Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu tạo rễ tóc cây đậu nành glycine max l bằng vi khuẩn agrobacterium rhizogenes

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu tạo rễ tóc cây đậu nành Glycine Max L bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, ứng dụng tiềm năng trong nông nghiệp.

• Tác giả: Ngô Thị Tú Trinh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Vũ Phong
• Trường học: Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo rễ tóc cây đậu nành (Glycine max L.) bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Lý do chọn đề tài
• 1.2. Mục tiêu đề tài
• 1.2.1. Mục tiêu tổng quát
• 1.2.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.3. Đối tượng nghiên cứu
• 1.4. Nội dung nghiên cứu
• 1.5. Ý nghĩa của đề tài
• 1.5.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
• 2.1. Cây đậu nành (Glycine max L.)
• 2.2. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
• 2.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn A. rhizogenes
• 2.2.2. Plasmid Ri của A. rhizogenes
• 2.2.3. Cơ chế chuyển T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật
• 2.2.4. Cơ sở phân tử và sinh lý của sự hình thành rễ tóc
• 2.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen
• 2.2.5.1. Sự phù hợp giữa kiểu gen thực vật và chủng vi khuẩn Agrobacterium
• 2.2.5.2. Mật độ vi khuẩn A. rhizogenes khi lây nhiễm
• 2.2.6. Chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogenes trên cây đậu nành
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Địa điểm — Thời gian nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2.2. Hóa chất và môi trường
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Tạo nguồn mẫu đậu nành in vitro và chuẩn bị
• 3.3.1.1. Tạo nguồn mẫu đậu nành
• 3.3.1.2. Chuẩn bị vi khuẩn
• 3.3.2. Xác định một số điều kiện phù hợp lây nhiễm A. rhizogenes lên mẫu đậu nành in vitro
• 3.3.2.1. Xác định chủng vi khuẩn A. rhizogenes và mẫu đậu nành phù hợp cảm ứng tạo rễ
• 3.3.2.2. Xác định hiệu quả diệt khuẩn A. rhizogenes của các loại kháng sinh
• 3.3.2.3. Ảnh hưởng tuổi của mẫu đậu nành đến sự cảm ứng tạo rễ
• 3.3.2.4. Ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes đến quá trình cảm ứng tạo rễ trên mẫu đậu nành
• 3.3.2.5. Xác định mật độ vi khuẩn phù hợp cho quá trình cảm ứng tạo rễ tóc
• 3.3.3. Duy trì các dòng rễ giả định chuyển gen
• 3.3.4. Khẳng định mẫu chuyển gen bằng phương pháp PCR
• 3.3.5. Đánh giá hình thái, sự tăng trưởng của các rễ cảm ứng bởi A. rhizogenes
• 3.3.6. Phương pháp xử lý thống kê
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
• 4.1. Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm
• 4.2. Chuẩn bị vi khuẩn rhizogenes và loại mẫu phù hợp với cảm ứng tạo rễ tóc ở đậu nành
• 4.3. Khả năng cảm ứng tạo rễ tóc của mẫu ở độ tuổi khác nhau
• 4.4. Hiệu quả cảm ứng tạo rễ của cách thức lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes phù hợp cho quá trình cảm ứng tạo rễ tóc
• 4.5. Duy trì các dòng rễ giả định chuyển gen
• 4.6. Xác định mẫu chuyển gen bằng phương pháp PCR
• 4.7. Đánh giá hình thái, sự tăng trưởng của các rễ cảm ứng bởi A. rhizogenes
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 5.1. Kết luận
• 5.2. Đề nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tạo rễ tóc cây đậu nành Glycine Max L

Nghiên cứu tạo rễ tóc cây đậu nành (Glycine max L.) bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Cây đậu nành là một trong những cây trồng quan trọng, không chỉ cung cấp nguồn thực phẩm mà còn có giá trị kinh tế cao. Việc tạo rễ tóc giúp cải thiện khả năng sinh trưởng và phát triển của cây, đồng thời mở ra cơ hội cho các nghiên cứu về chức năng gen và sinh học vùng rễ.

1.1. Lý do chọn nghiên cứu cây đậu nành Glycine Max L

Cây đậu nành có vai trò quan trọng trong nông nghiệp và thực phẩm. Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu khả năng tạo rễ tóc, từ đó hỗ trợ cho các nghiên cứu về gen và sinh học vùng rễ.

1.2. Mục tiêu của nghiên cứu tạo rễ tóc

Mục tiêu chính là tạo ra rễ tóc từ cây đậu nành bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, phục vụ cho các nghiên cứu chức năng gen và cải thiện giống cây trồng.

II. Thách thức trong nghiên cứu tạo rễ tóc cây đậu nành

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc tạo rễ tóc từ cây đậu nành gặp phải một số thách thức. Các yếu tố như điều kiện môi trường, chủng vi khuẩn và phương pháp lây nhiễm đều ảnh hưởng đến hiệu quả tạo rễ. Việc xác định các điều kiện tối ưu là rất cần thiết để đạt được kết quả tốt nhất.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ tóc

Các yếu tố như mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm và loại mẫu đậu nành đều có ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo rễ tóc. Nghiên cứu cần xác định rõ các điều kiện này.

2.2. Khó khăn trong việc duy trì các dòng rễ tóc

Việc duy trì các dòng rễ tóc chuyển gen là một thách thức lớn. Cần có các phương pháp hiệu quả để loại bỏ vi khuẩn và duy trì sự phát triển của rễ tóc.

III. Phương pháp nghiên cứu tạo rễ tóc bằng Agrobacterium Rhizogenes

Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes để tạo rễ tóc cho cây đậu nành. Phương pháp này đã được chứng minh là hiệu quả trong việc tạo ra các mẫu rễ tóc có khả năng sinh trưởng tốt. Các bước thực hiện bao gồm chuẩn bị mẫu, lây nhiễm vi khuẩn và duy trì môi trường nuôi cấy.

3.1. Chuẩn bị mẫu đậu nành cho lây nhiễm

Mẫu đậu nành cần được chuẩn bị kỹ lưỡng để đảm bảo khả năng lây nhiễm cao. Việc chọn giống và tuổi của mẫu cũng rất quan trọng.

3.2. Quy trình lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium

Quy trình lây nhiễm bao gồm việc sử dụng các chủng vi khuẩn khác nhau và điều chỉnh mật độ vi khuẩn để đạt hiệu quả tối ưu trong việc tạo rễ tóc.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes có thể tạo ra rễ tóc với tỷ lệ thành công cao. Các mẫu rễ tóc được tạo ra có hình thái tương tự như rễ tóc tự nhiên, mở ra cơ hội cho các nghiên cứu tiếp theo về chức năng gen và sinh học vùng rễ.

4.1. Tỷ lệ thành công trong việc tạo rễ tóc

Nghiên cứu đã ghi nhận tỷ lệ mẫu tạo rễ đạt từ 96% đến 100%, cho thấy hiệu quả cao của phương pháp này trong việc tạo rễ tóc từ cây đậu nành.

4.2. Ứng dụng trong nghiên cứu chức năng gen

Các mẫu rễ tóc tạo ra có thể được sử dụng để nghiên cứu chức năng gen, từ đó hỗ trợ cho việc cải thiện giống cây trồng và nghiên cứu về sự tương tác giữa cây và vi khuẩn.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu tạo rễ tóc cây đậu nành bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Kết quả nghiên cứu không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tạo rễ mà còn hỗ trợ cho các nghiên cứu về chức năng gen và cải thiện giống cây trồng trong tương lai.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong nông nghiệp

Nghiên cứu này có thể góp phần quan trọng vào việc phát triển các giống cây trồng mới, giúp nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng trong nông nghiệp.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình tạo rễ tóc và nghiên cứu sâu hơn về chức năng của các gen liên quan đến sự phát triển của rễ.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Đậu nành (Glycine max L.) là cây trồng quan trọng trong ngành nông nghiệp với giá trị dinh dưỡng cao và khả năng cố định đạm nhờ vi khuẩn cộng sinh ở vùng rễ. Trong bối cảnh biến đổi khí hậu và nhu cầu nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng, nghiên cứu về sinh học vùng rễ và chức năng gen liên quan đến rễ đậu nành ngày càng được quan tâm. Tuy nhiên, việc chuyển gen trên cây đậu nành truyền thống bằng phương pháp bắn gen hoặc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens gặp nhiều hạn chế về hiệu quả tái sinh và thời gian tạo cây chuyển gen.

Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo rễ tóc trên cây đậu nành bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, một phương pháp có ưu điểm vượt trội trong việc cảm ứng rễ tóc, giúp rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả chuyển gen, đồng thời hỗ trợ nghiên cứu chức năng gen vùng rễ. Mục tiêu chính là xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình lây nhiễm A. rhizogenes trên hai giống đậu nành HLĐN29 và DT84, bao gồm loại mẫu, chủng vi khuẩn, tuổi mẫu, cách thức lây nhiễm và mật độ vi khuẩn. Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh trong khoảng thời gian từ tháng 11/2017 đến tháng 5/2018.

Kết quả nghiên cứu không chỉ góp phần xây dựng quy trình tạo rễ tóc hiệu quả trên đậu nành mà còn tạo nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn về chức năng gen và tương tác sinh học vùng rễ, từ đó hỗ trợ phát triển bền vững năng suất và chất lượng cây trồng trong điều kiện biến đổi khí hậu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cơ chế chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes: A. rhizogenes mang plasmid Ri chứa vùng T-DNA có khả năng chuyển gen vào bộ gen thực vật tại vị trí vết thương, kích thích hình thành rễ tóc đặc trưng với khả năng phát triển nhanh, phân nhánh nhiều và không cần hormone ngoại sinh. Các gen rol (rolA, rolB, rolC, rolD) trên T-DNA đóng vai trò quan trọng trong cảm ứng rễ tóc và điều chỉnh sinh lý thực vật.

• Ảnh hưởng của kiểu gen thực vật và chủng vi khuẩn: Hiệu quả cảm ứng rễ tóc phụ thuộc vào sự phù hợp giữa giống đậu nành và chủng A. rhizogenes sử dụng. Các chủng phổ biến gồm ATCC 15834, ATCC 11325 và ICPB TR7 có khả năng lây nhiễm và cảm ứng rễ tóc khác nhau trên các mẫu đậu nành.

• Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen: Mật độ vi khuẩn (OD600 từ 0,5 đến 1,0), tuổi mẫu (6-8 ngày tuổi cho hiệu quả cao), cách thức lây nhiễm (trực tiếp hoặc đồng nuôi cấy), và việc sử dụng kháng sinh để loại bỏ vi khuẩn sau đồng nuôi cấy (cefotaxime 500 mg/L kết hợp carbenicillin 400 mg/L) là các yếu tố quan trọng quyết định thành công của quá trình tạo rễ tóc.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nghiên cứu sử dụng hai giống đậu nành HLĐN29 và DT84, cùng ba chủng vi khuẩn A. rhizogenes ICPB TR7, ATCC 11325 và ATCC 15834. Mẫu đậu nành được chuẩn bị in vitro, gồm lá mầm và trụ hạ diệp 5-8 ngày tuổi.

• Quy trình lây nhiễm: Mẫu đậu nành được tạo vết thương bằng dao, sau đó ngâm hoặc lây nhiễm trực tiếp với dịch khuẩn có nồng độ OD600 từ 0,5 đến 1,0, bổ sung acetosyringone 200 µM để tăng hiệu quả. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong 3 ngày ở 25°C trong điều kiện tối.

• Loại bỏ vi khuẩn: Sau đồng nuôi cấy, mẫu được rửa hai lần bằng môi trường LMXB, ngâm trong dung dịch chứa cefotaxime 500 mg/L và carbenicillin 400 mg/L trong 30 phút, sau đó chuyển sang môi trường MXB có bổ sung cefotaxime 500 mg/L để duy trì.

• Phân tích và xác định mẫu chuyển gen: Các dòng rễ tóc được duy trì trên môi trường không hormone, đánh giá hình thái và tốc độ tăng trưởng. Xác định sự chuyển gen thành công bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen rolC (có mặt trong T-DNA) và kiểm tra sự vắng mặt của gen virD (chỉ có ở vi khuẩn) để loại trừ nhiễm khuẩn.

• Thiết kế thí nghiệm: Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức gồm 10-20 mẫu. Số liệu thu thập gồm tỉ lệ mẫu tạo rễ tóc, số rễ trung bình trên mỗi mẫu, mức độ tái nhiễm vi khuẩn và hình thái rễ.

• Phân tích thống kê: Sử dụng phần mềm MSTATC V1.2, phân tích phương sai và kiểm định Duncan để đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (α=0,05).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Loại mẫu và chủng vi khuẩn phù hợp: Lá mầm 5-8 ngày tuổi của hai giống HLĐN29 và DT84 cho tỉ lệ tạo rễ tóc cao hơn so với mẫu trụ hạ diệp. Chủng A. rhizogenes ATCC 15834 và ATCC 11325 có hiệu quả tạo rễ tóc cao nhất trên giống HLĐN29 với tỉ lệ mẫu tạo rễ đạt từ 96% đến 100%, trung bình khoảng 8 rễ/mẫu. Chủng ATCC 15834 cũng cho hiệu quả tốt nhất trên giống DT84 với tỉ lệ tạo rễ tương tự.

2. Ảnh hưởng của tuổi mẫu: Mẫu lá mầm 6-8 ngày tuổi là thời điểm tối ưu cho cảm ứng tạo rễ tóc, với tỉ lệ mẫu tạo rễ trên 90% và số rễ trung bình đạt khoảng 5-7 rễ/mẫu. Mẫu 10 ngày tuổi có tỉ lệ tạo rễ giảm đáng kể xuống còn khoảng 38%.

3. Phương pháp lây nhiễm: Hai cách lây nhiễm trực tiếp và đồng nuôi cấy vi khuẩn cho kết quả tương đương về tỉ lệ mẫu tạo rễ và số rễ trung bình trên cả hai giống đậu nành. Mật độ vi khuẩn trong khoảng OD600 từ 0,5 đến 1,0 là phù hợp, với số rễ trung bình cao nhất (~7 rễ/mẫu) khi sử dụng dịch khuẩn có OD600 từ 0,5 đến 1,0.

4. Hiệu quả loại bỏ vi khuẩn: Sử dụng kết hợp cefotaxime 500 mg/L và carbenicillin 400 mg/L trong quá trình rửa mẫu và duy trì trên môi trường nuôi cấy giúp loại bỏ hiệu quả vi khuẩn A. rhizogenes mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của rễ tóc. Nồng độ cefotaxime 1000 mg/L tuy loại bỏ vi khuẩn tốt nhưng làm giảm khả năng cảm ứng tạo rễ.

5. Xác nhận chuyển gen: Ba dòng rễ tóc được xác định là chuyển gen thành công dựa trên kết quả PCR dương tính với gen rolC và âm tính với gen virD, đồng thời có hình thái rễ đặc trưng của rễ tóc chuyển gen khi nuôi trên môi trường không bổ sung hormone.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy sự phù hợp giữa chủng vi khuẩn và loại mẫu đậu nành là yếu tố quyết định hiệu quả cảm ứng rễ tóc. Lá mầm non có khả năng đáp ứng tốt hơn do hoạt động sinh lý và khả năng tiếp nhận T-DNA cao hơn so với trụ hạ diệp. Chủng ATCC 15834 nổi bật với khả năng tạo rễ tóc nhanh và nhiều, phù hợp cho các nghiên cứu chức năng gen vùng rễ.

Việc lựa chọn mật độ vi khuẩn phù hợp và phương pháp lây nhiễm tối ưu giúp tăng hiệu quả chuyển gen, đồng thời giảm thiểu tác động tiêu cực đến mẫu thực vật. Sử dụng kháng sinh kết hợp cefotaxime và carbenicillin là biện pháp hiệu quả để loại bỏ vi khuẩn sau đồng nuôi cấy, đảm bảo tính thuần khiết của dòng rễ chuyển gen.

So với các nghiên cứu trước đây, kết quả này tương đồng với các báo cáo về hiệu quả của A. rhizogenes trong việc tạo rễ tóc trên đậu nành và các cây họ đậu khác, đồng thời khẳng định tính khả thi của quy trình chuyển gen sử dụng A. rhizogenes trong điều kiện in vitro tại Việt Nam.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tỉ lệ mẫu tạo rễ theo chủng vi khuẩn và loại mẫu, bảng so sánh số rễ trung bình trên mỗi mẫu theo tuổi mẫu và mật độ vi khuẩn, cũng như hình ảnh minh họa hình thái rễ tóc chuyển gen.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình tạo rễ tóc bằng A. rhizogenes ATCC 15834 trên mẫu lá mầm 6-8 ngày tuổi nhằm tối ưu hóa tỉ lệ chuyển gen và số lượng rễ tóc, phục vụ nghiên cứu chức năng gen vùng rễ. Thời gian thực hiện quy trình từ 3-4 tuần, do các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực hiện.

2. Sử dụng phương pháp đồng nuôi cấy vi khuẩn kết hợp rửa mẫu bằng cefotaxime 500 mg/L và carbenicillin 400 mg/L để loại bỏ vi khuẩn hiệu quả, đảm bảo tính thuần khiết của dòng rễ chuyển gen, giảm thiểu nguy cơ tái nhiễm trong quá trình nuôi cấy.

3. Khuyến khích các trung tâm nghiên cứu và công ty giống cây trồng áp dụng quy trình này để phát triển các giống đậu nành chuyển gen có khả năng kháng bệnh và thích nghi với điều kiện môi trường khắc nghiệt, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

4. Tiếp tục nghiên cứu mở rộng về chức năng gen vùng rễ và tương tác với vi sinh vật đất dựa trên các dòng rễ tóc chuyển gen đã tạo, nhằm khai thác tiềm năng gen kháng bệnh và cải thiện khả năng thích nghi của đậu nành trong điều kiện biến đổi khí hậu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật: Có thể áp dụng quy trình tạo rễ tóc để nghiên cứu chức năng gen, tương tác vi sinh vật và phát triển giống cây trồng chuyển gen.

2. Các trung tâm nghiên cứu nông nghiệp và giống cây trồng: Sử dụng kết quả để phát triển các giống đậu nành có khả năng kháng bệnh và thích nghi tốt hơn với điều kiện môi trường.

3. Sinh viên và học viên cao học chuyên ngành công nghệ sinh học, nông học: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật chuyển gen và phân tích dữ liệu trong lĩnh vực biến đổi gen thực vật.

4. Doanh nghiệp sản xuất giống cây trồng và công nghệ sinh học: Áp dụng quy trình tạo rễ tóc để rút ngắn thời gian phát triển giống mới, nâng cao hiệu quả sản xuất và chất lượng sản phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn Agrobacterium rhizogenes thay vì Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen đậu nành?
   A. rhizogenes tạo rễ tóc nhanh và hiệu quả hơn, giúp rút ngắn thời gian chuyển gen và thuận lợi cho nghiên cứu chức năng gen vùng rễ, trong khi A. tumefaciens thường mất nhiều thời gian tái sinh cây chuyển gen.

2. Mẫu đậu nành nào phù hợp nhất để lây nhiễm A. rhizogenes?
   Mẫu lá mầm 6-8 ngày tuổi cho tỉ lệ tạo rễ tóc cao nhất và số rễ trung bình nhiều nhất, do đó được khuyến cáo sử dụng trong quy trình chuyển gen.

3. Mật độ vi khuẩn A. rhizogenes ảnh hưởng thế nào đến hiệu quả tạo rễ tóc?
   Mật độ vi khuẩn trong khoảng OD600 từ 0,5 đến 1,0 là tối ưu, giúp tạo số lượng rễ tóc nhiều nhất mà không gây độc cho mẫu thực vật.

4. Làm thế nào để loại bỏ vi khuẩn sau khi đồng nuôi cấy?
   Sử dụng kết hợp kháng sinh cefotaxime 500 mg/L và carbenicillin 400 mg/L trong quá trình rửa mẫu và duy trì nuôi cấy giúp loại bỏ hiệu quả vi khuẩn mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của rễ tóc.

5. Làm sao xác định mẫu rễ tóc đã chuyển gen thành công?
   Xác định bằng phương pháp PCR phát hiện gen rolC đặc trưng của T-DNA chuyển gen và kiểm tra sự vắng mặt của gen virD để loại trừ nhiễm khuẩn, đồng thời đánh giá hình thái rễ tóc đặc trưng khi nuôi trên môi trường không hormone.

Kết luận

• Đã thiết lập thành công quy trình tạo rễ tóc trên hai giống đậu nành HLĐN29 và DT84 sử dụng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, với tỉ lệ mẫu tạo rễ đạt 96-100% và số rễ trung bình khoảng 7-8 rễ/mẫu.

• Lá mầm 6-8 ngày tuổi là mẫu vật tối ưu cho quá trình lây nhiễm và cảm ứng rễ tóc.

• Chủng A. rhizogenes ATCC 15834 cho hiệu quả tạo rễ tóc tốt nhất trên cả hai giống đậu nành.

• Kết hợp sử dụng cefotaxime 500 mg/L và carbenicillin 400 mg/L hiệu quả trong việc loại bỏ vi khuẩn sau đồng nuôi cấy mà không ảnh hưởng đến sự phát triển rễ tóc.

• Các dòng rễ tóc chuyển gen được xác nhận bằng PCR và có hình thái đặc trưng, tạo nền tảng cho các nghiên cứu chức năng gen vùng rễ và ứng dụng trong cải tiến giống đậu nành.

Next steps: Áp dụng quy trình trong nghiên cứu chức năng gen sâu hơn, mở rộng sang các giống đậu nành khác và phát triển các giống chuyển gen có tính kháng bệnh cao.

Call to action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật nên áp dụng và phát triển quy trình này để nâng cao hiệu quả nghiên cứu và sản xuất giống cây trồng chuyển gen.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1.1 Lý do chọn đề tài Trong thời gian dài, các nghiên cứu cải thiện di truyền trên đậu nành tập trung vào khả năng kháng sâu bệnh (Somers và cs, 2005; Trần Thị Cúc Hòa, 2010). Vùng rễ của cây họ Đậu nói chung và cây đậu nành nói riêng được đặc biệt quan tâm do khả năng cố định đạm và cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium. Những năm gân đây, chức năng kháng tác nhân gây bệnh trong đất của các gen vùng rễ đậu nành đã được biết đến. Bên cạnh đó khả năng thích nghỉ với điều kiện hạn và đất mặn của cây đậu nành cũng được chú trọng.

Điều đó cho thay vùng rễ có chức năng cực kỳ quan trọng trong sự phát triển và thích ứng với sự biến đổi khí hậu của cây đậu nành. Khai thác khả năng tự vệ và nguồn gen kháng tác nhân gây bệnh của cây trồng là cơ sở để cải thiện giống cây trồng và là hướng đi được các nhóm nghiên cứu về bộ gen chức năng xác định (Md Setamam và cs, 2014). Hiện nay chưa có công bố nao về tạo rễ tóc trên cây đậu nành trong nước, và có ít nghiên cứu về sinh học vùng rễ và tương tác giữa các gen ở rễ và tác nhân gây bệnh vùng rễ. Trên thế giới, số lượng nghiên cứu tạo rễ tóc từ mẫu đậu nành in vitro cũng rat hạn chế.

Do đó, nghiên cứu sẽ giúp thiết lập qui trình tạo rễ tóc trên đối tượng đậu nành in vitro, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về chức năng của các gen cũng như sinh học vùng rê cây đậu nành. Kết quả nghiên cứu sẽ làm nền tảng cho các nghiên cứu về chức năng bộ gen đậu nành nhằm khai thác một cách hiệu quả nguồn gen hiện có trong nước. Đồng thời kết quả nay cũng hỗ trợ tích cực cho các nghiên cứu về sự tương tác của tác nhân gây bệnh vùng rễ và các gen ở vùng rễ thực vật. Các hướng nghiên cứu này, về lâu dai, sẽ góp phan đáng kế vào sự phát triển bền vững năng suất và chất lượng cây trồng.2 Mục tiêu đề tài 1.1 Mục tiêu tổng quát Tạo được ré tóc cây đậu nành cảm ứng bởi vi khuân Agrobacterium rhizogenes phục vụ cho các nghiên cứu chức nang gen và sinh học vùng rê đậu nành.2 Mục tiêu cụ thể - xác định được loại mâu đậu nành, vi khuan A.

rhizogenes và các điêu kiện thuận lợi lây nhiêm. - Xác định và duy trì các dòng rễ tóc đậu nành chuyền gen.3 Đối tượng nghiên cứu - Giống đậu nanh HLĐN 29 được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc thuộc Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam. - Giỗng đậu nành DT84 của Công ty cỗ phan giống cây trồng miền Nam. rhizogenes không mang plasmid tái tổ hợp gồm các chủng ICPB TR7, ATCC 11325, ATCC 15834 1.4 Nội dung nghiên cứu - Xác định một số điều kiện thích hợp (loại mau, chủng vi khuẩn, tuổi mau, cách thức lây nhiễm, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm) cho quá trình lây nhiễm A.

rhizogenes lên mẫu đậu nành in vitro. - Xác định mẫu rễ tóc đậu nành chuyền gen.5 Y nghĩa của đề tài 1.1 Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài giúp tìm hiểu thêm mối tương tác giữa vi khuẩn A. rhizogenes và mô hình thực vật đậu nành, tạo tiền đề xây dựng các nghiên cứu mới liên quan tạo cây đậu nành chuyên gen và góp phan phát triển các nghiên cứu tạo va nhân sinh khôi rê tóc giúp nghiên cứu về gen và chức năng gen vùng rê.2 Y nghĩa thực tiên Đề tài xác định được thông số quan trọng thích hợp và thiết lập quy trình chuyền gen bang vi khuẩn A. rhizogenes tạo rễ tóc ở cây đậu nành.

Quy trình này có thê ứng dụng trong nghiên cứu các van dé liên quan. Chương 2: TONG QUAN 2.1 Cay dau nanh (Glycine max L.) Đậu nành hay đậu tương (Glycine max L.) là một trong những cây trông quan trọng trong số các loại cây họ đậu (Fabaceae). Đậu nành có hàm lượng protein cao do đó được dùng trong chế biến thực phẩm cho người va gia súc. Đậu nành là loại cây trồng thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, than, cành, lá, hoa, quả và hạt.

Ré đậu nành là loại rễ cọc gồm rễ cái và các rễ bên, trên có nhiều nốt san chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cô định đạm của không khí. Thân tròn, mang 8 - 14 đốt, các cành và lá mọc ra từ các đốt trên thân. Đậu nành là cây tự thụ phần, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn có mau trắng hay tím. Thời ky cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào từng giống và thời vụ gieo trồng bởi nó chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ.

Quả đậu nành là loại quả ráp, ngoài vỏ quả thường có lông bao phủ, màu sắc vỏ quả khi chín có mau vàng hay xám đen. Hạt đậu nành có hình dạng tròn bầu dục, tròn dài, tròn đẹt; vỏ hạt thường nhẫn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, den. Cây đậu nành là cây trồng ngắn ngày, có thé trồng trên nhiều loại đất, nhiều vụ trong năm; có thể xen canh, gối vụ. rất thuận lợi cho phát triển sản xuất nông nghiệp để khai thác lợi thế của vùng khí hậu nhiệt đới.

Trong suốt thời gian sinh trưởng. nhu cầu nước của cây không đồng đều qua các giai đoạn. Yêu cầu về độ âm đồng ruộng trung bình là 50 - 60%, giai đoạn ra hoa, hình thành quả phải đạt 70 - 80% nên đậu nành được xếp vào nhóm cây trông có nhu cau về nước cao. Đối với ngành trông trọt, đậu nành có khả năng tích luỹ đạm của không khí để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ vi khuẩn cộng sinh trên nốt san ở bộ rễ va sinh khối thân, cành lá.

Các chất hữu cơ nay góp phan làm thay đổi tính chất lý hoá học và tăng độ phì nhiêu cho đất. Trong hệ thống thâm canh, trồng đậu nành có tác dụng làm cho cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh, chong nan ô nhiêm do lạm dụng phân bón hoá học và thuôc trừ sâu. Các sản phẩm thực phẩm từ đậu nành cũng rất đa dạng, có thể dùng trực tiếp ở dạng hạt thô hay qua chế biến. Ngoài ra, trồng cây đậu nành có tác dụng cai tao đất do hoạt động của nhóm vi khuẩn Rhizobium cộng sinh trên rễ cây họ đậu.

Nhiều nghiên cứu về bộ gen cây đậu nành đã được tiến hành vi đây là cây trồng quan trọng về mặt kinh tế trên thế giới (Stacey và cs, 2006). Những hướng nghiên cứu về cây đậu nành chủ yếu nhăm nâng cao chất lượng dinh dưỡng, khả năng kháng côn trùng gây hại và các mục tiêu khác. Một trong những quy trình hiệu quả để đạt các mục tiêu trên là biến đối di truyền cây đậu nành (Arruda và cs, 2013).2 Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 2.1 Giới thiệu về vi khuẩn A. rhizogenes Agrobacterium rhizogenes (trước day được gọi là Phytomonas rhizogenes) đã được nhận biết từ hon 70 năm trước như là một tác nhân gây bệnh trên tang lông hút của rễ cây song tử diệp (hội chứng rễ tóc — hairy root).

Agrobacterium rhizogenes là vi khuẩn Gram âm sống trong đất, hình que, có tính di động, không sinh bao tử, thuộc chi Agrobacterium. rhizogenes có quan hệ rat gần với Agrobacterium tumefaciens, tắc nhân gây khối u trên cây. Đến nay, những hiểu biết cơ bản về cơ chế phân tử của sự biến nạp gen thực vật bởi những thành viên của chi Agrobacterium đều là dựa trên những nghiên cứu tong quát về A. Toàn bộ quá trình lây nhiễm được xem như là tương tự nhau trong cả 2 loài.

rhizogenes gây nhiễm vào tế bào thực vật ở vị trí vết thương, do A. rhizogenes bị hap dẫn bởi hợp chat phenol được phóng ra từ những tế bào bị ton thương. Ri plasmid của A. rhizogenes sẽ xâm nhập vào tế bào thực vật va một đoạn nhỏ của Ri plasmid là T-DNA sẽ được chuyển và gan vào bộ gen của tế bào thực vật.

Theo cách này T-DNA được duy trì ôn định trong bộ gen mà nó chuyển vào. Từ vùng bị nhiễm sẽ tạo ra những rễ nhánh bất thường gọi là rễ tóc (hairy root). Những rễ này có đặc điểm là phát triển ăn nghiêng, phân nhánh nhiều, tăng trưởng nhanh và đặc biệt là chúng có khả năng phát triển in vitro trong điều kiện không có các yếu tố kích thích tăng trưởng (Rao và Ravishankar, 2002 trích dẫn bởi Taylor, 2007). Những đặc tính này làm cho rễ tóc trở thành một công cụ được sử dụng rộng rãi cho việc sản xuất các hợp chất thứ cấp, khảo sát chức năng gen, và nghiên cứu sinh học của rễ nói chung.

rhizogenes có thé được phan loai vao nhiều nhóm phụ khác nhau dựa trên kiểu opine ma chúng sản xuất ra. rhizogenes phố biến nhất được xác định đến nay gồm dòng sản xuất agropine (đại diện là Ri plasmid pRi A4, pRi 1855, pRi HRI, pRi 15834, và pRi LBA9402), dòng sản xuất mannopine (đại diện là Ri plasmid pRi 8/96), dòng sản xuất cucumopine (dai diện là Ri plasmid pRi 2659) va dòng sản xuất mikimopine (đại diện là Ri plasmid pRi 1724). Mikimopine và cucumopine là những chat đồng phân lập thể, nhưng không có tính tương đồng giữa các gen tong hop opine ở mức độ nucleotide. Trong số các dòng A.

rhizogenes khác nhau được biết, K47, K599 va HRI là các dòng gây độc cao có khả năng lây nhiễm cho nhiều loài thực vật khác nhau (Taylor, 2007).2 Plasmid Ri của A. rhizogenes Ri plasmid cua A. rhizogenes va Ti plasmid cua A. tumefaciens tuong tu nhau về cau trúc.

Những nghiên cứu so sánh trình tự của Ri va Ti plasmid cho thay các cơ câu của sự hoạt hóa và sự vận chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật được bảo tồn giữa 2 loại plasmid. Trong cả Ri và Ti plasmid, gần vùng biên giới của T-DNA có 1 chuỗi mã có tính chất lặp lại gồm 24 bp, được gọi là trình tự lẻ (border sequences). T-DNA nguyên thủy mang một nhóm gen gây ung thu và di hóa opine, biểu hiện ở những tế bào thực vật chuyển gen là sự phát triển của các mô ung thư và sự sản xuất opine, các dan xuất amino acid hầu như chỉ được vi khuẩn sử dụng như là nguồn carbon va nitrogen. Ca Ri va Ti plasmid đều chứa gen điều khiến quá trình gan va chuyén T-DNA vao té bao thuc vat va cho hién tượng di hóa các opine trong mô thực vật đã chuyền gen.