân biệt chính xác trạng thái dị hợp tử và đồng hợp tử ở từng thế hệ mà không cần chờ phân ly, kiểm soát đồng thời gen mục tiêu và loại bỏ hiện tượng liên kết kéo theo (linkage drag) từ nguồn gen hoang dại, giúp rút ngắn chu kỳ chọn tạo giống từ 8-10 vụ xuống còn 3-4 thế hệ lai hồi giao.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Thúy Anh đã hoàn thành mục tiêu ứng dụng kỹ thuật chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) để chuyển thành công QTL/gen yd7 từ dòng lúa hoang KC25 vào hai dòng/giống lúa Khang dân 18 và NPT1. Nghiên cứu đã xác lập quy trình sàng lọc kiểu gen bằng hệ thống chỉ thị SSR cận biên (RM445, RM500, RM21615) kết hợp kiểm soát nền di truyền trên 12 cặp nhiễm sắc thể. Kết quả thực nghiệm đã tạo ra hai dòng lúa triển vọng K2 và N8 mang locus yd7 ở trạng thái đồng hợp tử, nâng cao năng suất thực thu tương ứng 28,3% và 9,4% so với giống đối chứng gốc, cung cấp nguồn vật liệu di truyền có giá trị phục vụ sản xuất lúa lương thực tại vùng đồng bằng sông Hồng.