Đặt vấn đề Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum) là loại cây thân thảo được biết đến với giá trị dược liệu cao. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Thổ nhân sâm cho thấy, trong lá và rễ có rất nhiều các hợp chất có hoạt tính dược học khác nhau như: alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, phytosterol, phytol; trong đó các phytol chiếm tỷ lệ cao (69,32 %). Từ lâu, Thổ nhân sâm đã được sử dụng trong y học cổ truyền, đặc biệt là trong điều trị bệnh tiểu đường type 2, viêm da, rối loạn tiêu hóa, yếu sinh lý và rối loạn sinh sản. Galactogue trong lá có tác dụng chống viêm, kích thích tăng tiết sữa ở phụ nữ cho con bú và có khả năng chữa bệnh viêm loét.
Rễ của cây Thổ nhân sâm được sử dụng để thúc đẩy khả năng sinh sản và chữa các bệnh phụ khoa như bất thường trong chu kỳ kinh nguyệt. Steroid saponin trong rễ cây Thổ nhân sâm có tác dụng phòng và chữa bệnh xơ vỡ động mạch, đồng thời còn là nguyên liệu để tổng hợp nên hormone sinh dục. Flavonoid là một hợp chất có vai trò quan trọng đối với con người như có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng khuẩn, chống viêm, chống ung thư… Tuy nhiên, chưa thấy nghiên cứu về thu nhận flavonoid ở cây Thổ nhân sâm vì hàm lượng flavonoid ở các loài thuộc chi Talinum, trong đó có cây Thổ nhân sâm rất thấp. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để nâng cao hàm lượng flavonoid ở các loài thuộc chi Talinum nói chung và cây Thổ nhân sâm (T.
paniculatum) nói riêng để có thể sử dụng trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Cho đến nay, đã có một số cách tiếp cận chủ yếu được áp dụng đối với cây dược liệu để làm tăng hàm lượng flavonoid. Đó là sử dụng phương pháp chọn lọc từ quần thể hoặc lai hữu tính hay đột biến thực nghiệm, từ đó chọn lọc các dòng cây có hàm lượng flavonoid cao. Tuy nhiên, đối với cây Thổ nhân sâm chưa thấy công bố nào về ứng dụng phương pháp này để nâng cao hàm lượng flavonoid; nhưng việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật như chuyển gen và nuôi cấy mô tế bào thực vật ở cây dược liệu đã được quan tâm và mang lại hiệu quả cao trong thu nhận các dược chất, trong đó có flavonoid.
2 Ở thực vật, flavonoid được tổng hợp qua đường phenylpropanoid, chuyển phenylalanine thành 4-coumaroyl-CoA và sau đó 4-coumaroyl-CoA sẽ đi vào quá trình tổng hợp flavonoid. Có rất nhiều các enzyme tham gia vào con đường tổng hợp flavonoid như phenylalanine ammonia-lyase, cinnamate 4-hydroxylase, 4- Coumarate CoA ligase, chalcone synthase, chalcone isomerase… Trong đó, chalcone isomerase (CHI) là enzyme chìa khóa cho sinh tổng hợp flavonoid bằng việc xúc tác cho phân tử naringenin chalcone mạch hở được đóng vòng để hình thành các naringenin. Sau đó, hợp chất này sẽ được chuyển hóa thành nhiều loại flavonoid chính như flavanone, flavonol và anthocyanin. Do vậy, biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme CHI sẽ làm tăng hoạt độ của enzyme chìa khóa CHI và hàm lượng các loại flavonoid trong cây chuyển gen sẽ được cải thiện.
Ngoài ra, Thổ nhân sâm là loài cây có rễ củ, nhiều hợp chất thứ cấp được tập trung ở rễ, trong đó có flavonoid. Do vậy, để tăng thu nhận flavonoid ở cây Thổ nhân sâm, cách tiếp cận ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật bằng phương pháp cảm ứng tạo rễ tơ nhằm tăng sinh khối cũng được quan tâm nghiên cứu. Khi mô thực vật (lá, đoạn thân, lá mầm.) bị lây nhiễm Agrobacterium rhizogenes thì T-DNA trong cấu trúc Ri-plasmid mang các gen rol và các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin loại IAA sẽ được chuyển vào mô thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của các gen rol và các gen tổng hợp auxin sẽ tạo nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật được lây nhiễm A.
Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi đã chọn và tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid và cảm ứng tạo rễ tơ ở cây Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum)”. Mục tiêu nghiên cứu Tạo được dòng cây chuyển gen GmCHI có hàm lượng flavonoid cao hơn cây đối chứng không chuyển gen và xác định được điều kiện thích hợp trong cảm ứng tạo rễ tơ in vitro ở cây Thổ nhân sâm. Nội dung nghiên cứu (i) Nghiên cứu định danh các mẫu Thổ nhân sâm thu tại một số địa phương bằng phương pháp hình thái so sánh và mã vạch DNA. Đặc điểm hình thái của các mẫu Thổ nhân sâm thu từ các địa phương được quan sát trực tiếp và mô tả đặc điểm rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt.
Sử dụng mã vạch DNA (trình tự vùng ITS; đoạn gen matK, rpoB, rpoC1) để định danh các mẫu Thổ nhân sâm thu thập được. (ii) Nghiên cứu chuyển gen GmCHI và tạo dòng cây Thổ nhân sâm chuyển gen. Nghiên cứu điều kiện thích hợp trong khử trùng hạt ở cây Thổ nhân sâm. Khảo sát ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến sự tái sinh đa chồi, ra rễ in vitro ở cây Thổ nhân sâm; Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen GmCHI vào cây Thổ nhân sâm thông qua nách lá mầm và tạo các dòng cây Thổ nhân sâm chuyển gen.
Phân tích sự hợp nhất và sự biểu hiện của gen chuyển GmCHI ở cây Thổ nhân sâm chuyển gen; Phân tích, so sánh hàm lượng flavonoid tổng số trong các dòng cây Thổ nhân sâm chuyển gen và cây không chuyển gen. (iii) Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ từ cây Thổ nhân sâm nhờ A. Khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ ở cây Thổ nhân sâm. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ A.
rhizogenes, nồng độ AS, thời gian lây nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả tạo rễ tơ từ mô lá Thổ nhân sâm. Nghiên cứu xác định ngưỡng diệt khuẩn của cefotaxime đối với A. rhizogenes; Phân tích dòng rễ tơ mang gen rolC bằng kĩ thuật PCR. Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sự tăng trưởng rễ tơ Thổ nhân sâm.
Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống, từ định danh các mẫu Thổ nhân sâm thu thập ở một số địa phương tạo nguồn vật liệu ban đầu để nuôi cấy in vitro đến chuyển cấu trúc mang gen GmCHI vào cây Thổ nhân sâm và phân tích sự biểu hiện của gen GmCHI có nguồn gốc từ đậu tương ở cây Thổ nhân sâm chuyển gen. 4 Cụ thể là: 1) Năm mẫu Thổ nhân sâm thu tại các địa phương ở Việt Nam thuộc một loài T. paniculatum, chi Talinum, họ Rau sam (Portulacaceae) được định danh bằng sự kết hợp giữa phương pháp hình thái so sánh và mã vạch DNA. 2) Lần đầu tiên biểu hiện thành công gen GmCHI có nguồn gốc từ cây đậu tương ở cây Thổ nhân sâm và tạo được 2 dòng Thổ nhân sâm chuyển gen có hàm lượng flavonoid cao hơn các cây đối chứng không chuyển gen.
3) Tạo được 5 dòng rễ tơ từ cây Thổ nhân sâm làm vật liệu phục vụ chọn dòng rễ tơ có hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn trong cách tiếp cận cải thiện hàm lượng flavonoid bằng kỹ thuật chuyển gen mã hóa enzyme chìa khóa của quá trình tổng hợp flavonoid và tạo dòng rễ tơ in vitro ở cây Thổ nhân sâm. Về mặt khoa học Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ là cơ sở ứng dụng kỹ thuật tạo dòng rễ tơ và chuyển gen vào việc nâng cao hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học ở cây Thổ nhân sâm và một số loại cây dược liệu khác. Kết quả nghiên cứu tạo cơ sở khoa học cho giải pháp nâng cao hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thực vật.
Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học, công nghệ quốc tế và quốc gia cùng với các trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy. Về mặt thực tiễn Các dòng rễ tơ và dòng cây Thổ nhân sâm chuyển gen làm vật liệu cho chọn giống Thổ nhân sâm có hàm lượng flavonoid cao. Kết quả của nghiên cứu đã mở ra triển vọng ứng dụng kỹ thuật tạo dòng rễ tơ và kỹ thuật biểu hiện gen vào việc nâng cao hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây dược liệu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM 1. Cây Thổ nhân sâm 1. Phân loại và đặc điểm sinh học của cây Thổ nhân sâm Theo Đỗ Tất Lợi (2004), cây Thổ nhân sâm (T. paniculatum) thuộc chi Talinum, họ Rau sam (Portulacaceae), bộ Cẩm chướng (Caryophyllales), phân lớp Cẩm chướng (Caryophyllidae), lớp hai lá mầm (Magnoliopsida) [3].
Thổ nhân sâm là loại cây cỏ mọc hằng năm, thân màu xanh, mọc thẳng, có thể cao tới 0,6 m, phía dưới chia cành. Lá mọc so le, hình trứng ngược, hoặc hình thìa, phiến lá dày, hơi thẫm, hai mặt đều bóng, đầu lá nhọn hoặc tù, phía cuống hẹp lại, cuống rất ngắn, lá dài 5-7 cm, rộng 2,5-3,5 cm. Vào mùa hạ ở đầu cành xuất hiện cụm hoa hình chùm nhiều hoa nhỏ, đường kính 6 mm, 5 cánh hoa màu tím nhạt, hơn 10 nhị dài 2 mm. Bầu hoa hình cầu.
Quả nhỏ, khi chín có màu xám tro, đường kính ước 3mm. Hạt rất nhỏ, màu đen nhánh hơi dẹt, trên mặt hơi có vân nổi. Mùa ra hoa vào tháng 6-7-8, mùa quả vào tháng 9-10-11. Rễ củ hình trụ mang nhiều rễ con, bề ngoài màu nâu đen.
Lúc mới được thu hoạch, bên trong củ màu trắng, phơi khô sẽ chuyển thành màu đen, hình dáng củ gần giống với củ Nhân sâm. Cây Thổ nhân sâm mọc hoang và được trồng nhiều nơi trong nước ta vì nhiều người nhầm là cây Nhân sâm. Tuy nhiên, giữa cây Thổ nhân sâm và cây Nhân sâm khác nhau về hình thái cũng như về họ thực vật. Ở một số tỉnh của Trung Quốc như Triết Giang, Giang Tô, An Huy., cây Thổ nhân sâm cũng mọc hoang và được trồng làm cảnh, người ta gọi cây này với những tên Cao ly sâm, Thổ cao ly sâm… và cũng dùng nó làm thuốc bổ thay sâm [3].
Cây mọc rất khỏe, có thể trồng bằng hạt hoặc bằng một mẩu thân rễ. Cây phát triển nhanh, sau một năm có thể thu hoạch, để lâu năm thân rễ sẽ to hơn. Thông thường, dân địa phương trồng để lấy lá nấu canh [1], [3]. Thành phần hóa học cây Thổ nhân sâm Cây Thổ nhân sâm chứa rất nhiều các thành phần hợp chất có hoạt tính sinh học được quan tâm sử dụng.