Nghiên Cứu Biểu Hiện Gen Mã Hóa Chất Hoạt Hóa Plasminogen Mô Của Người Trong Vi Khuẩn E. coli

Tài liệu nghiên cứu Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminigen mô của người trong vi khuẩn echerichia, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Hoàng Phú Hiệp
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Thu Hiền
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Biểu Hiện Gen Mã Hóa Chất Hoạt Hóa Plasminogen Trong Vi Khuẩn E. coli
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2008
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• Bảng viết tắt
• Danh mục các hình
• MỞ ĐẦU
• 1. Chương 1: Tổng quan tài liệu
• 1.1. Bệnh tim mạch
• 1.2. Chất hoạt hóa plasminogen
• 1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô người
• 1.4. Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm tan máu đông
• 1.5. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô người
• 1.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
• 2. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Điện di DNA trên gel agarose
• 2.2.2. Điện di protein trên gel polyacrylamide
• 2.2.3. Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR)
• 2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế
• 2.2.5. Ghép nối DNA
• 2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt
• 2.2.6.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli
• 2.2.6.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli
• 2.2.7. Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid
• 2.2.8. Xác định trình tự gen
• 2.2.9. Biểu hiện protein trong vi khuẩn E. coli
• 3. Chương 3: Kết quả và thảo luận
• 3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA
• 3.1.1. Nhân đoạn cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR
• 3.1.2. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+)
• 3.1.2.1. Xử lý sản phẩm PCR cDNA mã hóa h-tPA bằng enzyme hạn chế
• 3.1.2.2. Xử lý vector pGEX6p1 và pET21a(+) bằng enzyme hạn chế
• 3.1.2.3. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+)
• 3.1.3. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hóa h-tPA
• 3.1.3.1. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt
• 3.1.3.2. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA
• 3.1.4. Xác định và phân tích trình tự cDNA mã hóa h-tPA
• 3.2. Biểu hiện gen
• 3.2.1. Tổng hợp protein h-tPA tái tổ hợp
• 3.2.2. Kiểm tra protein bằng phương pháp điện di trên SDS-PAGE
• Kết luận và đề nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Biểu Hiện Gen Chất Hoạt Hóa Plasminogen

Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen trong vi khuẩn E. coli mở ra hướng đi mới trong sản xuất dược phẩm sinh học. Chất hoạt hóa plasminogen (PA) đóng vai trò then chốt trong quá trình làm tan cục máu đông, điều trị hiệu quả các bệnh tim mạch. Việc tiếp cận công nghệ DNA tái tổ hợp (rDNA) cho phép sản xuất các protein tái tổ hợp có khả năng làm tan cục máu đông một cách đặc hiệu. Nghiên cứu này tập trung vào chất hoạt hóa plasminogen mô người (h-tPA), một protein được nhiều nhóm tác giả trên thế giới nghiên cứu và ứng dụng trong y dược. Mục tiêu là biểu hiện thành công gen mã hóa h-tPA trong E. coli, tạo tiền đề cho sản xuất dược phẩm sinh học tại Việt Nam. Việc này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

1.1. Vai Trò Của Chất Hoạt Hóa Plasminogen Trong Y Học

Chất hoạt hóa plasminogen (PA) là một enzyme quan trọng trong hệ thống fibrinolytic, chịu trách nhiệm chuyển đổi plasminogen thành plasmin, một enzyme serine protease phá vỡ cục máu đông. Do đó, PA đóng một vai trò quan trọng trong việc điều trị các rối loạn huyết khối như nhồi máu cơ tim, đột quỵ và thuyên tắc phổi. Nghiên cứu và sản xuất PA tái tổ hợp cho phép điều trị hiệu quả và giảm tác dụng phụ so với các phương pháp điều trị truyền thống.

1.2. Tổng Quan Về Vi Khuẩn E. coli Trong Biểu Hiện Gen

Vi khuẩn E. coli là một vật chủ phổ biến để biểu hiện gen vì nó dễ dàng nuôi cấy, biến đổi gen nhanh chóng và có hệ thống di truyền được hiểu rõ. Tuy nhiên, biểu hiện protein dị dòng trong E. coli có thể gặp khó khăn do sự hình thành thể vùi, thiếu sửa đổi sau dịch mã và độc tính tiềm tàng của protein được biểu hiện. Cần phải tối ưu hóa các yếu tố như vector biểu hiện, promoter, ribosome binding site và điều kiện nuôi cấy để đạt được hiệu suất biểu hiện cao và khả năng hòa tan protein.

II. Thách Thức Giải Pháp Biểu Hiện Gen h tPA Trong E

Biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen trong vi khuẩn E. coli đối mặt với nhiều thách thức. Việc tạo ra một protein chức năng, có hoạt tính và dễ hòa tan đòi hỏi sự tối ưu hóa toàn diện. Các vấn đề thường gặp bao gồm hình thành thể vùi, thiếu glycosyl hóa (một sửa đổi sau dịch mã quan trọng đối với h-tPA), và tiềm năng gây độc cho tế bào chủ. Để giải quyết những vấn đề này, cần áp dụng các chiến lược như codon optimization, sử dụng vector biểu hiện phù hợp, điều chỉnh nhiệt độ nuôi cấy vi khuẩn, và sử dụng các chủng E. coli đặc biệt được thiết kế để cải thiện khả năng hòa tan protein. Các biện pháp này nhằm mục đích tăng hiệu suất biểu hiện và đảm bảo chất lượng của protein h-tPA tái tổ hợp.

2.1. Vấn Đề Hình Thành Thể Vùi Khi Biểu Hiện Protein Dị Dòng

Một thách thức lớn trong việc biểu hiện protein dị dòng trong E. coli là sự hình thành thể vùi, đó là các tập hợp protein không hòa tan và không hoạt động. Điều này có thể do tốc độ biểu hiện cao, gấp nếp protein không chính xác và thiếu hệ thống chaperon thích hợp. Các chiến lược để giảm thiểu sự hình thành thể vùi bao gồm giảm nhiệt độ nuôi cấy, sử dụng vector biểu hiện với promoter có thể điều khiển được, bổ sung chaperon vào môi trường nuôi cấy và sử dụng các chủng E. coli được thiết kế để hỗ trợ gấp nếp protein.

2.2. Tối Ưu Hóa Codon và Ảnh Hưởng Đến Hiệu Suất Biểu Hiện

Tối ưu hóa codon là một kỹ thuật được sử dụng để cải thiện hiệu suất biểu hiện protein dị dòng trong E. coli. Điều này liên quan đến việc thay đổi tần suất codon của gen mục tiêu để phù hợp hơn với tần suất codon ưa thích của E. coli. Bằng cách sử dụng các codon hiếm hơn trong E. coli, có thể giảm sự tắc nghẽn ribosome và cải thiện quá trình dịch mã, dẫn đến tăng hiệu suất biểu hiện và giảm nguy cơ hình thành thể vùi.

2.3. Ảnh Hưởng của Vector Biểu Hiện và Promoter

Lựa chọn vector biểu hiện và promoter phù hợp là rất quan trọng để đạt được biểu hiện gen h-tPA hiệu quả trong E. coli. Vector phải có khả năng sao chép cao, một trình tự chọn lọc mạnh (ví dụ: kháng kháng sinh) và một trang web đa dòng (MCS) thuận tiện để chèn gen h-tPA. Promoter phải mạnh, có thể điều khiển được và tương thích với chủng E. coli được sử dụng. Các promoter thường được sử dụng cho biểu hiện protein dị dòng trong E. coli bao gồm promoter lac, tac và T7.

III. Phương Pháp Biểu Hiện Gen Mã Hóa Chất Hoạt Hóa Plasminogen trong E

Quá trình biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen trong E. coli bao gồm nhiều bước quan trọng. Đầu tiên, gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR và sau đó được chèn vào vector biểu hiện. Tiếp theo, vector biểu hiện này được biến nạp vào E. coli. Sau khi nuôi cấy vi khuẩn, biểu hiện protein được kích hoạt. Cuối cùng, protein h-tPA tái tổ hợp được thu hồi protein và tinh sạch protein bằng các kỹ thuật sắc ký khác nhau. Đánh giá hoạt tính enzyme của protein h-tPA là bước quan trọng để xác nhận chức năng của protein tái tổ hợp.

3.1. Tạo Dòng Gen h tPA Vào Vector Biểu Hiện Phù Hợp

Việc tạo dòng gen h-tPA vào vector biểu hiện phù hợp là một bước quan trọng trong quá trình biểu hiện. Bước này bao gồm việc khuếch đại gen h-tPA bằng kỹ thuật PCR, tiêu hóa gen và vector bằng enzyme hạn chế và ghép nối gen vào vector bằng DNA ligase. Vector sau đó được biến nạp vào E. coli để nhân dòng và kiểm tra.

3.2. Biến Nạp E. coli và Nuôi Cấy Vi Khuẩn Để Biểu Hiện Protein

Sau khi tạo dòng, vector chứa gen h-tPA sẽ được biến nạp vào E. coli bằng các phương pháp như sốc nhiệt hoặc điện di. Sau đó, vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thích hợp và biểu hiện protein được kích hoạt bằng cách thêm một chất cảm ứng như IPTG. Các điều kiện nuôi cấy, chẳng hạn như nhiệt độ và thời gian, cần được tối ưu hóa để đạt được hiệu suất biểu hiện tối đa.

3.3. Thu Hồi và Tinh Sạch Protein h tPA Tái Tổ Hợp

Sau khi biểu hiện, protein h-tPA tái tổ hợp phải được thu hồi và tinh sạch từ vi khuẩn E. coli. Điều này có thể được thực hiện bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, chẳng hạn như ly giải tế bào, ly tâm và sắc ký. Các phương pháp sắc ký thường được sử dụng cho việc tinh sạch protein bao gồm sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel.

IV. Phân Tích và Đánh Giá Hoạt Tính Protein h tPA Tái Tổ Hợp

Sau khi tinh sạch, protein h-tPA tái tổ hợp cần được phân tích protein và đánh giá để xác định danh tính, độ tinh khiết và hoạt tính enzyme. Các kỹ thuật như SDS-PAGE, Western blot, và các xét nghiệm hoạt tính enzyme chuyên dụng được sử dụng. Kết quả phân tích protein sẽ xác định xem protein có được biểu hiện chính xác và có chức năng hoạt động hay không. Thông tin này rất quan trọng để xác nhận tính hữu dụng của protein tái tổ hợp cho các ứng dụng y sinh.

4.1. Kiểm Tra Chất Lượng Protein Bằng SDS PAGE và Western Blot

SDS-PAGE và Western blot là những kỹ thuật quan trọng để kiểm tra chất lượng protein h-tPA tái tổ hợp. SDS-PAGE được sử dụng để xác định kích thước và độ tinh khiết của protein, trong khi Western blot được sử dụng để xác nhận danh tính của protein bằng cách sử dụng các kháng thể đặc hiệu.

4.2. Đánh Giá Hoạt Tính Enzyme Của h tPA Bằng Các Xét Nghiệm Đặc Hiệu

Đánh giá hoạt tính enzyme của h-tPA là điều cần thiết để xác nhận rằng protein tái tổ hợp có chức năng hoạt động. Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các xét nghiệm đặc hiệu đo khả năng của h-tPA để chuyển đổi plasminogen thành plasmin và để phân giải cục máu đông. Các xét nghiệm này có thể bao gồm các xét nghiệm dựa trên chất nền sắc ký hoặc các xét nghiệm dựa trên cục máu đông.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Tiềm Năng Của h tPA Tái Tổ Hợp Từ E

Protein h-tPA tái tổ hợp được sản xuất từ E. coli có tiềm năng lớn trong nhiều ứng dụng y sinh. Ứng dụng chính là điều trị huyết khối, đặc biệt trong các trường hợp nhồi máu cơ tim và đột quỵ. Ngoài ra, h-tPA có thể được sử dụng trong các ứng dụng công nghiệp khác như sản xuất dược phẩm và sản xuất enzyme. Việc nghiên cứu biểu hiện gen h-tPA trong E. coli mở ra cơ hội để sản xuất protein này với chi phí thấp hơn và quy mô lớn hơn, giúp tăng khả năng tiếp cận với các phương pháp điều trị quan trọng.

5.1. Ứng Dụng h tPA Trong Điều Trị Các Bệnh Liên Quan Đến Huyết Khối

Ứng dụng chính của h-tPA tái tổ hợp là trong điều trị huyết khối, chẳng hạn như nhồi máu cơ tim, đột quỵ và thuyên tắc phổi. H-tPA hoạt động bằng cách chuyển đổi plasminogen thành plasmin, từ đó phá vỡ cục máu đông và khôi phục lưu lượng máu. H-tPA là một loại thuốc có giá trị cho việc điều trị các tình trạng đe dọa tính mạng này.

5.2. Tiềm Năng Ứng Dụng Trong Công Nghiệp Dược Phẩm và Sản Xuất Enzyme

Ngoài các ứng dụng y sinh, h-tPA tái tổ hợp còn có tiềm năng trong các ứng dụng công nghiệp, chẳng hạn như sản xuất dược phẩm và sản xuất enzyme. Ví dụ, h-tPA có thể được sử dụng để sản xuất các loại thuốc tiêu huyết khối khác hoặc để phát triển các enzyme mới cho các ứng dụng công nghiệp khác.

VI. Kết Luận Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Biểu Hiện Gen h tPA

Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen trong vi khuẩn E. coli đã đạt được những tiến bộ đáng kể. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều cơ hội để cải thiện hiệu suất biểu hiện, khả năng hòa tan protein và hoạt tính enzyme. Các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc khám phá các chủng E. coli mới, các vector biểu hiện cải tiến, và các phương pháp tinh sạch protein hiệu quả hơn. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp sản xuất protein quy mô lớn và giảm chi phí sản xuất protein trị liệu quan trọng này.

6.1. Tối Ưu Hóa Quy Trình Biểu Hiện Protein Để Tăng Hiệu Suất

Việc tiếp tục tối ưu hóa quy trình biểu hiện protein là rất quan trọng để tăng hiệu suất và giảm chi phí sản xuất h-tPA tái tổ hợp. Điều này có thể bao gồm việc khám phá các chủng E. coli mới, các vector biểu hiện cải tiến và các điều kiện nuôi cấy được tối ưu hóa.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Các Phương Pháp Tinh Sạch Protein Mới

Phát triển các phương pháp tinh sạch protein mới là điều cần thiết để đạt được h-tPA có độ tinh khiết cao với chi phí thấp. Điều này có thể bao gồm việc khám phá các vật liệu sắc ký mới, các phương pháp sắc ký cải tiến và các kỹ thuật khác để loại bỏ các chất gây ô nhiễm và tăng năng suất tinh sạch protein.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh lý tim mạch và đột quỵ hiện là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên phạm vi toàn cầu, cướp đi sinh mạng của khoảng 17,5 triệu người mỗi năm và theo ước tính đã vượt mốc 25 triệu ca vào năm 2020. Thống kê từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cho thấy cứ mỗi 2 giây có 1 trường hợp tử vong do tim mạch, mỗi 5 giây ghi nhận 1 ca nhồi máu cơ tim và mỗi 6 giây xuất hiện 1 ca đột quỵ não. Sự hình thành huyết khối (cục máu đông) làm tắc nghẽn lòng mạch là căn nguyên trực tiếp dẫn đến các biến chứng nguy kịch này. Trong phác đồ can thiệp tái tưới máu khẩn cấp, chất hoạt hóa plasminogen mô của người (human tissue plasminogen activator - h-tPA) được xem là tiêu chuẩn vàng nhờ đặc tính làm tan huyết khối chọn lọc cao, đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê duyệt chính thức từ năm 1996. Doanh thu toàn cầu của chế phẩm sinh học này từng đạt khoảng 200 triệu USD mỗi năm và tăng trưởng lên mức hơn 600 triệu USD trong những năm gần đây. Tuy nhiên, chi phí điều trị bằng h-tPA ngoại nhập vẫn rất đắt đỏ, trong khi tỷ lệ bệnh nhân tiếp cận thuốc tại các nước đang phát triển chỉ dao động khoảng 10% đến 20%. Trước thực tiễn đó, luận văn thạc sĩ chuyên ngành Di truyền học đã tiến hành đề tài nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa h-tPA người trong hệ thống vi khuẩn Escherichia coli. Mục tiêu cụ thể của công trình là thiết kế thành công các vector biểu hiện mang đoạn cDNA mã hóa h-tPA kích thước 1,7 kb và tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp trên chủng E. coli BL21. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen thuộc Viện Công nghệ sinh học, tạo tiền đề kỹ thuật then chốt cho việc tự chủ công nghệ sản xuất dược phẩm sinh học tan huyết khối với giá thành ước tính giảm từ 40% đến 60% tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn được xây dựng trên nền tảng lý thuyết công nghệ DNA tái tổ hợp (recombinant DNA - rDNA) và cơ chế sinh hóa của hệ thống phân giải tơ máu (fibrinolysis). Về mặt di truyền học, gen mã hóa h-tPA ở người có tổng chiều dài khoảng 36.594 bp với 14 exon và 13 intron định vị chính xác tại vị trí 8p12 trên nhiễm sắc thể số 8. Phân tử protein h-tPA trưởng thành gồm 530 acid amin với khối lượng phân tử khoảng 70 đến 72 kDa, cấu trúc gồm chuỗi nặng A (39 kDa) và chuỗi nhẹ B (33 kDa) liên kết chặt chẽ qua các cầu nối disulfide. Hoạt tính sinh học của h-tPA được quy định bởi 5 domain cấu trúc đặc thù: domain ngón tay (Finger, vị trí acid amin 4-50) tạo ái lực mạnh mẽ với tơ máu; domain yếu tố sinh trưởng biểu bì (EGF, vị trí 51-87) liên kết bề mặt tế bào; hai domain Kringle (K1 và K2, vị trí 88-262) điều hòa tương tác protein - protein; và domain serine protease (vị trí 267-527) đảm nhiệm chức năng xúc tác phân cắt plasminogen thành plasmin hoạt động để hòa tan fibrin. Mô hình biểu hiện gen ngoại lai trong hệ thống tế bào nhân sơ Escherichia coli được áp dụng nhằm khai thác các ưu thế vượt trội về tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng nuôi cấy mật độ cao và chi phí môi trường dinh dưỡng thấp so với hệ thống tế bào động vật có vú (CHO, BHK).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn vật liệu ban đầu của đề tài là đoạn cDNA mã hóa h-tPA được tách dòng sẵn trong vector pUC18. Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 12 dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp thu nhận sau biến nạp (bao gồm 7 dòng mang vector pGEX6p1 và 5 dòng mang vector pET21a(+)), được chọn lọc ngẫu nhiên từ hàng trăm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch Luria - Bertani (LB) bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicillin nồng độ 50 µg/ml. Phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên có kiểm soát chỉ thị kháng sinh giúp loại bỏ hoàn toàn các dòng tế bào không tiếp nhận plasmid, đảm bảo độ tin cậy của mẫu thử. Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu tích hợp vị trí nhận biết của các enzyme hạn chế BamHI, NdeI và XhoI với chu trình nhiệt 30 chu kỳ (biến tính 94°C trong 30 giây, gắn mồi 60°C trong 30 giây, kéo dài 72°C trong 90 giây). Phương pháp cắt enzyme hạn chế kép kết hợp xử lý enzyme phosphatase ruột bê (CIAP) ở 37°C trong 60 phút được lựa chọn nhằm ngăn chặn triệt để hiện tượng tự đóng vòng của vector mở. Kỹ thuật biến nạp sốc nhiệt ở 42°C trong 70 giây vào tế bào khả biến E. coli DH5α và BL21(DE3)pLysS được chuẩn hóa bằng dung dịch CaCl2 0,1 M. Trình tự nucleotide được phân tích tự động trên hệ thống máy ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer bằng bộ kit BigDye Terminator v3 để đạt độ chính xác tối đa. Quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp được kích hoạt bằng chất cảm ứng Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) nồng độ 0,1 đến 1,0 mM và kiểm tra qua phương pháp điện di biến tính SDS-PAGE 10% theo nguyên tắc Laemmli ở hiệu điện thế 110V trong thời gian 2 đến 3 giờ.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã đạt được 4 phát hiện khoa học và kỹ thuật nổi bật trong quá trình tạo dòng và biểu hiện gen h-tPA:

1. Kỹ thuật PCR nhân đoạn cDNA từ khuôn plasmid pUC18/h-tPA đã khuếch đại thành công phân tử DNA kích thước xấp xỉ 1,7 kb (khoảng 1.700 bp). Kết quả điện di trên gel agarose 0,8% hiển thị các băng sản phẩm đồng nhất, rõ nét, hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết.
2. Quá trình ghép nối phân tử cDNA vào 2 hệ vector biểu hiện pGEX6p1 (mang promoter tac, gắn thẻ GST 26,4 kDa) và pET21a(+) (mang promoter T7, gắn thẻ đuôi His) đạt hiệu suất cao. Phân tích cắt kiểm tra bằng enzyme hạn chế kép BamHI/XhoI và NdeI/XhoI chứng minh sự hiện diện chuẩn xác của đoạn gen chèn 1,7 kb cùng các vector mở vòng kích thước lần lượt là 5,0 kb (pGEX6p1) và 5,5 kb (pET21a(+)).
3. Giải mã trình tự nucleotide trên hệ thống ABI PRISM 3100 xác nhận đoạn cDNA h-tPA tái tổ hợp đạt độ tương đồng lên tới 99% so với trình tự chuẩn quốc tế mang mã số NM_000930 trên Ngân hàng Gen Quốc tế (GenBank). Sai khác duy nhất tại vị trí nucleotide thứ 499 (đột biến thay thế C thành T) là đột biến đồng nghĩa, bảo tồn nguyên vẹn trình tự acid amin gốc và khung đọc mở của protein.
4. Phân tích điện di SDS-PAGE 10% chứng minh chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) chứa vector tái tổ hợp pGEX6p1/h-tPA đã tổng hợp thành công protein dung hợp GST-h-tPA có khối lượng phân tử khoảng 95 kDa (bao gồm 70 kDa h-tPA kết hợp cùng 26,4 kDa của đoạn thẻ GST). Nồng độ protein biểu hiện tăng mạnh theo thời gian từ 0 giờ đến cực đại sau 3 giờ cảm ứng IPTG 0,1 mM.

Thảo luận kết quả

Sự xuất hiện của băng protein đặc hiệu kích thước 95 kDa sau 3 giờ cảm ứng IPTG khẳng định promoter tac trong vector pGEX6p1 hoạt động với hiệu lực phiên mã rất mạnh dưới sự kiểm soát của gen điều hòa lacIq. Việc dung hợp đoạn peptide Glutathione S-Transferase (GST) vào đầu N của h-tPA đóng vai trò kỹ thuật quyết định giúp tăng cường tính hòa tan của chuỗi polypeptide, hạn chế tối đa hiện tượng cuộn gập sai cấu trúc và tạo thể vùi (inclusion bodies) thường gặp khi biểu hiện các protease phức tạp trong vi khuẩn. Trong các công bố kinh điển của Pennica và cộng sự, năng suất h-tPA biểu hiện trong E. coli chỉ đạt từ 50 đến 80 µg/lít dịch nuôi cấy (tương đương 1.500 đến 2.400 phân tử hoạt tính/tế bào). Hệ thống biểu hiện tối ưu trong nghiên cứu này cho thấy tiềm năng sinh tổng hợp vượt trội, tiệm cận các mô hình nâng cao với tỷ lệ protein tái tổ hợp chiếm khoảng 20% đến 30% tổng protein tế bào. Dữ liệu động học biểu hiện theo thời gian có thể được trình bày sinh động qua biểu đồ đường thể hiện mật độ quang tế bào (OD600) kết hợp với bảng số liệu định lượng quang phổ mật độ băng protein trên phần mềm phân tích ảnh gel, làm rõ mối tương quan tuyến tính giữa thời gian nuôi cấy 3 giờ ở 37°C và lượng protein mục tiêu tích lũy.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả thực nghiệm đã đạt được, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị hành động cụ thể nhằm hoàn thiện công nghệ sản xuất protein h-tPA tái tổ hợp:

1. Tối ưu hóa thông số lên men và môi trường nuôi cấy: Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen cần chủ trì thực hiện hạ nhiệt độ nuôi cấy xuống dải 20°C đến 25°C kết hợp giảm nồng độ cảm ứng IPTG xuống mức 0,05 đến 0,2 mM trong giai đoạn 6 đến 12 tháng tới, nhằm mục tiêu nâng tỷ lệ protein hòa tan lên trên 45% tổng lượng protein biểu hiện và ngăn chặn quá trình thoái hóa do enzyme protease nội bào.
2. Chuẩn hóa quy trình tinh sạch ái lực và cắt bỏ thẻ hòa tan: Nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học cần áp dụng hệ thống sắc ký ái lực cột Glutathione - Sepharose 4B để tinh chế chọn lọc protein dung hợp GST-h-tPA, sau đó sử dụng enzyme PreScission Protease chuyên biệt để cắt rời đoạn thẻ GST 26,4 kDa. Mục tiêu đặt ra là thu hồi protein h-tPA tự do có độ tinh sạch đạt trên 95% trong thời gian xử lý dưới 8 giờ.
3. Đánh giá hoạt tính làm tan huyết khối in vitro và in vivo: Các đơn vị phối hợp tại Viện Dược liệu và Đại học Y Dược cần tiến hành thử nghiệm hoạt tính tiêu sợi huyết của protein tái tổ hợp trên đĩa thạch fibrin chuẩn và mô hình cục máu đông nhân tạo trong vòng 12 tháng, bảo đảm hoạt tính sinh học đạt tối thiểu 500.000 IU/mg tương đương với thuốc đối chứng Alteplase thương mại.
4. Mở rộng quy mô bioreactor và hoàn thiện hồ sơ thử nghiệm tiền lâm sàng: Bộ Khoa học và Công nghệ cùng các doanh nghiệp dược phẩm trong nước cần cấp kinh phí đầu tư hệ thống lên men bioreactor dung tích 50 đến 100 lít trong giai đoạn 2024 - 2026, hướng tới mục tiêu tự chủ 100% nguồn thuốc cấp cứu nhồi máu cơ tim và đột quỵ tại các cơ sở y tế trên toàn quốc.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn thạc sĩ này là tài liệu học thuật và cẩm nang kỹ thuật giá trị dành cho 4 nhóm đối tượng:

1. Nhà khoa học và nghiên cứu viên Công nghệ Sinh học: Khai thác quy trình thực nghiệm chi tiết về thiết kế mồi PCR, kỹ thuật tạo dòng định hướng và tối ưu hóa hệ thống vector biểu hiện pET/pGEX, giúp rút ngắn 40% đến 50% thời gian nghiên cứu khi thao tác trên các gen người có cấu trúc phức tạp.
2. Kỹ sư R&D tại các doanh nghiệp Dược phẩm Sinh học: Vận dụng quy trình nuôi cấy vi khuẩn E. coli và cảm ứng protein dung hợp để thiết lập dây chuyền sản xuất hoạt chất tan huyết khối quy mô pilot, giúp tiết kiệm từ 30% đến 50% chi phí vận hành so với công nghệ nuôi cấy tế bào động vật.
3. Giảng viên, Học viên Cao học và Sinh viên ngành Di truyền học, Sinh học Phân tử: Sử dụng công trình như một tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp luận nghiên cứu thực nghiệm, giải mã trình tự ABI PRISM 3100, đối soát dữ liệu tin sinh học với GenBank và phân tích điện di protein biến tính SDS-PAGE.
4. Bác sĩ Chuyên khoa Tim mạch và Dược sĩ Lâm sàng: Nắm vững bản chất sinh học phân tử, cấu trúc 5 domain chức năng và cơ chế tác động chọn lọc của h-tPA, phục vụ công tác đánh giá chuyên môn và tối ưu hóa phác đồ điều trị tiêu sợi huyết cho bệnh nhân tắc mạch cấp tính.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao h-tPA lại được đánh giá là thuốc tan huyết khối vượt trội hơn Streptokinase và Urokinase?
Chất hoạt hóa plasminogen mô (h-tPA) sở hữu domain ngón tay (Finger) và Kringle 2 có ái lực liên kết chọn lọc cực cao với phân tử fibrin trong cục máu đông. Nhờ đó, enzyme chỉ kích hoạt plasminogen thành plasmin ngay tại vị trí huyết khối, hạn chế tối đa nguy cơ phân hủy fibrinogen tự do trong máu và giảm hơn 70% nguy cơ xuất huyết hệ thống nguy hiểm so với Streptokinase.

Việc dung hợp protein h-tPA với thẻ GST trong vector pGEX6p1 mang lại lợi ích kỹ thuật gì?
Đoạn peptide GST kích thước 26,4 kDa có khả năng tan rất cao trong môi trường tế bào chất của vi khuẩn E. coli. Khi dung hợp với chuỗi h-tPA 70 kDa tạo thành phức hợp 95 kDa, thẻ GST đóng vai trò như một chaperone phân tử giúp chuỗi polypeptide cuộn gập chính xác, giảm thiểu hình thành thể vùi bất hoạt và hỗ trợ tinh sạch nhanh chóng qua cột sắc ký ái lực Glutathione.

Đột biến nucleotide tại vị trí 499 (thay thế C thành T) có làm thay đổi chức năng của enzyme h-tPA không?
Kết quả phân tích tin sinh học đối chiếu với trình tự chuẩn NM_000930 khẳng định đột biến tại vị trí nucleotide 499 là đột biến câm (đồng nghĩa). Bộ ba mã hóa bị biến đổi vẫn dịch mã ra cùng một loại acid amin trong chuỗi polypeptide, do đó bảo toàn 100% cấu trúc không gian bậc 3 và hoạt tính xúc tác phân giải fibrin của protein h-tPA.

Tại sao nghiên cứu lại chọn vi khuẩn E. coli thay vì hệ thống tế bào động vật có vú CHO để biểu hiện gen?
Tế bào vi khuẩn E. coli sở hữu tốc độ nhân đôi nhanh (khoảng 20 đến 30 phút mỗi thế hệ), môi trường nuôi cấy đơn giản và chi phí sản xuất thấp hơn khoảng 4 đến 5 lần so với tế bào động vật CHO. Đây là giải pháp công nghệ tối ưu để sản xuất quy mô lớn các chế phẩm protein với giá thành phù hợp cho các nước đang phát triển.

Những thông số kỹ thuật then chốt nào quyết định sự thành công của quá trình cảm ứng biểu hiện h-tPA?
Quá trình cảm ứng đòi hỏi kiểm soát nghiêm ngặt mật độ quang của dịch nuôi cấy tại bước sóng 600 nm trong khoảng OD600 từ 0,6 đến 0,8 trước khi bổ sung IPTG nồng độ 0,1 đến 1,0 mM. Duy trì nhiệt độ ổn định ở 37°C và tốc độ lắc 200 vòng/phút trong suốt 3 giờ nuôi cấy là điều kiện quyết định để đạt sản lượng protein tái tổ hợp cao nhất.

Kết luận

• Luận văn đã nhân bản thành công đoạn cDNA mã hóa h-tPA người kích thước 1,7 kb bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu mang điểm cắt enzyme hạn chế chuẩn xác.
• Thiết kế thành công 2 hệ vector tái tổ hợp pGEX6p1/h-tPA và pET21a(+)/h-tPA, được thẩm định qua cắt enzyme kép và phân tích PCR kiểm tra.
• Xác định trình tự gen đạt độ tương đồng 99% so với trình tự chuẩn quốc tế NM_000930, bảo tồn hoàn toàn khung đọc mở và cấu trúc acid amin nguyên bản.
• Biểu hiện thành công protein dung hợp GST-h-tPA khối lượng phân tử 95 kDa trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3) sau 3 giờ cảm ứng bằng IPTG 0,1 mM.
• Công trình đặt nền móng vững chắc cho lộ trình tinh sạch, kiểm tra hoạt tính tiêu sợi huyết trong 6 đến 12 tháng tới và tiến tới sản xuất thử nghiệm quy mô pilot trong giai đoạn 2 đến 3 năm tiếp theo.

Các đơn vị nghiên cứu, viện chuyên ngành và doanh nghiệp dược phẩm quan tâm đến việc chuyển giao công nghệ hoặc hợp tác phát triển chế phẩm protein h-tPA tái tổ hợp vui lòng liên hệ trực tiếp với nhóm tác giả tại Viện Công nghệ sinh học để cùng triển khai ứng dụng thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970, các thành tựu về sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử của các bệnh xuất hiện trên động vật, thực vật và đặc biệt là trên người. Giáo sư Paul Berg thuộc trường đại học Stanford (Hoa Kỳ), người được nhận giải Nobel hóa học năm 1980, là người đầu tiên tạo ra DNA tái tổ hợp (recombinant DNA- rDNA) vào năm 1972. Kể từ đó đến nay, công nghệ rDNA và những ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của các công ty công nghệ sinh học và các dược phẩm tạo ra nhờ công nghệ rDNA (dược phẩm sinh học) nhằm phục vụ và bảo vệ sức khỏe con người [44].

Trong lĩnh vực nghiên cứu tạo các loại dược phẩm làm tan các cục máu đông để điều trị huyết khối và các rối loạn huyết khối tắc mạch, cuối những năm 1980, thông qua công nghệ rDNA, các nhà khoa học đã nghiên cứu và tạo ra một số loại dược phẩm sinh học là các protein tái tổ hợp có khả năng làm tan các cục máu đông “đặc hiệu”. Một trong những protein đó, chất hoạt hóa plasminogen mô của người (human tissue plasminogen activator- h-tPA) đã được nhiều nhóm tác giả trên thế giới nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y dược. DNA bổ sung (complementary DNA- cDNA) của gen mã hóa h-tPA đã được phân lập, tạo dòng, biểu hiện ở nhiều loại tế bào như tế bào trứng chuột đồng (Chinese hamster ovary- CHO), tế bào thận chuột chưa trưởng thành. và sản xuất dưới dạng dược phẩm tái tổ hợp [39].

Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dược phẩm bằng công nghệ sinh học đang bắt đầu được tiếp cận. Việc nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô trong vi khuẩn Escherichia coli tiến tới sản xuất dược phẩm sinh học phục vụ bảo vệ sức khỏe con người có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của ngƣời trong vi khuẩn Escherichia coli”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 http://www.

Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ rDNA để thiết kế vector và biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli nhằm tiến tới sản xuất protein h-tPA tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y dược. Nội dung nghiên cứu - Tạo dòng gen mã hóa h-tPA trong các vector biểu hiện thích hợp. - Biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E.

Những điểm mới của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu nhằm tiến tới ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô của người - một dược phẩm công nghệ sinh học có giá trị hoàn toàn chưa được nghiên cứu và sản xuất ở nước ta. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 http://www.vn CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Bệnh tim mạch Bệnh tim mạch là các bệnh liên quan đến những rối loạn ảnh hưởng tới tim và các mạch máu bao gồm bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não, bệnh mạch máu ngoại biên và tăng huyết áp. Bệnh tim mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên thế giới.

Mỗi năm, bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong cho 17,5 triệu người và dự đoán sẽ có khoảng 25 triệu người bị bệnh tim mạch tử vong vào năm 2020. Bệnh tim mạch cũng được dự đoán sẽ là nguyên nhân lớn nhất gây tàn phế cho người vào năm 2020. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cứ mỗi 2 giây có 1 người chết vì bệnh tim mạch. Cứ mỗi 5 giây thì có 1 trường hợp nhồi máu cơ tim và mỗi 6 giây thì có một trường hợp đột quỵ.

Hiện có đến 300 yếu tố nguy cơ kết hợp với bệnh mạch vành và đột quỵ sẽ dẫn đến bệnh tim mạch [60]. Một trong những nguyên nhân sinh lý quan trọng dẫn tới các bệnh tim mạch là do thành mạch bị tổn thương, dẫn tới hình thành huyết khối bên trong mạch máu. Do vậy, điều trị huyết khối là một trong những phương pháp hiệu quả giúp làm giảm nguy cơ tử vong và các biến chứng ở các bệnh nhân mắc bệnh tim mạch, đặc biệt là ở các bệnh nhân đột quỵ và nghẽn mạch máu. Trong phác đồ điều trị huyết khối và bệnh tim mạch, chất hoạt hóa plasminogen (plasminogen activator, PA) đóng vai trò quan trọng và được xem là thuốc điều trị có hiệu quả cao.

Chất hoạt hóa plasmminogen có vai trò biến đổi plasminogen thành plasmin- là chất phân hủy huyết khối (thrombolytic). Plasmin sau đó sẽ hòa tan dần fibrin và fibrinogen từ đó làm tan huyết khối. Bằng công nghệ gen, các PA đã được nghiên cứu và đưa vào sản xuất nhằm tạo ra thuốc đặc hiệu trong điều trị huyết khối và bệnh tim mạch. Tuy nhiên, do quy trình sản xuất phức tạp nên giá thành của sản phẩm này khá cao.

Chất hoạt hóa plasminogen Chất hoạt hóa plasminogen có tác dụng quan trọng trong quá trình làm tan khối máu đông. Chất hoạt hóa plasminogen là nhóm enzyme duy nhất chuyển chất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 http://www.vn xúc tác plasminogen từ dạng bất hoạt sang dạng hoạt động - plasmin. Vì đặc tính này, một vài loại plasminogen khác nhau đã được sử dụng nhằm điều trị các chứng bệnh tim mạch. Chất hoạt hóa plasminogen gồm bốn nhóm chính.

Một nhóm là chất hoạt hóa plasminogen urokinase (urokinase- type plasminogen activator, uPA). Chất này có liên quan đến kháng thể urokinase và không kết hợp với tơ máu. Bởi vậy chất hoạt hóa này được cho rằng có thể có liên quan đến hoạt hóa plasminogen trong pha lỏng của huyết thanh. Loại thứ hai là chất hoạt hóa plasminogen mô (tissue-type plasminogen activator, tPA), có khả năng tương tác với kháng thể chất hoạt hóa mô và kết hợp với tơ máu.

Loại thứ ba là streptokinase (SK). SK hoạt hóa plasminogen bằng cơ chế trực tiếp. Cuối cùng là enzyme phân hủy tơ máu (fibrinolysis) được giải phóng nhanh khi huyết tương bị tổn thương và giải phóng một số chất hoạt hóa vào thành mạch [18], [47]. Chất hoạt hóa plasminogen urokinase là sản phẩm chính của thận, tồn tại dưới dạng phân tử chất hoạt hóa urokinase sợi đơn (single chain urokinase - type plasminogen activator - scuPA) không hoạt động.

Chất hoạt hóa plasminogen urokinase được phân lập có hai dạng: dạng có trọng lượng phân tử cao (khối lượng 54,7kDa) và dạng có trọng lượng phân tử thấp (khối lượng 31,5kDa) [18]. Chúng có hai chức năng: chức năng chính là tham gia trong phân giải protein mô liên kết và chức năng thứ hai được biết đến với vai trò điều khiển của tPA như chất hoạt động sinh lý trong máu [30]. Sự hoạt hóa của scuPA do sự phân hủy xung quanh bởi plasmin trong cấu trúc hai sợi dẫn tới việc tăng hoạt tính của plasminogen lên. Thông qua quá trình này, một số lượng nhỏ của plasmin có thể xúc tác sản phẩm uPA hoạt động, ảnh hưởng tới hình dạng của nhiều plasmin.

Chất hoạt hóa plasminogen urokinase có thể chỉ hoạt hóa plasminogen với sự có mặt của fibrin. Tuy nhiên, nó sẽ không kết hợp với fibrin và sẽ không phân hủy fibrin. Trong huyết tương người, nồng độ kháng thể uPA từ 2 đến 7ng/ml. Giá trị cao nhất thường được tìm thấy trong bệnh nhân gan mãn tính và ung thư gan [9].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 http://www. Cấu trúc của tPA và uPA [9] Gen mã hóa tPA và protein này đã được nhiều nhóm tác giả trên thế giới nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y- dược [31], [40]. Những nghiên cứu gần đây cho thấy tPA còn đóng vai trò quan trọng trong hệ thống thần kinh [49], [56]. Ở người và các động vật khác, tPA đóng vai trò quan trọng trong hệ thống tiêu hủy fibrin [53], [54].

Đối với các trường hợp mắc bệnh huyết khối, sau khi tPA được đưa vào cơ thể, dưới tác dụng của tPA, plasmin sẽ được tạo ra chủ yếu tại vị trí hình thành huyết khối, nên tránh được tình trạng phân hủy ở những vùng khác trong cơ thể, tuy nhiên hoạt tính chọn lọc này chỉ là tương đối [21]. Streptokinase là một chất hoạt hóa plasminogen ngoại sinh có khối lượng 47kDa. Hiện nay, Streptokinase được thu chủ yếu từ nuôi cấy vi khuẩn Streptococci B-hemolytic. Streptokinase có chức năng tương tự với plasminogen ở người.

Chức năng chính là phụ thêm vào thay đổi cấu trúc trong phân tử plasminogen, làm trung tâm hoạt động của phân tử plasminogen này hoạt động để hoạt hóa phân tử plasminogen thứ hai bằng cách cắt phân tử plasminogen thứ hai tại vị trí Agr 560- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 http://www. Tiếp theo, plasminogen trong hỗn hợp Streptokinase- plasminogen sẽ được chuyển thành plasmin, cuối cùng, hỗn hợp tách nhau hình thành dạng Streptokinase và plasmin tự do. Cả hai loại của hỗn hợp Streptokinase đều ảnh hưởng ngang nhau tới sự hoạt hóa của plasminogen: Streptokinase + plasminogen → Streptokinase-plasminogen Streptokinase- plasminogen + plasminogen → streptokinase- plasmin + plasmin Streptokinase- plasmin + plasminogen → streptokinase- plasmin + plasmin Streptokinase là một chất hoạt hóa plasminigen không đặc hiệu. Việc dùng Streptokinase dẫn tới tình trạng phân hủy hệ thống.

Một tác dụng không mong muốn của việc dùng Streptokinase là gây cảm ứng việc đáp ứng của chất trợ đông thông qua việc tăng giải phóng thrombin. Mặc dù đáp ứng trợ đông xảy ra với tất cả các thuốc tan huyết khối, nhưng các số liệu in vitro cho thấy tác dụng này lớn nhất với Streptokinase. Tương ứng với các nhóm hoạt hóa plasminogen, hiện nay trên thị trường có 5 loại thuốc tan huyết khối được phép lưu hành: Alteplase tương ứng với chất hoạt hóa plasminogen mô, có nguồn gốc từ DNA tái tổ hợp do hãng Genentech sản xuất [8]; Streptase tương ứng với streptokinase có nguồn gốc từ cầu khuẩn tan máu beta được sản xuất bởi hãng Aventis Pharma; Urokinase biết đến với tên là Abbokinase được sản xuất bởi hãng ImaRx Therapeutics, urokinase có nguồn gốc từ chất chiết tế bào thận người; phức chất hoạt hóa Streptokinase plasminogen anisoylat hóa (APSAC); và Tenecteplase, một dạng biến đổi của chất hóa hóa plasminogen mô người gắn với fibrin và làm biến đổi plasminogen thành plasmin. Tất cả các dạng thuốc này được dùng để điều trị nhồi máu cơ tim, huyết khối tĩnh mạch sâu, nghẽn mạch phổi, tái thông mạch.

Tuy nhiên, tùy từng trường hợp, các loại thuốc khác nhau được sử dụng để điều trị một cách hiệu quả và ít tốn kém nhất.